Сполука 3-заміщеного-[1,2,3]-бензотриазинону для покращення глутаматергічних синаптичних реакцій

1. Сполука формули: C2 2 (19) 1 3 Даний винахід стосується сполуки, фармацевтичних композицій і способів застосування у попередженні і лікуванні церебральної недостатності, включаючи покращення функціонування рецепторів в синапсах в сітках мозку, відповідальних за поведінку вищого порядку. Ці сітки мозку, які залучені у пізнавальні здібності, пов'язані з порушеннями пам'яті, такими, які спостерігаються при старінні і різноманітних формах недоумства, при порушеннях нейронної активності між різними ділянками мозку, що передбачається при таких розладах, як хвороба Паркінсона, шизофренія, дефіцит уваги і розлади настрою, і при розладах, при яких мається дефіцит нейротрофічних факторів. В окремому втіленні, даний винахід стосується сполук, корисних для лікування таких станів, і способів застосування цих сполук для такого лікування. Ця заявка запитує пріоритет попередніх заявок США US60/878,503, поданої 3 лютого 2007 року і US60/921,433, поданої 2 квітня 2007 року, відповідні частини цих заявок включені в дану заявку як посилання. Вивільнення глутамату у синапсів в багатьох ділянках переднього мозку ссавців стимулює два класи постсинаптичних, іонотропних рецепторів. Ці класи зазвичай називають рецепторами АМРА/квісквалату і N-метил-D-аспарагінової кислоти (NMDA). АМРА/квісквалатні рецептори опосередковують незалежний від напруги швидкий збуджувальний постсинаптичний струм (швидкий (EPSC), тоді як NMDA рецептори створюють залежний від напруги повільний збуджувальний струм. Дослідження, проведені на зрізах гіпокампу або кори головного мозку, показують, що АМРА-рецептор, який опосередковує швидкий EPSC, зазвичай являє собою домінантну компоненту більшості глутаматергічних синапсів. АМРА-рецептори не розповсюджені рівномірно по мозку, а скоріше і головним чином обмежені кінцевим мозком і мозочком. Ці рецептори знайдені у високих концентраціях у поверхневих шарах неокортексу, в кожній з основних синаптичних зон гіпокампу і в стріарному комплексі, як повідомляли Monaghan et al. в Brain Research, 324:160-164 (1984). Дослідження на тваринах і людях показують, що ці структури організовують комплексні перцептивно-моторні процеси і надають основу для поведінки вищого порядку. Так, АМРАрецептори опосередковують передачу в ті сітки мозку, які відповідають за пізнавальні активності індивідууму. З цих причин ліки, які модулюють і, таким чином, підсилюють функціонування АМРАрецепторів, можуть чинити значний сприятливий вплив на інтелектуальні характеристики. Такі ліки повинні також полегшувати кодування пам'яті. Експериментальні дослідження, такі як ті, про які повідомляли Aria and Lynch, Brain Research, 598:173-184 (1992), показують, що збільшення інтенсивності опосередкованих АМРА-рецептором синаптичних реакцій підсилює індукування довготривалого потенціювання (LTP). LTP стабільно підвищує міцність синаптичних контактів, які виника 93306 4 ють після повторної фізіологічної активності такого типу, який, як відомо, відбувається в мозку під час навчання. Сполуки, які підсилюють функції АМРА форм глутаматних рецепторів, полегшують індукування LTP і накопичення задач навчання у гризунів і людей, як визначено у ряді прикладів. Дивіться, наприклад, Granger et al., Synapse, 15:326-329 (1993); Staubli et al., PNAS, 91:777-781 (1994); Arai et al., Brain Res., 638:343-346 (1994); Staubli et al., PNAS, 91:11158-11162 (1994); Shors et al., Neurosci., 186:153-156 (1995); Larson et al., J. Neurosci., 15:8023-8030 (1995); Granger et al., Synapse, 22:332-337 (1996); Arai et al., JPET, 278: 627-638 (1996); Lynch et al. Internat. Clin. Psychopharm. 11:13-19 (1996); Lynch et al., Exp. Neurology 145:89-92 (1997); Ingvar et al., Exp. Neurology 146:553-559 (1997); Hampson, et al., J. Neurosci. 18:2748-2763 (1998); Porrino et al., PLoS Biol 3(9): 1-14 (2006) і Lynch and Rogers, US Patent 5,747,492. Існує велика кількість доказів, які демонструють, що LTP являють собою основу пам'яті. Наприклад, сполуки, які блокують LTP, порушують створення пам'яті у тварин, і деякі ліки, які порушують навчання у людей, перешкоджають стабілізації LTP, про що повідомляли Cerro and Lynch, Neuroscience, 49:1-6 (1992). Вивчення простого завдання індукує LTP в гіпокампі, що перешкоджає LTP, генерованому високочастотною стимуляцією (Whitlock et al., Science 313:1093-1097 (2006)), і механізм, що підтримує LTP, підкріплює просторову пам'ять (Pastalkova, et al., Science 313:1141-1144 (2006)). Надзвичайно важливим для галузі навчання є винайдення того, що in vivo лікування позитивним модулятором глутаматних рецепторів типу АМРА відновлює стабілізацію базального дендритного LTP у тварин середнього віку (Rex, et al., J. Neurophysiol. 96:677-685 (2006)). Синаптична передача збудження забезпечує головний шлях, по якому нейротрофічні фактори збільшуються на певних ділянках мозку. Було знайдено, що як таке, потенціювання функцій АМРА-рецепторів за допомого модуляторів збільшує рівні нейротрофінів, зокрема нейротрофічного фактору головного мозку, або BDNF. Дивіться, наприклад, Lauterborn, et al., J. Neurosci. 20:8-21 (2000); Gall, et al., U.S. Patent 6,030,968; Lauterbom, et al., JPET 307:297-305 (2003); і Mackowiak, et al., Neuropharmacology 43: 1-10 (2002). Інші дослідження пов'язують рівні BDNF з різними неврологічними розладами, такими як хвороба Паркінсона, синдром дефіциту уваги з гшерактивністю (ADHD), аутизм, синдром ламкої Х-хромосоми і синдром Ретта (RTT). Дивіться, наприклад, O'Neill, et al., Eur. J. Pharmacol. 486: 163-174 (2004); Kent, et al., Моl. Psychiatry 10:939-943 (2005); Riikonen, et al., J. Child Neurol. 18:693-697 (2003) і Chang, et al., Neuron 49:341-348 (2006). Таким чином, потенціатори АМРА-рецпторів можуть бути корисними у лікуванні цих, а також інших неврологічних розладів, що є результатом порушення балансу глутаматергічної системи або дефіціту нейротрофічних факторів. 