Поліпшений спосіб мутагенезу з використанням поліетиленгліколь-опосередкованого введення мутагенних нуклеїнових основ в рослинні протопласти

1. Спосіб направленої зміни дуплексної акцепторної ДНК-послідовності в протопласті рослинної клітини, який включає об'єднання дуплексної акцепторної ДНК-послідовності з донорною мутагенною нуклеїновою основою, де дуплексна акцепторна ДНК-послідовність містить першу ДНКпослідовність і другу ДНК-послідовність, яка комплементарна першій ДНК-послідовності, і де донорна мутагенна нуклеїнова основа включає щонайменше одну помилкову пару відносно дуплексної акцепторної ДНК-послідовності, яку необхідно змінити, переважно, відносно першої ДНКпослідовності, де спосіб додатково включає стадію введення мутагенної нуклеїнової основи в протопласти клітин з використанням поліетиленгліколь (ПЕГ)-опосередкованої трансформації. 2. Спосіб за п. 1, де мутагенна нуклеїнова основа являє собою мутагенну одноланцюжкову нуклеїнову основу. 3. Спосіб за п. 1, де мутагенна нуклеїнова основа включає LNA-заміни, які являють собою щонайменше один нуклеотид, видалений з помилкової пари-мішені, і, необов'язково, щонайменше 3, 4 або 5 2 (19) 1 3 Галузь техніки Даний винахід стосується способу специфічної і селективної зміни нуклеотидної послідовності в визаченому сайті ДНК в клітині-мішені шляхом введення в клітину одноланцюжкового ДНКолігонуклеотиду у вигляді мутагенної нуклеїнової основи. Більш конкретно, винахід стосується способу спрямованого мутагенезу шляхом введення мутагенної нуклеїнової основи в рослинні протопласти з використанням поліетиленгліколю (ПЕГ). Винахід додатково стосується наборів реагентів, що містять мутагенну нуклеїнову основу і ПЕГ. Винахід також стосується застосування ПЕГ для поліпшення спрямованого мутагенезу. Рівень техніки Спосіб спеціального створення змін в генетичному матеріалі живих клітин має на меті модифікацію однієї або більше з біологічних властивостей цієї клітини, що генетично кодуються або організму, частину якого утворює клітина або в яку вона може регенеруватися. Ці зміни можуть приймати форму делеції частин генетичного матеріалу, вставку екзогенного генетичного матеріалу або зміни в існуючій нуклеотидній послідовності генетичного матеріалу. Методи зміни генетичного матеріалу еукаріотичних організмів були відомі протягом більше 20 років і виявили широке застосування в рослинних, людських і тваринних клітинах і мікроорганізмах для поліпшень в галузі сільського господарства, здоров'я людини, якості їжі і в галузі захисту від несприятливих впливів навколишнього середовища. Найбільш широко поширені методи складаються з вставки фрагментів екзогенної ДНК в геном клітини, які потім додадуть цій клітині нову властивість або її організму крім і над властивостей, що кодуються вже існуючими генами (включаючи застосування, в яких експресія існуючих генів буде в результаті придушуватися). Хоч багато які такі приклади ефективні в одержанні цільових властивостей, проте ці методи не дуже точні через відсутність контролю геномних положень, в які вставляються фрагменти екзогенної ДНК (і, отже, відсутність контролю граничного рівня експресії), і через те, що цільовий ефект повинен сам себе виражати відносно природних властивостей, що кодуються початковим і стійким геномом. Навпаки, методи спрямованого мутагенезу, які приводять в результаті до вставки, делеції або конверсії нуклеотидів в попередньо визначеному геномному локусі дадуть можливість точної модифікації існуючих генів. Крім того, через точну природу спрямованого мутагенезу, очікується, що нові рослинні лінії, одержані таким чином, будуть більш легко прийматися споживачами. Спрямований мутагенез являє собою метод сайтспецифічного мутагенезу, який оснований на доставці в еукаріотичну клітину синтетичних мутагенних нуклеїнових основ (молекул, що складаються з коротких фрагментів нуклеотидо-- подібних компонентів, які нагадують ДНК по їх властивостях спаровування основ по Уотсону-Крику, але можуть хімічно відрізнятися від ДНК) (Alexeev and Yoon, Nature Biotechnol. 16: 1343, 1998; Rice, Nature 96228 4 Biotechnol. 19: 32.L 2001; Kmiec, J. Clin. Invest. 