Антагоністи активіну-actrii та їх застосування для підвищення рівня еритроцитів
Формула / Реферат
1. Спосіб лікування або попередження анемії у пацієнта людини, у якому пацієнту, який цього потребує, вводять ефективну кількість поліпептиду ActRII, вибраного з групи, до якої належать:
a) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:2;
b) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:3;
c) поліпептид, який включає принаймні 50 послідовних амінокислот, вибраних із SEQ ID NO:2;
d) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:16;
e) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:17; та
f) поліпептид, який включає принаймні 50 послідовних амінокислот, вибраних з SEQ ID NO:16.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид має одну або кілька з наступних характеристик:
i) зв′язується з лігандом ActRII з KD принаймні 10-7 M; і
ii) інгібує сигнал ActRII у клітині.
3. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що поліпептид зв′язується активіном.
4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданий поліпептид є злитим білком, який включає, додатково до домену поліпептиду ActRII, одну або кілька поліпептидних частин, які підвищують одну або кілька характеристик, до яких належать in vivo стійкість, in vivo період піврозпаду, поглинання/введення, локалізація або розподіл у тканині, утворення білкових комплексів та/або очищення.
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вищезгаданий злитий білок включає поліпептидну частину, вибрану з групи, до якої належать: Fc домен імуноглобуліну та альбумін сироватки.
6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданий поліпептид включає один або кілька модифікованих амінокислотних залишків, вибраних з-поміж: глікозилованої амінокислоти, пегілованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон′югованої з ліпідним компонентом та амінокислоти, кон′югованої з органічним дериватизуючим агентом.
7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:2.
8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2.
9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95% ідентичною SEQ ID NO:3.
10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3.
11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95% ідентичною SEQ ID NO:16.
12. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:16.
13. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:17.
14. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:17.
15. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з мієлодиспластичним синдромом у пацієнта.
16. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з таласемією у пацієнта.
17. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з хронічною хворобою нирок у пацієнта.
18. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з хіміотерапевтичним лікуванням пацієнта.
19. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з множинною мієломою у пацієнта.
20. Спосіб розпізнавання агента, який підвищує рівень еритроцитів, у якому:
a) розпізнають досліджуваний агент, який зв′язується з ліганд-зв′язувальним доменом поліпептиду ActRII, відповідно до п. 1, конкурентно з лігандом ActRII; і
b) оцінюють вплив агента на рівень еритроцитів у тварини.
21. Застосування поліпептиду ActRII, вибраного з групи, до якої належать:
a) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:2;
b) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:3;
c) поліпептид, який включає принаймні 50 послідовних амінокислот, вибраних із SEQ ID NO:2;
d) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:16;
e) поліпептид, який включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною SEQ ID NO:17; та
f) поліпептид, який включає принаймні 50 послідовних амінокислот, вибраних з SEQ ID NO:16;
для виготовлення медикаменту для лікування або попередження анемії у пацієнта людини.
22. Спосіб лікування або попередження анемії у людини, у якому пацієнту вводять ефективну кількість злитого білка ActRII-Fc, причому злитий білок ActRII-Fc включає поліпептид, вибраний з групи, до якої належать:
a) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:3;
b) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2;
c) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:7;
d) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:12;
e) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 17;
f) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 16;
g) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:20; та
h) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:21.
23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що цей спосіб викликає менше ніж 15 % збільшення маси скелетних м′язів пацієнта.
24. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що злитий білок ActRII-Fc вводять для досягнення концентрації у сироватці пацієнта принаймні 100 нг/мл протягом періоду приблизно від 20 до 30 днів.
25. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що злитий білок ActRII-Fc вводять для досягнення концентрації у сироватці пацієнта у межах від 100 нг/мл до 1000 нг/мл.
26. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що злитий білок ActRII-Fc має півперіод у сироватці від 15 до 30 днів.
27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що злитий білок ActRII-Fc вводять пацієнтові не частіше, ніж раз на тиждень.
28. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що злитий білок ActRII-Fc вводять пацієнтові не частіше, ніж раз на місяць.
29. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:2.
30. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2.
31. Cпосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:3.
32. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3.
33. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:7.
34. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:7.
35. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:12.
36. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:12.
37. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:17.
38. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:17.
39. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95 % ідентичною SEQ ID NO:16.
40. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:16.
41. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95% ідентичною SEQ ID NO:20.
42. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:20.
43. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 95% ідентичною SEQ ID NO:21.
44. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:21.
45. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з хронічною хворобою нирок у пацієнта.
46. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з хіміотерапевтичним лікуванням пацієнта.
47. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з множинною мієломою у пацієнта.
48. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з мієлодиспластичним синдромом у пацієнта.
49. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що анемія пов′язана з таласемією у пацієнта.
50. Застосування злитого білка ActRII-Fc, який включає поліпептид, вибраний з групи, до якої належать:
a) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:3;
b) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2;
c) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:7;
d) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:12;
e) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 17;
f) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 16;
g) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90% ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:20; та
h) поліпептид, що має амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 90 % ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO:21;
для виготовлення медикаменту для лікування або попередження анемії у пацієнта людини.
Текст
Реферат: Винахід належить до способу лікування або попередження анемії у пацієнта людини, у якому пацієнту, який цього потребує, вводять ефективну кількість поліпептиду ActRII; до способу розпізнавання агента, який підвищує рівень еритроцитів; до застосування поліпептиду ActRII для виготовлення медикаменту для лікування або попередження анемії у пацієнта. UA 101309 C2 (12) UA 101309 C2 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антагоністи активіну-actrii та їх застосування для підвищення рівня еритроцитів Споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет Попередньої патентної заявки США № 60/875,682, поданої 18 грудня 2006 р., включеної авторами шляхом посилання у повному обсязі. Рівень техніки Зрілий еритроцит відповідає за перенесення кисню у системі кровообігу хребетних. Еритроцити переносять високу концентрацію гемоглобіну, білка, який зв’язує кисень у легенях при відносно високому парціальному тиску кисню (pO 2) і доставляє кисень до ділянок організму з відносно низьким pO2. Зрілі еритроцити продукуються з плюрипотентних кровотворних стовбурових клітин у процесі, який називається еритропоезом. У суб’єктів після пологів еритропоез відбувається, головним чином, у кістковому мозку та червоній пульпі селезінки. Узгоджена дія різних сигнальних шляхів регулює баланс проліферації, диференціації, виживання та смерті клітин. За нормальних умов еритроцити продукуються зі швидкістю, яка дозволяє підтримувати незмінну масу еритроцитів в організмі, і продукування може збільшуватися або зменшуватися у відповідь на різні подразники, включаючи підвищений або знижений тиск кисню або потребу тканини. Процес еритропоезу починається з утворення lineage committed клітин-прекурсорів і продовжується через низку окремих груп клітин-прекурсорів. Кінцеві стадії еритропоезу відбуваються, коли ретикулоцити вивільнюються у кровотік і втрачають свої мітохондрії та рибосоми, водночас набуваючи морфології зрілого еритроциту. Підвищений рівень ретикулоцитів або підвищене співвідношення ретикулоцитів:еритроцитів у крові вказує на підвищене продукування еритроцитів. Еритропоетин (Epo) широко визнається як найбільш значний позитивний регулятор еритропоезу у хребетних у післяпологовий період. Epo регулює компенсаторну кровотворну реакцію на знижений тиск кисню у тканинах (гіпоксію) та низький рівень еритроцитів або низький рівень гемоглобіну. У людини підвищений рівень Epo сприяє утворенню еритроцитів шляхом стимулювання утворення еритроїдних попередників у кістковому мозку та селезінці. У мишей Epo підвищує еритропоез, насамперед, у селезінці. Різні форми рекомбінантного Epo застосовуються лікарями для підвищення рівня еритроцитів у різних клінічних умовах, зокрема, для лікування анемії. Анемія є широко визначеним станом, який характеризується нижчим за нормальний рівнем гемоглобіну або еритроцитів у крові. У деяких випадках анемія викликається первинним порушенням у продукуванні або виживанні еритроцитів. Частіше анемія є вторинним порушенням, викликаним хворобами інших систем (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1169-1175). Анемія може бути результатом уповільнення продукування або прискорення руйнування еритроцитів, або може бути викликана втратою еритроцитів через кровотечу. Анемія може бути результатом різних порушень, до яких належать, наприклад, хронічна ниркова недостатність, мієлодиспластичний синдром, ревматоїдний артрит та трансплантація кісткового мозку. Лікування з застосуванням Epo зазвичай викликає підвищення гемоглобінів приблизно на 13 г/дл у здорових людей протягом тритижневого періоду. При введенні суб’єктам з анемією цей режим лікування часто забезпечує суттєве підвищення рівня гемоглобіну та еритроцитів і поліпшує якість та тривалість життя. Ефективність Epo є нерівномірною, і багато суб’єктів є стійкими навіть до високих доз (Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50). Понад 50% пацієнтів з раком мають неадекватну реакцію на Epo, приблизно 10% з термінальною стадією ниркової хвороби мають гіпореактивність (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425), і менше, ніж 10% з мієлодиспластичним синдромом мають сприятливу реакцію (Estey (2003) Curr Opin Hematol 10, 60-67). Деякі чинники, включаючи запалення, дефіцит заліза та вітамінів, недостатній діаліз, алюмінієва токсичність та гіперпаратиреоз, можуть вказувати на ймовірну негативну терапевтичну реакцію, але молекулярні механізми резистентності до Epo на даний час остаточно ще не з’ясовані. Таким чином, мета даного винаходу полягає у забезпеченні альтернативних композицій та способів підвищення рівня еритроцитів у пацієнтів. Короткий опис винаходу Частково винахід демонструє, що антагоністи активіну, а також антагоністи ActRIIa та ActRIIb, можуть застосовуватися для підвищення рівня еритроцитів та гемоглобіну. Зокрема, винахід демонструє, що розчинна форма ActRIIa діє як інгібітор активіну і при введенні in vivo підвищує рівень еритроцитів у крові. Більш помірний ефект спостерігався для розчинної форми ActRIIb, яка зв’язує активін A з меншою афінністю, ніж розчинний ActRIIa. Хоча розчинні ActRIIa та ActRIIb можуть впливати на рівень еритроцитів через механізм, відмінний від антагонізму до активіну, винахід демонструє, що потрібні терапевтичні агенти можуть бути вибрані на основі 1 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антагонізму до активіну або антагонізму до ActRII або і того, й іншого. Такі агенти мають спільну назву антагоністів активіну-ActRII. Таким чином, у деяких варіантах втілення винахід пропонує способи застосування антагоністів активіну-ActRII, включаючи, наприклад, активін-зв’язувальні поліпептиди ActRIIa, активін-зв’язувальні поліпептиди ActRIIb, антитіла проти активіну, антитіла проти ActRIIa, антитіла проти ActRIIb, активін-, ActRIIb- або ActRIIa-специфічні малі молекули та аптамери та нуклеїнові кислоти, які знижують експресію активіну, ActRIIb або ActRIIa, для підвищення рівня еритроцитів та гемоглобіну у пацієнтів і для лікування порушень, пов’язаних з низьким рівнем еритроцитів або гемоглобіну у пацієнтів, які цього потребують. Як описано у патентній заявці США № 11/603,485, яку включено авторами шляхом посилання, антагоністи активіну-ActRIIa можуть застосовуватися для сприяння ростові клітин та збільшення густини клітин. Як описується авторами даного винаходу, вплив таких антагоністів на рівень еритроцитів є більш швидким і відбувається у нижчих дозах порівняно з впливом таких антагоністів на кістки. Таким чином, у деяких варіантах втілення винахід забезпечує способи застосування антагоніста активіну-ActRIIa для підвищення рівня еритроцитів або гемоглобіну без викликання значного збільшення густини кісток. Наприклад, спосіб може викликати менше, ніж 3%, 5%, 10% або 15% збільшення густини кісток. Цей вибірковий вплив може досягатися через застосування, наприклад, нижчих доз антагоніста активіну-ActRIIa, зниження частоти введення доз або через застосування антагоніста активіну-ActRIIa з коротшим півперіодом у сироватці у дозах і з частотою, які розраховують для забезпечення нижчої концентрації у сироватці. У деяких аспектах винахід забезпечує поліпептиди, до яких належить розчинний, активінзв’язувальний поліпептид ActRII, який зв’язується з активіном. Активін-зв’язувальний поліпептид може бути поліпептидом ActRIIa або поліпептидом ActRIIb. Поліпептиди ActRII можуть бути рецептовані як фармацевтична композиція, яка включає активін-зв’язувальний поліпептид ActRII та фармацевтично прийнятний носій. Активін-зв’язувальний поліпептид ActRII може зв’язуватися з активіном з показником KD, меншим за 1 мікромоль або меншим за 100, 10 або 1 наномоль. Необов’язково активін-зв’язувальний поліпептид ActRII вибірково зв’язується з активіном на відміну від GDF11 та/або GDF8, і необов’язково з показником K D, який принаймні у 10, 20 або 50 разів є нижчим для активіну, ніж для GDF11 та/або GDF8. Без прив’язування до конкретного механізму дії передбачається, що цей ступінь селективності інгібування активіну порівняно з інгібуванням GDF11/GDF8 зумовлює вплив на кістки або еритропоез без стійкого вимірного впливу на м’язи. У багатьох варіантах втілення вибирають поліпептид ActRII, який викликає менше, ніж 15%, менше, ніж 10% або менше, ніж 5% збільшення м’язів у дозах, які забезпечують потрібний вплив на рівень еритроцитів. Композиція може бути чистою принаймні на 95% відносно інших поліпептидних компонентів, як визначається шляхом ексклюзійної хроматографії, і необов’язково композиція може бути чистою принаймні на 98%. Активінзв’язувальний поліпептид ActRIIa для застосування у такій композиції може бути будь-яким з описаних авторами, наприклад, поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вибрану