5 Прототип сполуки, що підсилює функціонування АМРА-рецепторів, був описаний Ito et al., J. Physiol., 424:533-543 (1990). Ці автори виявили, що ноотропний лікарський засіб анірацетам (Nанізоїл-2-піролідинон) підсилює струми, опосередковані АМРА-рецепторами мозку, експресованими в ооцити Xenopus, не порушуючи реакцій, які викликаються гамма-аміномасляною кислотою (GABA), каїновою кислотою (КА) або NMDAрецепторами. Було також показано, що інфузія анірацетаму у зрізи гіпокампу підвищує величину швидких синаптичних потенціалів, не змінюючи властивостей мембран, що знаходяться у спокої. З тих пір було отримане підтвердження того, що анірацетам підсилює синаптичні реакції на деяких ділянках гіпокампу і що він не впливає на опосередковані NMDA-рецептором потенціали. (Staubli et al., Psychobiology, 18:377-381 (1990) і Xiao et al., Hippocampus, 1: 373-380 (1991)). Було знайдено, що анірцацетам швидко діє і швидко виводиться і його можна використовувати повторно без видимих тривалих ефектів, що є досить бажаною властивістю для ліків, пов'язаних з поведінкою. Проте, анірацетам має декілька недоліків. Периферичне введення анірацетаму, певно, не впливає на рецептори мозку. Лікарський засіб діє тільки при високих концентраціях (приблизно 1,0 мМ) і близько 80% лікарського засобу перетворюється в анізол-GABA після переферичного введення людині (Guenzi and Zanetti, J. Chromatogr., 530:397-406 (1990). Було знайдено, що цей метаболіт, анізол-GABA, має меншу активність, ніж анірацетам. В доповнення до цього, анірацетам має уявний вплив на велику кількість інших нейротрансмітерів і ензиматичних мішеней в мозку, що робить непевним механізм дії будь-якого заявленого терапевтичного лікарського засобу. Дивіться, наприклад, Himori, et al., Pharmacology Biochemistry and Behavior 47:219-225 (1994); Pizzi et al., J. Neurochem. 61:683-689 (1993); Nakamura and Shirane, Eur. J. Pharmacol. 380:81-89 (1999); Spignoli and Pepeu, Pharmacol. Biochem. Behav. 27:491-495 (1987); Hall and Von Voigtlander, Neuropharmacology 26:1573-1579(1987); and Yoshimoto et al., J. Pharmacobiodyn. 10:730735(1987). Був описаний клас сполук, які модулюють АМРА-рецептори, який не демонстрував характеристик низької ефективності і нестабільності, властивих анірацетаму (Lynch and Rogers, US Patent 5,747,492). Ці сполуки, які називають "AMPAKINES"®, являють собою бензаміди, які включають, наприклад, 1-(1,3-бензодіоксол-5ілкарбоніл)піперидин (СХ516; Ampalex®). Зазвичай, вони хімічно більш стабільні, ніж анірацетам, і проявляють підвищену біодоступність. СХ516 є активним у тестах на тваринах, використаних для визначення ефективних лікарських засобів для лікування розладів пам'яті, шизофренії і депресії. В трьох окремих клінічних дослідженнях СХ516 проявив доказ своєї ефективності у покращенні різноманітних форм пам'яті людини (Lynch et al., Internat. Clin. Psychopharm. 11:13-19 (1996); Lynch et al., Exp. Neurology 145:89-92 (1997); Ingvar et al., Exp. Neurology 146:553-559 (1997)). 93306 6 Як було нещодавно виявлено, інший клас Ампакінів, бензоксазини, мають дуже високу активність в моделях in vitro та in vivo для оцінки вірогідності досягнення покращення пізнавальних здібностей (Rogers and Lynch; US Patent 5,736,543). Заміщені бензоксазини являють собою аналоги стійкого бензаміду з іншими рецептор модулюючими властивостями у порівнянні з гнучким бензамідом, СХ516. Було виявлено, що сполуки деяких заміщених бензофуразанів і бензотіадіазолів є значно і несподівано більш ефективними в моделях шизофренії на тваринах, ніж сполуки, про які йшла мова раніше, і є також більш ефективними стосовно покращення пізнавальних здібностей. Ці сполуки є структурно подібними до тих, які розкрито у Lynch and Rogers, US Patent 5,736,543. Попередньо розкриті структури, які містять 1,3бензоксазин-4-оновий фармакофор, були заміщені на бензольній частині гетероатомами, такими як азот або кисень (US Patents Nos. 5,736,543 and 5,962,447), заміщеними алкільними групами (US Patents Nos. 5,650,409 and 5,783,587), або незаміщені (WO 99/42456). Ще інший клас сполук 1,3бензоксазину містив карбоніл, зовні по відношенню до оксазинового кільця (US Patent No. 6,124,278), але не як замісник на структурі бензольного кільця. Тепер було виявлено новий клас сполук триазинону, які проявляють значну активність щодо синаптичних реакцій гіпокампу і нервових цільноклітинних струмів, опосередкованих АМРА-рецепторами. З-Заміщені сполуки бензо[1,2,3]триазин-4-ону є потужними модуляторами АМРА-рецепторів, які є значно більш метаболічно стабільними, ніж відповідні біс-бензоксазинони. Біологічна активність триазинонів була неочікуваною, а потужність на АМРА-рецепторах - несподівано високою; найбільш потужні триазинони в цьому класі подвоюють струми АМРА-рецепторів вже при концентраціях 3 нМ. Сполука бензо[1,2,3]триазин-4-ону як модулятор АМРАрецепторів розкрита тут нижче. Даний винахід включає, в одному з аспектів, сполуку, як представлено структурною формулою І і описано в розділі II докладного опису, який викладено нижче. Введення сполук цього класу, як було виявлено, підсилює синаптичні реакції, опосередковані АМРА-рецепторами. Сполука за даним винаходом є значно і несподівано більш ефективною, ніж описані раніше сполуки, щодо підсилення функцій AMPΑ-рецепторів у первинних нейрональних культурах і зрізах гіпокампу щурів, і щодо підвищення характеристих пізнавальних здібностей, таких як поведінка відкладеного вибору за зразком. Ця неочікувана активність втілюється у фармацевтичні сполуки і відповідні способи застосування, включаючи способи лікування, при яких використовують значно нижчі концентрації (в перерахунку моль-на-моль) сполук за даним вина 7 ходом у порівнянні до композицій з попереднього рівня