Способи та композиції для доставки до цнс ідуронат-2-сульфатази

Реферат: Даний винахід стосується складу для інтратекального введення при лікуванні синдрому Хантера, який містить білок ідуронат-2-сульфатазу (I2S) у концентрації в межах 10-150 мг/мл, фосфат у концентрації до 20 мМ, NaСl, полісорбатну поверхнево-активну речовину та має рН 6,0-7,0. UA 115649 C2 (12) UA 115649 C2 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА РОДИННІ ЗАЯВКИ [0001] Дана заявка претендує на пріоритет за попередніми заявками на патент США під номерами 61/358,857 з датою подачі 25 червня 2010 р.; 61/360,786 з датою подачі 1 липня 2010 р.; 61/387,862 з датою подачі 29 вересня 2010 р.; 61/435,710 з датою подачі 24 січня 2011 р.; 61/442,115 з датою подачі 11 лютого 2011 р.; 61/476,210 з датою подачі 15 квітня 2011р.; і 61/495,268 з датою подачі 9 червня 2011 р.; зміст кожної з яких включений до даної заявки за допомогою посилання. [0002] Родинними для даної заявки є заявки на патент США під заголовком "Доставка терапевтичних агентів до ЦНС", з такою ж датою подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС гепаран-N-сульфатази", з такою ж датою подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС арилсульфатази A", з такою ж датою подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС β-галактоцереброзидази", з такою ж датою подачі; "Лікування синдрому Санфіліппо типу B", з такою ж датою подачі; зміст кожної з яких включений до даної заявки за допомогою посилання. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ [0003] Замісна ферментна терапія (ЗФТ) включає системне введення суб'єктам природних або рекомбінантних білків і/або ферментів. Схвалені терапевтичні засоби зазвичай вводять суб'єктам внутрішньовенно і зазвичай вони є ефективними при лікуванні соматичних симптомів первинної ферментної недостатності. У результаті обмеженого розподілу введеного внутрішньовенно білка і/або ферменту по клітинах і тканинах центральної нервової системи (ЦНС) лікування захворювань, що мають етіологію, пов'язану з ЦНС, є особливо складним завданням, оскільки введені внутрішньовенно білки і/або ферменти не проникають у достатній мірі через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ). [0004] Гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) − це структурна система, яка складається з ендотеліальних клітин, функцією яких є захист центральної нервової системи (ЦНС) від шкідливих речовин у крові, таких як бактерії, макромолекули (наприклад, білки) та інші гідрофільні молекули, шляхом обмеження проникнення подібних речовин через ГЕБ до спинномозкової рідини (СМР) і ЦНС. [0005] Існує декілька способів обійти ГЕБ для покращення доставки терапевтичного агента до мозку, в тому числі пряма внутрішньочерепна ін'єкція, короткочасна пермеабілізація ГЕБ і модифікація активного агента, яка змінює розподіл у тканинах. Пряма ін'єкція терапевтичного агента до тканин мозку повністю обходить судинну систему, але пов'язана в першу чергу з ризиком ускладнень (інфекція, ушкодження тканин, імунна відповідь), які виникають у результаті внутрішньочерепних ін'єкцій і слабкої дифузії активного агента з місця введення. На даний момент пряме введення білків до мозкової речовини не забезпечило значного терапевтичного ефекту внаслідок існування бар'єра для дифузії та обмеженого об'єму складу, який може бути введений. Була вивчена дифузія з конвекцією через катетери, розміщені в паренхімі мозку, з використанням повільної довгострокової інфузії (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), однак у жодному зі схвалених способів терапії цей підхід не використовується для тривалого лікування. Крім того, розміщення внутрішньомозкових катетерів є вкрай інвазивним і є менш бажаною клінічною альтернативою. [0006] Також були розпочаті спроби здійснити інтратекальну (ІТ) ін'єкцію або введення білків до спинномозкової рідини (СМР), але вони також не призвели до терапевтичного успіху. Однією з основних проблем при такому лікуванні є схильність активної речовини до дуже щільного зв'язування з епендимною вистилкою шлуночка, яке заважає наступній дифузії. У даний час є відсутніми дозволені продукти для лікування генетичного захворювання мозку шляхом прямої доставки агентів до СМР. [0007] Насправді, багато хто вважає, що бар'єр для дифузії на поверхні мозку, а також відсутність ефективних і зручних способів доставки, є занадто суттєвою перешкодою для досягнення відповідного терапевтичного ефекту в головному мозку при лікуванні будь-якого захворювання. [0008] Багато які з лізосомних хвороб накопичення зачіпають нервову систему, що особливо ускладнює лікування цих хвороб за допомогою традиційних методів терапії. Часто зустрічаються значні накопичення глюкозоаміногліканів (ГАГ) у нейронах і в мозкових оболонках хворих індивідів, що призводить до різних форм симптомів з боку ЦНС. На сьогоднішній день не відомі випадки успішного лікування симптомів з боку ЦНС, викликаних лізосомними хворобами, з використанням доступних засобів. [0009] Таким чином, залишається велика потреба в ефективній доставці терапевтичних речовин до мозку. Зокрема, існує велика потреба в більш ефективній доставці активних речовин до центральної нервової системи для лікування лізосомних хвороб накопичення. 1 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0010] Даний винахід забезпечує ефективний і менш інвазивний підхід для прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Зокрема, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, який полягає в тому, що заміщуючий фермент (наприклад, ідуронат-2-сульфатаза (I2S)) для лізосомних хвороб накопичення (наприклад, синдрому Хантера) може бути прямо введений до спинномозкової рідини (СМР) суб'єкта, що потребує лікування, у високій концентрації (наприклад, більше 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл або більше), завдяки чому фермент ефективно й активно проникає через різні поверхні та поширюється в різних областях мозку, включаючи глибокі області мозку. Зовсім несподівано автори даного винаходу продемонстрували, що доставка такої високої концентрації білка може бути досягнута з використанням простих фізіологічних або буферних розчинів, не викликаючи суттєвих побічних ефектів, таких як різко виражена імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, даний винахід забезпечує високоефективний, клінічно бажаний і зручний для пацієнта підхід для прямої доставки до ЦНС для лікування різних захворювань і розладів, пов'язаних із компонентами ЦНС, зокрема лізосомних хвороб накопичення. Даний винахід являє собою значне досягнення в області спрямованої доставки речовин до ЦНС і замісної ферментної терапії. [0011] Як докладно описано нижче, автори даного винаходу успішно розробили стабільні склади для ефективного інтратекального (IT) введення білка ідуронат-2-сульфатази (I2S). Припускається, однак, що різні стабільні склади, описані тут, як правило, підходять для доставки до центральної нервової системи терапевтичних агентів, у тому числі різних інших лізосомальних ферментів. Дійсно, стабільні склади відповідно до даного винаходу можна використовувати для доставки до ЦНС різними методами й за допомогою різних шляхів введення, включаючи інтрапаренхімальне, інтрацеребральне, внутрішньошлуночкове церебральне (ІЦВ), інтратекальне (наприклад, інтратекальне через поперековий відділ, інтратекальне через задню мозочково-мозкову цистерну) введення й будь-які інші способи та шляхи ін'єкцій прямо або непрямо до ЦНС і/або СМР, але не обмежуючись ними. [0012] Також припускають, що різні стабільні склади, описані тут, як правило, підходять для доставки до центральної нервової системи терапевтичних агентів, наприклад, терапевтичних білків, у тому числі ферментів для замісної терапії лізосомних хвороб накопичення. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент може бути синтетичним, рекомбінантним, генноактивованим або природним ферментом. [0013] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад для прямого інтратекального введення до ЦНС, який містить білок ідуронат-2-сульфатазу (I2S), сіль і полісорбатну поверхнево-активну речовину. У деяких варіантах реалізації, білок I2S є присутнім у концентрації з діапазону приблизно 1-300 мг/мл (наприклад, 1-250 мг/мл, 1-200 мг/мл, 1-150 мг/мл, 1-100 мг/мл або 1-50 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, білок I2S є присутнім у концентрації або до концентрації, обраної з 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл. [0014] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будьяким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, де білок I2S містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1. У деяких варіантах реалізації, білок I2S складається з амінокислотної послідовності, щонайменше на 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичної SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах реалізації, стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, включає сіль. У деяких варіантах реалізації, сіль являє собою NaСl. У деяких варіантах реалізації, NaСl є присутнім у концентрації з діапазону приблизно 0-300 мМ (наприклад, 0-250 мМ, 0-200 мМ, 0-150 мМ, 0-100 мМ, 0-75 мМ, 0-50 мМ або 0-30 мМ).У деяких варіантах реалізації, NaСl є присутнім у концентрації з діапазону приблизно 137-154 мМ. У деяких варіантах реалізації, NaСl є присутнім у концентрації приблизно 154 мМ. [0015] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будьяким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, де полісорбатна поверхнево-активна речовина обрана з групи, яка складається з полісорбату 20, полісорбату 40, полісорбату 60, полісорбату 80 і їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації, поверхнево-активна речовина являє собою полісорбат 20. У деяких варіантах реалізації, полісорбат 20 є присутнім у концентрації з діапазону приблизно 0-0,02 %. У деяких варіантах реалізації, полісорбат 20 є присутнім у концентрації приблизно 0,005 %. [0016] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будьяким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, де зазначений склад додатково 2 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає буферний агент. У деяких варіантах реалізації, буферний агент вибирають із групи, яка складається з фосфату, ацетату, гістидину, сукцинату, трису і їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації, буферний агент являє собою фосфат. У деяких варіантах реалізації, фосфат є присутнім у концентрації не більшій за 50 мМ (наприклад, не більшій за 45 мМ, 40 мМ, 35 мМ, 30 мМ, 25 мМ, 20 мМ, 15 мМ, 10 мМ або 5 мМ). У деяких варіантах реалізації, фосфат є присутнім у концентрації не більшій за 20 мМ. У різних аспектах винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, причому склад має рН приблизно 3-8 (наприклад, приблизно 4-7,5; 5-8; 5-7,5; 5-6,5; 5-7,0; 5,5-8,0; 5,5-7,7; 5,5-6,5; 6-7,5 або 6-7,0). У деяких варіантах реалізації, склад має рН приблизно 5,5-6,5 (наприклад, 5,5; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4 або 6,5). У деяких варіантах реалізації, склад має рН приблизно 6,0. [0017] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільні склади згідно з будьяким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, де зазначений склад являє собою рідкий склад. У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, описаних у даному документі, де зазначений склад приготований у формі ліофілізованого сухого порошку. [0018] У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад для інтратекального введення, який містить білок ідуронат-2-сульфатазу (I2S) у концентрації з діапазону приблизно 1-300 мг/мл, NaСl у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат 20 у концентрації приблизно 0,005 % і який має pН приблизно 6,0. У деяких варіантах реалізації, білок I2S є присутнім у концентрації приблизно 10 мг/мл. У деяких варіантах реалізації, білок I2S є присутнім у концентрації приблизно 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл. [0019] У різних аспектах даний винахід включає контейнер, який містить лікарську форму для однократного введення стабільного складу згідно з різними варіантами реалізації, описаними в даному документі. У деяких варіантах реалізації, контейнер обраний із ампули, флакона, пляшки, картриджа, резервуара, шприца "lyo-ject" або попередньо заповненого шприца. У деяких варіантах реалізації, контейнер являє собою попередньо заповнений шприц. У деяких варіантах реалізації, попередньо заповнений шприц вибирають зі шприца з боросилікатного скла з термічно обробленим силіконовим покриттям, шприца з боросилікатного скла з напиленим шаром силікону або пластикового шприца без силікону. У деяких варіантах реалізації, стабільний склад є присутнім у об'ємі, меншому за приблизно 50 мл (наприклад, меншому за приблизно 45 мл, 40 мл, 35 мл, 30 мл, 25 мл, 20 мл, 15 мл, 10 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2,5 мл, 2,0 мл, 1,5 мл, 1,0 мл або 0,5 мл). У деяких варіантах реалізації, стабільний склад є присутнім у об'ємі, меншому за приблизно 3,0 мл. [0020] У різних аспектах даний винахід включає способи лікування синдрому Хантера, які включають стадію інтратекального введення суб'єктові, що потребує лікування, складу згідно з будь-яким із варіантів реалізації, описаних у даному документі. [0021] У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає спосіб лікування синдрому Хантера, який включає стадію інтратекального введення суб'єктові, що потребує лікування, складу, який містить білок ідуронат-2-сульфатазу (I2S) в концентрації з діапазону приблизно 1300 мг/мл, NaСl у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат 20 у концентрації приблизно 0,005 % і який має pН приблизно 6. [0022] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення композиції не призводить до суттєвого негативного ефекту (наприклад, тяжкої імунної відповіді) у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення не призводить до суттєвої адаптивної імунної відповіді, опосередкованої T-клітинами, у суб'єкта. [0023] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до доставки білка I2S до різних тканин-мішеней головного мозку, спинного мозку і/або периферичних органів. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до доставки білка I2S до тканин-мішеней головного мозку. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені головного мозку включають білу речовину і/або нейрони в сірій речовині. У деяких варіантах реалізації, білок I2S доставляють до нейронів, гліальних клітин, периваскулярних клітин і/або менінгеальних клітин. У деяких варіантах реалізації, білок I2S доставляють потім до нейронів у спинному мозку. [0024] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу додатково забезпечує системну доставку білка I2S до периферичних тканин-мішеней. У деяких варіантах реалізації, периферичні тканини-мішені обрані з печінки, нирок, селезінки і/або серця. [0025] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу викликає клітинну лізосомну локалізацію в тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу викликає 3 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зниження накопичення глюкозоаміногліканів (ГАГ) у тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, накопичення ГАГ знижується щонайменше на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем (наприклад, накопиченням ГАГ у організмі суб'єкта до лікування). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниженої вакуолізації в нейронах (наприклад, щонайменше на 20 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 90 %, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем). У деяких варіантах реалізації, нейрони включають клітини Пуркіньє. [0026] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу викликає підвищення ферментативної активності I2S у тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність I2S підвищується щонайменше в 1 раз, у 2 рази, в 3 рази, в 4 рази, в 5 разів, у 6 разів, у 7 разів, у 8 разів, у 9 разів або в 10 разів у порівнянні з контролем (наприклад, ендогенною ферментативною активністю в організмі суб'єкта до лікування). У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність I2S становить щонайменше приблизно 10 нмоль/год./мг, 20 нмоль/год./мг, 40 нмоль/год./мг, 50 нмоль/год./мг, 60 нмоль/год./мг, 70 нмоль/год./мг, 80 нмоль/год./мг, 90 нмоль/год./мг, 100 нмоль/год./мг, 150 нмоль/год./мг, 200 нмоль/год./мг, 250 нмоль/год./мг, 300 нмоль/год./мг, 350 нмоль/год./мг, 400 нмоль/год./мг, 450 нмоль/год./мг, 500 нмоль/год./мг, 550 нмоль/год./мг або 600 нмоль/год./мг. [0027] У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність I2S підвищується в поперековому відділі. У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність I2S у поперековому відділі становить щонайменше приблизно 2000 нмоль/год./мг, 3000 нмоль/год./мг, 4000 нмоль/год./мг, 5000 нмоль/год./мг, 6000 нмоль/год./мг, 7000 нмоль/год./мг, 8000 нмоль/год./мг, 9000 нмоль/год./мг або 10000 нмоль/год./мг. [0028] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниженої інтенсивності, тяжкості або частоти, або затримки початку щонайменше одного симптому чи ознаки синдрому Хантера. У деяких варіантах реалізації, щонайменше один симптом чи ознака синдрому Хантера являє собою когнітивний розлад (розлад пізнавальної функції); ушкодження білої речовини; розширення периваскулярного простору в паренхімі головного мозку, гангліїв, мозолистого тіла і/або стовбура мозку; атрофію; і/або вентрикуломегалію. [0029] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на два тижні. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на два місяці. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить два рази на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить один раз на тиждень. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить два або кілька разів на тиждень. У деяких варіантах реалізації, введення є безперервним, наприклад, за допомогою тривалої перфузії з використанням насоса. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють у комбінації з внутрішньовенним введенням. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше одного разу на тиждень. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше одного разу на два тижні. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше одного разу на місяць. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше одного разу на два місяці. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють частіше одного разу на місяць, наприклад, два рази на тиждень, щотижня, через тиждень або два рази на місяць. [0030] У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють у той самий день. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення не здійснюють протягом деякого періоду часу між введеннями, наприклад, у межах щонайменше 2 днів, у межах щонайменше 3 днів, у межах щонайменше 4 днів, у межах щонайменше 5 днів, у межах щонайменше 6 днів, у межах щонайменше 7 днів або в межах щонайменше одного тижня. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють за графіком, наприклад, змінне введення щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення заміняють інтратекальним введенням у графіку введень, наприклад, при графіку внутрішньовенного введення щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісячного введення, кожне третє або четверте, або п'яте внутрішньовенне введення в цьому графіку може бути замінене на інтратекальне введення замість внутрішньовенного. [0031] У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне й інтратекальне введення здійснюють послідовно, наприклад, спершу здійснюють внутрішньовенне введення (наприклад, щотижня, 4 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісячне, дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року і більше) з наступним інтратекальним введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більше двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року чи більше). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють першим (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць, щомісяця, один раз на два місяці, один раз на три місяці, дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше) з наступним внутрішньовенним введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більше, ніж двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше). [0032] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють при відсутності внутрішньовенного введення. [0033] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ [0034] Креслення наведені тільки з метою ілюстрації, а не для обмеження. [0035] Фігура 1 являє собою показову ілюстрацію, яка демонструє ІТ-доставлену I2S, виявлену в нейронах (стрілки) кори великого мозку й мозочка, включаючи I2S у шарі менінгеальних клітин, що покривають поверхню мозку (стрілки), після інтратекальних ін'єкцій 3 доз I2S. ІГХ офарблення I2S після 2 доз, введених до мозку, було слабкішим (фото не показане). Не спостерігали I2S-позитивного офарблення для якого-небудь із типів клітин головного мозку контрольних тварин, яким вводили наповнювач. Збільшення 40х. [0036] Фігура 2 являє собою показову ілюстрацію, яка демонструє зворотний розвиток патології в головному мозку мишей із нокаутом I2S (IKO) після інтратекально-поперекової ін'єкції I2S. Офарблені Г/Е тканини мозку демонструють численні клітинні вакуолі (стрілки) у контрольних тварин, яким вводили наповнювач. Клітинна вакуолізація зменшена в усьому мозку після 2 доз (фото не показане) і 3 доз, ін'єктованих мишам. Помітне зниження було виявлене після ін'єкції 3 дози. Збільшення 40х. [0037] Фігура 3 являє собою показову ілюстрацію, яка демонструє імуногістохімічне офарблення LAMP-1, де відмічене суттєве зниження лізосомної активності в мозку після 2 доз (фото не показане) і 3 доз лікування I2S у порівнянні з контрольними тваринами, яким вводили наповнювач. Таке зниження характеризувалося зменшенням кількості LAMP-1-позитивних клітин і невеликою інтенсивністю офарблення у всіх досліджених областях мозку. Збільшення 40х. [0038] Фігура 4 являє собою показову ілюстрацію, яка демонструє морфометричні результати порівняння середніх значень LAMP-1-позитивної області серед мишей дикого типу (WT), контрольних мишей, що одержували наповнювач, і мишей, яким вводили I2S (2 і 3 дози), у корі головного мозку (Кора), хвостатому ядрі (ХЯ), таламусі (Т), білій речовині (БВ) і мозочку (М), які підтверджують зменшення LAMP-1-позитивного офарблення у всіх оцінених областях мозку. Дані представлені як середнє ± стандартне відхилення # P < 0,05; * P < 0,01; ** P < 0,001. [0039] На Фігурі 