Спосіб лікування або профілактики відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин за допомогою антагоніста хемокінового рецептора в комбінації з циклоспорином та фармацевтична комбінація (варіанти)

1 Спосіб лікування або профілактики відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин, що включає введення пацієнту фармацевтичної композиції, яка включає антагоніст хемокшового рецептора в комбінації з циклоспорином 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що антагоніст хемокшового рецептора і циклоспорин використовуються одночасно, роздільно або послідовно 3 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є зрізаний по N-кінцю хемокін 4 Спосіб за п 1 або 2, який відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є подовжений по N-кшцю RANTES 5 Спосіб за п 1 або 2, який відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є MetRANTES 6 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що циклоспорин вибирають з циклоспорину А, а також його метаболітів і синтетичних аналогів 7 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що циклоспорином є циклоспорин А 8 Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що використовується для лікування або профілактики відторгнення алотрансплантата нирки 9 Фармацевтична композиція, що включає антагоніст хемокшового рецептора і циклоспорин в присутності одного або більше фармацевтично прийнятних наповнювачів для лікування або профілактики відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин 10 Фармацевтична композиція за п 9, яка відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є зрізаний по N-кінцю хемокін 11 Фармацевтична композиція за п 9, яка відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є подовжений по N-кшцю RANTES 12 Фармацевтична композиція за п 9, яка відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є Met-RANTES 13 Фармацевтична композиція за будь-яким з пп9-12, яка відрізняється тим, що циклоспорин вибирають з циклоспорину А, а також його метаболітів і синтетичних аналогів 14 Фармацевтична композиція за будь-яким з пп 10-13, яка відрізняється тим, що циклоспорином є циклоспорин А 15 Фармацевтична композиція за будь-яким з пп 9-14 для лікування або профілактики відторгнення алотрансплантанта нирки 16 Фармацевтична комбінація, яка включає антагоніст хемокшового рецептора і циклоспорин в присутності одного або більше фармацевтично прийнятних наповнювачів, для одночасного, роздільного або послідовного застосування його активних інгредієнтів для лікування або профілактики відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин 17 Фармацевтична комбінація за п 16, яка відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є зрізаний по N-кінцю хемокін 18 Фармацевтична комбінація за п 16, яка відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є подовжений по N-кшцю RANTES 19 Фармацевтична комбінація за п 16, яка відрізняється тим, що антагоністом хемокшового рецептора є Met-RANTES 20 Фармацевтична комбінація за будь-яким з пп 16-19, яка відрізняється тим, що циклоспорин вибирають з циклоспорину А, а також його метаболітів або синтетичних аналогів О 1^ со о (О З 60379 21 Фармацевтична комбінація за будь-яким з 22 Фармацевтична комбінація за будь-яким з пп 16-20, яка відрізняється тим, що циклоспорипп 16-21 для лікування або профілактики ном є циклоспорин А відторгнення алотрансплантата нирки Даний винахід відноситься до застосування антагоніста хемокшового рецептора спільно з циклоспорином з метою отримання фармацевтичної композиції для лікування або профілактики відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин Він ВІДНОСИТЬСЯ також до вказаних фармацевтичних композицій для (далі скрізь) одночасного, роздільного або послідовного застосування його активних інгредієнтів у вказаній вище терапії Зокрема, він відноситься до застосування MetRANTES спільно з циклоспорином А з метою отримання фармацевтичного складу для лікування відторгнення алогенного трансплантата нирки Передумови до створення винаходу Механізм, за яким формується Т-клітинна ВІДПОВІДЬ на чужорідний (алогеннии або ксеногеннии) білок або клітину, або орган, досить добре вивчений Анти ген презентуючі клітини (АПК) притягуються