техніки. Здатність сполук за даним винаходом підсилювати опосередковані АМРА-рецептором реакції робить ці сполуки корисними для різноманітних цілей. Вони включають полегшення вивчення поведінки, залежної від глутаматних рецепторів, лікування станів, при яких знижена кількість або ефективність АМРА-рецепторів або синапсів, які використовують ці рецептори, і підсилення активності збуджувальних синапсів для відновлення порушеного балансу між субділянками мозку або збільшення рівнів нейротрофічних факторів. В іншому аспекті винахід включає спосіб лікування ссавців, які страждають від гіпоглутаматергічного стану або від дефіциту кількості або ефективності збуджувальних синапсів, або кількості АМРА-рецепторів, такого, при якому порушується пам'ять або інші пізнавальні функції. Такі стани можуть також бути причиною кортико-стриарного дисбалансу, що приводить до шизофренії або шизофреноподібної поведінки. Відповідно до способу за даним винаходом пацієнта лікують ефективною кількістю сполуки, продемонстрованої структурною формулою І і як розкрито в розділі II детального опису, що викладено нижче, у фармацевтично прийнятному носії. Ці та інші цілі і особливості даного винаходу стануть більш очевидними після вивчення докладного опису винаходу з посиланням на креслення, що додаються. І. Визначення Наведені нижче терміни мають наступні значення, якщо немає інших вказівок. Інші терміни, які були використані з метою опису даного винаходу, мають ті ж визначення, що і терміни, які загально використовуються кваліфікованим в даній галузі фахівцем. Термін "алкіл" стосується повністю насиченого одновалентного радикалу, який містить вуглець і водень, який може бути нерозгалуженим, розгалуженим або циклічним ланцюгом. Прикладами алкільних груп є метил, етил, н-бутил, н-гептил, ізопропіл, 2-метилпропіл, циклопропіл, циклопропілметил, циклобутил, циклопентил, циклопентилетил і циклогексил. Термін «алкеніл» стосується одновалентного радикалу, який містить вуглець і водень, який включає одну або дві ділянки ненасичення, який може бути нерозгалуженим, розгалуженим або циклічним ланцюгом. Прикладами алкенільних груп є етеніл, н-бутеніл, н-гептеніл, ізопропеніл, циклопентеніл, циклопентенілетил і циклогексеніл. Термін «заміщений алкіл» стосується алкілу, як вже було описано, який включає одну або більше функціональних груп, таких як нижчий алкіл, який містить 1-6 атомів вуглецю, арил, заміщений арил, ацил, галоген (тобто галоалкіли, наприклад, CF3), гідрокси, алкокси, алкоксіалкіл, аміно, алкіл і діалкіл аміно, ациламіно, ацилокси, арилокси, арилоксіалкіл, карбоксіалкіл, карбоксамідо, тіо, тіоефіри, як насичені, так і ненасичені циклічні вуглеводні, гетероцикли і подібне. Термін «арил» стосується заміщеного або незаміщеного одновалентного ароматичного ради 93306 8 калу, який містить окреме кільце (наприклад, феніл) або декілька конденсованих кілець (наприклад, нафтил). Інші приклади включають гетероциклічні ароматичні кільцеві групи, які містять в кільці один або більше атомів азоту, кисню або сірки, такі як оксазоліл, ізоксазоліл, піразоліл, тіазоліл, тіадіазоліл, тетразоліл, піридазиніл, піримідил, бензофурил, бензотієніл, бензімідазоліл, бензоксазоліл, бензотіазоліл, хіноліл, ізохіноліл, імідазоліл, фурил, піроліл, піридил, тієніл та індоліл. Термін «заміщений», як використано у терміні «заміщений арил, заміщений ароматичний, заміщений гетероарил або заміщений гетероароматичний», означає, що може бути присутнім один або більше замісників, вказані замісники вибирають з атомів і груп, які, коли присутні, не перешкоджають сполуці функціонувати як потенціатор функцій АМРА-рецепторів. Приклади замісників, які можуть бути присутніми у заміщеній ароматичній або гетероароматичній групі, включають, але не обмежуються цим, групи, такі як (С1-С7)алкіл, (С1С7)ацил, арил, гетероарил, заміщений арил і гетероарил, галоген, ціано, нітро, (С1-С7)галоалкіли (наприклад, CF3), гідрокси, (С1-С7)алкокси, алкоксіалкіл, аміно, алкіл і діалкіламіно, ациламіно, ацилокси, арилокси, арилоксіалкіл, карбоксіалкіл, карбоксамідо, тіо, тіоефіри, як насичені, так і ненасичені (С3-С8)циклічні вуглеводні, (С3С8)гетероцикли і подібне. «Гетероцикл» або «гетероциклічний» стосується карбоциклічного кільця, в якому один або більше атом заміщені одним або більше гетероатомами, такими як азот, кисень або сірка. Приклади гетероциклів включають, але не обмежуються цим, піперидин, піроділин, морфолін, тіоморфолін, піперазин, тетрагідрофуран, тетрагідропіран, 2піролідинон, δ-велеролактам, δ-велеролактон і 2кетопіперазин. Термін «сполука» використовують при посиланні на будь-яку специфічну хімічну сполуку, розкриту в даному описі. В рамках використання терміну у контексті, він загалом посилається на саму сполуку, але у деяких випадках він може стосуватись стереоізомерів і/або оптичних ізомерів (включаючи рацемічні суміші) розкритих сполук. Термін «ефективна кількість» стосується кількості вибраної сполуки формули І, яку використовують для підсилення глутаматергічної синаптичної реакції в результаті підсилення АМРАрецепторної активності. Необхідна точна кількість буде змінюватись в залежності від конкретної вибраної сполуки і її застосування, віку і ваги пацієнта, способу введення і т.