зпоміж SEQ ID NO: 2, 3, 7 або 12, або амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% або 99% ідентичною амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12 або 13. Активін-зв’язувальний поліпептид ActRIIa може включати функціональний фрагмент природного поліпептиду ActRIIa, наприклад, такий, що включає принаймні 10, 20 або 30 амінокислот послідовності, вибраної з-поміж SEQ ID NO: 1-3 або послідовності SEQ ID NO: 2 без C-кінцевих 10-15 амінокислот ("хвоста"). Активін-зв’язувальний поліпептид ActRIIb для застосування у такій композиції може бути будь-яким з описаних авторами, таким, як поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вибрану з-поміж SEQ ID NO: 16, 17, 20 або 21, або амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% або 99% ідентичною амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NO: 16, 17, 20 або 21. Активін-зв’язувальний поліпептид ActRIIb може включати функціональний фрагмент природного поліпептиду ActRIIb, наприклад, такий, що включає принаймні 10, 20 або 30 амінокислот SEQ ID NO: 15-17 або послідовності без C-кінцевих 10-15 амінокислот ("хвоста"), наприклад, SEQ ID NO: 17. Розчинний активін-зв’язувальний поліпептид ActRII може включати одну або кілька змін в амінокислотній послідовності (наприклад, у ліганд-зв’язувальному домені) відносно природного поліпептиду ActRII. Приклади змінених поліпептидів ActRIIa та ActRIIb представлено у публікації WO 2006/012627, стор. 59-60 та стор. 55-58, відповідно, яку включено авторами шляхом посилання. Зміна в амінокислотній послідовності, наприклад, може змінювати глікозилування поліпептиду у разі продукування у клітині ссавця, комахи або іншій еукаріотній клітині або змінювати протеолітичне розщеплення поліпептиду відносно природного поліпептиду ActRII. Активін-зв’язувальний поліпептид ActRII може бути злитим білком, який має, як один домен, поліпептид ActRII (наприклад, ліганд-зв’язувальну частину ActRIIa або ActRIIb) та один або 2 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кілька додаткових доменів, які забезпечують потрібну властивість, таку, як поліпшена фармакокінетика, полегшене очищення, спрямування на конкретні тканини і т. ін. Наприклад, домен злитого білка може поліпшувати одну або кілька характеристик, до яких належать in vivo стійкість, in vivo період піврозпаду, поглинання/введення, локалізація або розподіл у тканині, утворення білкових комплексів, мультимеризація злитого білка та/або очищення. Активінзв’язувальний злитий білок ActRII може включати Fc домен імуноглобуліну (дикий або мутантний) або альбумін сироватки або поліпептидну частину, яка забезпечує потрібні властивості, такі, як поліпшена фармакокінетика, поліпшена розчинність або поліпшена стійкість. В оптимальному варіанті втілення злиття ActRII-Fc включає відносно неструктурований лінкер, розташований між Fc доменом та позаклітинним ActRIIa доменом. Цей неструктурований лінкер відповідати неструктурованій ділянці з приблизно 15 амінокислот на C-кінці позаклітинного домену ActRII ("хвості"), або може бути штучною послідовністю з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислот або мати довжину від 5 до 15, 20, 30, 50 або більше амінокислот, які є відносно вільними від вторинної структури, або їх сумішшю. Лінкер може бути багатим на гліцинові та пролінові залишки і, наприклад, може містити одну послідовність треоніну/серину та гліцинів або повторювані послідовності треоніну/серину та гліцинів (наприклад, TG4 (SEQ ID NO: 22) або SG4 (SEQ ID NO: 23) синглети або повтори). Злитий білок може включати підпослідовність очищення, таку, як мітка епітопу, мітка FLAG, послідовність полігістидину та GST злиття. Необов’язково розчинний поліпептид ActRIIa включає один або кілька модифікованих амінокислотних залишків, вибраних з-поміж: глікозилованої амінокислоти, пегілованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон’югованої з ліпідним компонентом, та амінокислоти, кон’югованої з органічним дериватизуючим агентом. Фармацевтична композиція також може включати одну або кілька додаткових сполук, таких, як сполука, яку застосовують для лікування від порушення кісток. В оптимальному варіанті фармацевтична композиція є практично вільною від пірогену. Як правило, перевагу віддають експресії білка ActRIIa у клітинній лінії ссавця, яка відповідно опосередковує природне глікозилування білка ActRIIa таким чином, щоб зменшити ймовірність несприятливої імунної реакції у пацієнта. Успішним було застосування клітинних ліній людини та CHO, і очікується, що інші звичайні системи експресії ссавців також будуть корисними. Як описується авторами даного винаходу, білки ActRIIa, позначені як ActRIIa-Fc (форма з мінімальним лінкером між ActRIIa-частиною та Fc-частиною), мають потрібні властивості, включаючи селективне зв’язування з активіном, на відміну від GDF8 та/або GDF11, високоафінне лігандне зв’язування та період піврозпаду в сироватці, більший за два тижні у тваринних моделях. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує поліпептиди ActRIIa-Fc і фармацевтичні композиції, які включають такі поліпептиди та фармацевтично прийнятний наповнювач. У деяких аспектах винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, які кодують розчинний активінзв’язувальний поліпептид ActRII, такий, як поліпептид ActRIIa або ActRIIb. Виділений полінуклеотид може включати кодуючу послідовність для розчинного активін-зв’язувального поліпептиду ActRIIa, як описано вище. Наприклад, виділена нуклеїнова кислота може включати послідовність, яка кодує позаклітинний домен (наприклад, ліганд-зв’язувальний домен) ActRIIa, та послідовність, яка має кодувати частину або весь трансмембранний домен та/або цитоплазматичний домен ActRIIa, крім стоп-кодону, розташованого у межах трансмембранного домену або цитоплазматичного домену, або розташованого між позаклітинним доменом та трансмембранним доменом або цитоплазматичним доменом. Наприклад, виділений полінуклеотид може включати полінуклеотидну послідовність ActRIIa повної довжини, таку, як SEQ ID NO: 4 або 5, або полінуклеотидну послідовність ActRIIb повної довжини, таку, як SEQ ID NO: 18, або частково зрізаний варіант ActRIIa або ActRIIb, вищезгаданий виділений полінуклеотид також включає кодон термінації транскрипції, розташований принаймні за шістсот нуклеотидів до 3'-кінця або в іншій позиції, таким чином, щоб трансляція полінуклеотиду викликала необов’язкове злиття позаклітинного домену зі зрізаною частиною ActRII повної довжини. Описані авторами нуклеїнові кислоти можуть бути функціонально зв’язані з промотором для експресії, і винахід забезпечує клітини, трансформовані такими рекомбінантними полінуклеотидами. В оптимальному варіанті клітина є клітиною ссавця, такою, як клітина CHO. У деяких аспектах винахід забезпечує способи одержання розчинного, активінзв’язувального поліпептиду ActRII. Такий спосіб може включати експресію будь-якої з описаних авторами нуклеїнових кислот (наприклад, SEQ ID NO: 4, 5 14, 18 або 19) у відповідній клітині, такій, як клітина яєчника китайського хом’яка (CHO). Такий спосіб може включати: a) 3 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культивування клітини в умовах, прийнятних для експресії розчинного поліпептиду ActRII, причому вищезгадана клітина трансформується експресійною конструкцією розчинного ActRII; та b) видобування експресованого таким чином розчинного поліпептиду ActRII. Розчинні поліпептиди ActRII можуть видобуватися як неочищені, частково очищені або високоочищені фракції. Очищення досягають через низку етапів очищення, включаючи, наприклад, один, два, три або більше з нижчезазначених у будь-якому порядку: хроматографія протеїну A, аніонообмінна хроматографія (наприклад, на Q-сефарозі), хроматографія гідрофобної взаємодії (наприклад, на фенілсефарозі), ексклюзійна хроматографія та катіонообмінна хроматографія. У деяких аспектах згідно зі способом може застосовуватись описаний авторами антагоніст активіну-ActRII, такий, як розчинний активін-зв’язувальний поліпептид ActRIIa або розчинний активін-зв’язувальний поліпептид ActRIIb, для сприяння продукуванню еритроцитів або підвищення рівня еритроцитів у суб’єкта. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує способи лікування від порушення, пов’язаного з низьким числом еритроцитів або низьким рівнем гемоглобіну (наприклад, анемії), або для сприяння продукуванню еритроцитів у пацієнтів, які цього потребують. Спосіб може включати введення суб’єктові, який цього потребує, ефективної кількості антагоніста активіну-ActRIIa. У деяких аспектах винахід забезпечує застосування антагоністів активіну-ActRII для приготування медикаменту для лікування від порушення або стану, як описано авторами. У деяких аспектах винахід забезпечує спосіб розпізнавання агента, який стимулює продукування еритроцитів. Спосіб включає: a) розпізнавання випробуваного агента, який зв’язується з активіном або ліганд-зв’язувальним доменом поліпептиду ActRII; і b) оцінку впливу агента на рівень еритроцитів, гемоглобіну та/або рівень прекурсорів еритроцитів (наприклад, рівень ретикулоцитів). Короткий опис фігур Фігура 1 показує очищення ActRIIa-hFc, який експресується у клітинах CHO. Білок очищується як єдиний, добре визначений пік, який візуалізують за допомогою сортувальної колонки (ліве зображення) та SDS-PAGE з забарвленням Кумасі (праве зображення) (лівий ряд: стандарти молекулярної маси; правий ряд: ActRIIa-hFc). Фігура 2 показує зв’язування ActRIIa-hFc з активіном та GDF-11, яке вимірюють за TM допомогою аналізу BiaCore . Фігура 3 показує вплив ActRIIa-hFc на число еритроцитів у самиць відмінних від людини приматів. Самиці мавпи cynomolgus (чотири групи по п’ять мавп у кожній) отримували плацебо або 1 мг/кг, 10 мг/кг або 30 мг/кг ActRIIa-hFc на початку відліку часу, на 7-й, 14-й та 21-й дні. Фігура 3A показує число еритроцитів (RBC). Фігура 3B показує рівень гемоглобіну. Статистична значущість визначається відносно базового показника для кожної досліджуваної групи. На 57-й день у кожній групі залишалося по дві мавпи. Фігура 4 показує вплив ActRIIa-hFc на число еритроцитів у самців відмінних від людини приматів. Самці мавпи cynomolgus (чотири групи по п’ять мавп у кожній) отримували плацебо або 1 мг/кг, 10 мг/кг або 30 мг/кг ActRIIa-hFc на початку відліку часу, на 7-й, 14-й та 21-й дні. Фігура 4A показує число еритроцитів (RBC). Фігура 4B показує рівень гемоглобіну. Статистична значущість визначається відносно базового показника для кожної досліджуваної групи. На 57-й день у кожній групі залишалося по дві мавпи. Фігура 5 показує вплив ActRIIa-hFc на число ретикулоцитів у самиць відмінних від людини приматів. Мавпи cynomolgus (чотири групи по п’ять мавп у кожній) отримували плацебо або 1 мг/кг, 10 мг/кг або 30 мг/кг ActRIIa-hFc на початку відліку часу, на 7-й, 14-й та 21-й дні. Фігура 5 A показує абсолютне число ретикулоцитів. Фігура 5B показує відсоток ретикулоцитів відносно RBC. Статистична значущість визначається відносно базового показника для кожної групи. На 57-й день у кожній групі залишалося по дві мавпи. Фігура 6 показує вплив ActRIIa-hFc на число ретикулоцитів у самиць відмінних від людини приматів. Мавпи cynomolgus (чотири групи по п’ять мавп у кожній) отримували плацебо або 1 мг/кг, 10 мг/кг або 30 мг/кг ActRIIa-hFc на початку відліку часу, на 7-й, 14-й та 21-й дні. Фігура 6A показує абсолютне число ретикулоцитів. Фігура 6B показує відсоток ретикулоцитів відносно RBC. Статистична значущість визначається відносно базового показника для кожної групи. На 57-й день у кожній групі залишалося по дві мавпи. Фігура 7 показує результати клінічного випробування на людях, описаного у Прикладі 5, у якому площа під кривою (AUC) та введена доза ActRIIa-мають лінійну кореляцію, незалежно від того, чи вводили ActRIIa-hFc внутрішньовенно (IV) чи підшкірно (SC). Фігура 8 показує порівняння рівня у сироватці ActRIIa-hFc у пацієнтів, які отримували IV- або SC-ін’єкції. 4 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фігура 9 показує рівень лужної фосфатази у кістках (BAP) у відповідь на різні рівні доз ActRIIa-hFc. BAP є показником анаболічного росту кісток. Фігура 10 показує медіанну зміну відносно базового показника рівня гематокриту у клінічному випробуванні на людях, описаному у Прикладі 5. ActRIIa-hFc вводили внутрішньовенно (IV) у зазначеній дозі. Фігура 11 показує медіанну зміну відносно базового показника рівня гемоглобіну клінічного випробування на людях, описаного у Прикладі 5. ActRIIa-hFc вводили внутрішньовенно (IV) у зазначеній дозі. Фігура 12 показує медіанну зміну відносно базового показника числа RBC (еритроцитів) у клінічному випробуванні на людях, описаному у Прикладі 5. ActRIIa-hFc вводили внутрішньовенно (IV) у зазначеній дозі. Фігура 13 показує медіанну зміну відносно базового показника ретикулоцитів у клінічному випробуванні на людях, описаному у Прикладі 5. ActRIIa-hFc вводили внутрішньовенно (IV) у зазначеній дозі. Детальний опис винаходу 1. Загальний огляд Надродина трансформуючих факторів росту-бета (TGF-бета) включає різні фактори росту, які мають спільні елементи послідовності та структурні мотиви. Відомо, що ці білки справляють біологічний вплив на різні типи клітин як у хребетних, так і у безхребетних. Члени цієї надродини виконують важливі функції під час ембріонального розвитку у формуванні структури та деталізації тканини і можуть впливати на різні процеси диференціації, включаючи адипогенез, міогенез, хондрогенез, кардіогенез, кровотворення, нейрогенез та диференціацію епітеліальних клітин. Родина розділяється на дві загальні гілки: BMP/GDF та TGF-бета/активін/BMP10, члени яких мають різний, часто комплементарний вплив. Шляхом маніпулювання активності члена родини TGF-бета часто можна досягти суттєвих фізіологічних змін в організмі. Наприклад, породи великої рогатої худоби п’ємонтська та бельгійська блакитна мають мутацію з втратою функції у гені GDF8 (також називається міостатином), яка викликає помітне збільшення м’язової маси. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Крім того, у людей неактивні алелі GDF8 є пов’язаними зі збільшеною м’язовою масою та, за свідченнями, виключною силою. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8. Активіни є димерними поліпептидними факторами росту, які належать до надродини TGFбета. Існують три основні форми активіну (A, B та AB), які є гомо/гетеродимерами двох близько споріднених підгруп (AA, BB та AB, відповідно). Людський геном також кодує активін C та активін E, які, головним чином, експресуються у печінці, а також є відомими гетеродимерні форми, які містять C або E. У надродині TGF-бета активіни є унікальними і багатофункціональними факторами, які можуть стимулювати продукування гормону в клітинах яєчників та плаценти, підтримують виживання нейронних клітин, позитивно або негативно впливають на процес клітинного циклу, залежно від типу клітин, і викликають мезодермальну диференціацію принаймні в ембріонах земноводних (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953963). Крім того, було виявлено, що еритроїдний фактор диференціації (EDF), виділений зі стимульованих людських моноцитарних лейкемічних клітин є ідентичним активінові A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Вказувалося на те, що активін A діє як природний позитивний регулятор еритропоезу в кістковому мозку. У деяких тканинах сигнал активіну антагонізується пов’язаним з ним гетеродимером, інгібіном. Наприклад, під час вивільнення фолікулостимулюючого гормону (FSH) з гіпофізу активін сприяє секреції та синтезові FSH, тоді, як інгібін перешкоджає секреції та синтезові FSH. До інших білків, які можуть регулювати біологічну активність активіну та/або зв’язуватися з активіном належать фолістатин (FS), споріднений з фолістатином білок (FSRP) та α 2-макроглобулін. Сигнали TGF- опосередковуються гетеродимерними комплексами рецепторів серин/треонінкінази типу I та типу II, які фосфорилують і активізують розташовані далі Smad білки при лігандному стимулюванні (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169- 178). Ці рецептори типу I та типу II є трансмембранними білками, які складаються з лігандзв’язувального позаклітинного домену з багатою на цистеїн ділянкою, трансмембранного домену та цитоплазматичного домену з прогнозованою специфічністю серину/треоніну. Рецептори типу I є суттєвими для сигналу; а рецептори типу II є необхідними для зв’язування лігандів та для експресії рецепторів типу I. Рецептори активіну типу I та II утворюють стійкий комплекс після лігандного зв’язування, що в результаті забезпечує фосфорилування рецепторів типу I рецепторами типу II. 5 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Два споріднені рецептори типу II, ActRIIa та ActRIIb, були визначені як рецептори типу II для активінів (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Крім активінів, ActRIIa та ActRIIb можуть біохімічно взаємодіяти з кількома іншими білками родини TGF-, включаючи BMP7, Nodal, GDF8 та GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306- 9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 є первинним рецептором типу I для активінів, зокрема, для активіну A, і ALK-7 також може служити як рецептор для активінів, зокрема, для активіну B. Як було продемонстровано авторами, розчинний поліпептид ActRIIa (sActRIIa), який демонструє значну перевагу у зв’язуванні з активіном A на відміну від інших членів родини TGFбета, таких, як GDF8 або GDF11, є ефективним для підвищення рівня еритроцитів in vivo. Якщо не прив’язуватися до будь-якого конкретного механізму, очікується, що вплив sActRIIa викликається, насамперед, впливом антагоніста активіну при дуже сильному зв’язуванні активіну (пікомолярна константа дисоціації), яке демонструє конкретна послідовність sActRIIa, яка застосовується в цих дослідженнях. Незалежно від механізму, з представлених авторами даних стає зрозумілим, що ActRIIa-антагоністи активіну підвищують рівень еритроцитів у гризунів, мавп та людини. Слід зазначити, що гематопоез є складним процесом, який регулюється різними факторами, включаючи еритропоетин, G-CSF та гомеостаз заліза. Терміни "підвищувати рівень еритроцитів" та "сприяти утворенню еритроцитів" стосуються величин, які піддаються клінічному спостереженню, таких, як гематокрит, число еритроцитів та вимірювання гемоглобіну, і є нейтральними по відношенню до механізму, згідно з яким відбуваються ці зміни. Авторами також було продемонстровано, що розчинний поліпептид ActRIIb (sActRIIb) є ефективним для підвищення рівня ретикулоцитів in vivo, і вважається, що цей ефект за тривалий період часу викликає підвищення рівня гематокриту. Дані, наведені авторами стосовно відмінних від людини приматів, також можуть бути відтворені у мишей, щурів та людини, а отже, цей винахід забезпечує способи застосування поліпептидів ActRII та інших антагоністів активіну-ActRII для сприяння продукуванню еритроцитів та підвищення рівня еритроцитів у ссавців від гризунів до людини. До антагоністів активіну-ActRII належать, наприклад, активін-зв’язувальні розчинні поліпептиди ActRIIa, активінзв’язувальні розчинні поліпептиди ActRIIb, антитіла, які зв’язуються з активіном (зокрема, субодиницями активіну A або B, які також називають A або B) і розривають зв’язування ActRIIa та/або ActRIIb, антитіла, які зв’язуються з ActRIIa і розривають зв’язування активіну, антитіла, які зв’язуються з ActRIIb і розривають зв’язування активіну, білки, які не є антитілами, вибрані з огляду на зв’язування з активіном, ActRIIb або ActRIIa (див., наприклад, публікації WO/2002/088171, WO/2006/055689 та WO/2002/032925, у яких наводяться приклади білків та способів їх побудови та відбору), рандомізовані пептиди, вибрані з огляду на зв’язування з активіном, ActRIIb або ActRIIa, часто прикріплені до Fc домену. Два різні білки (або інші компоненти) з активністю зв’язування активіну, ActRIIb або ActRIIa, зокрема, активінзв’язувальні речовини, які блокують місця зв’язування типу I (наприклад, розчинний рецептор активіну типу I) та типу II (наприклад, розчинний рецептор активіну типу II), відповідно, можуть бути зв’язані між собою для створення біфункціональної зв’язувальної молекули. Нуклеїновокислотні аптамери, малі молекули та інші агенти, які інгібують сигнальну вісь активінActRIIa, включаються як антагоністи активіну-ActRII. Різні білки мають активність антагоніста активіну-ActRIIa, включаючи інгібін (тобто, субодиницю інгібін альфа), хоча інгібін не антагонізує активін в усіх тканинах, фолістатин (наприклад, фолістатин-288 та фолістатин-315), FSRP, активін C, альфа(2)-макроглобулін та мутантний активін A M108A (заміна метіоніну на аланін у позиції 108). Зазвичай альтернативні форми активіну, зокрема, ті, що мають зміни в домені зв’язування рецептора типу I, можуть зв’язуватися з рецепторами типу II і не можуть утворити активний потрійний комплекс, таким чином, діючи як антагоністи. Крім того, нуклеїнові кислоти, такі, як антисмислові молекули, siРНК або рибозими, які інгібують активін A, B, C або E або, зокрема, експресію ActRIIa або ActRIIb, можуть застосовуватись як антагоністи активіну-ActRII. Антагоніст активіну-ActRIIa, який має бути застосований, демонструє селективність інгібування опосередкованого активіном сигналу порівняно з іншими членами родини TGF-бета, зокрема, по відношенню до GDF8 та GDF11. Терміни, вжиті в цьому описі, в цілому мають їх загальноприйняті у даній галузі значення, у контексті цього винаходу і в конкретному контексті вживання кожного терміну. Деякі терміни обговорюються нижче або в інших частинах опису для забезпечення додаткових вказівок для спеціаліста-практика в описі композицій та способів згідно з винаходом та способах їх застосування. Обсяг або значення будь-якого застосування терміну стане зрозумілим з конкретного контексту, в якому вжито цей термін. 6 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 "Близько" та "приблизно" в цілому означає прийнятний рівень похибки у виміряній кількості з врахуваннях типу та точності вимірювань. Зазвичай типовий рівень похибки становить не більше 20 відсотків (%), в оптимальному варіанті – не більше 10%, у ще кращому варіанті – не більше 5% від даного значення або діапазону значень. В альтернативному варіанті, зокрема у біологічних системах, терміни "близько" та "приблизно" можуть означати значення, які перебувають у межах порядку величини, в оптимальному варіанті – у межах 5-разового, у ще кращому варіанті – у межах 2-разового показника даного значення. Вказані авторами числові значення кількості є приблизними, якщо не вказується іншого, означаючи, що термін "близько" або "приблизно" може матися на увазі, коли він прямо не вказується. Способи згідно з винаходом можуть включати етапи порівняння між послідовностями, включаючи порівняння послідовності дикого типу з одним або кількома мутантами (варіантами послідовності). Такі порівняння зазвичай включають співставлення полімерних послідовностей, наприклад, з використанням програм та/або алгоритмів вирівнювання послідовностей, які є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі (наприклад, BLAST, FASTA та MEGALIGN). Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що при таких вирівнюваннях, коли мутація містить інсерцію або делецію залишку, у вирівняній послідовності вставляють "пробел" (зазвичай представлений як тире або "A") у полімерній послідовності, яка не містить вставленого або делетованого залишку. "Гомологічний" в усіх граматичних формах та варіантах написання, стосується зв’язку між двома білками, які мають " спільне еволюційне походження", включаючи білки з надродин одного виду організму, а також гомологічні білки з іншого виду організму. Такі білки (та їхні кодуючі нуклеїнові кислоти) мають гомологію послідовності, яка відображається через подібність послідовності, чи то у відсотках ідентичності, чи то через присутність конкретних залишків або мотивів та консервативних позицій. Термін "подібність послідовності" в усіх його граматичних формах, стосується ступеня ідентичності або відповідності між нуклеїновокислотними або амінокислотними послідовностями, які можуть на мати спільного еволюційного походження. Однак у загальновживаному сенсі і в даній заявці термін "гомологічний", при додаванні прислівника "високо", може стосуватися подібності послідовності і може бути або не бути пов’язаним зі спільним еволюційним походженням. 2. Поліпептиди ActRII У деяких аспектах даний винахід стосується поліпептидів ActRII. Вжитий авторами термін "ActRIIa" стосується білків родини рецепторів активіну типу II. Ця родина включає як рецептор активіну типу II a, так і рецептор активіну типу IIb. У деяких аспектах даний винахід стосується поліпептидів ActRIIa. Вжитий авторами термін "ActRIIa" стосується білків родини рецепторів активіну типу IIa (ActRIIa) з будь-якого виду та варіантів, отриманих з таких білків ActRIIa шляхом мутагенезу або іншої модифікації. Посилання на ActRIIa в цьому описі слід розглядати як посилання на будь-яку з ідентифікованих на даний час форм. Члени родини ActRIIa зазвичай є трансмембранними білками, які складаються з ліганд-зв’язувального позаклітинного домену з багатою на цистеїн ділянкою, трансмембранним доменом та цитоплазматичним доменом з прогнозованою активністю серин/треонінкінази. Термін "поліпептид ActRIIa" включає поліпептиди, які включають будь-який природний поліпептид члена родини ActRIIa, а також будь-які його варіанти (включаючи мутанти, фрагменти, злиття та пептидоміметичні форми), які зберігають корисну активність. Див., наприклад, WO/2006/012627. Наприклад, до поліпептидів ActRIIa належать поліпептиди, які походять від послідовності будь-якого відомого ActRIIa, що має послідовність, принаймні приблизно на 80% ідентичну послідовності поліпептиду ActRIIa, в оптимальному варіанті – ідентичну принаймні на 85%, 90%, 95%, 97%, 99% або більше. Наприклад, поліпептид ActRIIa згідно з винаходом може зв’язуватися й інгібувати функцію білка ActRIIa та/або активіну. Поліпептид ActRIIa може бути вибраний з огляду на активність у сприянні утворенню еритроцитів in vivo. Прикладами поліпептидів ActRIIa є поліпептид-прекурсор людського ActRIIa (SEQ ID NO: 1) та розчинні людські поліпептиди ActRIIa (наприклад, SEQ ID NO: 2, 3, 7 та 12). Послідовність білка-прекурсора людського ActRIIa є такою: 55 7 UA 101309 C2 5 Сигнальний пептид підкреслено однією лінією; позаклітинний домен виділено жирним шрифтом, і можливі N-зв’язані місця глікозилування підкреслено подвійною лінією. Послідовність розчинного (позаклітинного) обробленого поліпептиду людського ActRIIa є такою: C-кінцевий "хвіст" позаклітинного домену є підкресленим. Послідовність з делетованим "хвостом" (послідовність Δ15) є такою: 10 Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує білок-прекурсор людського ActRIIa є такою (нуклеотиди 164-1705 зі зразка у Genbank NM_001616): 8 UA 101309 C2 Нуклеїновокислотна послідовність, людського ActRIIa є такою: 5 10 яка кодує розчинний (позаклітинний) поліпептид У деяких аспектах даний винахід стосується поліпептидів ActRIIb. Вжитий авторами термін "ActRIIb" стосується білків родини рецептора активіну типу IIb (ActRIIb) з будь-яких видів та різновидів, які одержують із білків ActRIIb шляхом мутагенезу або іншої модифікації. У контексті даного винаходу посилання на ActRIIb слід розуміти як посилання на будь-яку з ідентифікованих на даний час форм. Члени родини ActRIIb зазвичай є трансмембранними білками, які складаються з ліганд-зв’язувального позаклітинного домену з багатою на цистеїн ділянкою, 9 UA 101309 C2 5 10 15 трансмембранного домену та цитоплазматичного домену з прогнозованою активністю серин/треонінкінази. Термін "поліпептид ActRIIb" включає поліпептиди, які включають будь-який природний поліпептид члена родини ActRIIb, а також будь-які його варіанти (включаючи мутанти, фрагменти, злиття та пептидоміметичні форми), які зберігають корисну активність. Див., наприклад, WO/2006/012627. Наприклад, до поліпептидів ActRIIb належать поліпептиди, які походять від послідовності будь-якого відомого ActRIIb, які мають послідовність, принаймні приблизно на 80% ідентичну послідовності поліпептиду ActRIIb, необов’язково – ідентичну принаймні на 85%, 90%, 95%, 97%, 99% або більше. Наприклад, поліпептид ActRIIb згідно з винаходом може зв’язуватися й інгібувати функцію білка ActRIIb та/або активіну. Поліпептид ActRIIb відбирають на активність у сприянні утворенню еритроцитів in vivo. Прикладами поліпептидів ActRIIb є поліпептид-прекурсор людського ActRIIb (SEQ ID NO: 15) та розчинні людські поліпептиди ActRIIb (наприклад, SEQ ID NO: 16, 17, 20 та 21). Послідовність білка-прекурсора людського ActRIIb є такою: Сигнальний пептид підкреслено однією лінією; позаклітинний домен виділено жирним шрифтом, і можливі N-зв’язані місця глікозилування є обведеними. Послідовність розчинного (позаклітинного) обробленого поліпептиду людського ActRIIb є такою: 20 25 C-кінцевий "хвіст" позаклітинного домену є підкресленим. Послідовність з делетованим "хвостом" (послідовність Δ15) є такою: SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSS GTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHL PEA SEQ ID NO: 17) Нуклеїновокислотна послідовність, яка кодує білок-прекурсор людського ActRIIb є такою: (нуклеотиди 5-1543 зі зразка у Genbank NM_001106) 10 UA 101309 C2 Нуклеїновокислотна послідовність, людського ActRIIa , є такою: яка кодує 11 розчинний (позаклітинний) поліпептид UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 У конкретному варіанті втілення винахід стосується розчинних поліпептидів ActRII. Як описується авторами даного винаходу, термін "розчинний поліпептид ActRII" в цілому стосується поліпептидів, які включають позаклітинний домен білка ActRIIa або ActRIIb. Вжитий авторами термін "розчинний поліпептид ActRII" включає будь-який природний позаклітинний домен білка ActRIIa або ActRIIb, а також будь-які його варіанти (включаючи мутанти, фрагменти та пептидоміметичні форми). Активін-зв’язувальний поліпептид ActRII є таким, що зберігає здатність до зв’язування з активіном, зокрема, активіном AA, AB або BB, або формами, які включають субодиницю C або E. Необов’язково активін-зв’язувальний поліпептид ActRII зв’язується з активіном AA з константою дисоціації 1 нM або менше. Позаклітинний домен білка ActRII зв’язується з активіном і зазвичай є розчинним, а отже, може називатися розчинним, активін-зв’язувальним поліпептидом ActRII. Прикладами розчинних, активін-зв’язувальних поліпептидів ActRIIa є розчинні поліпептиди, представлені у SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12 та 13. SEQ ID NO:7 вказується як ActRIIa-hFc і докладніше описується у Прикладах. Інші приклади розчинних, активін-зв’язувальних поліпептидів ActRIIa включають сигнальну послідовність, додаткову до позаклітинного домену білка ActRIIa, наприклад лідерну послідовність бджолиного мелітину (SEQ ID NO: 8), лідерну послідовність тканинного активатора плазміногену (TPA) (SEQ ID NO: 9) або лідерну послідовність природного ActRIIa (SEQ ID NO: 10). Поліпептид ActRIIa-hFc, показаний у SEQ ID NO: 13, використовує лідерну послідовність TPA. Приклади розчинних, активін-зв’язувальних поліпептидів ActRIIb включають розчинні поліпептиди, представлені у SEQ ID NO: 16, 17, 20. Активін-зв’язувальні поліпептиди ActRIIb також можуть включати сигнальну послідовність, додаткову до позаклітинного домену білка ActRIIb, наприклад, лідерну послідовність бджолиного мелітину (SEQ ID NO: 8) або лідерну послідовність тканинного активатора плазміногену (TPA) (SEQ ID NO: 9). Функціонально активні варіанти поліпептидів ActRII одержують шляхом скринінгу бібліотек модифікованих поліпептидів, рекомбінантно утворених з відповідних мутагенізованих нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид ActRII. Крім того, фрагменти можуть бути хімічно синтезовані з застосуванням способів, відомих спеціалістам у даній галузі, таких, як традиційний твердофазний синтез f-Moc або t-Boc за Мерифілдом. Фрагменти утворюють (рекомбінантно або шляхом хімічного синтезу) і випробують для розпізнавання пептидильних фрагментів, які можуть функціонувати як антагоністи (інгібітори) білка ActRII або сигналу, опосередкованого активіном. Функціонально активні варіанти поліпептидів ActRII одержують шляхом скринінгу бібліотек модифікованих поліпептидів, рекомбінантно утворених з відповідних мутагенізованих нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид ActRII. Варіанти утворюють і випробують для виявлення тих, які можуть функціонувати як антагоністи (інгібітори) білка ActRII або сигналу, опосередкованого активіном. У деяких варіантах втілення функціональний варіант поліпептидів ActRII включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 75% ідентичною амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NO: 2 або 3. У деяких випадках функціональний варіант має амінокислотну послідовність, принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичну амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NO: 2 або 3. У деяких варіантах втілення функціональний варіант поліпептидів ActRIIb включає амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 75% ідентичною амінокислотній послідовності, вибраній зпоміж SEQ ID NO: 16 або 17. У деяких випадках функціональний варіант має амінокислотну послідовність, принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичну амінокислотній послідовності, вибраній з-поміж SEQ ID NO: 17 або 18. Функціональні варіанти одержують шляхом модифікації структури поліпептиду ActRII з такимицілями, як підвищення терапевтичної ефективності або стійкості (наприклад, терміну зберігання ex vivo та стійкості до протеолітичного розпаду in vivo). Такі модифіковані 12 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поліпептиди ActRII, якщо відбираються для збереження зв’язування активіну, вважаються функціональними еквівалентами природних поліпептидів ActRII. Модифіковані поліпептиди ActRII також можуть бути утворені, наприклад, шляхом заміщення, делеції або додавання амінокислот. Наприклад, існують підстави очікувати, що окрема заміна лейцину на ізолейцин або валін, аспартату на глутамат, треоніну на серин, або інша подібна заміна амінокислоти на споріднену за структурою амінокислоту (наприклад, консервативні мутації) не матимуть значного впливу на біологічну активність утвореної в результаті молекули. Консервативними замінами є ті, які відбуваються у межах родини амінокислот, які є спорідненими за їхніми боковими ланцюгами. Чи буде в результаті зміни в амінокислотній послідовності поліпептиду ActRII утворено функціональний гомолог, можна легко визначити шляхом оцінки здатності варіанта поліпептиду ActRII до викликання реакції у клітинах у спосіб, подібний до викликання поліпептидом ActRII дикого типу. У деяких варіантах втілення даний винахід передбачає конкретні мутації поліпептидів ActRII для зміни глікозилування поліпептиду. Такі мутації можуть бути вибрані таким чином, щоб ввести або видалити одне або кілька місць глікозилування, такі, як O-зв’язані або N-зв’язані місця глікозилування. Аспарагін-зв’язані ділянки розпізнавання глікозилування зазвичай включають трипептидну послідовність, аспарагін-X-треонін (або аспарагіни-X-серин) (де "X" є будь-якою амінокислотою), яка специфічно розпізнається відповідними ферментами клітинного глікозилування. Зміну також здійснюють шляхом додавання або заміщення одним або кількома сериновими або треоніновими залишками у послідовності поліпептиду ActRII дикого типу (Oзв’язані місця глікозилування). Різні амінокислотні заміщення або делеції в одній або обох першій або третій амінокислотних позиціях ділянки розпізнавання глікозилування (та/або делеція амінокислоти у другій позиції) в результаті ведуть до деглікозилування у модифікованій трипептидній послідовності. Іншим засобом збільшення кількості вуглеводних компонентів на поліпептиді ActRII є хімічне або ферментне з’єднання глікозидів з поліпептидом ActRII. Залежно від застосовуваного режиму з’єднання, цукор (цукри) може(уть) приєднуватися до (a) аргініну та гістидину; (b) вільних карбоксильних груп; (c) вільних сульфгідрильних груп, такі, як групи цистеїну; (d) вільних гідроксильних груп, таких, як групи серину, треоніну або гідроксипроліну; (e) ароматичних залишків, таких, як залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану; або (f) амідної групи глутаміну. Видалення одного або кількох вуглеводних компонентів, присутніх на поліпептиді ActRII, може здійснюватися хімічно та/або ферментативно. Хімічне деглікозилування може включати, наприклад, піддавання поліпептиду ActRII дії сполуки трифторометансульфонової кислоти або рівноцінної сполуки. Ця обробка в результаті забезпечує розщеплення більшості або всіх цукрів, за винятком зв’язувального цукру (Nацетилглюкозаміну або N-ацетилгалактозаміну), не займаючи амінокислотну послідовність. Ферментного розщеплення вуглеводних компонентів на поліпептидах ActRII досягають шляхом застосування різних ендо- та екзоглікозидаз, як описано у публікації Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Послідовність поліпептиду ActRII може регулюватися відповідним чином, залежно від типу застосовуваної експресійної системи, оскільки клітини ссавців, дріжджів, комах та рослин можуть мати різні моделі глікозилування, на які може впливати амінокислотна послідовність пептиду. Як правило, білки ActRIIa, які застосовують для людей, мають експресуватися у клітинній лінії ссавця, що забезпечує належне глікозилування, наприклад, клітинних лініях HEK293 або CHO, хоча також можуть бути корисними інші експресійні клітинні лінії ссавців. Цей винахід також передбачає спосіб створення мутантів, зокрема, наборів комбінаторних мутантів поліпептиду ActRII, а також зрізаних мутантів; пули комбінаторних мутантів є особливо корисними для розпізнавання функціональних варіантів послідовностей. Метою відбору таких комбінаторних бібліотек може бути створення, наприклад, варіантів поліпептиду ActRII, які можуть діяти як агоністи або антагоністи, або, в альтернативному варіанті, які демонструють зовсім нову активність. Різні аналізи для відбору представлено нижче, і такі аналізи можуть застосовуватися для оцінки варіантів. Наприклад, варіант поліпептиду ActRII може бути відібраний на здатність до зв’язування з лігандом ActRII для запобігання зв’язуванню ліганду ActRII з поліпептидом ActRII або для перешкоджання сигналові, викликаного лігандом ActRII. Активність поліпептиду ActRII або його варіантів також може випробуватися шляхом аналізу на основі клітин або in vivo. Наприклад, оцінюють вплив варіанта поліпептиду ActRIIa на експресію генів, які беруть участь у гематопоезі. Таку оцінку у разі необхідності здійснюють у присутності одного або кількох рекомбінантних лігандних білків ActRII (наприклад, активіну), і клітини можуть бути трансфіковані таким чином, щоб створювати поліпептид ActRII та/або його варіанти та, необов’язково, ліганд ActRII. Подібним чином поліпептид ActRIIa вводять в організм 13 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 миші або іншої тварини і оцінюють одну або кілька характеристик крові, таких, як число RBC, гемоглобін або число ретикулоцитів. Можуть бути створені комбінаторно отримані варіанти, які мають вибіркову або в цілому підвищену ефективність відносно природного поліпептиду ActRII. Подібним чином мутагенез може створювати варіанти, які мають внутрішньоклітинний період піврозпаду, різко відмінний від показника відповідного поліпептиду ActRII дикого типу. Наприклад, змінений білок можна зробити більш стійким або менш стійким до протеолітичного розпаду або інших клітинних процесів, які в результаті ведуть до руйнування або інактивації природного поліпептиду ActRII. Такі варіанти та гени, які їх кодують, застосовують для зміни рівня поліпептиду ActRIIa шляхом модулювання періодів піврозпаду поліпептидів ActRII. Наприклад, короткий період піврозпаду може викликати більш короткочасний біологічний ефект і у межах індуцибельної експресійної системи може забезпечувати більш жорсткий контроль рівня рекомбінантного поліпептиду ActRII у клітині. У злитому білку Fc можуть здійснюватися мутації у лінкері (за наявності) та/або Fc-частині для зміни періоду піврозпаду білка. Комбінаторну бібліотеку створюють через дегенеровану бібліотеку генів, які кодують бібліотеку поліпептидів, які можуть включати принаймні частину можливих послідовностей поліпептиду ActRII. Наприклад, суміш синтетичних олігонуклеотидів може бути ферментативно лігована у послідовності генів таким чином, щоб можливі нуклеотидні послідовності поліпептиду ActRII з дегенерованого набору могли експресуватися в окремих поліпептидах або, в альтернативному варіанті, як набір більших злитих білків (наприклад, для фагового дисплея). Існує багато способів створення бібліотеки потенційних гомологів з дегенерованої олігонуклеотидної послідовності. Хімічний синтез дегенерованої генної послідовності здійснюють в автоматичному синтезаторі ДНК і синтетичні гени після цього лігують у відповідний вектор для експресії. Синтез дегенерованих олігонуклеотидів є загальновідомим серед спеціалістів у даній галузі (див., наприклад, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Такі способи застосовують для спрямованої еволюції інших білків (див., наприклад, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; а також патенти США №№: 5,223,409, 5,198,346 та 5,096,815). В альтернативному варіанті для створення комбінаторної бібліотеки можуть застосовуватись інші форми мутагенезу. Наприклад, варіанти поліпептиду ActRII можуть бути утворені й виділені з бібліотеки шляхом відбору з застосуванням, наприклад, аланін-скануючого мутагенезу та інших подібних способів (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; та Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), шляхом лінкер-скануючого мутагенезу (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); шляхом насичувального мутагенезу (Meyers et al., (1986) Science 232:613); шляхом PCR-мутагенезу (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); або шляхом випадкового мутагенезу, включаючи хімічний мутагенез, і т. ін. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; та Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Лінкер-скануючий мутагенез, зокрема, у комбінаторних умовах, є привабливим способом розпізнавання зрізаних (біологічно активних) форм поліпептидів ActRII. Спеціалістам у даній галузі відомі різні способи скринінгу генних продуктів комбінаторних бібліотек, які одержують шляхом точкових мутацій та зрізання, тобто, фактично, скринінгу бібліотек кДНК генних продуктів, які мають певну властивість. Такі способи зазвичай можуть бути пристосовані для швидкого скринінгу бібліотек генів, створених шляхом комбінаторного мутагенезу поліпептидів ActRII. Найбільш поширені способи скринінгу великих бібліотек генів зазвичай включають клонування генної бібліотеки у репліковані вектори експресії, трансформацію відповідних клітин утвореною в результаті бібліотекою векторів та експресування комбінаторних генів в умовах, у яких виявлення потрібної активності забезпечує відносно легке виділення вектора, який кодує ген, продукт якого було виявлено. До аналізів, яким віддають перевагу, належать аналізи зв’язування активіну та аналізи опосередкованого активіном сигналу клітин. У деяких варіантах втілення поліпептиди ActRII згідно з винаходом також можуть включати посттрансляційні модифікації додатково до будь-яких, що є присутніми у поліпептидах ActRII у 14 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 природі. До таких модифікацій, крім інших, належать ацетилування, карбоксилування, глікозилування, фосфорилування, ліпідування та ацилування. В результаті модифіковані поліпептиди ActRII можуть містити неамінокислотні елементи, такі, як поліетиленгліколі, ліпіди, полі- або моносахарид та фосфати. Вплив таких неамінокислотних елементів на функціональність поліпептиду ActRII може випробуватися, як описано авторами для інших варіантів поліпептиду ActRII. Коли поліпептид ActRII утворюється у клітинах шляхом розщеплення виникаючої форми поліпептиду ActRII, посттрансляційна обробка також може бути важливою для правильного складання та/або функціонування білка. Різні клітини (такі, як CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 або HEK293) мають свою клітинну структуру та характерні механізми для такої посттрансляційної активності і можуть бути вибрані для забезпечення правильної модифікації та обробки поліпептидів ActRII. У деяких аспектах функціональні варіанти або модифіковані форми поліпептидів ActRII включають злиті білки, які мають принаймні частину поліпептидів ActRII та один або кілька злитих доменів. Загальновідомими прикладами таких злитих доменів є, крім інших, полігістидин, Glu-Glu, глутатіон-S-трансфераза (GST), тіоредоксин, протеїн A, протеїн G, постійну ділянку важкого ланцюга імуноглобуліну (Fc), білок зв’язування мальтози (MBP) або альбумін людської сироватки. Злитий домен може бути вибраний таким чином, щоб забезпечувати потрібну властивість. Наприклад, деякі злиті домени є особливо корисними для виділення злитих білків шляхом афінної хроматографії. Для афінного очищення застосовують відповідні матриці для афінної хроматографії, такі, як кон’юговані з глутатіоном, амілазою та нікелем або кобальтом смоли. Багато з цих матриць існують у формі "набору", наприклад, система для очищення Pharmacia GST та система QIAexpress™ (Qiagen), які застосовують у моделях злиття (HIS 6). Як інший приклад, злитий домен може бути вибраний таким чином, щоб забезпечувати виявлення поліпептидів ActRII. Прикладами таких доменів виявлення є різні флуоресцентні білки (наприклад, GFP), а також "мітки епітопу", які зазвичай є короткими пептидними послідовностями, для яких існує специфічне антитіло. До загальновідомих міток епітопів, для яких існують легко доступні специфічні моноклональні антитіла, належать FLAG, гемаглютинін вірусу грипу (HA) та мітки c-myc. У деяких випадках злиті домени мають місце розщеплення протеазою, наприклад, для фактора Xa або тромбіну, яке дозволяє відповідній протеазі частково гідролізувати злиті білки і, таким чином, вивільнювати з них рекомбінантні білки. Вивільнені білки після цього можуть бути відокремлені від злитого домену шляхом наступного хроматографічного відокремлення. У деяких оптимальних варіантах втілення поліпептид ActRII є злитим з доменом, який стабілізує поліпептид ActRII in vivo ("стабілізуючий" домен). Під "стабілізацією" слід розуміти буд-який захід, який збільшує період піврозпаду в сироватці, незалежно від того, чи відбувається це через зменшення руйнування, зменшення виведення нирками або інший фармакокінетичний вплив. Відомо, що злиття з Fc частиною імуноглобуліну забезпечують потрібні фармакокінетичні властивості у різних білках. Подібним чином злиття з альбуміном людської сироватки також можуть забезпечувати потрібні властивості. До інших типів злитих доменів, які можуть бути вибрані, належать мультимеризуючі (наприклад, димеризуючі, тетрамеризуючі) домени та функціональні домени (які забезпечують додаткову біологічну функцію, таку, як подальше стимулювання росту м’язів). Як конкретний приклад, у даному винаході пропонується злитий білок, який включає розчинний позаклітинний домен ActRII, злитий з Fc доменом (наприклад, SEQ ID NO: 6). Як додатковий конкретний приклад даний винахід забезпечує злитий білок, який включає розчинний позаклітинний домен ActRIIb, злитий з Fc доменом (наприклад, SEQ ID NO: 21). Необов’язково Fc домен має одну або кілька мутацій у залишках, таких, як Asp-265, лізин 322 та Asn-434. У деяких випадках мутантний Fc домен, який має одну або кілька з цих мутацій 15 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, мутацію Asp-265), має знижену здатність до зв’язування з рецептором Fcγ порівняно з Fc доменом дикого типу. В інших випадках мутантний Fc домен, який має одну або кілька з цих мутацій (наприклад, мутацію Asn-434) має підвищену здатність до зв’язування з пов’язаним з MHC класу I Fc-рецептором (FcRN) порівняно з Fc доменом дикого типу. Слід розуміти, що різні елементи злитих білків можуть розташовуватися будь-яким чином, якщо це відповідає потрібній функціональності. Наприклад, поліпептид ActRII може бути розташований у C-кінцевій позиції до гетерологічного домену, або, в альтернативному варіанті, гетерологічний домен може бути розташований у C-кінцевій позиції до поліпептиду ActRII. Домен поліпептиду ActRII та гетерологічний домен не обов’язково мають прилягати до злитого білка, і додаткові домени або амінокислотні послідовності можуть бути включені у C- або Nкінцевій позиції до будь-якого домену або між доменами. У деяких варіантах втілення поліпептиди ActRII згідно з даним винаходом містять одну або кілька модифікацій, які є здатними стабілізувати поліпептиди ActRII. Наприклад, такі модифікації підвищують in vitro період піврозпаду поліпептидів ActRII, збільшують період піврозпаду поліпептидів ActRII в системі кровообігу або знижують протеолітичний розпад поліпептидів ActRII. До таких стабілізуючих модифікацій належать, крім інших, злиті білки (включаючи, наприклад, злиті білки, які включають поліпептид ActRII та стабілізуючий домен), модифікації місця глікозилування (включаючи, наприклад, додавання місця глікозилування до поліпептиду ActRII) та модифікації вуглеводного компонента (включаючи, наприклад, видалення вуглеводних компонентів з поліпептиду ActRII). Вжитий авторами термін "стабілізуючий домен" не лише стосується злитого домену (наприклад, Fc), як у разі злитих білків, але також включає небілкові модифікації, такі, як вуглеводний компонент, або небілковий полімер, такий, як поліетиленгліколь. У деяких варіантах втілення даний винахід забезпечує виділені та/або очищені форми поліпептидів ActRII, які є відокремленими або іншим чином є вільними від інших білків. Поліпептиди ActRII зазвичай утворюють шляхом експресії з рекомбінантних нуклеїнових кислот. 