112: 632, 2003). Після введення в клітину, такі мутагенні нуклеїнові основи злучаються з комплементарною послідовністю в локусі-мішені. За допомогою спеціального конструювання помилкової пари в нуклеїновій основі, помилкова пара може являти собою нуклеотидну конверсію у відповідному положенні в геномній послідовності-мішені. Цей метод дає можливість конверсії одного або по більшій мірі декількох нуклеотидів в ендогенних локусах, але може застосовуватися і для створення стоп-кодонів в існуючих локусах, приводячи в результаті до порушення їх функції, або може застосовуватися для створення змін в кодонах, приводячи в результаті до одержання генів, що кодують білки із зміненим амінокислотним складом (білкова інженерія). Спрямований мутагенез був описаний в рослинних, тваринах і дріжджевих клітинах. У цих дослідженнях використали два різних класи синтетичних мутагенних нуклеїнових основ, химерні ДНК:РНК нуклеїнові основи або одноланцюжкові нуклеїнові основи. Химерні ДНК:РНК нуклеїнові основи (химери) являють собою самокомплементарні молекули, що складаються з 25 п.о., що являють собою тільки ділянку ДНК, і з 25 п.о. комплементарної послідовності, зробленої з 5 п.о. корової ділянки ДНК, фланкованої з кожного боку ділянками по 10 п.о. 2'-Ометилованої РНК, які, як вважається, сприяють стабільності химери в клітині. Корова ділянка 5 п.о. включає в своєму центрі сконструйовану помилкову пару з нуклеотидом, який необхідно змінити в геномній послідовності-мішені. Обидві ці ділянки пов'язані за допомогою 4 п.о. тимідинових шпильок. При введенні в клітину химера, як вважається, утворює подвійну D-петлю зі своєю послідовністю-мішенню, і помилкова пара утворюється між химерою і нуклеотидом-мішенню. Ця помилкова пара потім виправляється за допомогою ендогенних клітинних білків ДНК репарації шляхом конверсії геномного нуклеотиду. Перші приклади спрямованого мутагенезу з використанням химер прийшли з тваринних клітин (розглянуто у Igoucheva et al. 2001 Gene Therapy 8,__391-399) і потім пізніше також використовувалися для здійснення спрямованого мутагенезу в рослинних клітинах (Beetham et al. 1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:_8774-8778; Zhu et al. 1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 8768-8773; Zhu et al. 2000 Nature Biotech. 18, 555-558; Kochevenko et al. 2003 Plant Phys. 132:_174-184; Okuzaki et al. 2004 Plant Cell Rep. 22:_509-512). На відміну від людських клітин, рослинна клітина, в якій відбувається подія спрямованого мутагенезу, може регенеруватися в інтактну рослину і мутація перенесеться в наступне покоління, що робить рослинну клітину ідеальним засобом одночасно для дослідницького і комерційного мутагенезу важливих харчових культур. Однак інтенсивне дослідження багатьма лабораторіями показало, що частота спрямованого мутагенезу з використанням химер досить низька і варіабельна або навіть не детектовна (Ruiter et 5 al. 2003 Plant Моl. Biol. 53, 715-729, Van der Steege et al. (2001) Nature Biotech. 19:_305-306), і залежить від таких чинників, як транскрипційний статус мішені, положення клітини в клітинному циклі, послідовність мішені і якість химер, які важко синтезувати. Завдяки відносно низькій частоті спрямованого мутагенезу за допомогою методів, відомих з рівня техніки, такі події можуть детектуватися тільки коли зміна одного нуклеотиду геномної мішені приводить в результаті одержанню домінантного селективного фенотипу. У рослинних клітинах специфічні точкові мутації вводилися у відкриту рамку прочитання гена ацетолактатсинтази (ALS, в маїсі AHAS), яка каталізує початкову стадію, загальну для синтезу амінокислот з розгалуженими ланцюгами, лейцину, ізолейцину і валіну. У тютюні, зміни одиничного нуклеотиду є достатніми для одержання кодонових конверсій P194Q або W571L. Білок ALS, що одержується після кожної з цих кодонових конверсій, не чутливий до інгібуванню гербіцидами класу сульфонілсечовини, одержуючи таким чином метод селекції для одиничних нуклеотидних конверсій в хромосомному локусі. Через труднощі роботи з химерами, велися пошуки більш надійної альтернативи олігонуклеотидного дизайну. Деякі лабораторії досліджували можливість використання одноланцюжкових (ss) нуклеїнових основ для здійснення спрямованого мутагенезу. Було виявлено, що вони дають більш відтворюювані результати, будучи при цьому більш просто синтезовними, а також вони можуть включати модифіковані нуклеотиди для поліпшення представленості мутагенної основи в клітині (Liu et al. 2002 Nucl. Acids Res. 30:_2742-2750; огляд, Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12:_639-646; Dong et al.2006 Plant Cell Rep. 25:_457-65; De Piedoue et al. 2007 Oligonucleotides 