д., але її можна легко визначити за допомогою звичайних експериментів. У випадку лікування стану або захворювання ефективною кількістю буде та кількість, яку використовують для ефективного лікування конкретного стану або захворювання. Термін «фармацевтично прийнятний носій» стосується носія або ексципієнта, який не є токсичним для пацієнта, якому його вводять. Фармацевтично прийнятні ексципієнти докладно описані T.W. Martin у "Remington's Pharmaceutical Science". «Фармацевтично прийнятна сіль» амінової сполуки, така як ті, що розглядаються в даному 9 винаході, являє собою сіль амонію, яка має як протиіон неорганічний аніон, такий як хлорид, бромід, йодид, сульфат, нітрат, нітрит, фосфат і подібне, або органічний аніон, такий як ацетат, малонат, піруват, пропіонат, фумарат, цинамат, тозилат і подібне. Термін «пацієнт» або «суб'єкт» використовують в даній заявці для опису тварини, зазвичай, ссавця, включаючи людину, до якої застосовують лікування або застосування сполук або композицій за даним винаходом. При лікуванні або застосуванні при/або тих станів або захворювань, які є специфічними для специфічних тварин (особливо, наприклад, людина як суб'єкт або пацієнт), термін пацієнт або суб'єкт стосується конкретної тварини. Термін «сенсомоторні порушення» використовують для опису порушень, які виникають у пацієнта або суб'єкта через нездатність скласти в єдине ціле зовнішню інформацію, яка походить від п'яти відомих відчуттів, таким чином, щоб спонукати відповідні фізичні реакції, які включають рух і дію. Термін «задача пізнавального характеру» або «пізнавальна функція» використовують для опису прагнення або процесу, спричиненого пацієнтом або суб'єктом, який залучає мишлення і знання. Різноманітні функції асоціативної зони кори тім'яної, скореневої і лобової долі, що складають приблизно 75% всієї мозкової тканини людини, відповідальні за більшу частку обробки інформації, яка проходить між сенсорним входом і виходом рухового нерву. Різноманітні функції асоціативної зони кори часто називають пізнанням, що буквально означає процес, за яким ми знайомимось зі світом. Вибіркове звертання уваги на окремі подразнювачі, розпізнавання та ідентифікування характеристик цих відповідних подразнювачів і планування і переживання реакцій являють собою деякі з процесів або здібностей, опосередкованих людським мозком, які пов'язані з пізнанням. Термін «сітка мозку» використовують для опису різних анатомічних ділянок мозку, які контактують одна з одною через синаптичну активність нейронних клітин. Термін «АМРА-рецептор» стосується сукупності білків, знайдених у деяких мембранах, які дозволяють позитивним іонам проникати у мембрану у відповідь на зв'язування з глутаматом або АМРА (DL--аміно-3-гідрокси-5-метил-4ізоксазолпропіонова кислота), але не NMDA. Термін «збуджувальний синапс» використовують для опису з'єднання клітина-клітина, при якому вивільнення хімічного месенджера однією клітиною викликає деполяризацію зовнішньої мембрани іншої клітини. Збуджувальний синапс характеризує постсинаптичний нейрон, який має потенціал реверсії, який є більш позитивним, ніж пороговий потенціал і, відповідно, в такому синапсі нейромедіатор збільшує можливість того, що виникне збуджувальний постсинаптичний потенціал (нейрон «згорить», виробляючи потенціал дії). Потенціали реверсії і порогові потенціали визначають постсинаптичне збудження та інгібування. Якщо потенціал реверсії для постсинаптичного потенціалу («PSP») є більш позитивним, ніж порог потенціалу дії, вплив медіатора буде збуджуваль 93306 10 ним і буде продукувати збуджувальний постсинаптичний потенціал («EPSP») і «спалення» нейроном потенціалу дії. Якщо потенціал реверсії для постсинаптичного потенціалу є більш негативним, ніж порог потенціалу дії, медіатор буде гальмівним і може генерувати гальмівний постсинаптичний потенціал («IPSP»), таким чином знижуючи вірогідність того, що синапс «спалить» потенціал дії. Загальне правило постсинаптичної дії наступне: якщо потенціал реверсії є більш позитивним, ніж пороговий, виникає збудження; гальмування виникає, якщо потенціал реверсії є більш негативним, ніж пороговий. Дивіться, наприклад, Розділ 7, NEUROSCIENCE, опублікований Dale Purves, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA 1997. Термін «завдання на моторику» використовують для опису намагання пацієнта або суб'єкта, що залучає рух або дію. Термін «завдання на сприйняття» використовують для опису дії пацієнта або суб'єкта щодо приділення уваги припливу сенсорних чутливих імпульсів «сенсорний вхід». Термін «синаптична реакція» використовують для опису біофізичних реакцій в одній клітині як наслідок вивільнення хімічних месенджерів іншою клітиною, з якою вона знаходиться у тісному контакті. Термін «гіпоглутаматергічний стан» використовують для опису стану, при якому передача, опосередкована глутаматом (або пов'язаними збуджувальними амінокислотами), знижена до рівня, нижче нормального. Передача складається з вивільнення глутамату, зв'язування з постсинаптичними рецепторами і відкриття каналів, які є невід'ємною частиною цих рецепторів. Кінцевим результатом гіпоглутаматергічного стану є ослаблений збуджувальний постсинаптичний струм. Він може виникнути на будь-якій із зазначених фаз передачі. Стани або захворювання, які вважаються гіпоглутаматергічними станами і які можуть лікуватись з використанням сполук, композицій і способів за даним винаходом, включають, наприклад, втрату пам'яті, недоумство, депресію, розлади уваги, сексуальну дисфункцію, порушення рухів, включаючи хворобу Паркінсона, шизофренію або шизофреноподібну поведінку, розлади пам'яті і навчання, включаючи ті розлади, які виникають через старіння, травми, інсульт і нейродегенеративні захворювання, такі, як асоційовані зі станами, викликаними дією наркотиків, нейротоксичних агентів, хворобу Альцгеймера і старіння. Такі стани легко розпізнаються і діагностуються кваліфікованими в даній галузі фахівцями. Термін «кортико-стриарний дисбаланс» використовують для опису стану, при якому баланс нейронних активностей у зв'язаних корі головного мозку і стриарному комплексі, що лежіть під нею, відклоняється від того, що вважається нормальним. «Активність» можна оцінити за допомогою електричного зчитування або молекулярнобіологічних методів. Дисбаланс може бути підтверджений шляхом застосування цих методик до двох структур або шляхом застосування функціонального (поведінкового або психологічного) критерію. 