до дільниць запалення або пошкодження (які можуть бути викликані хірургічною трансплантацією) Спектр Т-клітин на периферії безперервно обстежує тканини для виявлення патогенів або наявності чужорідної (ало- або ксеногенної) тканини Як тільки розпізнається який-небудь з цих попереджуючих сигналів, АПК поглинає білок, переварює його і надає його імунній системі господаря Імунна система добре пристосована для швидкого ідентифікування чужорідної, інфікованої або запаленої тканини і швидко її руйнує Це завжди було основною перешкодою при трансплантації тканини, органу і клітини, а також при генній терапії БІЛЬШІСТЬ проблем звичайно пов'язані з хронічною імуносупресією, інкапсуляцією або імуНОІЗОЛЯЦІЄЮ Небажані побічні ефекти хронічної імуносупресм включають підвищену чутливість до умовно-патогенної інфекції і утворення пухлини Зокрема, гостре відторгнення алотрансплантату нирки опосередковується як алоантигензалежними, так і незалежними чинниками і характеризується моноядерним клітинним шфильтратом, що складається, в основному, з Т-лімфоцитів, моноцитів/макрофагів і атипових еозинофілів (Grone Н J , 1996, Valente J F et al, 1998, Bishop G A et al, 1986) Рекрутинг цих лейкоцитів з периферичного кровообігу до трансплантованого органу включає складну взаємодію між рядом молекул, експрессованих на поверхні лейкоцитів і ендотелію (Butcher E G , 1991, Butcher EG et al , 1996, Springer ТА ,1994) Бажання забезпечити довготривале сприйняття трансплантованої тканини за відсутністю постійної імуносупресм є давньою метою медицини людини Було показано, що хемокши, велике суперсімейство структурно родинних ЦИТОКІНІВ, виборче стимулюють швидку адгезію, хемотаксис і активацію специфічних ефекторних субпопуляціи лейкоцитів (Springer T А , 1994, Nelson P J et al , 1998, Luster A D , 1998, Schlondorff D et al, 1997) Хемокши характеризуються рядом загальних структурних елементів, що включають консервативні цистешові залишки (С), що використовуються для розрізнення хемокшівих підгруп С, С-С, СХ-С і С-Хз-С (де X означає проміжний амінокислотний залишок, розташований між першими двома N-кшцевими проксимальними цистеїнами) Вся різноманітна біологічна активність хемокшів, мабуть, контролюється їх взаємодією з великим сімейством, що охоплює сім трансмембранних зв'язаних з С-білком рецепторів (Nelson P J et al , 1998, Luster A/D , 1998, Schlondorff D et al, 1997) Специфічна експресія клітинного типу цих рецепторів, мабуть, значною мірою контролює лейкоцитну специфічність активності хемокшів (Nelson P J et al , 1998, Luster A D , 1998, Schlundorff D etal , 1997) Хемокш RANTES (регульований при активації, експресований і секретований нормальними Тклітинами), член підродини хемокшів С-С, є лігандом для ряду хемокшівих рецепторів, включаючи CCR1, CCR3, CCR5, CCR9 і DARC (антигеновий рецептор Даффі для хемокшів) у людини (Nelson Р J et al , 1998, Luster A D , 1998, Schlondorff D et al , 1997, Nibbs R J et al , 1997) RANTES є сильним хемоатрактантом для Т-клітин, моноцитів, природних клітин-кілерів, базофілів і еозинофілів (Nelson PJ etal , 1998) Вважається, що такі хемокши, як RANTES, грають основну роль в клітинних інфільтратах, які складають основу різних патологічних процесів Наприклад, RANTBS експресується in vivo при захворюваннях, що характеризуються моноядерним клітинним інфільтратом, включаючи пперчутливість уповільненого типу, некротизуючий гломерулонефрит, запальні захворювання легенів і відторгнення ниркоподібного трансплантату (Schlondorff D et al , 1997, Nelson P J et al , 1998, Devergne 0 et al , 1994, Luckas N W et al, 1996, Lloyd C M et al , 1997, Pattison J et al , 1994, Wiedermann C J et al, 1993) При дослідженні людських нирок, що зазнають гострого клітинного відторгнення, було знайдено, що білок RANTES локалізований в моноядерних інфільтруючих клітинах, ниркоподібних тубулярних епітеліальних клітинах і ендотеліальному шарі перитубулярних капілярів (Pattison J et al, 1994, Wiedermann С J et al , 1993) Оскільки гостре клітинне відторгнення характеризується внутрішньосудинним розвиненим штерстиціальним клітинним інфільтратом, що складається з моноцитів/макрофагів, Тлимфоцитів і атипових еозинофілів, RANTES грає потенційно ключову роль в