5 наведені показові електронні мікрофотографії клітин головного мозку, які показують покращення патології на ультраструктурному рівні. Нейрони мишей, яким вводили наповнювач, мали пластинчасті включення, структуру типу "зеброїдних тілець" і вакуолі, що містять відкладення в формі гранул (вставка), яких було менше у мишей, яким ін'єктували I2S. Олігодендроцити мишей, що одержували наповнювач, показували більші електроннопросвічуючі запасаючі вакуолі (стрілка), в той час як олігодендроцити мишей, яким ін'єктували I2S, мали мінімальну вакуолізацію. Шкала: в нейронах, 2 мкм; в олігодендроцитах, 500 нм. [0040] На Фігурі 6 наведені показові імуногістохімічні результати, які демонструють I2S, виявлену в синусоїдальних клітинах печінки після інтратекальної ін'єкції 3 доз I2S. ІГХофарблення після 2 доз, введених до печінки, було слабкішим (фото не показане). I2Sпозитивне офарблення в печінці контрольних тварин, що одержували наповнювач, було відсутнім. Збільшення 40х. [0041] На Фігурі 7 наведена типова тканина печінки. Інтенсивна клітинна вакуолізація та аномально висока лізосомна активність показана з використанням Г/Е офарблення, і інтенсивне імуноофарблення LAMP-1 було виявлене у контрольних тварин, що одержували наповнювач, у порівнянні з WT. Помітне ослаблення клітинної вакуолізації та імуноофарблення LAMP-1 було виявлене після інтратекального введення 3 та 2 (фото не показане) доз I2S. Офарблення з використанням Г/Е, яке виявило внутрішньоцитоплазматичну вакуолізацію, майже повністю 5 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зникало, при цьому спостерігалася практично нормальна структура клітин печінки. Офарблення Г/Е, збільшення 40х; офарблення LAMP-1, збільшення 20х. [0042] Фігури 8A–F ілюструють показові дані з порівняння агрегації складів на основі хлориду натрію та фосфату за допомогою ексклюзійної ВЕРХ (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20): 1 місяць при ≤ -65 ºC і 40 ºC. [0043] Фігура 9 ілюструє показові дані з порівняння агрегації складів на основі хлориду натрію та фосфату за допомогою ексклюзійної ВЕРХ (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20): 6 місяців при ≤ -65 ºC і 25 ºC. [0044] Фігури 10A – F ілюструють показові дані з порівняння агрегації складів на основі хлориду натрію та фосфату за допомогою ексклюзійної ВЕРХ (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20): 24 місяці при ≤ -65 ºC і 2-8 ºC. [0045] Фігура 11 ілюструє показові дані з порівняння агрегації складів на основі хлориду натрію та фосфату за допомогою сильної аніонообмінної ВЕРХ (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20): початковий рівень у порівнянні з 1 місяцем при 40 ºC. [0046] Фігура 12 ілюструє показові дані з порівняння агрегації складів на основі хлориду натрію та фосфату за допомогою сильної аніонообмінної ВЕРХ (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20): початковий рівень у порівнянні з 6 місяцями при 25 ºC. [0047] Фігура 13 ілюструє показові дані з порівняння агрегації складів на основі хлориду натрію та фосфату за допомогою сильної аніонообмінної ВЕРХ (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20): початковий рівень у порівнянні з 24 місяцями при 2-8 ºC. [0048] Фігура 14 ілюструє показові дані з порівняння електрофорезу в ДСН-ПААГ з офарбленням Кумассі для складів на основі хлориду натрію та фосфату (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20) на початковому рівні й через 1 місяць при 40 ºC. [0049] Фігури 15А і В ілюструють показові дані з порівняння електрофорезу в ДСН-ПААГ з офарбленням Кумассі для складів на основі хлориду натрію та фосфату (усі розчини включали 0,01 % полісорбату 20) через 6 місяців при 25 ºC і через 16 місяців при 2-8 ºC. [0050] На Фігурі 16 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка одержувала дозу 3 мг. I2S-позитивне офарблення в менінгеальних клітинах. Збільшення 4х. [0051] На Фігурі 17 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка одержувала дозу 30 мг. I2S-позитивне офарблення в нейронах і менінгеальних клітинах. Збільшення 4х. [0052] На Фігурі 18 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка одержувала дозу 100 мг. I2S-позитивне офарблення в нейронах і менінгеальних клітинах було сильнішим, ніж у випадку мишей, які одержували дозу 3 і 30 мг. Збільшення 4х. [0053] На Фігурі 19 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка одержувала дозу 150 мг. Відмічена велика популяція I2S-позитивних нейронів серед сильно позитивних менінгеальних клітин. [0054] На Фігурі 20 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-позитивні нейрони та гліальні клітини, а також менінгеальні клітини всередині I шару головного мозку у тваринної групи, яка одержувала дозу 30 мг. Збільшення 40х. [0055] На Фігурі 21 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-позитивні нейрони та гліальні клітини, а також периваскулярні клітини всередині III шару головного мозку у тваринної групи, яка одержувала дозу 30 мг. Збільшення 40х. [0056] На Фігурі 22 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-позитивні нейрони та гліальні клітини всередині VI шару головного мозку, які прилягають до білої речовини, у тваринної групи, яка одержувала дозу 30 мг. Збільшення 40х. [0057] На Фігурі 23 наведені приклади тканин, що демонструють сильне I2S-позитивне офарблення нейронів (головний мозок) у тваринної групи, що одержувала дозу 150 мг. Збільшення 100х. [0058] На Фігурі 24 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-імуноофарблення шийного відділу спинного мозку у тваринної групи, яка одержувала дозу 150 мг. Збільшення 4х. [0059] На Фігурі 25 наведені приклади тканин, що демонструють сильне I2Sімуноофарблення поперекового відділу спинного мозку у тваринної групи, яка одержувала дозу 150 мг. Збільшення 4х. [0060] На Фігурі 26 наведені приклади тканин, що демонструють сильне I2S-позитивне імуноофарблення менінгеальних клітин, гліальних клітин і епі/пери/ендоневрію (сполучні клітини) у поперековому відділі у тваринної групи, яка одержувала дозу 150 мг. Збільшення 40х. [0061] Фігура 27: нейрони в поперековому відділі спинного мозку в групі тварин, що одержувала дозу 150 мг, були в значній мірі I2S-позитивними. Збільшення 40х. 6 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0062] На Фігурі 28 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що одержувала дозу 3 мг. Тільки синусоїдальні клітини були I2S-позитивними. Збільшення 40х. [0063] На Фігурі 29 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що одержувала дозу 30 мг. I2S-позитивними були синусоїдальні клітини й гепатоцити. Збільшення 40х. [0064] На Фігурі 30 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що одержувала дозу 100 мг. I2S-імуноофарблення було посилене в синусоїдальних клітинах і гепатоцитах. Збільшення 40х. [0065] На Фігурі 1 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що одержувала дозу 150 мг. Сильне I2S-позитивне офарблення виявлене в синусоїдальних клітинах і гепатоцитах. Збільшення 40х. [0066] На Фігурі 2 наведені показові результати для серця в групі тварин, що одержувала дозу 3 мг. I2S-імуноофарблення було негативним. Збільшення 40х. [0067] На Фігурі 3 наведені показові результати для серця в групі тварин, що одержувала дозу 30 мг. Інтерстиціальні клітини були I2S-позитивними. Збільшення 40х. [0068] На Фігурі 4 наведені показові результати для серця в групі тварин, що одержувала дозу 100 мг. I2S-позитивне офарблення інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0069] На Фігурі 35 наведені показові