11 Термін «афективний розлад» або «розлад настрою» описує стан, коли смуток або радість - занадто сильно виражені і тривають довше очікуваного прояву стресової життєвої події або виникають ендогенно. Як використано в даному описі термін «афективний розлад» включає всі типи розладів настрою, як описано, наприклад, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition (DSM IV), pages 317-391. Термін «шизофренія» використовують для опису стану, який являє собою звичайний тип психозу, який характеризується розладами у розумовому процесі, такими як марення і галюцинації, поширена втрата інтересу індивідууму до інших людей і зовнішнього світу, і замкненість. Шизофренію зараз розглядають як групу розумових розладів, а не як єдине захворювання, і відмінність проводять між гострою і безперервно протікаючою шизофреніями. Як використано в даному описі термін «шизофренія» або «шизофреноподібний» охоплює всі типи шизофренії, включаючи амбулаторну шизофренію, кататонічну шизофренію, гебефренію, латентну шизофренію, безперервно протікаючу шизофренію, псевдоневротичну шизофренію, гостру шизофренію, просту шизофренію і пов'язані психотичні розлади, які є подібними до шизофренії, але які не діагностують обов'язково безпосередньо як шизофренію. Шизофренія та інші психотичні розлади можуть бути діагностовані, використовуючи керівництва, викладені, наприклад, у Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition (DSM IV) Sections 293.81, 293.82, 295.10, 295.20, 295.30, 295.40, 295.60, 295.70, 295.90, 297.1, 297.3, 298.8. Термін «функція мозку» використовують для опису комбінованих завдань сприйняття, об'єднання, фільтрування і відповіді на зовнішні подразники і внутрішні мотиваційні процеси. Термін «ослаблені» використовуються для опису функції, яка виконується на рівні, нижчому ніж нормальний. Ослаблені функції можуть значним чином бути піддані впливу так, що функція майже не буде виконуватись, буде віртуально неіснуючою або буде виконуватись на рівні, який значно нижче нормального. Ослаблені функції можуть також бути недостатньо оптимальними. Ослаблення функції буде змінюватись щодо своєї тяжкості від пацієнта до пацієнта і в залежності від стану, який будуть лікувати. II. Сполуки, які підсилюють функції АМРАрецепторів Даний винахід в одному зі своїх аспектів спрямований на сполуки, які мають властивості підсилювати функції АМРА-рецепторів. Ці сполуки мають структурну формулу І, представлену нижче: Синтез сполуки за даним винаходом, 8циклопропіл-3-[2-(3-фторфеніл)етил]-7,8-дигідро3Н-[1,3]оксазино[6,5-g][1,2,3]бензотриазин-4,9 93306 12 діону, переважно проводять за наступною схемою синтезу, в якій синтез заміщеного саліциламіду є добре відомим у галузі органічного синтезу: На Схемі 1 стадію А можуть проводити при звичайних умовах, серед яких - каталізована кислотою вставка синтону формальдегіду. Наприклад, саліциламід (1) розчиняють і нагрівають у придатному органічному розчиннику разом із триоксаном і сірчаною або хлористоводневою кислотою. Стадія В являє собою реакцію нітрування, яку можуть проводити при помірних умовах, відомих кваліфікованому в галузі органічного синтезу фахівцю і детально викладених в таких роботах як Reagents for Organic Synthesis (Fieser and Fieser) і Organic Syntheses (дивіться веб-сайт http://www.orgsyn.org/). Стадія С включає 2-етапне окислення метальної групи сполуки 3 до карбонової кислоти за допомогою проміжного альдегіду, залучаючи Ν,Ν-диметилформамід диметилацеталь і періодат натрію, а потім оксон. Стадія D включає зв'язування первинного аміну з нітрозаміщеною кислотою, що може бути здійснене з використанням різноманітних агентів зв'язування, відомих кваліфікованому у хімії фахівцю. Деякі необмежувальні приклади, які звичайно використовують, включають тіонілхлорид, оксалілхлорид або карбонілдіімідазол. Стадія Ε являє собою відновлення нітроароматичної сполуки до аніліну і може бути здійснена відновленням, використовуючи різноманітні каталізатори, включаючи, але не обмежуючись цим, Pd або Pt або нікель Ренея і водень або Zn/Cu. Стадія F утворює триазинонове кільце і її можуть проводити шляхом додавання ізоамілнітриту в ДМФ. Всі композиції, розкриті в даній заявці, можуть бути синтезовані за допомогою розкритих вище способів, застосовуючи аналогічні стадії синтезу до тих, що зокрема представлені у прикладах, розкритих тут, а також тих, що відомі в даній галузі техніки. Також заявляються всі їх адитивні солі з фармацевтично принятними кислотою або основою. III. Спосіб лікування Відповідно до одного з аспектів даного винаходу забезпечується спосіб лікування ссавців, що страждають від гіпоглутаматергічного стану або від недостатньої кількості або ефективності збуджувальних синапсів або кількості АМРАрецепторів. У такого суб'єкта пам'ять або інші пізнавальні функції можуть бути ослаблені або може виникати кортико-стриарний дисбаланс, що веде до втрати пам'яті, 13 недоумства, депресії, розладів уваги, сексуальної дисфункції, порушення рухів, шизофренії або шизофреноподібної поведінки. Розлади пам'яті і розлади навчання, які піддаються лікуванню відповідно до даного винаходу, включають ті розлади, які виникають через старіння, травми, інсульт і нейродегенеративні захворювання. Приклади нейродегенеративних захворювань включають, але не обмежуються цим, такі, як асоційовані зі станами, викликаними дією наркотиків, нейротоксичних агентів, хворобу Альцгеймера і старіння. Такі стани легко розпізнаються і діагностуються кваліфікованими в даній галузі фахівцями і лікуються шляхом введення пацієнту ефективної кількості однієї або більше сполук за даним винаходом. В даному винаході спосіб лікування включає введення суб'єкту, який цього потребує, у фармацевтично прийнятному носії ефективної кількості 8-циклопропіл-3-[2-(3-фторфеніл)етил]-7,8-дигідро3Н-[1,3]оксазино[6,5-g][1,2,3]бензотриазин-4,9діону наступної