патогенезі гострого відторгнення (Schlondorff D et al , 1997, Nelson P J et al, 1998, Pattison J et al, 1994, Wiedermann С J etal, 1993) Засновуючись на цих спостереженнях, була 60379 циклоспорином Зокрема, автори виявили, що Met-RANTES зменшує пошкодження судин і канальців і спричиняє значне ослаблення штерстиціального відторгнення в ниркоподібних алотрансплантатах Отже, основним об'єктом даного винаходу є застосування антагоніста хемокінівого рецептора в комбінації з циклоспорином з метою отримання фармацевтичного складу для лікування або профілактики (далі скрізь) відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин Антагоніст хемокінівого рецептора і циклоспорин можуть вводитися одночасно, роздільно або послідовно Тому іншим об'єктом даного винаходу є спосіб лікування або попередження відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин шляхом одночасного, роздільного або послідовного введення ефективної КІЛЬКОСТІ антагоніста хемокінівого рецептора і ефективної КІЛЬКОСТІ циклоспорину разом з фармацевтичне прийнятним наповнювачем Термін «ефективна КІЛЬКІСТЬ» означає КІЛЬКІСТЬ активних інгредієнтів, яка є достатньою для того, щоб впливати на хід і важкість відторгнення трансплантованих органів, тканин або клітин, приМодифікація N-кінця білка RANTES може в ІСводячи до ослаблення або ремісії такої патології ТОТНІЙ мірі змінити його властивості (Proudfoof A E Ефективна КІЛЬКІСТЬ буде залежати від шляху ввеet al , 1996, Gong J H et al , 1996, Simmons G et дення і стану пацієнта al , 1997) Приєднання одного залишку метіоніну (Met) змінює агоністичний білок в антагоніст рецеЩе одним об'єктом даного винаходу є фармаптора хемокшу RANTES з активністю при наномоцевтичні склади, що містять антагоніст хемокініволярній концентрації (Proudfoof A E et al , 1996) го рецептора і циклоспорин в присутності одного Цей антагоніст, Met-RANTES, виявляє біологічну або декількох фармацевтично прийнятних наповактивність у мишей і пацюків (Proudfoof, не опублінювачів, для одночасного, роздільного або посліковані спостереження) і, як було показано, ослабдовного введення активних інгредієнтів з метою ляє запалення на мишачих моделях алергічної лікування або попередження відторгнення трансшкіри і ревматоїдного артриту і частково придушує плантованих органів, тканин або клітин некротизуючии гломерулонефрит (Теїхепа М М et У разі роздільного або послідовного застосуal , 1997, Plater-Zyberk С et al , 1997, Lloyd С М et вання двох активних інгредієнтів фармацевтичні al , 1997) склади згідно з винаходом будуть включати два різних склади, причому кожний включає один або Циклоспорини являють собою групу неполярдва активних інгредієнти нарівні з одним або декіних циклічних олігопептидів з імунодепресивною лькома фармацевтично прийнятними наповнюваактивністю, що продукуються грибом чами Tolypocladium mflatum Gams і іншими дефектними грибами Основний компонент, циклоспорин А був Мається на увазі, що термін «фармацевтичне ідентифікований поряд з декількома іншими міноприйнятний» охоплює будь-який носій, який не рними метаболітами, циклоспоринами від В до N впливає на ефективність біологічної активності Було також отримано множину синтетичних аналоактивного інгредієнту і не і токсичним для господагів Циклоспорин А є комерційне доступним препаря, якому вводиться Наприклад, для парентераратом, який отримав широке клінічне застосування льного введення вказані вище активні інгредієнти в якості імунодепресанту при трансплантаті' оргаможуть бути змішані у вигляді одиничної дози для нів ін'єкції В наповнювачах, таких, як фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін Основною проблемою застосування циклосабо розчин Рінгера порину А є його нефротоксичність (Martmdale, 1996), що характеризується затримкою рідини, Крім фармацевтичне прийнятного носія, склапідвищеною концентрацією сироваткового креатиди згідно з винаходом можуть також включати ненину і сечі, падінням швидкості гломерулофільтвеликі КІЛЬКОСТІ добавок, таких, як стабілізатори, рацм і зниженою екскрецією натрію і калію Зокренаповнювачі, буфери і консерванти ма, у реципієнтів ниркоподібного трансплантату Введення таких активних інгредієнтів може бубуває важко відрізнити нефротоксичність