Плазмідний експресуючий вектор ркns3 -120, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е. coli гібридного злитного білка pns3 вірусу гепатиту с

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної Інженерії І може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка pNS3 вірусу гепатиту С І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до вірусу гепатиту С в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ.1-3 (Keith К Stanley and Paul luslo., Construction of a new family of high efflclenty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins, // EMBO Journel, vol 3, N 6, p. 1429-1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. coll элитного білка pNS3 вірусу гепатиту С. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка pNS3 вірусу гепатиту С. Для цього була створена рекомбінантна плазмида pKNS3-120, яка містить наступні Інсерційні фрагменти ДНК; фрагмент гену Сrо, розміром 51 п.о., фрагмент Lad, розміром 114 п.о., фрагмент Lac Z, розміром 1050 п.о. 1 фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку NS3 вірусу гепатиту С, розміром 3339 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coll. Pop 2136. РекомбінанінІ клони Е. coll нарощували І тестували методом Імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до неструктурних білків вірусу гепатиту С. Плазмида pKNS3 120 кодує гібридний білок молекулярною масою 125,5 кД. (1113 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-120) одержували трансформацією клітин Е. coll Рор-2136 плазмидою pKNS3-120 (див. креслення). Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонкому поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють Інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібрідного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-120 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення І по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою pKNS3-120.