3. Нуклеїнові кислоти, які кодують поліпептиди ActRII У деяких аспектах винахід забезпечує виділені та/або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, які кодують будь-які з поліпептидів ActRIIa (наприклад, розчинні поліпептиди ActRIIa та розчинні поліпептиди ActRIIb), включаючи описані авторами фрагменти, функціональні варіанти та злиті білки. Наприклад, SEQ ID NO: 4 кодує природний поліпептид-прекурсор людського ActRIIa, а SEQ ID NO: 5 кодує оброблений позаклітинний домен ActRIIa. Наприклад, SEQ ID NO: 18 кодує природний поліпептид-прекурсор людського ActRIIb, тоді, як SEQ ID NO: 19 кодує оброблений позаклітинний домен ActRIIb. Дані нуклеїнові кислоти можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими. Такі нуклеїнові кислоти можуть бути молекулами ДНК або РНК. Ці нуклеїнові кислоти можуть застосовуватися, наприклад, у способах одержання поліпептидів ActRII або як безпосередні терапевтичні агенти (наприклад, у генній терапії). У деяких аспектах слід розуміти, що до нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди ActRIIa, також належать нуклеїнові кислоти, які є варіантами SEQ ID NO: 4 або 5. У деяких аспектах слід розуміти, що до нуклеїнових кислот, які кодують поліпептиди ActRIIb, також належать нуклеїнові кислоти, які є варіантами SEQ ID NO: 18 або 19. До варіантів нуклеотидних послідовностей належать послідовності, які відрізняються заміщеннями, додаваннями або делеціями одного або кількох нуклеотидів, такі, як алельні варіанти. У деяких варіантах втілення винахід забезпечує виділені або рекомбінантні нуклеїновокислотні послідовності, які є принаймні на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичними SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19. Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що нуклеїновокислотні послідовності, комплементарні SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19, та варіанти SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19 також охоплюються обсягом цього винаходу. В інших варіантах втілення нуклеїновокислотні послідовності згідно з винаходом можуть бути виділеними, рекомбінантними та/або злитими з гетерологічною нуклеотидною послідовністю або у бібліотеці ДНК. В інших варіантах втілення нуклеїнові кислоти згідно з винаходом також включають нуклеотидні послідовності, які гібридизуються за дуже жорстких умов з нуклеотидною послідовністю, позначеною як SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19, комплементарною послідовністю SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19, або їх фрагментами. Як обговорювалося вище, спеціалістові у даній галузі легко стане зрозуміло, що відповідні жорсткі умови, які сприяють гібридизації ДНК, можуть бути різними. Спеціалістові у даній галузі легко стане зрозуміло, що відповідні жорсткі умови, які сприяють гібридизації ДНК, можуть бути різними. Наприклад, можна здійснювати гібридизацію при 6,0 x хлориду натрію/цитрату натрію (SSC) при приблизно 45 °C з наступним промиванням 2,0 x SSC при 50 °C. Наприклад, концентрація на етапі промивання може бути вибрана з-поміж умов від низької жорсткості приблизно 2,0 x SSC при 50 °C до високої жорсткості приблизно 0,2 16 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 x SSC при 50 °C. Крім того, температура на етапі промивання може бути збільшена від умов низької жорсткості при кімнатній температурі, приблизно 22 °C, до умов високої жорсткості при приблизно 65 °C. Температура та концентрація солей можуть змінюватися, або можуть підтримуватися на постійному рівні при варіюванні іншої змінної. В одному варіанті втілення винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, які гібридизуються за умов низької жорсткості 6 x SSC при кімнатній температурі з наступним промиванням 2 x SSC при кімнатній температурі. Виділені нуклеїнові кислоти, які відрізняються від нуклеїнових кислот, представлених у SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19, через дегенерацію у генетичному коді, також охоплюються обсягом винаходу. Наприклад, багато амінокислот позначаються більш, ніж одним триплетом. Кодони, які визначають одну амінокислоту, або синоніми (наприклад, CAU та CAC є синонімами гістидину) в результаті можуть вести до "мовчазних" мутацій, які не впливають на амінокислотну послідовність білка. Однак, за припущеннями поліморфізми послідовності ДНК, які призводять до змін в амінокислотних послідовностях даних білків, мають існувати у клітинах ссавців. Спеціалістові у даній галузі стане зрозуміло, що ці зміни в одному або кількох нуклеотидах (до приблизно 3-5% нуклеотидів) нуклеїнових кислот, які кодують конкретний білок, можуть існувати серед особин даного виду через природну алельну варіацію. . Будь-які і всі подібні варіації нуклеотидів та утворені в результаті амінокислотні поліморфізми охоплюються обсягом цього винаходу. У деяких варіантах втілення рекомбінантні нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть бути функціонально зв’язаними з одним або кількома регуляторними нуклеотидними послідовностями в експресійній конструкції. Регуляторні нуклеотидні послідовності зазвичай мають бути прийнятними для клітини-хазяїна, яку використовують для експресії. Спеціалістам відомо багато типів прийнятних експресійних векторів та відповідних регуляторних послідовностей для різних клітин-хазяїв. Зазвичай вищезгадані одна або кілька регуляторних нуклеотидних послідовностей можуть включати, крім інших, промоторні послідовності, лідерні або сигнальні послідовності, місця зв’язування рибосом, транскрипційні стартові та термінуючі послідовності, трансляційні стартові або термінуючі послідовності та послідовності енхансерів або активаторів. Винахід охоплює конститутивні або індуцибельні промотори, відомі спеціалістам у даній галузі. Промотори можуть бути або природними промоторами, або гібридними промоторами, в яких поєднуються елементи кількох промоторів. Експресійна конструкція може бути присутньою в клітині на епісомі, такій, як плазміда, або ж експресійна конструкція може бути вставлена у хромосому. В оптимальному варіанті втілення експресійний вектор містить селектований ген-маркер, який дозволяє відбирати трансформовані клітинихазяї. Гени-маркери, які можуть бути відібрані, є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі і можуть бути різними для різних клітин-хазяїв. У деяких аспектах винаходу дана нуклеїнова кислота забезпечується в експресійному векторі, який включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид ActRII і є функціонально зв’язаним з принаймні однією регуляторною послідовністю. Регуляторні послідовності є визнаними серед спеціалістів і вибираються таким чином, щоб спрямовувати експресію поліпептиду ActRII. Відповідним чином, термін “регуляторна послідовність” включає промотори, енхансери та інші елементи контролю експресії. Приклади регуляторних послідовностей описуються у публікації Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Наприклад, будь-яка з різних послідовностей контролю експресії, яка контролює експресію послідовності ДНК, коли функціонально зв’язується з нею, може використовуватись у цих векторах для експресії послідовностей ДНК, які кодують поліпептид ActRII. До таких корисних послідовностей контролю експресії належать, наприклад, ранні та пізні промотори SV40, tet-промотор, безпосередній ранній промотор аденовірусу або цитомегаловірусу, RSV промотори, lac-система, trp-система, TAC або TRC система, T7 промотор, експресія якого спрямовується T7 RNA полімеразою, головні операторні та промоторні ділянки фага лямбда, контрольні ділянки для вірусного білка fd, промотор для 3фосфогліцераткінази або інші гліколітичні ферменти, промотори кислотної фосфатази, наприклад, Pho5, промотори α-факторів спарювання дріжджів, промотор поліедрону бакуловірусної системи та інші послідовності, про які відомо, що вони контролюють експресію генів прокаріотних або еукаріотних клітин або їх вірусів, та їх різні комбінації. Слід розуміти, що будова експресійного вектора може залежати від таких чинників, як вибір клітини-хазяїна, яка піддається перетворенню, та/або тип білка, який має бути експресований. Крім того, також слід враховувати кількість копій вектора, здатність до контролювання цієї кількості копій та експресія будь-якого іншого білка, який кодується вектором, таким, як антибіотичні маркери. Рекомбінантна нуклеїнова кислота згідно з винаходом може бути утворена шляхом лігування клонованого гена або його частини у вектор, придатний для експресії в прокаріотних 17 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах, еукаріотних клітинах (дріжджів, птахів, комах або ссавців), або і тих, і інших. Носіями експресії для створення рекомбінантного поліпептиду ActRII є плазміди та інші вектори. Наприклад, до прийнятних векторів належать плазміди таких типів: похідні від pBR322 плазміди, похідні від pEMBL плазміди, похідні від pEX плазміди, похідні від pBTac плазміди та похідні від pUC плазміди для експресії у прокаріотних клітинах, таких, як E. coli. Деякі експресійні вектори ссавців містять прокаріотні послідовності для сприяння поширенню вектора у бактеріях, та одну або кілька еукаріотних транскрипційних одиниць, які експресуються в еукаріотних клітинах. Похідні від pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo та pHyg вектори є прикладами експресійних векторів ссавців, придатних для трансфекції еукаріотних клітин. Деякі з цих векторів модифікують послідовностями з бактеріальних плазмід, таких, як pBR322, для сприяння реплікації та вибору резистентності до медикаменту в прокаріотних та еукаріотних клітинах. В альтернативному варіанті похідні вірусів, таких, як вірус папіломи великої рогатої худоби (BPV-1) або вірус Епштейна-Барр (похідні від pHEBo, pREP та p205) можуть застосовуватися для короткочасної експресії білків в еукаріотних клітинах. Приклади інших вірусних (включаючи ретровірусні) експресійних систем можна знайти нижче в описі систем забезпечення генної терапії. Різні способи, які застосовують в одержанні плазмід та трансформації організмів-хазяїв, є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Інші прийнятні експресійні системи для прокаріотних та еукаріотних клітин, а також загальні рекомбінантні процедури описуються у публікації Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). У деяких випадках може бути бажаною експресія рекомбінантних поліпептидів шляхом застосування бакуловірусної експресійної системи. Прикладами таких бакуловірусних експресійних систем є похідні від pVL вектори (такі, як pVL1392, pVL1393 та pVL941), похідні від pAcUW вектори (такі, як pAcUWl) та похідні від pBlueBac вектори (такі, як pBlueBac III, що містить β-gal). В оптимальному варіанті втілення для утворення потрібних поліпептидів ActRIIa у клітинах CHO призначається вектор, такий, як вектор Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), вектори pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) та вектори pCI-neo (Promega, Madison, Wisc). Як стане зрозуміло, потрібні послідовності генів застосовують для викликання експресії потрібних поліпептидів ActRII у клітинах, які поширюються у культурі, наприклад, для утворення білків, включаючи злиті білки або варіанти білків, для очищення. Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, трансфікованої рекомбінантним геном, який включає кодуючу послідовність (наприклад, SEQ ID NO: 4, 5, 18 або 19) для одного або кількох потрібних поліпептидів ActRII. Клітина-хазяїн може бути будь-якою прокаріотною або еукаріотною клітиною. Наприклад, поліпептид ActRII згідно з винаходом може експресуватися в бактеріальних клітинах, таких, як E. coli, клітинах комах (наприклад, з застосуванням бакуловірусної експресійної системи), клітинах дріжджів або ссавців. Інші прийнятні клітинихазяї є відомими спеціалістам у даній галузі. Відповідно, даний винахід також стосується способів створення потрібних поліпептидів ActRII. Наприклад, клітина-хазяїн, трансфікована експресійним вектором, який кодує поліпептид ActRIIa або ActRIIb, може бути культивована за відповідних умов, які дозволяють відбуватись експресії поліпептиду ActRII. Поліпептид ActRII може бути секретований і виділений з суміші клітин та середовища, яка містить поліпептид ActRII. В альтернативному варіанті поліпептид ActRII може утримуватись у цитоплазмі або у мембранній фракції, і клітини збирають, піддають лізисові й білок відокремлюють. Культура клітин включає клітини-хазяї, середовища та інші побічні продукти. Придатні середовища для клітинної культури є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Потрібні поліпептиди ActRII можуть бути відокремлені від середовища культури клітин, клітин-хазяїв або і того, й іншого, з застосуванням відомих спеціалістам способів очищення білків, включаючи іонообмінну хроматографію, гельфільтрацію, ультрафільтрацію, електрофорез, імуноафінне очищення антитілами, специфічними до конкретних епітопів поліпептидів ActRII, та афінне очищення агентом, який зв’язується з доменом, злитим з поліпептидом ActRII (наприклад, колонку протеїну A застосовують для очищення злиття ActRIIa-Fc або ActRIIb-Fc). В оптимальному варіанті втілення поліпептид ActRII є злитим білком, який містить домен, який сприяє його очищенню. В оптимальному варіанті втілення очищення досягають за допомогою серії етапів колонкової хроматографії, включаючи, наприклад, три або більше з нижчезазначених етапів у будь-якому порядку: хроматографію білка A, хроматографію на Q-сефарозі, хроматографію на фенілсефарозі, ексклюзійну хроматографію та катіонообмінну хроматографію. Очищення може довершуватися вірусною фільтрацією та зміною буфера. Як було продемонстровано авторами, білок ActRIIa-hFc очищали до ступеня очищення >98%, як визначають шляхом хроматографії з 18 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виключенням за розміром і >95%, як визначають шляхом SDS PAGE. Цей рівень очищення був достатнім для досягнення потрібних результатів у мишей, щурів та відмінних від людини приматів. В іншому варіанті втілення злитий ген, який кодує лідерну послідовність очищення, таку, як послідовність ділянки розщеплення полі-(His)/ентерокіназою на N-кінці потрібної частини рекомбінантного поліпептиду ActRII, може забезпечувати очищення експресованого злитого 2+ білка шляхом афінної хроматографії з застосуванням смоли з іоном металу Ni . Лідерна послідовність очищення після цього може бути видалена шляхом обробки ентерокіназою для забезпечення очищеного поліпептиду ActRII (див., наприклад, публікації Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; та Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). Способи одержання злитих генів є загальновідомими. По суті, з’єднання різних фрагментів ДНК, які кодують різні поліпептидні послідовності, здійснюють згідно з традиційними способами з застосуванням blunt-ended або stagger-ended кінців для лігування, гідролізу рестрикційним ферментом для забезпечення потрібних кінців, заповнення когезивних кінців у відповідних випадках, обробки лужною фосфатазою для уникнення небажаного приєднання та ферментного лігування. В іншому варіанті втілення злитий ген може бути синтезований традиційними способами, включаючи застосування автоматичних синтезаторів ДНК. В альтернативному варіанті здійснюють PCR-ампліфікацію фрагментів генів, застосовуючи якірні праймери, які викликають комплементарні виступи між двома послідовними фрагментами генів, які згодом можуть бути випалені для створення химерної послідовності гена (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). 