від відти внутрішньовенним, внутрішньом'язовим або торгнення трансплантату підшкірним Даний винахід охоплює і ІНШІ ШЛЯХИ введення, які можуть забезпечити в крові бажані Розкриття суті винаходу рівні ВІДПОВІДНИХ інгредієнтів У цей час автори виявили, що комбінована терапія антагоністом хемокінівого рецептора і низьКомбінована терапія згідно з даним винаходом кою дозою циклоспорину приводить до зменшення застосовна для лікування або попередження відвипадків запалення пов'язаних з відторгненням торгнення будь-якого трансплантованого органу, трансплантату в порівнянні з лікуванням одним тканини або клітин, але вона особливо доцільна у запропонована модель, що пояснює роль RANTES у відторгненні ниркоподібних алотрансплантатів (Nelson PJ et al , 1998, Pattison J et al , 1994, Wiedermann С J et al , 1993) На початку відторгнення мікроваскулярний ендотелій запалюється, відбувається дегрануляція тромбоцитів, що вивільняє білок RANTES, який зв'язується з поверхнею ендотелію Запалені ниркоподібні канальці і ендотеліальні клітини продукують додаткові хемокіни, включаючи RANTES Потім акумульовані поверхово-пов'язані хемокши подають направлені сигнали циркулюючим в крові лейкоцитам по мірі того, як вони проходять по поверхні ендотелію (Butcher E G , 1991, Butcher EG et al , 1996, Springer T A , 1994, Nelson P J et al , 1998, Pattison J etal , 1994, Wiedermann С J etal,1993) Лейкоцити впізнають поверхово-пов'язаний білок, посилюють регуляцію інтегринів і міцно прилипають до поверхні ендотелію, зазнають діапедезу і транссудації По мірі того, як лейкоцити активуються, вони виділяють додаткові цитокши і хемокши, посилюючи і розповсюджуючи, таким чином, запальну реакцію (Nelson P J e t a l , 1998, Pattison J e t a l , 1994, Wiedermann С J , 1993) 60379 8 середнього значення ± стандартне відхилення від З ДОСЛІДІВ (Примітка результати були такими, що відтворюються в інтервалі Met-RANTES від 0,01мкг/мл до 1мкг/мл) Приклади Матеріали і методи Клітини, ЩО використовуються ЛІНІЮ моноцитарних пухлинних клітин МопоМас б культивували в середовищі RPMI 1640 з додаванням 10% FCS, як описано раніше (ZieglerHeitbrock Н W L etal, 1988) Клітини, як звичайно, вміщували в 24-лункові планшети (фірми Costar), середовище і сироватку тестували на вміст ліпополісахаридів (ЛПС) низької ЩІЛЬНОСТІ Первинні людські дермальні мікроваскулярні ендотеліальні клітини (DMVEC) з людської неонатальної крайньої плоті отримані від д-ра К Degitz (Dermatology, LMU, Munich, Germany) Клітини вносили в середовище MCDB 131 (Gibco BRL, Eggenstem, Germany) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (Boebrmger Mannheim Germany) 1 мг/мл ацетату гідрокортизону (Sigma, Deisenhofen, Germany), 5x105M дибутириладеноЦиклоспорин вибирають з циклоспорину А, йозинмонофосфату (Sigma, Deisenhofen, Germany), го метаболітів або синтетичних аналогів, Перева2мМ глутамшу (Seromed, Berlin Germany) жним є циклоспорин А ЮОЕ/мл пеніциліну, 100мг/мл стрептоміцину, Отже, переважне втілення винаходу полягає в 25мг/мл амфтерицину В (антибіотичспільному застосуванні Met-RANTES і циклоспоний/протигрибковий розчин Gibco BRL, Eggenstem, рину А для лікування або попередження відторгGermany) і шкубували при 37°С і 5% СОг Клітини нення ниркоподібного алотрансплантату Заявник вирощували в колбах Т75, чашках Петрі діаметром знайшов, що в цьому випадку можна знизити ефе35мм (Costar, Corning, New York) або 96-лункових ктивну дозу циклоспорину, і це є величезною пеплоскодонних планшетах (Nunc, Wiesbaden, ревагою, враховуючи дозо-залежну токсичність Germany), заздалегідь покритих 0,5% желатином для нирки, яка, як відомо, пов'язана з лікуванням (Sigma, Deisenhofen, Germany) Середовище заміциклоспорином нювали кожні 2-3 дні Клітини характеризували, Вказаний вище ефект показаний в експеримечистоту культур забезпечували за допомогою нтах на пацюках in vivo морфологічних ознак і імунофлуоресцентної проВинахід буде тепер описуватися за допомогою точної цитометри для поверхневої експресії CD31 наступних прикладів, які не повинні розглядатися як такі, що обмежують даний винахід У прикладах Матеріали будуть посилання на фігури, описані нижче Матеріали для ГІСТОЛОГІЧНИХ досліджень отримували від фірми Merck (DumbUiJi