формули або його адитивної солі з фармацевтично прийнятною кислотою або основою. Як зазначено вище, лікування суб'єкта відповідно до способу за даним винаходом є корисним для підвищення активності АМРА-рецепторів, і, таким чином, таке лікування можна застосовувати для полегшення набуття навичок поведінки, що залежить від АМРА-рецепторів, а також лікувати стани, такі як порушення пам'яті, при яких кількість або ефективність АМРА-рецепторів або синапсів, які використовують ці рецептори, зменшена. Спосіб є також корисним для підсилення збуджувальної синаптичної активності для того, щоб відновити баланс між субділянками мозку, які можуть проявляти себе у шизофренії або шизофреноподібній поведінці, або іншій поведінці, як описано вище. Виявилось, що сполуки, введені відповідно до даного способу, є більш ефективними, ніж попередньо розкриті сполуки стосовно підсилення активності АМРА-рецепторів, як показано у in vitro та in vivo тестах, які розкриваються далі. IV. Біологічна активність: Підсилення AMPАрецепторної функції Синаптичні реакції, опосередковані АМРАрецепторами, підсилюються відповідно до способу за даним винаходом, з використанням описаної тут сполуки. Ця сполука, як продемонстровано, виявляється більш ефективною, ніж сполуки, описані раніше, стосовно підсилення АМРА опосередкованих клітинних струмів у культивованих нейронах. In vitro дослідження розкривають наступним чином. Кортикальні клітини одержують від 18-19 денних ембріональних щурів Sprague-Dawley і зчитують через 3 дні у культурі. Зовнішньоклітинний розчин (ECS) містить (у мМ): NaCl (145), КСl (5,4), HEPES (10), MgCl2 (0,8), СаСl2(1,8), глюкозу (10), сахарозу (30); рН: 7,4. Для того, щоб блокувати потенціалзалежні натрієві струми, додають 40нМ 93306 14 ТТХ до реєструвального розчину. Внутрішньоклітинний розчин містить (в мМ): К-глюконат (140), HEPES (20), EGTA (1,1), фосфокреатин (5), MgATP (3), GTP (0,3), MgCl2 (5), and СаСl2 (0,1); рН: 7,2. Всі тестові сполуки і глутаматні розчини були сформовані у зовнішньоклітинному розчині. Струм режиму «ціла клітина» вимірюють за допомогою патч-кламп підсилювача (Axopatch 200В), фільтрують при 2кГц, відцифровують при 5 кГц і записують на PC за допомогою pClamp 8. Потенціал клітин фіксують на -80 мВ. Розчини наносять за допомогою системи DAD-12. Базову реакцію кожної клітини реєструють, використовуючи 1 сек. імпульс 500 мкМ глутамату, розчиненого в ECS. Реакцію на тестову сполуку потім визначають шляхом застосування 10 сек. імпульсу тестової сполуки з наступним 1 сек. імпульсом тієї ж концентрації тестової сполуки плюс 500 мкМ глутамату і потім 10 сек. фізіологічного розчину. Цю послідовність імпульсів повторюють доти, доки не одержують стабільне зчитування, або доти, доки не визначають достатні експериментальні точки для того, щоб дозволити екстраполяцію до підрахованої максимальної зміни. Підраховують середнє значення плато струму між 600 мсек. до 900 мсек. після застосування глутамату або тестової сполуки плюс глутамат, і використовують його як параметр для вимірювання дії лікарського засобу. Реакції плато у присутності різноманітних концентрацій тестової сполуки розділяють відносно базової реакції для підрахунку збільшення у процентному співвідношенні. Сполуки вважають активними у даному тестуванні, якщо, при тестовій концентрації 3 мкМ або менше, вони продукують більше ніж 100% збільшення значення стаціонарного струму, виміряного завдяки застосуванню лише глутамату. Концентрацію, при якій індукований глутаматом струм збільшений на 100%, зазвичай називають ЕС2х значенням. Сполука за даним винаходом, 8-циклопропіл3-[2-(3-фторфеніл)етил]-7,8-дигідро-3Н[1,3]оксазино[6,5-g][1,2,3]бензотриазин-4,9-діон, має ЕС2х значення на рівні 0,1 мкМ. V. Способи введення, дозування і композиції Як зазначено вище, сполука і спосіб за даним винаходом підвищують реакції, опосередковані АМРА-рецептором, і можуть бути застосовані для лікування гіпоглутаматергічних станів. Сполука також є корисною для лікування таких станів, як порушення пам'яті або інших пізнавальних функцій, викликаних дефіцитом кількості або ефективності збуджувальних синапсів, або кількості АМРАрецепторів. Сполуку також можна застосовувати для лікування шизофренії або шизофренопобічної поведінки, яка виникає через кортико-стриальний дисбаланс, і для полегшення вивчення поведінки, що залежить від АМРА-рецепторів. У суб'єктів, яких лікують сполукою, фармацевтичними композиціями або способами за даним винаходом, пам'ять або інші пізнавальні функції можуть бути порушені, може виникати кортикостриарний дисбаланс, який веде до втрати пам'яті, недоумства, депресії, розладів уваги, сексуальної дисфункції, порушення рухів, шизофренії або шизофреноподібної поведінки. Розлади пам'яті і роз 15 лади навчання, які піддаються лікуванню відповідно до даного винаходу, включають ті розлади, які виникають через старіння, травми, інсульт і нейродегенеративні захворювання. Приклади нейродегенеративних захворювань включають, але не обмежуються цим, такі, як асоційовані зі станами, викликаними дією наркотиків, нейротоксичних агентів, хворобу Альцгеймера і старіння. Такі стани легко розпізнаються і діагностуються кваліфікованими в даній галузі фахівцями і лікуються шляхом введення пацієнту ефективної кількості однієї або більше сполук за даним винаходом. Зазвичай дози і способи введення сполук визначають відповідно до ваги і стану пацієнта, відповідно до стандартної фармацевтичної практики. Рівні дозувань, які використовують, можуть широко змінюватись, і їх може легко визначити фахівець. Зазвичай використовують кількості від міліграму аж до граму. Композицію можна вводити пацієнту різними способами, наприклад, перорально, трансдермально, періневрально або парентерально, тобто за допомогою внутрішньовенних, підшкірних, внутрішньочеревинних або внутрішньом'язових ін'єкцій, серед інших, включаючи букальне, ректальне і трансдермальне введення. Суб'єкти, яких можна лікувати відповідно до способу за даним винаходом, включають людей, домашніх тварин, лабораторних тварин і т.