27:_258-263). Спрямований мутагенез був описаний в різних патентних заявках Кmіес, серед іншого в WO0173002, WO03/027265, WO01/87914, WO99/58702, WO97/48714, WO02/10364. У WO 01/73002 передбачили, що низька ефективність генних змін, що одержуються з використанням немодифікованих нуклеїнових основ значною мірою, як вважається, визначається результатом їх деградації нуклеазами, присутніми в реакційній суміші клітини-мішені. Для усунення цієї проблеми, запропонували включати модифіковані нуклеотиди, які роблять одержані в результаті нуклеїнові основи стійкими проти нуклеаз. Типові приклади таких модифікованих нуклеотидів включають фосфоротіоатні зв'язки або 2'-О-метил-аналоги. Ці модифікації переважно локалізовані на кінцях нуклеїнової основи, що покидає центральну немодифіковану домен, навколишню основу-мішень. У підтримку цього припущення, в патентній заявці WO 02/26967 продемонстрували, що певні модифіковані нуклеотиди, що збільшують внутрішньоклітинний тривалість існування нуклеїнової основи, посилюють ефективність спрямованого мутагенезу в in vitro тест-системах а також в хромосомній мішені ссавців. Не тільки стійкість до нуклеазам, але також афінність зв'язування мутагенної однолан 96228 6 цюжкової нуклеїнової основи з її комплементарною ДНК-мішенню володіє значним ефектом посилення частоти спрямованого мутагенезу. Одноланцюжкова нуклеїнова основа, що містить модифіковані нуклеотиди, які посилюють її афінність зв'язування, може більш ефективно знаходити свою комплементарну мішень в складному геномі і/або залишатися пов'язаним зі своєю мішенню протягом більш тривалого періоду часу і мати меншу імовірність видалення білками, регулюючими ДНК-транскрипцію і реплікацію. Для тестування множини модифікованих нуклеотидів для поліпшення ефективності процесу мутагенезу використали in vitro аналіз спрямованого мутагенезу. Закриті нуклеїнові кислоти (LNA) і С5-пропінпіримідини мають модифікації цукрового компонента і основи, відповідно, яка стабілізує утворення дуплекса і підвищує температуру плавлення дуплекса. Коли ці модифіковані нуклеотиди включають в одноланцюжкову нуклеїнову основу, вони поліпшують ефективність спрямованого мутагенезу до 13 разів вище, ніж ефективність, що одержується з використанням немодифікованої нуклеїнової основи в тій же послідовності. Див. в зв'язку з цим WO2007073166 і WO2007073170 від імені заявників даного винаходу. Автори даного винаходу спробували поліпшити частоту спрямованого мутагенезу в рослинних клітинах шляхом оптимізації методу, що використовується для введення мутагенних нуклеїнових основ в рослинні клітини. Метод трансформації рослинних клітин, що найбільш широко використовується, Agrobacterium-опосередкована трансформація переносить секцію її пухлинно-індукуючої (Ті) плазміди, так званої Т-ДНК, в рослинні клітини, де вона ефективно інтегрується в геном рослини у випадкове положення. Т-ДНК фланкується з кожного кінця "прикордонними" послідовностями довжиною до 22 п.о., з походженням з Ті-плазміди, які не мають гомології з послідовністю-мішенню. Оскільки для спрямованого мутагенезу використовується коротка довжина мутагенних одноланцюжкових нуклеїнових основ, прикордонні послідовності будуть заважати процесу. Таким чином, спрямований мутагенез може бути досягнутий тільки в рослинних клітинах за допомогою прямого перенесення ДНК з використанням хімічних або фізичних методів. У публікаціях повідомлялося про деякі такі методи перенесення ДНК, які включають електропорацію, обробку поліетиленгліколем (ПЕГ) протопластів, біолістичне бомбардування калюсного матеріалу рослини і мікроін'єкцію ДНК в індивідуальні протопласти або тканину. У рівні техніки немає ніяких вказівок відносно переважного методу перенесення одноланцюжкових нуклеїнових основ для спрямованого мутагенезу, конкретно, для перенесення ДНК в рослини або рослинних протопласти. З метою досягнення настільки високої ефективності спрямованого мутагенезу в рослинах, наскільки це можливе, автори даного винаходу в ході своїх досліджень ідентифікували чотири чинники, які потрібно оптимізувати. По-перше, мутагенна нуклеїнова основа переважно вводиться з високою ефективністю трансформації, тобто, вводить 7 ся в настільки велику кількість рослинних клітин, наскільки це можливо. По-друге, обробка переважно не летальна для більшості клітин, гарантуючи, що настільки, наскільки можливо багато трансформованих клітин також буде виживати при процедурі