Germany) МаОпис фігур теріали для ХІМІЧНИХ і імунологічних вимірювань Фіг 1 Визначали здатність RANTES зв'язувабули поставлені фірмою Sigma (Munich, Germany) тися безпосередньо з мікроваскулярним ендотеліIL-ip i TNFa придбані у фірми Sigma (Munich, єм до і після стимуляції з IL-ip (5нг/мл) протягом 12 Germany) Отримання рекомбшантного RANTES і годин DMVEC вирощували в 96-лункових планшеRANTES-специфічного моноклонального антитіла тах, вміст RANTES вимірювали з використанням VL1 описані раніше (Von Luettichau I , 1996) Отримодифікованої методики ELISA мували Met-RANTES і видаляли ендотоксин для Фіг 2а і 26 Вплив Met-RANTES на стійку задосліджень in vivo, як описано раніше (Proudfoof тримку, поширення або трансміграцію клітин лінії А Е et al, 1996, Теїхеїга M M et al, 1997, PlaterМопоМас 6 на активованому мікроваскулярному Zyberk С et al , 1997, Lloyd C M et al, 1997) ендотелії при фізіологічному струмі Клітини DMVEC, вирощені до злиття в чашках Петрі, стиТварини і трансплантація нирок мулювали 1 _13 (5нг/мл) або залишали необробле1- ( У всіх експериментах використали інбредних ними (контроль) протягом 12 годин, потім заздалепацюків-самців Пацюки лінії Lewis (LEW, RT11) гідь шкубували з RANTES (10нг/мл) або без нього служили як реципієнти нирок від пацюків лінії протягом ЗО хвилин клітини МопоМас 6 заздалеFisher 344 (F344 RTIlvl) або Brown Norway (BN гідь обробляли з Met-RANTES (1мкг/мл) або без RT1*) Тварин отримували від фірми Charles River нього і перфузували при ПОСТІЙНІЙ ШВИДКОСТІ струGmbH, Suilzfeld, Germany Пацюки важили 190му 1,5дин/см (а) Стійку адгезію до DMVEC визна250г (Lew і F344) і 140-170 г (BN) для регулювання чали шляхом підрахунку міцно прикріплених монодіаметра сечоводу Трансплантацію проводили, цитів в множинних полях через 5 хвилин і використовуючи модифікацію методики, спочатку виражали як клітини/мм (б) Моноцити, що зазнаописаної Fisher і Lee (Fisher В et al , 1965) Коротють поширення або трансміграцм, підраховували ко, тваринам давали наркоз за допомогою ефірночерез 5 хвилин в множинних полях високого розрікраплинної анестезії, донорську нирку промивали знення і виражали як процент від спочатку міцно 5мл холодного (4°С) 0,9% NaCI, що містить або не прикріплених клітин Дані представлені у вигляді містить ЮОмкг Met-RANTES Нирку і сечовід видавипадках ниркоподібних трансплантатів із-за нефротоксичності циклоспорину А Термін «антагоніст хемокшівого рецептора» означає будь-яку молекулу, яка діє як антагоніст по відношенню до зрілих, повнорозмірних, природних хемокшів і, переважно, не володіє значною хемоатрактантною активністю Для вимірювання вказаної хемоатрактантної активності можна послатися, наприклад, на Nelson P J etal , 1998 Антагоніст хемокшівого рецептора вибирають переважно серед усічених молекул хемокшу RANTES, про які повідомлено в Міжнародній патентній заявці WO 97/44462, усічених МСР-3, RANTES і МІР-Іа, описаних в Міжнародній патентній заявці WO 98/06751, усічених RANTES і МСР-2, описаних в Європейській патентній заявці 97116863 8/ або подовженого по N-кінцю RANTES, описаного в WO 96/17935 Особливо переважним є Met-RANTES У цитованих вище патентних заявках приведені також посилання на способи отримання згаданих антагоністів хемокшівих рецепторів ляли в блоці, включаючи ниркоподібну артерію разом з 5мм скупченням клітин навколо аорти і ниркоподібну вену з Змм дільницею порожнистої вени Нирки зберігали в 0,9% NaCI при 4°С Донорську нирку трансплантували до черевної аорти і нижньої порожнистої вени твариниреципієнта, нижче лівої ниркоподібної артерії, з допомогою анастомозів «кінець в бік» монофіламентним нейлоновим швом, що не розсмоктується 8-0 Анастомоз сечоводу здійснювали «кінець в бік» з монофіламентним нейлоновим швом, що не розсмоктується 11-0 Загальний ішемічний час донорської нирки складав від ЗО до 40 хвилин Гіпонефроз оцінювали як макроскопічне під час загибелі, так і за допомогою світлової мікроскопи Всі тварини з ппонефрозом виключалися з дослідних груп Ліву нирку реципієнта завжди видаляли під час трансплантації При трансплантації від тварини лінії Fisher реципієнту лінії Lewis права нирка знаходилася на пластині зліва для того, щоб мати внутрішній коїм роль ефектів Met-RANTES