результати для серця в групі тварин, що одержувала дозу 150 мг. Значне I2S-позитивне офарблення інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0070] На Фігурі 36 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що одержувала дозу 3 мг. I2S-імуноофарблення було негативним. Збільшення 40х. [0071] На Фігурі 37 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що одержувала дозу 30 мг. I2S-позитивними були клубочкові та інтерстиціальні клітини. [0072] На Фігурі 5 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що одержувала дозу 100 мг. Посилення I2S-офарблення клубочкових та інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0073] На Фігурі 39 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що одержувала дозу 150 мг. I2S-позитивне офарблення проксимальних канальцевих, клубочкових та інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0074] На Фігурі 40 наведені результати імуногістохімічних (ІГХ) досліджень з оцінки тканин ЦНС яванських макак, яким вводили щотижня дози ідуронат-2-сульфатази (I2S). Як було показано методами ІГХ, великі клітинні відкладення I2S зустрічалися у всій ЦНС. У сірій речовині I2S виявлялася в нейронах великих півкуль, мозочка, стовбура мозку й спинного мозку у всіх груп із залежністю від дози. У поверхневій сірій речовині груп, що одержували більш високі дози, велика кількість нейронів у поверхневій корі демонструвала позитивне I2Sофарблення (Фігура 40A). I2S також виявлялася в нейронах таламуса (Фігура 40B), гіпокампа (Фігура 40C), хвостатого ядра (Фігура 40D) і спинного мозку (Фігура 40E). Менінгеальні та периваскулярні клітини були також I2S-позитивно офарбленими (Фігура 40F). Зазначена шкала відповідає 25 мкм. [0075] На Фігурі 41 наведене графічне порівняння кліренсу ідуронат-2-сульфатази (I2S) у краніальному та спінальному пулах на основі графіка залежності кількості I2S у таких пулах від часу після введення. [0076] На Фігурі 42 показане дозозалежне накопичення в сірій речовині у приматів, відмінних від людини, яким інтратекально вводили ідуронат-2-сульфатазу (I2S) протягом шести місяців. Показана інтенсивність офарблення відповідає накопиченню ідуронат-2-сульфатази в таламусі. На даній Фігурі 42 ядра контрастовані з використанням DAPI і виглядають синіми, а білок (I2S) виглядає зеленим. [0077] На Фігурі 43 показане дозозалежне накопичення введеної інтратекально ідуронат-2сульфатази (I2S) приматам, відмінним від людини, після однократної ін'єкції та після декількох ін'єкцій протягом шести місяців. Показана інтенсивність офарблення відповідає накопиченню білка I2S у корі головного мозку. [0078] На Фігурі 44 показана клітинна локалізація ідуронат-2-сульфатази (I2S) у головному мозку примата, що не є людиною. На Фігурі 44A представлений поперечний зріз тканин головного мозку, вилучених з головного мозку примата, що не є людиною, а на Фігурі 44B показані окремі області відділів, які відповідають трьом областям тканин білої речовини (позначених БР1, БР2 і БР3), білої речовини поблизу шлуночка (ШБР) і поверхневої сірої речовини (ПСР) розрізу, ідентифікованого на Фігурі 44A. [0079] Фігура 45A – D ілюструє поглинання нейронами та олігодендроцитами і асоціацію аксонів у приматів, відмінних від людини, при інтратекальному введенні ідуронат-2-сульфатази (I2S) після щомісячних ін'єкцій протягом шестимісячного періоду. Зокрема, Фігура 45A, Фігура 45B, Фігура 45C і Фігура 45D ілюструють офарблені волокна в тканинах головного мозку 7 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 приматів, відмінних від людини, яким інтратекально вводили ідуронат-2-сульфатазу (I2S), що відповідно співвідносяться з трьома областями білої речовини (БР1, БР2 і БР3) і областями поверхні сірої речовини, визначеними на Фігурі 44B. Фігура 45А ілюструє поглинання олігодендроцитами I2S, інтратекально введеної до тканини білої речовини. На Фігурі 45B і Фігурі 45C показане поглинання олігодендроцитами і асоціація аксонами інтратекально введеної I2S у тканинах білої речовини БР2 і БР3 відповідно. На Фігурі 45D показане поглинання інтратекально введеної I2S нейронами в тканинах на поверхні сірої речовини (ПСР). [0080] На Фігурі 46 показана клітинна ідентифікація ідуронат-2-сульфатази в білій речовині поблизу шлуночка (ШБВ) у приматів, відмінних від людини. Як показано на об'єднаному зображенні, ідуронат-2-сульфатаза не пов'язана з мієліном (показаний червоним). На даній Фігурі 46 ядра контрастовані з використанням DAPI (знизу ліворуч), білок (I2S) проявляється зверху ліворуч. [0081] На Фігурі 47 показане офарблення в тканинах здорових собак породи бігль, яким інтрацеребровентрикулярно (ІЦВ) або інтратекально (ІТ) вводили однократну ін'єкцію ідуронат2-сульфатази (I2S). Як показано на Фігурах 47А-47Н, I2S була широко розподілена в усій сірій речовині в обох випадках, як у ІТ, так і у ІЦВ груп, що було виявлено з використанням імуногістохімії (ІГХ). Фігури 47А і 47В показують, що в корі головного мозку нейрони є I2Sпозитивно офарбленими в усіх шести нейронних шарах, від поверхневого молекулярного шару до глибокого внутрішнього шару в обох групах: ІТ та ІЦВ. Фігури 47С і 47 D ілюструють, що в корі мозочка груп ІТ та ІЦВ I2S виявлена в нейронах, включаючи клітини Пуркіньє. Аналогічно, Фігури 47Е і 47F демонструють, що в обох групах з ІТ та ІЦВ введенням великі популяції нейронів у гіпокампі були I2S-позитивно офарбленими. Нарешті, зображення G і H показують, що I2S-позитивні нейрони були також знайдені в таламусі та хвостатому ядрі як у ІТ, так і у ІЦВ групі. На даній Фігурі 47 I2S-офарблення показане стрілками. [0082] На Фігурі 48 наведена порівняльна ілюстрація тканини мозолистого тіла мишей із нокаутом ідуронат-2-сульфатази (IKO), які відносяться до контрольної групи (без обробки), і тих, які одержували I2S інтратекально (скорочення V = вакуоль). Як можна побачити на зображенні, у мишей IKO, які одержували І2S, спостерігалося зниження клітинної вакуолізації, що є характерною рисою деяких лізосомних хвороб накопичення, у мозолистому тілі та зводі тканин I2S-оброблених мишей. [0083] На Фігурі 49A проілюстроване помітне зниження в присутності лізосомного пов'язаного з мембраною білка 1 (LAMP-1) патологічного маркера лізосомних хвороб у тканинах на поверхні кори мозку оброблених мишей IKO (Фігура 49A) в порівнянні з необробленими контрольними мишами IKO (Фігура 49B) при 20х і 40х збільшенні. [0084] На Фігурі 50 показаний приклад пристрою інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ). [0085] На Фігурі 51 показаний приклад низькопрофільної системи доступу PORT-A-CATH®, що інтратекально імплантується. [0086] На Фігурі 52 показаний приклад пристрою інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ). [0087] На Фігурі 6 показаний приклад пристрою інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ), який дозволяє вводити в домашніх умовах ферменти до ЦНС при замісній ферментній терапії (ЗФТ). [0088] Фігура 54 ілюструє типовий вплив на вакуолізацію після однократної внутрішньомозкової ін'єкції ідурсульфази до нейронів (клітини Пуркіньє). [0089] Фігура 557 ілюструє приклад активності I2S у головному мозку в залежності від дози та області. [0090] Фігура 56 ілюструє приклад даних з імуногістохімічної локалізації ідурсульфази в різних рівнях кори головного мозку. [0091] Фігура 57 ілюструє приклад активності I2S у спинному мозку мавпи після інтратекального введення ідурсульфази. [0092] Фігура 58 ілюструє приклад активності I2S у печінці, серці та нирках мавпи після інтратекального введення ідурсульфази. [0093] На Фігурі 59 показана типова схема програми випробувань із ескалацією дози HunterIT. [0094] Фігура 60 ілюструє приклад вимірювання концентрації I2S у різних зрізах тканин мозку після 30 мг дози. Різні криві відповідають різному часу вимірювання. [0095] Фігура 61 ілюструє приклад вимірювання концентрації I2S після тривалого введення з використанням різних шляхів введення та різних концентрацій продукту. 