трансформації (ефективність виживання). Потретє, метод трансформації переважно не є шкідливим для подальших поділів трансформованих рослинних клітин при утворенні мікрокалюсів (регенерація/ефективність культивування) і, нарешті, переважною є можливість ідентифікації індивідуальних регенерованих рослин, що відбулися після подій спрямованого мутагенезу без застосування селекції (ефективність ідентифікації). Більшість методів трансформації ДНК в індивідуальні рослинні клітини використовує протопласти, виділені безпосередньо з листя (мезофільні протопласти) або з клітинних суспензій (розглянуто в Sheen, J. (2001) Plant Phys. 127: 1466-1475). Протопласти можуть використовуватися для досліджень транзиторної експресії, у випадку якої експресія гена або локалізація білка можуть оцінюватися незабаром після трансформації, або для одержання стабільно трансформованих рослин при зростанні протопластів на середовищі для посилення утворення калюса і для органогенезу. Про трансформацію рослинних протопластів з використанням протопластів повідомлялося раніше (Fromm et al. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 5824-5828; Nishiguchi et al. (1986) Plant Cell Rep. 5: 57-60; Ou-Lee et al. (1986) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 6815-6819; Hauptmann et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 265-270; Jones et al. (1989) Plant Mol.Biol. 13: 503-511). Як правило, інтенсивність поля (В/см), та, що дає найбільшу ефективність трансформації приводить в результаті до виживання протопластів 90% після обробки ПЕГ. Не все протопласти зберігають здатність розподілу з мікрокалюсів. У типовому виділенні не оброблених протопластів тютюну, приблизно 25% доводиться на мікрокалюси. Обробка ПЕГ надає незначний вплив на ефективність регенерації, яка падає приблизно на 10%, але це не дуже значне в порівнянні з іншими методами трансформації. Ні в одному з вищеописаних методів, відомих їх рівня техніки, не передбачалося використання ПЕГ-трансформації для сайт-спрямованого мутагенезу, конкретно TNE. Автори даного винаходу спробували поліпшити метод прямого перенесення ДНК для одержання ефективного спрямованого мутагенезу в рослинних клітинах. Автори даного винаходу виявили, що з числа методів трансформації, описаних денебудь в цьому документі, ПЕГ-трансформація протопластів значно поліпшує загальну ефективність спрямованого мутагенезу в порівнянні з електропорацією і біолістикою. Це виявилося несподіваним, оскільки методи спрямованого мутагенезу в рослинах до даного моменту, як представляється, віддавали перевагу використанню електропорації, незважаючи на асоційовану низьку ефективність. Крім того, більшість поліпшень в методі були направлені на поліпшення мутагенних нуклеїнових основ, а не на систему доставки мутагенної нуклеїнової основи в мішень геномної ДНК. Для порівняння автори даного винаходу використали мутагенну одноланцюжкову нуклеїнову основу для одержання конверсії P194Q в локусі ALS, ведучої до стійкості до гербіцидів. Ідентичні мутагенні одноланцюжкові нуклеїнові основи вводили в мезофільні протопласти тютюну з використанням або ПЕГ-опосередкованої трансформації або електропорації, і селектували клітини, стійкі до гербіцидів, з використанням умов селекції. Таким чином, автори даного винаходу виявили, що ПЕГопосередкована трансформація рослинних клітин є найбільш ефективним методом для здійснення спрямованого мутагенезу в рослинних клітинах в порівнянні з відомими методами трансформації. У одному аспекті винахід стосується способу направленої зміни дуплексної акцепторної ДНКпослідовності в протопласті рослинної клітини, що включає - об'єднання дуплексної акцепторної ДНКпослідовності з мутагенною одноланцюжковою нуклеїновою основою, де дуплексна акцепторна ДНК-послідовність містить першу ДНКпослідовність і другу ДНК-послідовність, яка ком 96228 10 плементарна першій ДНК-послідовності, і де донорна мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа включає щонайменше одну помилкову пару по відношенню до дуплексної акцепторної ДНКпослідовності, яку необхідно змінити, переважно, по відношенню до першої ДНК-послідовності, де спосіб додатково включає стадію введення мутагенної одноланцюжкової нуклеїнової основи в протопласти клітин з використанням поліетиленгліколь (ПЕГ)-опосередкованої трансформації. Мутагенну одноланцюжкову нуклеїнову основу вводять в контакт з протопластами рослини, що