При трансплантації від Brown Norway до Lewis у час трансплантації проводили двосторонню нефректомію ДОСЛІДНІ групи ДОСЛІДНІ групи були наступні Група 1 нирка від Fisher 344 пацюку Lewis з однією ендогенною ниркою Група 1а з Met-RANTES, 200 мкг/день протягом 7 днів (п=9) Група 16 без Met-RANTES протягом 7 днів (п=9) Група 2 нирка від Brown Norway пацюку Lewis при двосторонній нефректомії і введенні 2,5 мг/кг вапгтіла на день циклоспорину А Група 2а з Met-RANTES, 50 мкг/день протягом 12 днів (п=4) Група 26, без Met-RANTES протягом 12 днів (п=4) Циклоспорин А (СуА) (люб'язно наданий Sandoz, Basel, Switzerland) розчиняли в оливковій олії і вводили підшкірно при концентрації 2,5 мг/кг ваги тіла щодня протягом 12 днів, починаючи через 4 години після трансплантації Met-RANTES розчиняли у воді і доводили до 0,9% хлоридом натрію і вводили шляхом внутрішньовенної ін'єкції щодня в дозі 200мкг/день в ДОСЛІДІ ПО трансплантації від Fisher до Lewis і в дозі 50мкг/день в ДОСЛІДІ по трансплантації від Brown Norway до Lewis Аналіз сироватки Кров, взяту з аорти під час умертвіння, аналізували на вміст креатинину, сечовини, глюкози і білірубіну, використовуючи автоматичний аналізатор сироватки Це не забезпечувало інформацію про функцію нирки для моделі Fisher-Lewis, оскільки у тварин, що зазнали трансплантації була одна ендогенна нирка, але ці вимірювання були доречні у разі трансплантації на моделі Brown Norway-Lewis ГІСТОЛОГІЯ Органи (легені, печінку, нирку і селезінку) видаляли під глибоким наркозом Органи швидко промокали від крові, зважували і потім піддавали обробці, необхідній для гістологи, імунопстохімп або гібридизації in situ 3 органів готували зрізи в 1мм і або фіксували зануренням в 4% формальде 60379 10 гіді в забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS), рН 7 35 (PBS 99мМ NaH2PO4xH2O, 108мМ NaH2PO4xH2O і 248мМ NaCI) протягом 24 годин, або фіксували в метакамі протягом 8 годин і заливали парафіном, або заморожували в рідкому азоті і в подальшому зберігали при -80°С до використання в імунопстохімічіюм) аналізі Світлову мікроскопію проводили на зрізах Змкм за допомогою суміші перюдна кислота - реагент Шиффа або реагенту Голднер-Еластіка Імунопстохімія Моноклональне антитіло ED1 (фірми Serotech/Camon, Wiesbaden, Оегпіапу) використали на фіксованій метакамом і залитій парафіном тканині (Змкм) для того, щоб продемонструвати наявність моноцитів/макрофагів Для виявлення антигенна CD8, експресованого на цитотоксичних Т-лімфоцитах, мишачі моноклональні антитіла наносили на заморожені зрізи після фіксації охолодженим льодом ацетоном протягом 5 хвилин (фірма Serotech/Camon, Wiesbaden, Germany) Використали систему виявлення лужна фосфатаза - антилужна фосфатаза (фірми Dako, Hamburg, Germany) Контролі, що виключають перше або друге антитіло для кожного зрізу, були негативними Морфометрія Оцінка васкулярного пошкодження в балах прегломерулярні судини з пошкодженим ендотелієм, тромбом і ендотеліалітом були оцінені як такі, що не міають ніякого пошкодження (0), що мають слабу (1), помірну (2) і важку (3) міру пошкодження, і визначалися у всьому ниркоподібному зрізі, включаючи корковий шар, ЗОВНІШНІЙ І внутрішній мозковий шар Міру специфічного показника васкулярного пошкодження визначали як процент судин з ВІДПОВІДНОЮ мірою пошкодження, що зустрічається у всьому ниркоподібному зрізі Оцінку загального васкулярного пошкодження в балах розраховували як суму всіх судин з всіма мірами васкулярного пошкодження, при тому, що число судин з показником 1 множили на одиницю, з показником 2 - на коефіцієнт два і з показником 3 - на коефіцієнт три (Stojanovic T et al , 1996) Оцінка тубулярного запалення в балах тубулярне пошкодження розцінювали як відсутнє (0), слабе (1), помірне (2) і важке (3) за оцінкою в 20 полях високого дозволу (HPF) коркового шару і поперечної смужки зовнішнього мозкового шару Загальне тубулярне пошкодження в балах розраховували, як описано, для оцінки загального васкулярного пошкодження Оцінка штерстиціального запалення в балах поширеність штерстиціальної інфільтрації з допомогою моноядерних клітин оцінювали як відсутню (0), слабу (1), помірну (2) і важку (3), і загальне пошкодження в балах розраховували, як описано