д. Композиції, які містять сполуку за даним винаходом, можуть мати форму твердих, напівтвердих, ліофілізованих порошків або рідких лікарських форм, наприклад, таких як таблетки, капсули, порошки, композиції із уповільненим вивільненням, розчини, суспензії, емульсії, супозиторії, креми, мазі, лосьйони, аерозолі, пластирі і т.п., переважно в одиничних лікарських формах, придатних для простого введення точного дозування. Фармацевтичні композиції за даним винаходом зазвичай включають традиційний фармацевтичний носій або ексципієнт і можуть додатково включати інші медичні агенти, носії, ад'юванти, домішки і т.п. Переважно, щоб композиція містила від 0,5 до 75% за вагою сполуки або сполук за даним винаходом, причому решту складають придатні фармацевтичні ексципієнти. Для перорального введення такі ексципієнти включають фармацевтичної міри чистоти маніт, лактозу, крохмаль, стеарат магнію, натрійсахарин, тальк, целюлозу, глюкозу, желатин, сахарозу, карбонат магнію і подібне. За бажання композиція може також містити невеликі кількості нетоксичних допоміжних речовин, таких як змочувальні агенти, емульгуючі агенти або буфери. Рідкі композиції можна приготувати, розчиняючи або диспергуючи сполуки (від близько 0,5% до близько 20%) і необов'язково фармацевтичні ад'юванти в носії, такому як, наприклад, водний фізіологічний розчин, водна декстроза, гліцерин або етанол, до утворення розчину або суспензії. Для застосування у рідких препаратах для перорального введення композицію можна приготувати у вигляді розчину, суспензії, емульсії або сиропу, які доставляються або у формі рідини, або у сухому вигляді, придатному для розчинення у воді або нормальному фізіологічному розчині. 93306 16 Якщо композицію використовують у формі твердих препаратів для перорального введення, ці препарати можуть бути таблетками, гранулами, порошками, капсулами і т.п. Для композицій у формі таблеток композицію звичайно приготовляють з домішками, наприклад, ексципієнтами, такими як сахарид або целюлоза, такими зв'язувальними речовинами, як крохмальна паста або метилцелюлоза, наповнювачами, розпушувачами та іншими домішками, які зазвичай використовують при виготовленні медичних препаратів. Композиції для ін'єкцій для парентерального введення зазвичай містять сполуку у придатному для внутрішньовенного введення розчині, такому як стерильний фізіологічний сольовий розчин. Композиція може бути також приготована у вигляді суспензії в ліпіді або фосфоліпіді, у ліпосомній суспензії або у водній емульсії. Способи одержання таких лікарських форм відомі або будуть очевидні фахівцям в даній галузі техніки: дивіться, наприклад, "Remington's Pharmaceutical Sciences" (17th Ed., Mack. Pub. Co, 1985). Композиція, призначена для введення, повинна містити кількість вибраної сполуки у фармацевтично ефективній кількості для здійснення підсилення АМРА-рецепторних струмів у пацієнта. Наступні приклади лише ілюструють винахід, але жодним чином не обмежують його. Якщо немає інших вказівок, всі температури представлені в градусах Цельсію. Якщо немає інших вказівок, всі ЯМР спектри являють собою 1Н ЯМР спектри і одержані в дейтерохлороформі або дейтерованому DMSO як розчиннику з використанням як внутрішнього стандарту тетраметилсилану. Найменування сполуки прикладу відповідає номенклатурі IUPAC відповідно до програмного забезпечення ChemSketch від ACD Labs. Приклад 1 8-Циклопропіл-3-[2-(3-фторфеніл)етил]-7,8дигідро-3Н-[1,3]оксазино[6,5-g] [1,2,3]бензотриазин-4,9-діон 4-Метилсаліцилову кислоту (21,3 г, 140 ммоль) розчиняють в метиленхлориді (120 мл) з наступним додаванням CDI (22,7 г, 140 ммоль) частинами. Суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 24 год. і потім коротко нагрівають до кипіння. Розчин циклопропіламіну (8,0 г, 140 ммоль) в триетиламіні (5 мл, 36 ммоль) додають до суміші, яку перемішують протягом 3 днів. Додають воду (200 мл) і рН доводять до 2, використовуючи 12М хлористоводневу кислоту. Фази розділяють і водну фазу екстрагують хлороформом (200 мл). Об'єднані органічні фази промивають розчином бікарбонату натрію (100 мл) і висушують над сульфатом натрію. Концентрування дає 22,7 г аміду як тверду речовину білуватого кольору. Амід (22,7 г, 119 ммоль) і триоксан (36 г, 0,4 моль) розчиняють в хлороформі (250 мл), який перемішують при кімнатній температурі. Додають сульфат натрію 17 (32 г) і концентровану сірчану кислоту (80 крапель) і суміш нагрівають зі зворотним холодильником протягом 30 хвилин, після чого додають додаткові 40 крапель концентрованої сірчаної кислоти. Через 90 хвилин тверді речовини видаляють шляхом фільтрування і промивають етилацетатом. Об'єднані розчинники видаляють у вакуумі для одержання 30 г олії. Олію очищують, використовуючи флеш-хроматографію (250 г силікагелю, етилацетат:гексан 30:70, потім 40:60) для одержання 20,1 г 7-метилбензоксазинону як безбарвної олії. Бензоксазинон (16 г, 79 ммоль) розчиняють в метиленхлориді (200 мл), до якого додають оцтову кислоту (30 мл). Суміш потім охолоджують до ~0°С, використовуючи льодяну баню, і азотну кислоту (14 мл, 90%) додають краплями протягом 15 хвилин, що дає оранжевий розчин. Реакційну суміш перемішують протягом 90 хвилин і потім виливають на подрібнений лід/воду (300 мл). Повільно додають розчин гідроксиду натрію доти, доки рН не досягне 5. Реакційну суміш екстрагують хлороформом (200 мл), висушують над сульфатом натрію і концентрують у вакуумі до 40 мл. Додають етилацетат (200 мл) і суміш концентрують у вакуумі до 60 мл. Утворені кристали відфільтровують для одержання 8,1 г (33 ммоль, вихід = 41%) бажаного 6-нітроізомеру як тверду речовину білуватого кольору. Вихідний розчин концентрують