трансформуються з використанням методу на основі ПЕГ-трансформації. Метод ПЕГопосередкованої трансформації сам по собі є широко відомим, і з потреби фахівець може виробити невеликі зміни в конкретних протоколах, не виходячи за рамки суті даного винаходу. Мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа, що використовується в даному винаході, має довжину, яка відповідає іншій (химерній) мутагенній одноланцюжковій нуклеїновій основі, що використовується в направленому мутагенезі, тобто звичайно між 10-60 нуклеотидів, переважно, 20-55 нуклеотидів, більш переважно, 25-50 нуклеотидів. У певних втіленнях винаходу, мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа, що використовується в даному винаході, може бути модифікована, наприклад з допомогою LNA і/або пропінілових модифікацій, як описано в заявках WO2007073166 і WO2007073170. Таким чином, в деяких варіантах здійснення, мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа містить щонайменше одну LNA, локалізовану в положенні, взятому з помилкової паримішені, і переважно, дві LNA, локалізовані на місці щонайменше одного нуклеотиду, видаленого з кожної сторони від помилкової пари. Крім того, ці LNA являють собою щонайменше 3, 4 або 5 нуклеотидів, видалених з 5'- і/або 3'-кінця мутагенної одноланцюжкової нуклеїнової основи. У деяких варіантах здійснення, мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа може включати одну або більше пропінових замін, по суті, як описано в WO2007073166 і WO2007073170. У деяких варіантах здійснення, донорна мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа може бути кон'югована з білком, таким як сигнал ядерної локалізації. У цьому варіанті здійснення, олігонуклеотид, що використовується в даному винаході, сполучається за допомогою відповідного (лінкерного) методу з сигналом ядерної локалізації, таким як відомий (NLS) пептид великого Т-антигену SV40, GATA транскрипційний чинник 11, хеліказа ХВР1 ДНКрепарації, білок світлово-опосередкованого розвитку DET1, транскрипційний чинник ERF, PRспоріднений транскрипційний аткиватор РТІ6 і ядерний спіральний білок, по суті, як описано в заявках на стадії розгляду PCT/NL2007/000279. Кон'югат олігонуклеотиду і сигналу ядерної локалізації може використовуватися в способі трансформації на основі ПЕГ, описаному в даному описі. Зміна, одержана за допомогою способу за даним винаходом, являє собою делецію, заміну або вставку щонайменше одного нуклеотиду. Переважно, зміна являє собою заміну. Більше нуклеоти 11 дів може бути замінено на один нуклеотид, але очікується, що ефективність зменшиться, отже існує перевага для зміни одного нуклеотиду. ДНКмішень (або дуплексна акцепторна ДНК) може бути з будь-якого джерела, але переважно, ДНКмішень беруть з рослини. Переважно, ДНК-мішень беруть з геномної ДНК, лінійної ДНК, штучних хромосом, ядерної хромосомної ДНК, хромосомної ДНК органел, епісомної ДНК. Спосіб згідно з винаходом може використовуватися для зміни клітини, корекції мутації шляхом відновлення дикого типу, індукування мутації, інактивації ферменту шляхом порушення кодуючої області, модифікації біоактивності ферменту шляхом порушення кодуючої області, модифікації білка шляхом порушення кодуючої області. У одному аспекті винахід стосується застосування ПЕГ-опосередкованої трансформації для поліпшення ефективності спрямованого мутагенезу в рослинних протопластах. Не маючи обмежень по частині теорії, вважається, що використання ПЕГ-опосередкованої трансформації осаджує ДНК на клітинній мембрані протопласта. Осажденна ДНК інкапсулюється клітинною мембраною і вводиться в протопласт в захищеній формі. Протопласт в ході його звичайного клітинного циклу безпосереднє після цього утворення з видаленням клітинної стінки, почне свій звичайний процес регенерації клітинної стінки. Клітинний розподіл звичайно починається пізніше (від декількох годин до декількох днів). Направлена нуклеотидна зміна, як правило, має місце під час клітинного розподілу з використанням клітинного механізму репарації. У період часу між введенням донорної ДНК в протопласт і стартом клітинного розподілу, донорна ДНК зазнає впливу з боку механізму захисту клітини, такого як екзонуклеази і, ймовірно, дегенерує і, отже, стає неефективною для TNE. При використанні методу ПЕГ-опосередкованої трансформації, донорна ДНК інкапсулюється за допомогою ендоцитозу і таким шляхом щонайменше тимчасово захищається від дегенеративної дії ендонуклеаз. Коли ДНК вивільняється з своєї інкапсульованої форми, вона має підвищені шанси присутності в сам момент або приблизно в момент клітинного розподілу, у час якого ДНК (т.е. мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа) стає доступно для пошуку комплемента в ДНК акцепторної клітини і для заміни нуклеотиду, як в звичайних механізмах спрямованого мутагенезу. Приклади: Порівняння частот спрямованого мутагенезу з використанням або ПЕГ-опосередкованої трансформації або електропорації Виділення Протопластів In vitro культури паростків Nicotiana tabacum cv Petit Havana лінії SRI підтримували на середовищі MS2О з 0,8% агаром Difco у високих скляних колбах протягом 16/8-годинних світлових дні при освітленості 2000 люкс при 25°С і 60-70% відносної вогкості. Середовище MS2O являє собою основне середовище Murashige and Skoog's medium (Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962), що містить 2% (мас/об.) сахарозу, без додання гормонів, і 0,8% агар Difco. Зби 96228 12 рали листя 3-6-тижневих культур паростків, що повністю розпустилося. Листя нарізали смужками товщиною 1 мм, які потім переносили у великі чашки Петрі (100 мм100 мм), що містять 45 мл базального середовища MDE для преплазмолізисної обробки протягом 30 хвилин. Базальне середовище МВЕ містить 0,25 г КСl, 1 г MgSO47H2O, 0,136 г КН2РО4, 2,5 г полівінілпіролідону (MW 10000), 6 мг нафталіноцтової кислоти і 2 мг 6-бензиламінопурину в загальному об'ємі 900 мл. Осмоляльность розчину регулювали до 600 -1 мОсм.кг сорбітом, рН до 5,7. Потім додавали 5 мл базових ферменти SR1. Базовий фермент складається з 750 мг целюлази Onozuka R10, 500 мг дризелази (driselase) і 250 мг мацерозима R10 на 100 мл, відфільтровувати через ватманський папір і стерилізовані за допомогою фільтрації. Гідролізу давали пройти протягом ночі в темряві при 25 °С. Гідролізоване листя фільтрували через нейлоновий фільтр 50 мкм в стерильній пробірці. Рівний об'єм холодного промивального середовища КСl для промивання фільтра і об'єднаної з протопластами суспензії. Промивальне середовище КСl складається з 2 г СаСl22Н2О на літр і достатньої кількості КСl для доведення осмоляльності до -1 540 мОсмкг . Суспензію переносили в 10 млпробірки, і протопласти осаджували протягом 10 хвилин при 85xg при 4°С. Супернатант видаляли і осаджені протопласти ретельно ресуспендували в 5 мл холодного промивального середовища MLm, які являють собою макро-нутрієнти середовища MS (Murashige, Т. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962) в половині звичайної концентрації, 2,2 г СаСl22Н2О на літр і кількість маніту для доведення осмоляльності до 540 -1 мОсмкг . 2 існуючі пробірки об'єднували і центрифугували протягом 10 хвилин при 85xg при 4°С. Супернатант видаляли і осаджені протопласти ретельно ресуспендували в 5 мл холодного промивального середовища MLs, яке являє собою середовище MLm, в якому маніт замінений на сахарозу. 2 існуючі пробірки об'єднували і обережно додавали 1 мл промивального середовища КСl зверху розчину сахарози, щоб не зруйнувати нижню фазу. Протопласти центрифугували протягом 10 хвилин при 85xg при 4°С. Інтерфазу між розчинами сахарози і КСl, що містить живі протопласти, ретельно збирали. Додавали рівний об'єм промивального середовища КСl і ретельно перемішували. Щільність пртопластів вимірювали з допомогою гемоцитометра. ПЕГ-трансформація Суспензію протопластів центрифугували при 85xg протягом 10 хвилин при 5°С. Супернатант видаляли і осаджені протопласти ресуспендували в промивальному середовищі КСl до кінцевої кон-1 центрації 106мл . У 10 мл-пробірці м'яко, але ретельно перемішували 250 мкл суспензії протопластів, 1,6 нмоль мутагенної одноланцюжкової нуклеїнової основи і 250 мкл ПЕГ-розчину. Через 20 хвилин інкубації при кімнатній температурі по краплях додавали 5 мл холодного розчину 0,275 М Ca(NO3)2. Суспензію протопластів центрифугували при 85xg протягом 10 хвилин при 4°С. Супернатант видаляли і осаджені протопласти ретельно 13 ресуспендували в 1,25 мл культуральнго середо-1 вища То, що містить 50 мкгмл цефотаксиму і 50 -1 мкг мл ваноміцину, культурального середовища для мутагенної одноланцюжкової нуклеїнової основи, що містить (на 1 літр, рН 5,7) 950 мг KNO3, 825 мг NH4NO3, 220 мг СаСl22Н2О, 185 мг MgSQ47H2O, 85 мг КН2РО4, 27,85 мг FeSO47H2O, 37,25 мг Na2EDTA2H2O, мікро-нутрієнти згідно з середовищем Heller's medium (Heller, R., Arm Sci Nat