4. Альтернативні антагоністи активіну та ActRII Представлені авторами дані демонструють, що антагоністи сигналу активіну-ActRII можуть застосовуватися для підвищення рівня еритроцитів або гемоглобіну. Хоча розчинні поліпептиди ActRIIa та ActRIIb, зокрема, ActRIIa-Fc та ActRIIb-Fc, є оптимальними антагоністами, і хоча такі антагоністи можуть впливати на рівень еритроцитів через механізм, відмінний від антагонізму до активіну (наприклад, інгібування активіну може бути показником схильності агента до інгібування активності спектра молекул, включаючи, можливо, інші члени надродини TGF-бета, і таке колективне інгібування може забезпечувати потрібний вплив на гематопоез), інші типи антагоністів активіну-ActRII також можуть бути корисними, включаючи антитіла проти активіну (наприклад, активін βA, βB, βC та βE), антитіла проти ActRIIa, антитіла проти ActRIIb, антисмислові, РНКі або рибозимні нуклеїнові кислоти, які інгібують продукування ActRIIa та/або ActRIIb, та інші інгібітори активіну, ActRIIb або ActRIIa, зокрема, ті, які розривають зв’язування активіну-ActRIIa та/або активіну-ActRIIb. Антитіло, яке специфічно реагує з поліпептидом ActRII (наприклад, розчинним поліпептидом ActRIIa або ActRIIb) і яке конкурентно зв’язується з лігандом з поліпептидом ActRII або іншим чином інгібує опосередкований ActRII сигнал, може застосовуватись як антагоніст активності поліпептиду ActRII. Подібним чином антитіло, яке специфічно реагує з активіном β A, βB, βC або βE або будь-яким його гетеродимером, і яке розриває зв’язування ActRIIa та/або ActRIIb, може застосовуватись як антагоніст. Шляхом застосування імуногенів, які походять від поліпептиду ActRIIa, поліпептиду ActRIIb або активіну, за допомогою стандартних протоколів одержують протибілкові / протипептидні протисироватки або моноклональні антитіла (див., наприклад, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ссавець, такий, як миша, хом’як або кріль, може бути імунізований імуногенною формою поліпептиду ActRIIa або ActRIIb, антигенним фрагментом, який здатен викликати реакцію на антитіло, або злитим білком. До способів забезпечення імуногенності для білка або пептиду, належать кон’югація з носіями або інші способи, загальновідомі серед спеціалістів у даній галузі. Імуногенну частину поліпептиду ActRIIa або активіну вводять у присутності ад’юванта. За процесом імунізації спостерігають через виявлення титрів антитіла у плазмі або сироватці. Для оцінки рівня антитіл застосовують стандартний аналіз ELISA або інші імуноаналізи з імуногеном як антигеном. Після імунізації тварини антигенною композицією активіну, поліпептиду ActRIIa або ActRIIb одержують антисироватки і, у разі необхідності, поліклональні антитіла можуть бути відокремлені від сироватки. Для одержання моноклональних антитіл продукуючі антитіло клітини (лімфоцити) беруть у імунізованої тварини і зливають шляхом стандартного злиття соматичних клітин з імморталізуючими клітинами, такими, як клітини мієломи, для утворення клітин гібридоми. Такі способи є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі, і до них належать, наприклад, гібридомна технологія (вперше розроблена Колером та Мільштейном (1975) Nature, 256: 495-497), гібридомна технологія з застосуванням людських B-клітин (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) та EBV-гібридомна технологія для одержання людських 19 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моноклональних антитіл (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Клітини гібридоми відбирають імунохімічним способом на продукування антитіл, які специфічно реагують з активіном, поліпептидом ActRIIa або ActRIIb та моноклональними антитілами, виділеними з культури, яка включає такі клітини гібридоми. Вжитий авторами термін "антитіло" включає цілі антитіла, наприклад, будь-якого ізотипу (IgG, IgA, IgM, IgE і т.д.), та фрагменти або домени імуноглобулінів, які здатні реагувати з вибраним антигеном. A Антитіла фрагментують, застосовуючи традиційні способи, і фрагменти відбирають на придатність та/або взаємодію зі специфічним епітопом. Таким чином, термін охоплює ділянки протеолітично розщеплених або рекомбінантно одержаних частин молекули антитіла, здатних селективно реагувати з певним білком. Необмежувальними прикладами таких протеолітичних та/або рекомбінантних фрагментів є Fab, F(ab')2, Fab', Fv та одноланцюгові антитіла (scFv), які містять домен V[L] та/або V[H], з’єднаний пептидним лінкером. scFv можуть бути ковалентно або нековалентно зв’язані для утворення антитіл, які мають два або більше місць зв’язування. Термін “антитіло” також стосується поліклональних, моноклональних або інших очищених препаратів антитіл та рекомбінантних антитіл. Термін "рекомбінантне антитіло" означає антитіло або антиген-зв’язувальний домен імуноглобуліну, який експресується з нуклеїнової кислоти, побудовані з застосуванням технологій молекулярної біології, наприклад, олюднене антитіло або повністю людське антитіло, яке походить від одноланцюгового антитіла. Однодоменні та одноланцюгові антитіла також охоплюються терміном "рекомбінантне антитіло". У деяких варіантах втілення антитіло згідно з винаходом є моноклональним антитілом, і у деяких варіантах втілення винахід передбачає застосування способів вироблення нових антитіл. Наприклад, спосіб вироблення моноклонального антитіла, яке специфічно зв’язується з поліпептидом ActRIIa, поліпептидом ActRIIb або активіном, може включати введення миші кількості імуногенної композиції, яка включає антигенний поліпептид, ефективний для стимуляції імунної реакції, що піддається виявленню, отримання продукуючих антитіло клітин (наприклад, клітин селезінки) з миші та злиття продукуючих антитіло клітин з клітинами мієломи для отримання продукуючих антитіло гібридом та випробування продукуючих антитіло гібридом для розпізнавання гібридоми, яка виробляє моноклональне антитіло, яке специфічно зв’язується з антигеном. Після отримання гібридома може бути поширена у культурі клітин, необов’язково в умовах культивування, за яких похідні від гібридоми клітини виробляють моноклональне антитіло, яке специфічно зв’язується з антигеном. Моноклональне антитіло може бути очищене від культури клітин. Вираз "специфічно реагує з", який стосується антитіла, означає, у загальноприйнятому у галузі значенні, що антитіло має достатню селективність між потрібним антигеном (наприклад, активіном, поліпептидом ActRIIa або ActRIIb) та іншими антигенами, які не мають відношення до призначення цього антитіла, принаймні виявляє присутність потрібного антигена у конкретному типі біологічного зразка. Згідно з деякими способами застосування антитіла, наприклад, з терапевтичними цілями, може бути бажаним більш високий ступінь специфічності зв’язування. Моноклональні антитіла зазвичай мають більшу схильність (порівняно з поліклональними антитілами) до ефективного розрізнення між потрібними антигенами та перехресно реагуючими поліпептидами. Одна з характеристик, яка впливає на специфічність антитіла: взаємодія з антигеном є афінністю антитіла до антигена. Хоча потрібна специфічність може бути досягнута при різних рівнях афінності, перевагу зазвичай віддають антитілам, які мають афінність -6 -7 -8 -9 (константу дисоціації) приблизно 10 , 10 , 10 , 10 або меншу. Крім того, способи, які застосовують для відбору антитіл з метою розпізнавання потрібного антитіла, можуть впливати на властивості одержаного антитіла. Наприклад, якщо антитіло має застосовуватися для зв’язування антигена у розчині, може бути бажаним випробування зв’язування розчину. Існують різні інші способи випробування взаємодії між антитілами та антигенами для розпізнавання особливо потрібних антитіл. До таких способів належать аналізи ELISA, аналізи зв’язування на основі поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, аналіз зв’язування Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Sweden), сендвіч-аналізи (наприклад, система парамагнітних кульок від IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), вестерн-блотинг, аналізи імунопреципітації та імуногістохімія. Прикладами категорій нуклеїновокислотних сполук, які є антагоністами активіну або ActRII, є антисмислові нуклеїнові кислоти, послідовності РНКі та каталітичні нуклеїновокислотні послідовності. Нуклеїновокислотна сполука може бути одно- або дволанцюговою. Дволанцюгова сполука також може включати ділянки нависання або некомплементарності, в яких один або інший з ланцюгів є одинарним. Одноланцюгова сполука може включати ділянки самокомплементарності, що означає, що сполука утворює так звану "шпильку" або "stem-loop" 20 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 структуру, з ділянкою подвійної спіральної структури. Нуклеїновокислотна сполука може включати нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною ділянці, яка складається не більше, ніж з 1000, не більше, ніж з 500, не більше, ніж з 250, не більше, ніж з 100 або не більше, ніж з 50, 35, 25, 22, 20, 18 або 15 нуклеотидів нуклеїновокислотної послідовності ActRII повної довжини або нуклеїновокислотної послідовності активіну A, B, C або E. Ділянка комплементарності в оптимальному варіанті має принаймні 8 нуклеотидів, необов’язково – приблизно від 18 до 35 нуклеотидів. Ділянка комплементарності може бути частиною інтрона, кодуючої послідовності або некодуючої послідовності заданого транскрипту, наприклад, частиною кодуючої послідовності. Зазвичай нуклеїновокислотна сполука має довжину від приблизно 8 до приблизно 500 нуклеотидів або пар основ, необов’язково довжина може складати від приблизно 14 до приблизно 50 нуклеотидів. Нуклеїновою кислотою може бути ДНК (зокрема, якщо застосовується як антисмислова), РНК або гібрид РНК:ДНК. Будь-який ланцюг може включати суміш ДНК та РНК, а також модифіковані форми, які не можуть бути напевно класифіковані як ДНК або РНК. Подібним чином, дволанцюгова сполука може являти собою ДНК:ДНК, ДНК:РНК або РНК:РНК, і будь-який ланцюг також може включати суміш ДНК та РНК, а також модифіковані форми, які не можуть бути напевно класифіковані як ДНК або РНК. Нуклеїновокислотна сполука може включати будь-яку з різних модифікацій, включаючи одну з модифікацій основного ланцюга (цукрово-фосфатну частину у природній нуклеїновій кислоті, включаючи міжнуклеотидні зв’язки) або основну частину (пуринову або піримідинову частину природної нуклеїнової кислоти). Антисмислова нуклеїновокислотна сполука в оптимальному варіанті має довжину від приблизно 15 до приблизно 30 нуклеотидів і часто містить одну або кілька модифікацій для поліпшення таких характеристик, як стійкість у сироватці, у клітині або у місці, до якого сполука може доставлятися, наприклад, у шлунку, якщо сполуки вводять перорально, та легенях, якщо сполуку вводять шляхом інгаляції. У разі послідовності РНКі ланцюг, комплементарний заданому транскриптові, зазвичай являє собою РНК або його модифікації. Іншим ланцюгом може бути РНК, ДНК або будь-який інший варіант. Подвійна частина дволанцюгової або одноланцюгової послідовності "шпильки" РНКі в оптимальному варіанті має довжину від 18 до 40 нуклеотидів, необов’язково, приблизно від 21 до 23 нуклеотидів, якщо вона служить як Dicer-субстрат. Каталітичні або ферментні нуклеїнові кислоти можуть бути ферментами рибозимів або ДНК і також можуть містити модифіковані форми. Нуклеїновокислотні сполуки можуть інгібувати експресію мішені приблизно на 50%, 75%, 90% або більше при контакті з клітинами за фізіологічних умов і при концентрації, за якої несмисловий або смисловий контроль не має або майже не має впливу. Оптимальна концентрація для випробування впливу нуклеїновокислотних сполук становить 1,5 та 10 мікромоль. Нуклеїновокислотні сполуки також можуть випробуватися на вплив, наприклад, на рівень еритроцитів. 5. Скринінгові аналізи У деяких аспектах даний винахід стосується застосування поліпептидів ActRII (наприклад, розчинних поліпептидів ActRIIa або ActRIIb) та поліпептидів активіну для розпізнавання сполук (агентів), які є агоністами або антагоністами шляху сигналу активіну-ActRIIa та/або активінуActRIIb. Сполуки, розпізнані шляхом такого відбору, піддають випробуванню на їхню здатність до регулювання рівня еритроцитів, гемоглобіну та/або ретикулоцитів in vivo або in vitro. Ці сполуки можуть випробуватися, наприклад, у тваринних моделях. Існує багато підходів до відбору терапевтичних агентів для підвищення рівня еритроцитів або гемоглобіну шляхом спрямування сигналу активіну та ActRII. У деяких варіантах втілення високопродуктивний відбір сполук здійснюють для розпізнавання агентів, які перешкоджають опосередкованому активіном або ActRII впливові на вибрану лінію клітин. У деяких варіантах втілення здійснюють аналіз для відбору та розпізнавання сполук, які специфічно інгібують або зменшують зв’язування поліпептиду ActRIIa або ActRIIb з активіном. В альтернативному варіанті аналіз застосовують для розпізнавання сполук, які посилюють зв’язування поліпептиду ActRIIa або ActRIIb з активіном. В іншому варіанті втілення сполуки розпізнають за їхньою здатністю до взаємодії з активіном, поліпептидом ActRIIb або поліпептидом ActRIIa. Існує достатня кількість різних форматів аналізу, і в контексті даного винаходу навіть ті, які спеціально не було описано, також можуть розглядатися спеціалістами у даній галузі. Як описано авторами, випробувані сполуки (агенти) згідно з винаходом можуть бути утворені з застосуванням будь-якого комбінаторного хімічного способу. В альтернативному варіанті дані сполуки можуть бути природними біомолекулами, синтезованими in vivo або in vitro. Сполуки (агенти), які підлягають випробуванню на їх здатність діяти як модулятори росту тканини, можуть вироблятися, наприклад, бактеріями, дріжджами або іншими організмами (наприклад, природні продукти), вироблятися хімічним шляхом (наприклад, малі молекули, включаючи 21 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептидоміметики) або рекомбінантним шляхом. До випробуваних сполук, які охоплюються даним винаходом, належать непептидильні органічні молекули, пептиди, поліпептиди, пептидоміметики, цукри, гормони та молекули нуклеїнових кислот. У конкретному варіанті втілення випробуваним агентом є мала органічна молекула, яка має молекулярну масу, меншу, ніж приблизно 2000 дальтонів. Випробувані сполуки згідно з винаходом можуть забезпечуватися як окремі, дискретні утворення, або можуть забезпечуватися у більш складних бібліотеках, наприклад, утворюватися за допомогою комбінаторної хімії. Ці бібліотеки можуть включати, наприклад, спирти, алкілгаліди, аміни, аміди, естери, альдегіди, етери та інші класи органічних сполук. Подача випробуваних сполук у випробувальну систему може відбуватися або у відокремленій формі, або у формі сумішей сполук, зокрема, на етапах первісного відбору. Сполуки необов’язково можуть бути дериватизовані іншими сполуками, які мають дериватизуючі групи, які сприяють відокремленню сполук. Необмежувальними прикладами дериватизуючих груп є біотин, флуоресцеїн, дигоксигенін, зелений флуоресцентний білок, ізотопи, полігістидин, магнітні кульки, глутатіон-S-трансфераза (GST), фотоактивовані крослінкери або будь-які їх комбінації. У багатьох програмах відбору медикаментів, у яких випробують бібліотеки сполук та природні екстракти, бажаними є високопродуктивні аналізи, які дозволяють досягати максимальної кількості сполук, досліджуваних за даний період часу. Аналізам, які здійснюють у безклітинних системах, таких, як ті, що можуть бути дериватизовані очищеними або напівочищеними білками, часто віддають перевагу як "первинним" тестам, оскільки вони можуть бути розроблені таким чином, щоб забезпечувалися швидкий розвиток та відносно легке виявлення змін у молекулярній мішені, яка опосередковується випробуваною сполукою. Крім того, вплив клітинної токсичності або біодоступності випробуваної сполуки може в цілому не враховуватися в in vitro системі, і аналіз натомість зосереджується, головним чином, на впливі медикаменту на молекулярну мішень, який може виявлятись у зміні афінності зв’язування між поліпептидом ActRIIa та активіном і/або між поліпептидом ActRIIb та активіном. Виключно для пояснення у наведеному для прикладу скринінговому аналізі згідно з даним винаходом потрібну сполуку приводять у контакт з виділеним і очищеним поліпептидом ActRIIa, який зазвичай може зв’язуватися з активіном. До суміші сполуки та поліпептиду ActRIIa потім додають композицію, яка містить ліганд ActRIIa. Виявлення та визначення кількості комплексів ActRIIa/активіну забезпечує засіб визначення ефективності сполуки при інгібуванні (або посиленні) утворення комплексу між поліпептидом ActRIIa та активіном. Ефективність сполуки може визначатися шляхом побудови кривої реакції на дозу на основі даних, отриманих з застосуванням різних концентрацій випробуваної сполуки. Крім того, також може здійснюватися контрольний аналіз для забезпечення основи для порівняння. Наприклад, у контрольному аналізі виділений і очищений активін додають до композиції, яка містить поліпептид