для оцінки загального васкулярного пошкодження КІЛЬКІСТЬ моноцитів/макрофагів і Т-клітин всередині капілярних сплетень клубочків розраховували як середнє значення від ВІДПОВІДНИХ кількостей у всіх клубочках в одному ниркоподібному зрізі Гібридизація in situ Одноланцюгові РНК-зонд и отримували шляхом транскрипції in vitro клону кДНК щурячого RANTES (Dr H, Sprenger, Marburg, Germany), Транскрипцію in vitro проводили з використанням 12 11 60379 набору Транс-зонд-Т (Pharmacia, Freiburg, васкулярного ендотелію Ендотеліальний Germany) і міченою дигоксигеніном трифосфату моношар обережно промивали їх ростовим сереуридину (Boehnnger, Mannheim, Germany) Вектор довищем без добавок (25°С), додавали комплекс (pBluoscnpt KS (+), Stratagene, Heidelberg, хемокш-антитіло і шкубували при 25°С протягом Germany) розрізали рестриктазою BamHI і трансЗО хвилин Потім лунки промивали чотири рази крибували з РНК-полімеразою ТЗ, отримуючи ансередовищем без сироватки при 25 °С Реакцію з тисмисловий зонд, для того, щоб отримати смиспероксидазою хрону проводили протягом 5 хвилин ловий зонд, плазміду розрізали рестриктазою або менше Оптичну ЩІЛЬНІСТЬ В планшеті при EcoRI з подальшою транскрипцією з РНК406нм визначали з використанням зчитувального полімеразою Т7 Після видалення парафіну нирпристрою для ELISA Результати демонструють коподібні зрізи розщеплювали 20мкг/мл протешазміни в зв'язуючій здатності запаленого мікровасзою К (Boehnnger) в буфері PBS протягом 16 хвикулярного ендотелію по відношенню до білка лин Зрізи повторно фіксували в 4% формальдегіді RANTES після активації ендотеліальних клітин Всі протягом 5 хвилин і ацетилювали (0,25% оцтовий експерименти проводилися чотири рази по чотири, ангідрид в 0,1М триетаноламші, 10 хвилин) Для і результати, що демонструються представляють гібридизації in situ з міченої дигоксигеніном мРНК репрезентативну вибірку від трьох окремих ДОСЛІвикористали наступний гібридизаційний буфер 5х ДІВ стандартний розчин хлориду і цитрату натрію Аналіз клітинного сортінгу, що активується (SSC), 50% формамід, 50мкг/мл тРНК, 50мкг/мл флуоресценцією (FACS) гепарину і 0,1% додецилсульфат натрію Проточний цитометрічний аналіз дермальних мікроваскулярних клітин (DMVEC) проводили, в Після гібридизації при 56°С протягом 16 год основному, як описано (Weber С et al , 1995) Козрізи промивали однократно буфером 4xSSC і ротко клітини, що злилися DMVEC, стимульовані 2xSSC протягом 10 хвилин при 37°С з подальшим IL-lp (5нг/мл) або залишені необробленими протяпромиванням в 0,55xSSC протягом ЗО хвилин і 0,1 гом 12 годин, трипсинізували, вводили в реакцію з SSC при 22°С протягом 15 хвилин Інкубацію анштерлейкін-насичуючими концентраціями моноктидигоксигеншового антитіла і реакцію з лужною лопального антитіла (mAb) RR1/1 (люб'язно надафосфатазою проводили ВІДПОВІДНО ДО керівництва ного Dr R Rothlem) до антигену ІСАМ-1, монокловиробника (Boehnnger, Mannheim, Germany), виконального антитіла до Е-селектину і ристовуючи n-нітротетразолій синій і 5-бром-4моноклонального антитіла до антигену VCAM-1 хлор-3-шдолілфосфат як забарвлюючі реагенти (обидва антитіла від Serotec), або проводили ізо(StojanovicT etal, 1996, Simon M et al , 1995) типічний контроль протягом ЗО хвилин на льоду, Аналіз на захист від РНКази забарвленому за допомогою кон'югованого з флуЗагальну РНК виділяли з всієї нирки пацюка, оресцеїнізоціанатом (FITC) козячим антимишачим як описано раніше (Simon M et al , 1995) Досліди IgG (Boehnnger Mannheim) і аналізували FACScan по захисту від РНКази проводили з використанням (Becton Dickinson) Після поправки на неспецифічкомерційного набор) RP/V (PharMmgen, San не скріплення дані виражали у вигляді специфічної Diego, California, зонд rCK-1) Цей набір дозволяє середньої логарифмічної інтенсивності флуоресодночасно вимірювачії к зразках мРНК пацюка ILценції (SMFI) в каналах la, IL-lp, TNF-а, THF-p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL10 і TFN-y і конститутивні гени GAPDH і L32 Для Модельна система рекрутингу моноцитів на кожного визначення використали 20мкг загальної мікроваскулярному ендотелії in vitro при фізіологіРНК Захищені зразки проганяли на преформовачних умовах струму ному гелі (систему швидкого розділення