і ще більше продукту кристалізується (1,2 г) як тверда речовина білуватого кольору. Після цього ще 5 г змішаних ізомерів виділяють з вихідного розчину, цю суміш використовують на наступній стадії. Змішані ізомери у формі твердих речовин з попередньої стадії (5 г, 20 ммоль) суспендують в Ν,Ν-диметилформамід диметилацеталі (30 мл) і DMF (10 мл) і нагрівають до 125°С протягом 16 годин. Розчинник видаляють у вакуумі для одержання залишку темнокоричневого кольору, який перемішують протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Щільну суспензію бежевого кольору екстрагують хлороформом (200 мл), висушують над сульфатом натрію і розбавляють етилацетатом (200 мл). Розчинникам дають повільно випаритись, що приводить до кристалізації бажаного ізомеру (2,0 г, 7,6 ммоль) як твердої речовини білуватого кольору. Проміжну сполуку нітроальдегіду (524 мг, 2,0 ммоль) розчиняють у DMF (10 мл) при 40°С. Після охолодження розчину до температури навколишнього середовища додають оксон (1,47 г, 2,4 ммоль) і суміш перемішують протягом ночі. Додавання води (25 мл) і етилацетату (30 мл) дає дві фази, які розділяють, і органічну фазу фільтрують і промивають водою. Водну фазу екстрагують етилацетатом і об'єднані органічні фази промивають двічі водою, висушують над сульфатом магнію і концентрують у вакуумі для одержання мокрого, жовтого залишку (0,54 г, 1,9 ммоль), який використовують без подальшого очищення. Розчин проміжної сполуки нітроальдегіду (0,54 г, 1,9 ммоль) в метиленхлориді об'єднують з тіонілхлоридом (1,4 мл, 20 ммль) разом з декількома краплями DMF, перемішуваного при температурі навколишнього середовища протягом ночі. Суміш концентрують у вакуумі і повторно розчиняють у 93306 18 метиленхлориді (10 мл). 3-Фторфенетиламін (0,56 мл, 4,3 ммоль) і триетиламін (1,1 мл, 7,9 ммоль) розчиняють у метиленхлориді (15 мл), до якого додають свіжоприготований розчин хлорангідриду. Після перемішування протягом 2 годин розчин промивають водною НСl (1 М) і насиченим бікарбонатом натрію і висушують над сульфатом магнію. Розчин продукту концентрують у вакуумі для одержання твердої речовини білого кольору, яку порошкують в етилацетаті для одержання кристалів світло-бежевого кольору (0,53 г, 1,3 ммоль). Тверду речовину бежевого кольору з попередньої стадії (0,53 г, 1,3 ммоль) розчиняють у суміші THF (20 мл) і метанолу (20 мл) і додають до свіжоприготованого Zn/Cu реагента (10 г, дивіться нижче). Додають мурашину кислоту (10 крапель) і суміш перемішують при температурі навколишнього середовища протягом ночі, після чого тонкошарова хроматографія показує завершення реакції. Після додавання DMF (2 мл) суміш перемішують протягом 10 хвилин і потім фільтрують через силікагель (2 см). Кремнезем промивають THF/метанолом (1:1) і об'єднані фільтрат і рідину концентрують у вакуумі. Хлороформ додають і потім випаровують для видалення залишкової води. Додають DMF (2 мл) і надлишок ізоамілнітрилу (5 мл) і суміш перемішують протягом 2,5 годин, після чого тонкошарова хроматографія показує, що реакція завершена. Додавання діетилового ефіру (5 мл) викликає осадження продукту, який промивають етилацетатом і висушують на повітрі для одержання 0,29 г твердої речовини білого кольору з наступними властивостями: Точка плавлення 181-182°С; 1Н ЯМР (300 MHz, CDCl3) δ 8,78 (1Н, с), 7,82 (1Н, с), 7,3-6,8 (4Н, м), 5,33 (2Н, с), 4,67 (2Н, м), 3,21 (2Н, м), 2,76 (1H, м), 1,02 (2Н, м) і 0,86 м.ч. (2Н, м). Zn/Cu реагент (використаний вище) був свіжоприготований наступним чином: концентровану НСl (3 мл) додають до 10 г цинку у 100 мл води при енергійному перемішуванні. Перемішування продовжують протягом 2 хвилин (починають утворюватись грудки), після чого воду декантують. Додають ще 100 мл води при енергійному перемішуванні. Всі грудки, які залишились, розбивають лопаткою. Додають концентровану НСl (3 мл) і перемішування продовжують протягом 2 хвилин. Після видалення води шляхом декантування, тверду речовину промивають додатковими 100 мл води. Воду (50 мл) додають до твердої речовини і перемішування продовжують, поки додають розчин CuSO4 (300 мг у 50 мл води). Після того, як цинк стає чорного кольору, воду видаляють шляхом декантування. Залишок послідовно промивають метанолом (50 мл) і ТГФ (50 мл). Приклад 2 In vitro фізіологічне тестування Фізіологічну дію сполуки за даним винаходом тестують in vivo на анестезованих тваринах відповідно до наступної методики. Тварин підтримують під анестезією шляхом введення фенобарбіталу за допомогою шприцевих насосів компанії Гамільтон. Стимулюючий і вимірювальний електроди вставляють в перфорантний 19 93306 шлях і зубчату звивину гіпокампу, відповідно. Як тільки електроди імплантовано, досягають стабільного вихідного рівня викликаних реакцій, використовуючи окремі монофазні імпульси (100 мксек. тривалість імпульсу), які надходять на 3-ю хв. на стимулюючий електрод. Поле EPSP спостерігають доти, доки не досягають стабільного вихідного рівня (близько 20-30 хвилин), після чого розчин тестової сполуки у HPCD ін'єктують внутрішньочеревинно і зчитують викликані потенціали поля. Викликані потенціали зчитують протягом приблизно 2 годин з наступним введенням лікарського засобу або доти, доки амплітуда поля EPSP не повернеться до вихідної. В останньому випадку, Комп’ютерна верстка Л. Купенко 20 звичайним є те, що внутрішньовенне введення також проводять з відповідним дозуванням тієї ж тестової сполуки. 8-Циклопропіл-3-[2-(3-фторфеніл)етил]-7,8дигідро-3Н-[1,3]оксазино[6,5-g][1,2,3]бензотриазин4,9-дioн продукує збільшення амплітуди поля EPSP на 10% при дозуванні 5 мг/кг через внутрішньовенне введення. Хоча даний винахід було розкрито з посиланням на конкретні методики і втілення, слід розуміти, що, не виходячи за рамки об'єму і суті винаходу, можна здійснити його різноманітні модифікації. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601