ActRIIa, і утворення комплексу ActRIIa/активіну кількісно визначають за відсутності випробуваної сполуки. Слід розуміти, що, як правило, порядок, у якому домішують реагенти, може змінюватися, або вони можуть змішуватись одночасно. Крім того, замість очищених білків можуть застосовуватися клітинні екстракти та лізати для забезпечення придатної безклітинної системи для аналізу. Сполуки, які впливають на сигнал ActRIIb, можуть розпізнаватися у подібний спосіб з застосуванням поліпептиду ActRIIb та ліганду ActRIIb. Утворення комплексу між поліпептидом ActRII та активіном може виявлятися різними способами. Наприклад, модулювання утворення комплексів піддають кількісному аналізові з застосуванням, наприклад, білків з мітками, які піддаються виявленню, наприклад, радіоактивно 32 35 14 3 міченого (наприклад, P, S, C або H), флуоресцентно міченого (наприклад, FITC) або ферментативно міченого поліпептиду ActRIIa або ActRIIb або активіну, шляхом імуноаналізу або через виявлення за допомогою хроматографії. У деяких варіантах втілення даний винахід передбачає застосування аналізів з поляризацією флуоресценції та передачею енергії через флуоресцентний резонанс (FRET) для вимірювання, прямого або непрямого, ступеня взаємодії між поліпептидом ActRII та його зв’язувальним білком. Крім того, інші режими виявлення, наприклад, на основі світловодів (Публікація PCT WO 96/26432 та Патент США № 5,677,196), поверхневого плазмонного резонансу (SPR), детекторів поверхневих зарядів та датчиків поверхневих зусиль, також є сумісними з багатьма варіантами втілення винаходу. Крім того, даний винахід передбачає застосування аналізу “взаємодія trap”, також відомого як "двогібридний аналіз" , для розпізнавання агентів, які розривають або посилюють взаємодію між поліпептидом ActRII та його зв’язувальним білком. Див., наприклад, Патент США № 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; та Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). У 22 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конкретному варіанті втілення даний винахід передбачає застосування обернених двогібридних систем для розпізнавання сполук (наприклад, малих молекул або пептидів), які роз’єднують взаємодію між поліпептидом ActRII та його зв’язувальним білком. Див., наприклад, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; та патенти США №№ 5,525,490; 5,955,280; та 5,965,368. У деяких варіантах втілення дані сполуки розпізнають за їхньою здатністю до взаємодії з поліпептидом ActRII або активіном згідно з винаходом. Взаємодія між сполукою та ActRIIa, ActRIIb або активіном може бути ковалентною або нековалентною. Наприклад, така взаємодія може бути розпізнана на рівні білка з застосуванням in vitro біохімічних способів, включаючи фотозшивання, радіоактивно мічене лігандне зв’язування та афінну хроматографію (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). У деяких випадках сполуки відбирають шляхом аналізу на основі механізму, такого, як аналіз для виявлення сполук, які зв’язуються з активіном або поліпептидом ActRII. Зв’язування може відбуватись у твердій фазі або рідкій фазі. В альтернативному варіанті ген, який кодує поліпептид ActRII або активін, може бути трансфікований з репортерною системою (наприклад, β-галактозидазою, люциферазою або зеленим флуоресцентним білком) у клітину і відібраний з бібліотеки, в оптимальному варіанті – шляхом високопродуктивного скринінгу або з окремими представниками бібліотеки. Можуть застосовуватися й інші аналізи зв’язування на основі механізму, наприклад, аналізи зв’язування, які дозволяють виявляти зміни у вільній енергії. Аналізи зв’язування здійснюють з мішенню, прикріпленою до комірки, кульки або чіпа, або захопленою іммобілізованим антитілом або розкладеною шляхом капілярного електрофорезу. Зв’язані сполуки зазвичай виявляють, застосовуючи колориметрію або флуоресценцію або поверхневий плазмонний резонанс. 6. Приклади терапевтичного застосування У деяких варіантах втілення антагоністи активіну-ActRII (наприклад, поліпептиди ActRIIa або ActRIIb) згідно з даним винаходом можуть застосовуватися для підвищення рівня еритроцитів у ссавців, таких, як гризуни та примати, зокрема, у людини. У деяких варіантах втілення даний винахід забезпечує способи лікування або профілактики анемії у суб’єкта, який цього потребує, шляхом введення суб’єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста активіну-ActRIIa, такого, як поліпептид ActRIIa, або терапевтично ефективної кількості антагоніста активінуActRIIb, такого, як поліпептид ActRIIb. У деяких варіантах втілення даний винахід забезпечує способи сприяння утворенню еритроцитів у суб’єкта шляхом введення суб’єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста активіну-ActRIIa, зокрема, поліпептиду ActRII. Ці способи можуть застосовуватися для терапевтичного та профілактичного лікування ссавців, зокрема, людини. У контексті даного опису терапевтичний засіб, який "запобігає" порушенню або станові, стосується сполуки, яка, у статистичній вибірці, знижує кількість випадків порушення або стану у групі, яку піддавали лікуванню, порівняно з контрольною групою, яка не отримувала лікування, або затримує початок або знижує тяжкість одного або кількох симптомів порушення або стану порівняно з контрольною групою, яка не отримувала лікування. Вжитий авторами термін "лікування" включає профілактику зазначеного стану або поліпшення або усунення стану після його виникнення. У будь-якому разі запобігання або лікування можуть бути виявлені через діагноз, поставлений лікарем або іншим медичним працівником, та бажаний результат ведення терапевтичного засобу. Як показано авторами винаходу, антагоністи активіну-ActRIIa та антагоністи активіну-ActRIIb можуть застосовуватися для підвищення рівня еритроцитів, гемоглобіну або ретикулоцитів у здорових суб’єктів, і такі антагоністи можуть застосовуватися у вибраних популяціях пацієнтів. Прикладами придатних популяцій пацієнтів є ті, що мають небажано низький рівень еритроцитів або гемоглобіну, наприклад, пацієнти, що мають анемію, та ті, що є підданими ризикові розвитку небажано низького рівня еритроцитів або гемоглобіну, наприклад, пацієнти, які мають бути піддані радикальній хірургії або іншим процедурам, які в результаті можуть призводити до суттєвої втрати крові. В одному варіанті втілення пацієнт з достатнім рівнем еритроцитів піддається лікуванню з застосуванням антагоніста активіну-ActRIIa для підвищення рівня еритроцитів, а потім у нього беруть кров і зберігають для подальшого використання у переливанні. В одному варіанті втілення пацієнт з достатнім рівнем еритроцитів піддається лікуванню з застосуванням антагоніста активіну-ActRIIb для підвищення рівня еритроцитів, а потім у нього беруть кров і зберігають для подальшого використання у переливанні. Описані авторами антагоністи активіну-ActRII, зокрема, білки ActRIIa-Fc та ActRIIb, можуть застосовуватися для підвищення рівня еритроцитів у пацієнтів з анемією. При спостереженні рівня гемоглобіну у людини рівень, менший за нормальний для певної вікової та статевої категорії, може свідчити про анемію, хоча враховуються індивідуальні коливання. Наприклад, 23 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рівень гемоглобіну 12 г/дл зазвичай вважається нижньою межею норми у загальній дорослій популяції. Можливими причинами є втрата крові, харчова недостатність, реакція на медикаменти, різні проблеми з кістковим мозком та багато хвороб. Більш конкретно анемія пов’язується з різними порушеннями, до яких належать, наприклад, хронічна ниркова недостатність, мієлодиспластичний синдром, ревматоїдний артрит, трансплантація кісткового мозку. Анемія також може бути пов’язана з такими станами: тверді пухлини (наприклад, рак молочної залози, рак легенів, рак товстої кишки); пухлини лімфатичної системи (наприклад, хронічна лімфоцитарна лейкемія, неходжкінська та ходжкінська лімфома); пухлини кровотворної системи (наприклад, лейкемія, мієлодиспластичний синдром, множинна мієлома); променева терапія; хіміотерапія (наприклад, режими з включенням похідних платини); запальні та аутоімунні хвороби, включаючи, крім інших, ревматоїдний артрит, інші запальні артрити, системний червоний вовчак (SLE), гострі або хронічні хвороби шкіри (наприклад, псоріаз), запальна хвороба кишечника (наприклад, хвороба Крона та виразковий коліт); гостра або хронічна ниркова хвороба або недостатність, включаючи ідіопатичні та уроджені стани; гостра або хронічна хвороба печінки; гостра або хронічна кровотеча; ситуації, у яких переливання еритроцитів є неможливим через ало- або аутоантитіла пацієнта та/або з релігійних причин (наприклад, у свідків Ієгови); інфекції (наприклад, малярія, остеомієліт); гемоглобінопатії, включаючи, наприклад, серпоподібно-клітинне захворювання, таласемії; вживання або зловживання наркотичними засобами, наприклад, зловживання алкоголем; педіатричні пацієнти з анемією, для яких переливання є протипоказаним з будь-якої причини; та літні пацієнти або пацієнти з анемією на фоні серцево-легеневої хвороби, які не можуть отримувати переливання з міркувань уникнення перевантаження системи кровообігу. Пацієнти можуть піддаватися лікуванню з застосуванням режиму дозування, призначеного для відновлення у пацієнта заданого рівня гемоглобіну, як правило, від приблизно 10 г/дл до приблизно 12,5 г/дл, зокрема, приблизно 11,0 г/дл (див. також Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19), хоча нижчі задані рівні можуть викликати менше серцево-судинних побічних ефектів. В альтернативному варіанті рівень гематокриту (відсоток об’єму зразка крові, зайнятий клітинами) може використовуватись як міра стану еритроцитів. Рівень гематокриту у здорових суб’єктів становить від 41 до 51% для дорослих чоловіків і від 35 до 45% для дорослих жінок. Заданий рівень гематокриту зазвичай становить близько 30-33%. Крім того, рівень гемоглобіну/гематокриту у різних суб’єктів може бути різним. Таким чином, в оптимальному варіанті, заданий рівень гемоглобіну/гематокриту для кожного пацієнта визначають індивідуально. Швидкий вплив описаних авторами антагоністів активіну-ActRIIa на рівень еритроцитів вказує на те, що ці агенти діють через механізм, відмінний від Epo. Відповідним чином, ці антагоністи можуть застосовуватися для підвищення рівня еритроцитів та гемоглобіну у пацієнтів, які належним чином не реагують на Epo. Наприклад, антагоніст активіну-ActRIIa може бути сприятливим для пацієнта, у якого введення від нормальної до підвищеної (>300 IU/кг/тиждень) дози Epo в результаті не забезпечує підвищення рівня гемоглобіну до заданого рівня. Пацієнти з недостатньою реакцією на Epo виявлялися в усіх типах анемії, але найбільша кількість нереспондентів найчастіше спостерігалася серед пацієнтів з раком та пацієнтів з термінальною стадією ниркової хвороби. Недостатня реакція на Epo може бути конститутивною (тобто, такою, що спостерігається після першого застосування Epo) або набутою (наприклад, такою, що спостерігається після повторного застосування Epo). Антагоністи активіну-ActRII також можуть застосовуватися для лікування пацієнтів, які є сприйнятливими до несприятливих ефектів Epo. Основними несприятливими ефектами Epo є надмірне підвищення рівня гематокриту або гемоглобіну та поліцитемія. Підвищений рівень гематокриту може призводити до гіпертонії (зокрема, загострення гіпертонії) та тромбозу судин. Іншими несприятливими ефектами Epo, про які повідомлялося, і деякі з яких є пов’язаними з гіпертонією, є головний біль, грипоподібний синдром, обструкція шунтів, інфаркти міокарда та церебральні конвульсії через тромбоз, гіпертонічна енцефалопатія та аплазія еритроцитів (Singibarti, (1994) J. Clin Investig 72 (suppl. 6), S36-S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686-689; Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523). 7. Фармацевтичні композиції У деяких варіантах втілення антагоністи активіну-ActRII (наприклад, поліпептиди ActRIIa та ActRIIb) згідно з даним винаходом рецептують з фармацевтично прийнятним носієм. Наприклад, поліпептид ActRII вводять окремо або як компонент фармацевтичної композиції (терапевтичної композиції). Дані сполуки можуть бути рецептовані для введення традиційним шляхом при застосуванні у медицині або ветеринарії. 24 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах втілення терапевтичний спосіб згідно з винаходом включає введення композиції системно або локально, у формі імплантата або пристрою. При введенні терапевтична композиція для застосування згідно з цим винаходом, звичайно, має перебувати у вільній від пірогену, фізіологічно прийнятній формі. Терапевтично корисні агенти, крім антагоністів активіну-ActRII, які також необов’язково можуть включатися до композиції, як описано вище, можуть вводитись одночасно або послідовно зі сполуками, які є предметом винаходу (наприклад, поліпептидами ActRIIa та ActRIIb) у способах згідно з винаходом. Зазвичай антагоністи активіну-ActRII вводять парентерально. Фармацевтичні композиції, придатні для парентерального введення, можуть включати один або кілька поліпептидів ActRII у комбінації з одним або кількома фармацевтично прийнятними стерильними ізотонічними водними або неводними розчинами, дисперсіями, суспензіями або емульсіями, або стерильними порошками, які можуть бути відновлені до стерильних прийнятних для ін’єкцій розчинів або дисперсій безпосередньо перед застосуванням, які можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостати, розчинені речовини, які забезпечують ізотонічність композиції з кров’ю реципієнта, для якого вони призначаються, або суспендуючі агенти або загусники. Прикладами прийнятних водних та неводних носіїв, які можуть застосовуватись у фармацевтичних композиціях згідно з винаходом, є вода, етанол, поліоли (такі, як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. ін.) та їх відповідні суміші, рослинні олії, такі, як оливкова олія, та придатні для ін’єкцій органічні естери, такі, як етилолеат. Належну текучість підтримують, наприклад, шляхом застосування матеріалів покриття, таких, як лецитин, шляхом підтримання потрібного розміру частинок у разі дисперсій та шляхом застосування поверхнево-активних речовин. Крім того, композиція може бути інкапсульована або введена шляхом ін’єкції у формі для доставлення до заданого місця тканини (наприклад, кісткового мозку). У деяких варіантах втілення композиції згідно з даним винаходом можуть включати матрикс, здатний доставляти одну або кілька терапевтичних сполук (наприклад, поліпептиди ActRIIa або ActRIIb) до заданого місця тканини (наприклад, кісткового мозку), що забезпечує структуру для розвитку тканини і необов’язково може бути резорбований в організм. Наприклад, може забезпечувати повільне вивільнення поліпептидів ActRII. Такі матрикси можуть утворюватися з матеріалів, які на даний час застосовують у медицині для інших імплантацій. Вибір матеріалу матриксу ґрунтується на біосумісності, здатності до біологічного розкладання, механічних властивостях, косметичному вигляді та властивостях взаємодії. Конкретне застосування певних композицій визначає належний склад. Потенційні матрикси для композицій можуть піддаватися біологічному розкладенню і хімічно визначатися як сульфат кальцію, трикальційфосфат, гідроксіапатит, полімолочна кислота та поліангідриди. Іншими потенційними матеріалами є ті, що піддаються біологічному розкладенню і є добре визначеними біологічно, такі як колаген кісток або шкіри. Інші матрикси складаються з чистих білків або компонентів позаклітинного матриксу. Інші потенційні матрикси не піддаються біологічному розкладенню і не визначаються хімічно, такі, як спечений гідроксіапатит, біоскло, алюмінати або інші керамічні матеріали. Матрикси можуть складатися з комбінації будь-яких з вищезгаданих типів матеріалу, таких, як полімолочна кислота та гідроксіапатит або колаген та трикальційфосфат. Біокерамічні матеріали можуть бути змінені за складом, наприклад, кальційалюмінат-фосфат, та піддані обробці для зміни розміру пор, розміру частинок, форми частинок та здатності до біологічного розкладання. У деяких варіантах втілення способи згідно з винаходом можуть застосовуватися для перорального введення, наприклад, у формі різних капсул, пігулок, таблеток, пастилок (з застосуванням ароматизованої основи, зазвичай цукрози та гуміарабіку або трагаканту), порошків, гранул, або як розчин або суспензія у водній або неводній рідині, або як рідка емульсія “олія-у-воді” або “вода-в-олії”, або як еліксир або сироп, або як пастилки (з