Bot Biol Veg 14: 1:223, 1953), вітаміни згідно з середовищем Morel and Wetmore's medium (Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38:138-40, 1951), 2% (мас/об.) сахарози, 3 мг нафталіноцтової кислоти, 1 мг 6- бензиламінопурину і кількість маніту для доведення осмоляльності до 540 -1 мОсмкг . Суспензію переносили в 35 мм-чашку Петрі. Додавали рівний об'єм агарозного середовища Т0 і м'яко перемішували agarose. Зразки інкубували при 25°С в темряві і далі культивували, як описано нижче. Електропорація Протопласти центрифугували при 85xg протягом 10 хвилин при 5°С. Супернатант видалили і осад ресуспендували в крижаному буфері електропорації, що складається з 10 мМ HEPES, 80 мМ NaCl, 0,04 мМ СаСl2, 0,4 М маніту, рН 5,7 регулю-1 вали до 540 мОсмкг з допомогою електропорації, що складається з 10 мМ HEPES, 80 мМ NaCl, 0,04 мМ СаСl2, 0,4 М маніту до кінцевої концентрації -1 106 мл . Протопласти тримали на льоду протягом всієї процедури. У широку 0,4 см-кювету для електропорації додавали 4,5 нмоль мутагенної одноланцюжкової нуклеїнової основи і 700 мкл суспензії протопластів. Однократний пульс експонентного розпаду доставляється до клітинної суспензії з використанням системи електропорації Biorad GenePulser ХсеІІ, обладнаної PC- і ЦИМмодулем згідно з наступними параметрами: -1 Інтенсивність поля 500 Всм , Місткість 950 мкФ При цих умовах опір зразка становить приблизно 30 ом і одержана в результаті постійна часу становить приблизно 30 мс. Ці параметри вибирали як параметри, що дають найбільший рівень транзисторної експресії GFP в протопластах тютюну через 24 години після електропорації. Після подачі імпульсу, протопластам давали можливість відновитися в кюветі при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Протопласти потім відновлювали в 1 мл культуральнго середовища Т0 і переносили в 10 мл пробірку. Кювету промивали за допомогою додаткових 5 мл культурального середовища Т0, яке об'єднували з суспензією протопластів. Після ґрунтовного, але м'якого перемішу-1 вання додавали 50 мкгмл цефотаксиму і 50 -1 мкгмл ванкоміцину і 1,25 мл суспензії протопластів переносили в 35 мм чашку Петрі. Додавали рівний об'єм агарозной середовища Т0 і суміш м'яко гомогенізували. Зразки інкубували при 25°С в темряві і далі культивували, як описано нижче. Культивування протопластів Через 10 днів культивування, агарозну пластинку розрізали на 6 рівних частин і переносили в чашку Петрі, що містить 22,5 мл середовища МАР1АО, що містить 20 нМ хлорсульфурону. Це 96228 14 середовище складається з (на 1 літр, рН 5,7) 950 мг КNO3, 825 мг NH4NO3, 220 мг СаСl22Н2О, 185 мг MgSO47H2O, 85 мг КН2РО4, 27,85 мг FeSO47H2O, 37,25 мг Na2EDTA2H2O, мікронутрієнти згідно з середовищем Murashige and Skoog's medium (Murashige, T. and Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15: 473-497, 1962) в одній десятій від початкової концентрації, вітаміни згідно з середовищем Morel and Wetmore's medium (Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38j_l 38-40, 1951), 6 мг пірувату, 12 мг кожні із сполук, фумарової кислоти і лимонної кислоти, 3% (мас/об.) сахарози, 6% (мас/об.) маніту, 0,03 мг ніфталіноцтової кислоти і 0,1 мг 6-бензиламінопурину. Зразки інкубували при, 25°С при слабому освітленні протягом 6-8 тижнів. Зростаючі калюси потім переносили в середовище МАРІ і давали їм можливість розвинутися протягом ще 2-3 тижнів. Середовище МАР1 має той же склад, що і середовище МАР1АО, однак -1 містить 3% (мас/об.) маніт замість 6%, і 46,2 мгл гістидину (рН 5,7). Воно твердне за допомогою 0,8% (мас/об.) агару Difco. Калюси потім переносили в середовище RP з використанням стерильних пінцетів. Середовище RP складається з (на 1 літр, рН 5,7) 273 мг KNO3, 416 мг Ca(NO3)24H2O, 392 мг Mg(NO3)26H2O, 57 мг MgSO47H2O, 233 мг (NH4)2SO4, 271 мг КН2РО4, 27,85 мг FeSO47H2O, 37,25 мг Na2EDTA2H2O, мікронутрієнти згідно з середовищем Murashige and Skoog's medium в однією п'ятою від опублікованої концентрації, вітаміни згідно з середовищем Morel and Wetmore's medium (Morel, G. and R.H. Wetmore, Amer. J. Bot. 38: 138-40, 19511 0,05% (мас/об.) сахарози, 1,8% (мас/об.) маніту, 0,25 мг зеатину і 41 нМ хлорсульфурону, і твердне за допомогою 0,8% (мас/об.) агару Difco. Зрілі паростки переносили в субстрат для вирощування рослин через 2-3 тижні. Мутагенні одноланцюжкові нуклеїнові основи Всі мутагенні одноланцюжкові нуклеїнові основи синтезували з допомогою Eurogentec (Seraing, Belgium), очищали з використанням HPLC із оберненою фазою і ресуспендували в стерильній воді milliQ. Перед використанням мутагенну одноланцюжкову нуклеїнову основу нагрівали до 95°С протягом 5 хвилин. Мутагенну одноланцюжкову нуклеїнову основу 06Q262 сконструювали для введення однієї помилкової пари (підкреслений нуклеотид) в ген ALS тютюну (реєстраційний номер Х07644) в положенні кодону Р194, яке приводить в результаті до конверсії ССА на САА (P194Q). Мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа 06Q261 є точною парою для послідовності гена ALS тютюну і служить як негативний контроль. Мутагенна одноланцюжкова нуклеїнова основа 06Q263 складається з випадкової комбінації 40 нуклеотидів і служить як негативний контроль. 06Q261 5'TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCT GTTATAG [SEQ ID 1] 06Q262 5'TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCT GTTATAG [SEQ ID 2] 15 96228 06Q263 5'ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGA TCGATCG [SEQ ID 3] Виживання протопластів при обробці Виживання протопластів після обох процедур, ПЕГ-трансформації і електропорації, оцінювали з допомогою активність естерази, з використанням флуоресцентного барвника для прижиттєвого забарвлення флюоресцеїндіацетату (FDA) через 24 години після трансформації. Додавали два мкл 5 -1 мгмл базового розчину FDA в ацетоні до 1 мл трансформованих протопластів. Пропорцію флуоресцентних протопластів у всій популяції вважали на гемоцитометрі. Спостереження проводили за допомогою прямого епіфлуоресцентного мікроскопа Nikon Eclipse E600, обладнаного набором фільтрів GFP LP (EX480/40, DM505, ВА510). Збудження забезпечували за допомогою ртутної 100 Вт лампи надвисокого тиску. Виявляли зображення з 16 використанням камери DS-2MBWc CCD, приєднаної до контролера DS-U 1, приєднаного до PCмодуля, що виконує програму NIS Element image по збору даних/аналізів зображень. Результати Підсумовування результатів трансформації з використанням обох процедур, ПЕГ-трансформації і електропорації, представлені в таблиці 1. При використанні ПЕГ-трансформації міра виживання протопластів була значно вища в порівнянні з використанням електропорації. Природа електропорації сама по собі є більш шкідливою для виживання протопластів, ніж природа ПЕГтрансформації, яка приводить в результаті до набагато більш високої міри відновлення/виживання, а також до більш високої ефективності спрямованого мутагенезу. Ефективність спрямованого мутагенезу оцінювали після інкубування протопластів в присутності хлорсульфурону. Таблиця 1 Порівняння ПЕГ-трансформації і електропорації відносно міри виживання протопластів, виражене в процентному вмісті флуоресцентних протопластів після фарбування FDA у відновленій популяції протопластів. Мутагенна нуклеїнова основа 06Q261 06Q262 06Q263 ПЕГ-обробка Виживання (%) 83,5±1,8 82,6±2,1 83,8±2,6 Результати являють собою середнє значення 3 незалежних повторів експериментів ± Станд.Відхил. ПЦР-ампліфікація ALS і секвенування ДНК виділяли з стійких до хлорсульфурону мікроколоній тютюну з використанням набору реагентів DNeasy kit (Qiagen), і використали як матриця в реакції ПЦР. Конверсії кодонівмішеней в гені ALS тютюну детектували з використанням праймерів 5'GGTCAAGTGCCACGTAGGAT [SEQ ID 4] і 5'GGGTGCTTCACTTTCTGCTC [SEQ ID 5], які ампліфікують фрагмент 776 п.о. цього гена, включаючи кодон 194. Нуклеотидну конверсію в стійкому до гербіциду калюсі тютюну підтверджували за допомогою клонування ПЦР-продуктів у Електропорація Виживання (%) 65,9±2,2 66,3±2,6 64,7±3,1 вектор pCR2.1::TOPO (Invitrogen) і секвенування індивідуальних плазмід. Тютюн містить 2 алелі ALS (SurA і SurB). Нуклеотидна конверсія кодона Р194 в кожному з цих локусів є достатньою для придання стійкості до хлорсульфурону. Оскільки тютюн являє собою алотетраплоїдний вигляд, існує - вісім можливих мішеней в тютюні, в яких може зустрітися TNE. У відповідності з цим, необхідно секвенувати >10 плазмідних клонів, що містять ПЦР-продукт для детектування одного з конверсією ССА на САА. Це передбачає, що в кожному стійкому калюсі тільки 1 з 8 алелей ALS зазнає нуклеотидної конверсії, опосередкованої спрямованим мутегенезом. Для всіх калюсів, одержаних в даному дослідженні, ми спостерігали очікувану нуклеотидну конверсію ССА на САА. 17 96228 18 19 Комп’ютерна верстка Мацело В. 96228 Підписне 20 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601