нуклеїноВзаємодію моноцитів з клітинами DMVEC вивих кислот Quickpomt™ використали ВІДПОВІДНО ДО вчали в тестах ламінарного потоку, чшйстованих в рекомендацій виробника, фірми Novex, San Diego, основному, як описано (Weber С et al 1997, California) Інтенсивність специфічних смуг оцінюKukerti S et al 1997 Piah L et al , 1998) Коротко вали КІЛЬКІСНО, використовуючи прилад Molecular клітини DMVEC вирощували до злиття в чашках Dynamics Storm 840 Phosphonmager, стандартизоПетрі діаметром 35мм, стимулювали IL-lp (5нг/мл) ваний до експресії гена L32, і усереднювали по або залишали необробленими протягом 12 годин трьох аналізованих тваринах Чашки компонували у вигляді нижньої стінки в проточній камері з паралельними стінками і монАналіз скріплення in vitro тували ГІСТОЛОГІЧНІ зрізи на столику інвертованого Клітини DMVEC вирощування до злиття на 96мікроскопа Olympus IMT-2 з 20х і 40х об'єктивами лункових плоскодонних планшетах з покриттям фазового контрасту Монотипи (клітини МопоМас Ендотеліальний моношар, що утворюється або 6) культивували, як повідомлено (Ziegler-Heitbrock залишали необробленим, або обробляли різними H W L et al , 1988, Weber C et al, 1993) і знову концентраціями IL-lp (від 0,1 до 5нг/мл) протягом суспендували при 106/мл в аналітичному буфері 12 годин, Аналіз скріплення RANTES був модифі(HBSS), що містить ЮмМ Hepes, pH 7,4 і 0,5% кацією описаної раніше методики (Pattison J et a) , HSA Незадовго до аналізу додавали 1мМ Мд2+ і 1994 Wiedermam С J et al , 1993) Кон'юговане з 1мМ Са 2+ У ХОДІ аналізу КЛІТИННІ суспензії витрипероксидазою хрону (HRP) моноклональне антитімували в нагрівальному блоці при 37°С і перфузуло проти людського RANTES (VL1, 0,1 мкг) преінкували в проточну камеру при ШВИДКОСТІ 1,5ДИН/СМ2 бували при 25°С протягом ЗО хвилин з надлишком протягом 5 хвилин У дослідах по інгібуванню морекомбінантного людського RANTES (20мкг/мл) в ноцити заздалегідь інкубували з Met-RANTES при ростовому середовищі DMVEC (без добавок) Дорізних концентраціях (0,01-1мкг/мл) протягом ЗО давали комплекс хемокш-антитіло, потім аналізухвилин на льоду КІЛЬКІСТЬ МІЦНО прикріплених клівали відносну хемокш-зв'язуючу здатність мікро 14 13 60379 тин після п'ятого потоку визначали КІЛЬКІСНО В Найбільш виражені ефекти обробки Met-RANTES множинних полях (щонайменше, п'ять на експерипідсумовані в таблиці 2 Дані демонструють значне мент) за допомогою видеоаналізу, записаного відзменшення судинного пошкодження і показника еокамерою тривалого накопичення JVC 3CCD і за тубулярного відторгнення у тварин, оброблених з допомогою відео магнітофон a JVC SR L 900E, і Met-RANTES, в порівнянні з тим, що спостеріга2 виражали в клітинах/мм Тип адгезії, що аналізується у необроблених тварин У той час, як загається був обмежений первинними, тобто прямими льна тенденція, що стосується оцінки штерстиціавзаємодіями моноцитів з ендотелієм Як взаємольного відторгнення, свідчить про явне зниження у зворотного вимірювання стійкої затримки, КІЛЬКІСТЬ оброблених Met-RANTES тварин, вона не може КЛІТИН, що рухаються при зниженій швидкості по розглядатися як статистично значуща (критерій ендотелію, визначали протягом останніх ЗО сесуми рангів Манра-Уітні У-Уїлкоксона) кунд п'ятихвилинних інтервалів і оцінювали в проДля того, щоб оцінити вплив Met-RANTES на центах від всіх взаємодій в даному полі КІЛЬКІСТЬ процес відторгнення, досліджували ГІСТОЛОГІЧНІ КЛІТИН, що розповсюджуються або трансмігруючих зрізи і імунопстохімічне забарвлення Нирки видавизначали з п'ятихвилинними інтервалами в полях ляли через сім днів після трансплантації і препависокого розрізнення, як описано (Luscmskas FW рували, як описано в розділі Матеріали і методи et al , 1994) і виражали в проценшх під міцно приУ необроблених нирках спостерігали судинне кріплених клітин пошкодження з наявністю моноядерних клітин в просвіті і СТІНЦІ артерій У протилежність цьому, у Статистичний аналіз тварин, оброблених Met-RANTES, судинне відторЗначення ±SEM представляли ms roman Стагнення не виявлялося В штерстиціальній області у тистичний аналіз проводили, використовуючи кринеоброблених тварин спостерігалася інфільтрація терій суми рангів Манна-Уітні У-Уїлкоксона Знавеликого числа темнозабарвленйх моноядерних чення р