застосуванням інертної основи, такої, як желатин та гліцерин, або цукроза та гуміарабік) та/або як розчини для промивання рота і т. ін., кожен з яких містить задану кількість агента як активного інгредієнта. Агент також може вводитись як велика пілюля, електуарій або паста. У твердих дозованих формах для перорального введення (капсули, таблетки, пігулки, драже, порошки, гранули і т. ін.) одну або кілька терапевтичних сполук згідно з даним винаходом змішують з одним або кількома фармацевтично прийнятними носіями, такими, як цитрат натрію або дикальційфосфат, та/або будь-якими з компонентів, до яких належать: (1) наповнювачі або розріджувачі, такі, як крохмалі, лактоза, цукроза, глюкоза, маніт, та/або кремнієва кислота; (2) зв’язувальні речовини, такі, як, наприклад, карбоксиметилцелюлоза, альгінати, желатин, полівінілпіролідон, цукроза та/або гуміарабік; (3) зволожувачі, такі, як гліцерин; (4) дезінтегратори, такі, як агар-агар, карбонат кальцію, кукурудзяний або тапіоковий крохмаль, альгінова кислота, деякі силікати та карбонат натрію; (5) уповільнювачі розчину, такі, 25 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як парафін; (6) прискорювачі абсорбції, такі, як четвертинні амонієві сполуки; (7) зволожувачі, такі, як, наприклад, цетиловий спирт та гліцеринмоностеарат; (8) абсорбенти, такі, як каолін та бентонітова глина; (9) мастила, такі, як тальк, стеарат кальцію, стеарат магнію, тверді поліетиленгліколі, лаурилсульфат натрію та їх суміші; та (10) барвники. У разі капсул таблеток та пігулок фармацевтичні композиції також можуть включати буферні агенти. Тверді композиції подібного типу також можуть застосовуватись як наповнювачі у м’яких та твердих заповнених желатинових капсулах з використанням таких наповнювачів, як лактоза або молочні цукри, а також високомолекулярні поліетиленгліколі і т. ін. До рідких дозованих форм для перорального введення належать фармацевтично прийнятні емульсії, мікроемульсії, розчини, суспензії, сиропи та еліксири. Крім активного інгредієнта, рідкі дозовані форми можуть містити інертні розріджувачі, які широко застосовують у галузі, такі, як вода або інші розчинники, солюбілізатори та емульгатори, такі, як етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етилкарбонат, етилацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, олії (зокрема, бавовняну олію, арахісову олію, кукурудзяну олію, олію зародків пшениці, оливкову олію, рицинову та кунжутну олії), гліцерин, тетрагідрофуриловий спирт, поліетиленгліколі та естери жирних кислот сорбіту та їх суміші. Крім інертних розріджувачів, композиції для перорального введення також можуть включати ад’юванти, такі, як зволожувачі, емульгатори та суспендуючі агенти, підсолоджувачі, ароматизатори, барвники, віддушки та консерванти. Суспензії, крім активних сполук, можуть містити суспендуючі агенти, такі, як етоксиловані ізостеарилові спирти, поліоксіетилен сорбіт та естери сорбіту, мікрокристалічна целюлоза, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар та трагакант, та їх суміші. Композиції згідно з винаходом також можуть містити ад’юванти, такі як консерванти, зволожувачі, емульгатори та диспергатори. Запобігання дії мікроорганізмів може забезпечуватися шляхом включення різних протибактеріальних та протигрибкових агентів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолсорбінової кислоти і т. ін. Також може бути бажаним включення до композицій ізотонічних агентів, таких, як цукри, хлорид натрію і т. ін. Крім того, подовження абсорбції фармацевтичної форми для ін’єкцій може бути викликане шляхом включення агентів, які затримують абсорбцію, таких, як моностеарат алюмінію та желатин. Слід розуміти, що режим дозування має визначатися лікарем, який враховує різні чинники, які змінюють дію даних сполук згідно з винаходом (наприклад, поліпептидів ActRIIa та ActRIIb). До різних чинників, крім інших, належать число еритроцитів у пацієнта, рівень гемоглобіну або інші діагностичні показники, потрібне задане число еритроцитів, вік, стать та режим харчування пацієнта, тяжкість будь-якої хвороби, яка може сприяти зниженню рівня еритроцитів, час введення та інші клінічні чинники. Додавання інших відомих факторів росту до готової композиції також може впливати на дозування. За процесом спостерігають шляхом періодичної оцінки рівня еритроцитів та гемоглобіну, а також оцінки рівня ретикулоцитів та інших показників кровотворного процесу. Експерименти з приматами та людьми продемонстрували, що вплив ActRIIa-Fc на рівень еритроцитів піддається виявленню, якщо дозу сполуки вводять з інтервалами і в кількості, які є достатніми для досягнення концентрації у сироватці приблизно 100 нг/мл або більше протягом періоду принаймні приблизно від 20 до 30 днів. Також може застосовуватися дозування для досягнення рівня у сироватці 200 нг/мл, 500 нг/мл, 1000 нг/мл або більше протягом періоду принаймні від 20 до 30 днів. Вплив на кістки може спостерігатися при рівні у сироватці приблизно 200 нг/мл, причому суттєвий вплив починається приблизно при 1000 нг/мл або вище протягом періоду принаймні приблизно від 20 до 30 днів. Таким чином, якщо бажаним є досягнення впливу на еритроцити при незначному впливі на кістки, схема дозування може бути розрахована для забезпечення концентрації у сироватці приблизно від 100 до 1000 нг/мл протягом періоду приблизно від 20 до 30 днів. У людини рівень у сироватці 200 нг/мл може досягатися при одноразовій дозі 0,1 мг/кг або більше, а рівень у сироватці 1000 нг/мл може досягатися при одноразовій дозі 0,3 мг/кг або більше. Півперіод молекули, який спостерігається у сироватці, становить приблизно від 20 до 30 днів – значно довше, ніж у більшості Fc-злитих білків, і, таким чином, може досягатися стійкий ефективний рівень у сироватці, наприклад, при дозуванні приблизно від 0,05 до 0,5 мг/кг раз на тиждень або на два тижні, або можуть застосовуватися більші дози з довшими інтервалами між дозами. Наприклад, можуть застосовуватися дози від 0,1 до 1 мг/кг раз на місяць або на два місяці. У деяких варіантах втілення даний винахід також передбачає генну терапію для in vivo вироблення поліпептидів ActRII. Така терапія дозволяє досягати терапевтичного ефекту через введення полінуклеотидних послідовностей ActRIIa або ActRIIb у клітини або тканини, які мають вищеперелічені порушення. Доставлення полінуклеотидних послідовностей ActRII досягають, 26 UA 101309 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 застосовуючи рекомбінантний вектор експресії, такий, як химерний вірус або систему колоїдної дисперсії. Оптимальним для терапевтичного доставлення полінуклеотидних послідовностей ActRII є застосування спрямованих ліпосом. До різних вірусних векторів, які можуть застосовуватися для генної терапії згідно з даним винаходом, належать аденовірус, вірус герпесу, вакцина або РНК-вірус, такий, як ретровірус. Ретровірусний вектор може походити від мишачого або пташиного ретровірусу. Прикладами ретровірусних векторів, у яких може бути вставлений єдиний сторонній ген, крім інших, є: вірус лейкемії мишей Moloney (MoMuLV), вірус саркоми мишей Harvey (HaMuSV), вірус пухлини молочної залози мишей (MuMTV) та вірус саркоми Рауса (RSV). Багато додаткових ретровірусних векторів можуть включати кілька генів. Усі ці вектори можуть переносити або включати ген для відібраного маркера таким чином, щоб перетворені клітини могли бути розпізнані й вироблені. Ретровірусні вектори можуть набувати специфічності до мішені через приєднання, наприклад, цукру, гліколіпіду або білка. Оптимальне спрямування здійснюють з використанням антитіла. Спеціалістам у даній галузі стане зрозуміло, що специфічні полінуклеотидні послідовності можуть бути вставлені у ретровірусний геном або приєднані до вірусної оболонки, що дозволяє спрямовувати специфічне доставлення ретровірусного вектора, який містить полінуклеотид ActRII. В альтернативному варіанті клітини тканинної культури можуть бути безпосередньо трансфіковані плазмідами, які кодують ретровірусні структурні гени gag, pol та env, шляхом традиційної трансфекції з застосуванням фосфату кальцію. Ці клітини потім трансфікують векторною плазмідою, яка містить потрібні гени. Утворені в результаті клітини вивільнюють ретровірусний вектор у культуральне середовище. Іншою системою спрямованого доставлення полінуклеотидів ActRII є система колоїдної дисперсії. До систем колоїдної дисперсії належать макромолекулярні комплекси, нанокапсули, мікросфери, кульки та системи на основі ліпідів, включаючи емульсії “олія-у-воді”, міцели, змішані міцели та ліпосоми. Оптимальною колоїдною системою згідно з цим винаходом є ліпосома. Ліпосоми є везикулами штучної мембрани, які застосовують як засоби доставлення in vitro та in vivo. РНК, ДНК та інтактні віріони можуть бути інкапсульовані у водний компонент і доставлені у клітини у біологічно активній формі (див., наприклад, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Способи ефективного перенесення генів з застосуванням ліпосомного носія є відомими спеціалістам у даній галузі, див., наприклад, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. Композиція ліпосоми зазвичай є комбінацією фосфоліпідів, як правило, у комбінації зі стероїдами, зокрема, холестерином. Також застосовують інші фосфоліпіди або інші ліпіди. Фізичні характеристики ліпосом залежать від pH, іонної сили та присутності двовалентних катіонів. Прикладами ліпідів, які застосовують для вироблення ліпосом, є сполуки фосфатидилу, такі, як фосфатидилгліцерин, фосфатидилхолін, фосфатидилсерин, фосфатидилетаноламін, сфінголіпіди, цереброзиди та гангліозиди. Типовими фосфоліпідами є фосфатидилхолін, виділений з курячих яєць, дипальмітоїлфосфатидилхолін та дистеароїлфосфатидилхолін. Спрямування ліпосом також може бути можливим на основі, наприклад, органної специфічності, клітинної специфічності та специфічності органел, які є відомими спеціалістам у даній галузі. Приклади Далі винахід описується в загальних рисах, і він стане легше зрозумілим за допомогою посилання на представлені нижче приклади, які включаються лише з метою пояснення деяких варіантів втілення даного винаходу, якими не обмежується обсяг винаходу. Приклад 1: Злиті білки ActRIIa-Fc Авторами було побудовано розчинний злитий білок ActRIIa, який має позаклітинний домен людського ActRIIa, злитий з людським або мишачим Fc доменом з мінімальним лінкером між ними. Послідовності називаються ActRIIa-hFc та ActRIIa-mFc, відповідно. ActRIIa-hFc показано нижче як очищений з клітинні лінії CHO (SEQ ID NO: 7): 27 UA 101309 C2 5 Білки ActRIIa-hFc та ActRIIa-mFc експресувалися у клітинних лініях CHO. Розглядали три різні лідерні послідовності: (i) Бджолиний мелітин (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii) Тканинний активатор плазміногену (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9) (iii) Природна: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10). У вибраній формі застосовується лідерна послідовність TPA, і вона має таку необроблену амінокислотну послідовність: Цей поліпептид кодується такою нуклеїновокислотною послідовністю: 10 15 20 Слід відзначити, що і ActRIIa-hFc, і ActRIIa-mFc піддавалися рекомбінантній експресії. Як показано на фігурі 1, білок очищався як єдиний, добре визначений пік білка. N-кінцеве секвенування виявило єдину послідовність ILGRSETQE (SEQ ID NO: 11). Очищення досягали через серію етапів колонкової хроматографії, включаючи, наприклад, три або більше з нижчезазначених у будь-якому порядку: хроматографія протеїну A, хроматографія на Qсефарозі, хроматографія на фенілсефарозі, ексклюзійна хроматографія та катіонообмінна хроматографія. Очищення може довершуватися вірусною фільтрацією та зміною буфера. Білок ActRIIa-hFc очищали до ступеня очищення >98%, як визначали шляхом ексклюзійної хроматографії, та >95%, як визначали за допомогою SDS PAGE. ActRIIa-hFc та ActRIIa-mFc демонстрували високу афінність до лігандів, зокрема, активіну A. GDF-11 або Активін A ("ActA") іммобілізували на чіпі Biacore CM5, застосовуючи стандартну 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюActivin-actrii antagonists thereof and uses for increasing red blood cell levels
Автори англійськоюSherman, Matthew, L.
Назва патенту російськоюАнтагонисты активина-actrii и их применение для повышения уровня эритроцитов
Автори російськоюШерман Метью Л.
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/62, A61K 38/17, A61P 7/06
Мітки: рівня, антагоністи, активіну-actrii, еритроцитів, підвищення, застосування
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/62-101309-antagonisti-aktivinu-actrii-ta-kh-zastosuvannya-dlya-pidvishhennya-rivnya-eritrocitiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Антагоністи активіну-actrii та їх застосування для підвищення рівня еритроцитів</a>
Антагоністи активіну-actriia та їх застосування для сприяння ростові кісток
Номер патенту: 98447
Опубліковано: 25.05.2012
Автори: Сіхра Джасбір, Кнопф Джон
МПК: C07K 14/435
Мітки: кісток, антагоністи, застосування, сприяння, активіну-actriia, ростові
Формула / Реферат:
1. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa, який включає амінокислотну послідовність, яка складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 7. 2. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa за п. 1, який відрізняється тим, що поліпептид має очищення принаймні 95 % відносно білкових забруднювачів, як визначають шляхом хроматографії з виключенням за розміром. 3. Активінзв'язувальний поліпептид ActRIIa за п. 1 або 2, який...
Антагоністи рнк і їх застосування для інгібування her3
Номер патенту: 99290
Опубліковано: 10.08.2012
Автор: Хеттьярн Май
МПК: A61P 35/00, C12N 15/11, A61K 31/7088
Мітки: антагоністи, застосування, інгібування, рнк
Формула / Реферат:
1. Олігомер довжиною 10-25 нуклеїнових основ, що містить послідовність суміжних нуклеїнових основ, що містить у цілому 10-24 нуклеїнових основ, у якому і) зазначена послідовність суміжних нуклеїнових основ на 100 % гомологічна SEQ ID NO:211 або SEQ ID NO:200; або іі) зазначена послідовність суміжних нуклеїнових основ включає не більше одного помилкового спарювання з відповідною областю SEQ ID NO:211 або SEQ ID NO:200.2. Олігомер за п....
Спосіб підвищення продукування протеїну с, спосіб підвищення рівня його модифікації
Номер патенту: 26870
Опубліковано: 29.12.1999
Автор: ГРІННЕЛЛ Брайан Уільям
МПК: C12N 5/00, C12N 9/64, C12N 5/10, C07K 14/745, C12N 15/57, C12P 21/02, C12N 15/09, C12R 1/91, C12P 21/00
Мітки: підвищення, рівня, модифікації, протеїну, спосіб, продукування
Формула / Реферат:
1. Способ повышения продуцирования протеина С при культивировании аденовирустрансформированных рекомбинантных клеток млекопитающих, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при температуре около 39°С, а упомянутые клетки выбирают из группы, включающей рекомбинантные клетки AV 12 и рекомбинантные клетки 293.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют рекомбинантные клетки AV 12.3. Способ по п.1, отличающийся тем,...
Антагоністи рецептора глюкагону, їх одержання та терапевтичне застосування
Номер патенту: 86621
Опубліковано: 12.05.2009
Автори: Коннер Скотт Юджін, Лі Цзяньке, Чжу Госінь
МПК: C07C 235/42, C07D 213/62, A61P 3/10, A61K 31/197, C07C 323/60
Мітки: застосування, антагоністи, терапевтичне, одержання, рецептора, глюкагону
Формула / Реферат:
1. Сполука, структура якої представлена формулою І, (I)або фармацевтично прийнятна сіль цієї сполуки де:Y - -О- або -S-;Q, D, X та Т незалежно один від одного означають вуглець (заміщений воднем або факультативними замісниками, вказаними у цьому описі) або азот (факультативно заміщений киснем), за умови, що не більше ніж два з Q, D, X та Т -...
Антагоністи ванілоїдного рецептора підтипу 1 (vr1) і їх застосування
Номер патенту: 94940
Опубліковано: 25.06.2011
Автори: Кеніг Джон Р., Браун Брайан С., Лі Чіх-Хунг, Гомтсян Артур Р.
МПК: C07D 231/56, A61K 31/416, C07D 493/00, A61K 31/352
Мітки: застосування, рецептора, підтипу, антагоністи, vr1, ванілоїдного
Формула / Реферат:
1. Сполука формули (І) або її фармацевтично прийнятна сіль, проліки, сіль проліків або їх комбінація, (I) деX1 є -(CR1aR1b)m-, -(CR1aR1b)nG1- або -(CR1aR1b)p-G1-C(R1aR1b)-; m дорівнює 1, 2, 3 або 4; n дорівнює 1, 2 або 3; р дорівнює 1 або 2; G1 являє собою О,...
Попередній патент: Гніздова і штирова з’єднуючі частини для самозатискного з’єднувача
Наступний патент: Газотурбінний підйомно-маршовий двигун
Випадковий патент: Вібраційний конвеєр для транспортування сипкої харчової сировини