Спосіб визначення нелетальних кріопошкоджень клітин дріжджів

Изобретение относится к области криобиологии, в частности к способам определения нелетальных криоповреждений микроорганизмов. Известен способ определения нелетальных криоповреждений микроорганизмов, основанный на обработке замороженных -отогретых клеток детергентами, например дезоксихолатом натрия [1]. Этот способ можно отнести к экспрессметодам, т.к. длительность инкубации клеток в растворах дезоксихолата натрия не превышает 1,5 часов. Однако недостатком этого способа является то, что он позволяет выявлять криоповреждения лишь внешней мембраны клеток. Такие повреждения восстанавливаются у микроорганизмов относительно быстро. Выявляя нелетальные криоповреждения, в первую очередь следует обращать внимание на повреждения цитоплазматической мембраны и связанных с ней биохимических жизненно важных процессов. Наиболее близким к заявляемому по своей сущности является способ определения нелетальных криоповреждений с использованием гипертонического раствора NaCl [2]. Согласно этому способу клеточную суспензию после, размораживания высевают на агаризованную питательную среду, содержащую 0,5М NaCl. Через 48 часов культивирования подсчитывают число колоний. В качестве контроля жизнеспособности клеток служит число колоний, выросших на нормальной для данного вида микроорганизмов питательной среде. По разности этих двух показателей судят о количестве клеток в криоконсервированной суспензии, несущи х в себе нелетальные структурные криоповреждения. Недостатком этого способа является его длительность и сложность. В основу изобретения поставлена задача создания такого способа определения нелетальных криоповреждений клеток дрожжей, в котором изменение условий воздействия на клетки гипертоническим раствором хлорида натрия обеспечивало бы его ускорение и упрощение. Создание такого экспресс-метода обеспечит своевременное выявление степени и характера нелетальных повреждений с целью использования этих данных для последующей разработки оптимальных способов реабилитации и культивирования микроорганизмов. Поставленная задача решается тем, что в способе определения нелетальных криоповреждений клеток дрожжей путем воздействия на размороженные клетки гипертоническим раствором NaCl и последующего определения их жизнеспособности относительно контроля, NaCl добавляют непосредственно к суспензии размороженных клеток в концентрации 3,0М, а жизнеспособность определяют по окрашиванию их суправитальным красителем. Выбор концентрации NaCl (3,0M) осуществлялся с учетом 100% ной толерантности к тестируемому агенту нативной культуры [3]. Способ осуществляют следующим образом. К суспензии размороженных дрожжевых клеток добавляют 3,0М раствора NaCl, интенсивно перемешивают, добавляют суправитальный краситель и под микроскопом определяют количество прокрашенных клеток. Контролем служит количество прокрашенных клеток в размороженной суспензии, не подвергнутой воздействию гипертоническим раствором NaCl. Число структурно поврежденных клеток в криоконсервированной суспензии определяют по разности количества прокрашенных клеток в контроле и после воздействия NaCl. Пример 1. 1мл суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae замораживали в металлических контейнерах емкостью 1мл на программном замораживателе биообъектов ЗПБ 000 000 (производство СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины) со скоростью 0,4°C/мин (оптимальная скорость замораживания для данной расы дрожжей). Размораживали суспензию на водяной бане при 30°C. Из 1мл размороженной суспензии клеток брали пробу в 0,1мл и добавляли несколько капель суправитального красителя метиленового синего (контроль). Под микроскопом при увеличении в 600 - 800 раз в 5 полях зрения подсчитывали количество прокрашенных клеток, которые называем летально поврежденными - K = 15%. Ко второй пробе в 0,1мл добавляли 10мл раствора NaCl с концентрацией 3,0М и несколько капель красителя метиленового синего (опыт). Определяли процент прокрашенных клеток, называемых летально и нелетально поврежденными - O = 36%. Количество нелетально поврежденных клеток в криоконсервированной суспензии определяли по разнице показателей в опыте и контроле: X = O - K = 36 - 15 = 21%. Таким образом, при замораживании суспензии с оптимальной для нее скоростью 0,4°C/мин 21% клеток идентифицировались как нелетально поврежденные и способные в определенных условиях либо к обратимой репарации и восстановлению исходных морфофункциональных свойств, либо к последующей гибели. Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что исследованию подвергали дрожжи Candida utilis, которые замораживали со скоростью 1,0°C/мин (оптимальная скорость замораживания для данного вида дрожжей). Прокрашенных клеток в суспензии непосредственно после размораживания (контроль) - 8%. Прокрашенных клеток в суспензии после воздействия 3,0% - ным раствором NaCl (опыт) 48%. Количество нелетально поврежденных клеток дрожжей в криоконсервированной суспензии: X = 48 - 8 = 40%. Т.е. 40% клеток дрожжей Candida utilis получили в результате замораживания нелетальные криоповреждения. Сравнительный анализ показал, что результаты, получаемые при осуществлении заявляемого способа и способа-прототипа, достоверно не отличаются друг от др уга (табл.1). Результаты исследования нелетальных криоповреждений клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae представлены в табл.1. Таким образом, заявляемый способ не уступает по точности известному, но при этом он намного проще и позволяет значительно сократить время исследования (табл.2). Сравнительный анализ этапов осуществления заявляемого способа и способа-прототипа представлен в табл.2. Таким образом, на осуществление заявляемого способа требуется всего лишь 21мин. Кроме того, способ экономичен, поскольку не требует дорогостоящих питательных сред.