8 UA 115649 C2 124 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0096] Фігура 62 являє собою типове ПЕТ зображення I-міченої ідурсульфази-ІТ у яванських макак при t=5 годин після ВВ, ІТ-П або ІЦВ введення. [0097] На Фігурі 63 представлена типова схема пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів ПІДЛЗ. [0098] На Фігурі 64 показані різні елементи ПІДЛЗ у організмі суб'єкта (Фігура 64A) і на плоскій поверхні (Фігура 64B). ВИЗНАЧЕННЯ [0099] Для полегшення розуміння даного винаходу нижче надані визначення деяких термінів. Додаткові визначення наступних термінів та інші терміни наведені в тексті опису. [0100] Приблизно або близько: У даній заявці термін "приблизно" або "близько" стосовно одного або більше розглянутих значень відноситься до значення, яке є близьким до зазначеного еталонного значення. У деяких варіантах реалізації термін "приблизно" або "близько" відноситься до діапазону значень, які входять до діапазону 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % або менше в будь-якому напрямку (більше або менше) від установленого еталонного значення, якщо не зазначено інше або інше не є очевидним із контексту (окрім випадків, коли таке значення перевищує 100 % від можливого значення). [0101] Покращення: У даній заявці "покращення" означає попередження, скорочення або тимчасове полегшення стану, або покращення стану суб'єкта. Покращення включає, але не обов'язково, повне видужання або повне попередження хворобливого стану. У деяких варіантах реалізації, покращення включає підвищення рівнів відповідного білка або його активності, які є недостатніми у відповідних хворих тканинах. [0102] Біологічна активність: У даній заявці вираз "біологічна активність" відноситься до характеристики будь-якого агента, який має активність у біологічній системі й, зокрема, в організмі. Наприклад, агент, який при введенні до організму демонструє біологічний вплив на організм, вважається біологічно активним. У конкретних варіантах реалізації, у випадках, коли білок або поліпептид є біологічно активним, ту частину білка або поліпептиду, яка має щонайменше один вид біологічної активності білка або поліпептиду, як правило, називають "біологічно активною" частиною. [0103] Наповнювач: У даній заявці термін "наповнювач" відноситься до сполуки, яка додає маси ліофілізованій суміші та вносить вклад у фізичну структуру ліофілізованої таблетки (наприклад, полегшує виробництво по суті однорідної ліофілізованої таблетки, яка підтримує структуру з відкритими порами). Приклади таких наповнювачів включають манітол, гліцин, хлорид натрію, гідроксиетилкрохмаль, лактозу, сахарозу, трегалозу, поліетиленгліколь і декстран. [0104] Катіон-незалежний маноза-6-фосфатний рецептор (CI-MRP): У даній заявці термін "катіон-незалежний маноза-6-фосфатний рецептор (CI-MRP)” відноситься до клітинних рецепторів, які зв'язують фрагменти маноза-6-фосфату на попередниках кислих гідролаз у апараті Гольджи, призначених для транспорту до лізосом. На додаток до маноза-6-фосфатів, CI-MRP також зв'язує інші білки, у тому числі IGF-II. CI-MRP також відомий як рецептор "M6P/IGF-II", рецептор "CI-MRP/IGF-II", "рецептор IGF-II" або "рецептор IGF2". Ці терміни і їхні скорочення використовуються в даній заявці взаємозамінно. [0105] Супутня імунопригнічуюча терапія: У даній заявці термін "супутня імунопригнічуюча терапія" включає будь-які способи імунопригнічуючої терапії, які використовуються як попереднє лікування, прекондиціювання або паралельно зі способом лікування. [0106] Розчинник: У даній заявці термін "розчинник" відноситься до фармацевтично прийнятної (наприклад, безпечної та нетоксичної для ін'єкції людині) розчиняючої речовини, застосовної для приготування відновлюваного складу. Приклади розчинників включають стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (БВІ), буферний розчин (наприклад, фосфатно-сольовий буфер), стерильний фізіологічний розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози. [0105] Лікарська форма: У даній заявці термін "лікарська форма" і "дозована лікарська форма" відноситься до фізично дискретної одиниці терапевтичного білка для лікування пацієнта. Кожна одиниця містить деяку кількість активної речовини, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту. Слід розуміти, однак, що загальна доза в композиції буде визначена лікарем у рамках обґрунтованого медичного висновку. [0108] Замісна ферментна терапія (ЗФТ): У даній заявці термін "замісна ферментна терапія (ЗФТ)” відноситься до будь-якої терапевтичної стратегії, яка коректує дефіцит ферменту з використанням доставки відсутнього ферменту. У деяких варіантах реалізації, відсутній фермент доставляють шляхом інтратекального введення. У деяких варіантах реалізації, 9 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відсутній фермент доставляють шляхом інфузії до кров'яного потоку. Після введення фермент поглинається клітинами і транспортується до лізосом, де фермент діє, видаляючи речовини, які накопичуються в лізосомах у результаті ферментної недостатності. Як правило, замісна ферментна терапія лізосомальними ферментами є ефективною, терапевтичні ферменти доставляються до лізосом у клітинах відповідних тканин-мішеней, де проявляється дефект накопичення. [0106] Покращення, збільшення або зменшення: У даній заявці терміни "покращення", "збільшення" або "зменшення" чи граматичні еквіваленти вказують на значення, які співвідносяться зі значеннями базових вимірювань, наприклад, у того ж самого індивіда, до початку обробки/лікування, описаного в даній заявці, або значеннями, виміряними у контрольних індивідів (або декількох контрольних індивідів) при відсутності обробки/лікування, описаного в даній заявці. "Контрольні індивіди" являють собою індивідів, які страждають на ті ж самі форми лізосомної хвороби накопичення, що й індивіди, які проходять лікування, і вони приблизно того ж віку, що й індивіди, які проходять лікування (для того, щоб стадії захворювання індивіда, який проходить лікування, і контрольного індивіда (індивідів) були порівнянними). [0110] Індивід, суб'єкт, пацієнт: У даній заявці терміни "індивід", "суб'єкт" або "пацієнт" відносяться до людини або тварини, відмінної від людини. Індивід (який також згадується як "пацієнт" або "суб'єкт"), що проходить лікування, являє собою індивіда (плід, немовля, дитину, підлітка або дорослу людину), що страждає на розглянуте захворювання. [0111] Інтратекальне введення: У даній заявці термін "інтратекальне введення" або "інтратекальна ін'єкція" відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можуть бути використані різні методики, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через трепанаційний отвір або цистернову чи поперекову пунктуру або т.п. У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до ІТ введення або доставки через поперекову область або відділ, наприклад, поперекове ІТ введення або доставка. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, відділу хребта L2-S1. [0107] Лінкер: У даній заявці термін "лінкер" відноситься до амінокислотної послідовності в гібридному білку, крім тієї, яка зустрічається в конкретному положенні в природних білках і, як правило, лінкер сконструйований таким чином, що він є гнучким або являє собою проміжну структуру, таку як а-спіраль, між двома частинами білка. Лінкер також відноситься до спейсера. [0113] Ліопротектор: У даній заявці термін "ліопротектор" відноситься до молекули, яка попереджає або зменшує хімічну і/або фізичну нестабільність білка або іншої речовини при ліофілізації та наступному зберіганні. Приклади ліопротекторів включають цукри, такі як сахароза або трегалоза; амінокислоти, такі як глутамат натрію або гістидин; метиламіни, такі як бетаїн; ліотропні солі, такі як сульфат магнію; багатоатомні спирти, такі як трьохатомні або вищі спирти, наприклад, гліцерин, еритрит, гліцерол, арабітол, ксиліт, сорбіт і манітол, пропіленгліколь, поліетиленгліколь; плюроніки; і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, ліопротектор являє собою невідновлений цукор, такий як трегалоза або сахароза. [0108] Лізосомальний фермент: У даній заявці термін "лізосомальний фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який є здатним зменшити накопичені в лізосомах тварин сполуки або який може попередити чи покращити один або більше симптомів лізосомної хвороби накопичення. Лізосомальні ферменти, придатні для даного винаходу, включають як фермент дикого типу, так і модифікований лізосомальний фермент, і вони можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних методик або можуть бути виділені з природних джерел. Приклади лізосомальних ферментів перераховані в Таблиці 1. [0115] Лізосомна ферментна недостатність: У даній заявці термін "лізосомна ферментна недостатність" відноситься до групи генетичних захворювань, які є результатом недостатності щонайменше одного ферменту, який є необхідним для руйнування макромолекул (наприклад, ферментних субстратів) до пептидів, амінокислот, моноцукрів, нуклеїнових кислот і жирних кислот у лізосомах. У результаті у індивідів, що страждають на лізосомну ферментну недостатність, накопичуються сполуки в різних тканинах (наприклад, ЦНС, печінці, селезінці, кишечнику, стінках кровоносних судин та в інших органах). [0109] Лізосомна хвороба накопичення: У даній заявці термін "лізосомна хвороба накопичення" відноситься до будь-якої хвороби в результаті недостатності одного або декількох лізосомальних ферментів, необхідних для метаболізму природних макромолекул. Ці захворювання, як правило, призводять до накопичення незруйнованих молекул у лізосомах, що 10 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 призводить до збільшення числа запасних гранул (також називаних запасними пухирцями). Ці захворювання й різні приклади описані більш докладно нижче. [0117] Поліпептид: У даній заявці "поліпептид", у цілому, являє собою ланцюжок із щонайменше 2 амінокислот, з'єднаних одна з одною за допомогою пептидного зв'язку. У деяких варіантах реалізації, поліпептид може включати щонайменше 3-5 амінокислот, кожна з яких з'єднана з іншими з використанням щонайменше одного пептидного зв'язку. Фахівцям у даній області відомо, що поліпептиди можуть включати "неприродні" амінокислоти або інші молекули, які, проте, здатні до інтеграції в поліпептидний ланцюг. [0110] Заміщуючий фермент: У даній заявці термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який може діяти як заміщуючий, щонайменше частково, при недостатності або відсутності ферменту при лікуванні хвороби. У деяких варіантах реалізації, термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, дія якого може заміщувати, щонайменше частково, недостатність або відсутність лізосомальних ферментів при лізосомних хворобах накопичення, що підлягають лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент дозволяє знизити накопичення речовин у лізосомах ссавців або може попередити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. Заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, включають обидва з ферменту дикого типу і модифікованого лізосомального ферменту та можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних способів або виділені з природних джерел. Заміщуючий фермент може бути рекомбінантним, синтетичним, ген-активованим або природним ферментом. [0111] Розчинний: У даній заявці термін "розчинний" відноситься до здатності терапевтичного агента утворювати гомогенний розчин. У деяких варіантах реалізації, розчинність терапевтичного агента в розчині, до якого він введений і з використанням якого він транспортується до ділянки-мішені (наприклад, до клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до сайтумішені. Декілька факторів можуть впливати на розчинність терапевтичних агентів. Наприклад, фактори, які можуть впливати на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх косолюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції складені так, що солі кальцію виключаються з таких композицій. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти відповідно до даного винаходу є розчинними у відповідній фармацевтичній композиції. Слід мати на увазі, що хоча ізотонічні розчини, як правило, є переважними для парентерального введення складів, застосування ізотонічних розчинів може обмежувати адекватну розчинність для деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було продемонстровано, що злегка гіпертонічні розчини (наприклад, до 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) і цукровмісні розчини (наприклад, до 2 % сахарози в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) добре переносяться мавпами. Наприклад, найпоширенішою прийнятою композицією болюсного складу для ЦНС є фізіологічний розчин (150 мМ NaCl у воді). [0112] Стабільність: У даній заявці термін "стабільність" відноситься до здатності терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного ферменту) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усю або переважно всю його передбачувану біологічну активність і/або фізико-хімічну цілісність) при тривалому періоді часу. Стабільність терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента можуть бути оцінені протягом тривалого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). Загалом, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом були створені таким чином, щоб вони були здатні стабілізувати або ж сповільнювати чи запобігати деградації одного або більше терапевтичних агентів, поєднаних із ними (наприклад, рекомбінантних білків). У контексті даного винаходу стабільним складом є той, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свої фізичну і/або хімічну цілісність і біологічну активність при зберіганні й під час обробки (наприклад, заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена за утворенням високомолекулярних агрегатів, втратою ферментативної активності, формуванням пептидних фрагментів і зміщенням профілів заряду. [0121] Суб'єкт: У даній заявці термін "суб'єкт" означає будь-якого ссавця, включаючи людину. У деяких варіантах реалізації даного винаходу суб'єкт являє собою дорослого, підлітка і немовля. Крім того, даний винахід передбачає введення фармацевтичної композиції і/або здійснення способів лікування внутрішньоутробно. [0113] Суттєва гомологія: У даній заявці словосполучення "суттєва гомологія" відноситься до порівняння між послідовностями амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності зазвичай вважаються "по суті гомологічними", якщо 11 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вони містять гомологічні залишки у відповідних положеннях. Гомологічні залишки можуть бути однаковими залишками. Крім того, гомологічні залишки можуть бути неідентичними залишками, які мають адекватно близькі структурні і/або функціональні характеристики. Наприклад, як добре відомо фахівцям у даній області, деякі амінокислоти зазвичай класифікують як "гідрофобні" або "гідрофільні" амінокислоти і/або такі, що мають "полярні" або "неполярні" бічні ланцюги. Заміна однієї амінокислоти на іншу того ж типу часто може вважатися "гомологічною" заміною. [0114] Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як BLASTN для нуклеотидних послідовностей і BLASTP, gapped BLAST і PSI-BLAST для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. На додаток до ідентифікації гомологічних послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня гомології. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно гомологічними, якщо щонайменше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше їхніх відповідних залишків є гомологічними до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка залишків є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків. [0115] Суттєва ідентичність: У даній заявці словосполучення "суттєва ідентичність" відноситься до порівняння послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності, як правило, вважаються "по суті ідентичними", якщо вони містять однакові залишки у відповідних позиціях. Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як BLASTN для нуклеотидних послідовностей і BLASTP, gapped BLAST і PSI-BLAST для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. На додаток до визначення однакових послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня ідентичності. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно ідентичними, якщо не менше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше їхніх відповідних залишків ідентичні до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків. [0116] Синтетична СМР: У даній заявці термін "синтетична СМР" відноситься до розчину, який має рН, електролітний склад, вміст глюкози і осмос, що відповідають таким характеристикам у спинномозковій рідині. Синтетичну СМР також називають штучною СМР. У деяких варіантах реалізації, синтетична СМР являє собою розчин Елліотта B. [0126] Підходящий для доставки до ЦНС: У даній заявці фраза "підходящий для доставки до ЦНС" або "підходящий для інтратекальної доставки" стосовно фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом, як правило, відноситься до стабільності, переносимості та властивостей розчинності таких композицій, а також до здатності таких композицій доставляти ефективну кількість терапевтичного агента, що міститься в ньому, до цільових місць доставки (наприклад, до СМР або мозку). [0117] Тканини-мішені: У даній заявці термін "тканини-мішені" відноситься до будь-якої тканини, на яку впливає лізосомна хвороба накопичення, яка розглядається для лікування, або будь-якої тканини, в якій недостатньо лізосомальних ферментів, виражених у нормі. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, в яких існує помітна або аномально 12 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 висока кількість ферменту, субстрату, наприклад, накопичених у клітинних лізосомах тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають сприйнятливість до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, які відображають патології, супутні хвороби, симптоми або функції. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатньо лізосомальних ферментів, як правило, в нормі експресованих на високому рівні. У даній заявці "тканини-мішені" можуть являти собою тканинимішені головного мозку, тканини-мішені спинного мозку і/або периферичні тканини-мішені. Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче. [0128] Терапевтична група/фрагмент: У даній заявці термін "терапевтична група/фрагмент" відноситься до групи/фрагменту молекули, яка обумовлює терапевтичний ефект молекули. У деяких варіантах реалізації, терапевтична група/фрагмент являє собою поліпептид, що має терапевтичну активність. [0118] Терапевтично ефективна кількість: У даній заявці термін "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка (наприклад, заміщуючого ферменту), який дає терапевтичний ефект у суб'єкта, що пройшов лікування, відповідно до розумного співвідношення користь/ризик, застосовного для будь-якого медичного лікування. Терапевтичний ефект може бути об'єктивним (тобто вимірюваним із використанням деяких випробувань чи маркерів) або суб'єктивним (тобто суб'єкт проявляє ознаки або відчуває ефект). Зокрема, "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка або композиції, яка забезпечує лікування, покращення або попередження бажаного захворювання чи стану або демонструє помітний терапевтичний чи профілактичний ефект, такий як покращення симптомів, пов'язаних із хворобою, попередження або затримка прояву захворювання і/або зменшення тяжкості або частоти симптомів захворювання. Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять у режимі введення, який може включати багаторазове введення доз. Для будь-якого конкретного терапевтичного білка, терапевтично ефективна кількість (і/або відповідна доза з ефективним режимом введення) може варіювати, наприклад, у залежності від способу введення, в комбінації з іншими фармацевтичними засобами. Крім того, конкретна терапевтично ефективна кількість (і/або доза) для кожного конкретного пацієнта може залежати від різних факторів, включаючи захворювання, яке лікують, тяжкість захворювання; активність застосовуваного конкретного фармацевтичного агента, конкретного застосовуваного складу; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і дієту пацієнта, час введення, шлях введення і/або швидкість виведення або метаболізму застосовуваного конкретного гібридного білка, тривалість лікування і подібні фактори, які добре відомі в медицині. [0119] Допустимий/переносимий: У даній заявці терміни "допустимий/переносимий" і "переносимість" відносяться до здатності фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом не викликати побічних реакцій у суб'єкта, якому вводять таку композицію, або, як варіант, не викликати серйозної побічної реакції у суб'єкта, якому вводять таку композицію. У деяких варіантах реалізації, фармацевтична композиція згідно з даним винаходом добре переноситься суб'єктом, якому вводять таку композицію. [0131] Лікування: У даній заявці термін "лікування" (а також "лікувати/обробляти") відноситься до будь-якого введення терапевтичного білка (наприклад, лізосомального ферменту), яке повністю або частково пом'якшує, покращує стан, знімає, гальмує, затримує настання, зменшує тяжкість і/або зменшує частоту одного чи декількох симптомів або особливостей конкретного захворювання, розладу і/або умови (наприклад, синдрому Хантера, синдрому Санфіліппо типу B). Таке лікування/обробка може проводитися для суб'єкта, який не проявляє ознак відповідного захворювання, розладу і/або стану, і/або суб'єкта, який демонструє тільки перші ознаки захворювання, розладу і/або патологічного стану. Як альтернатива або доповнення таке лікування може проводитися для суб'єкта, який має одну або більше виражених ознак відповідного захворювання, розладу і/або патологічного стану. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0120] Згідно з даним винаходом запропоновані, серед іншого, покращені способи для ефективної прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Як уже обговорювалося вище, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, що заміщуючий фермент (наприклад, білок I2S) для лізосомної хвороби накопичення (наприклад, синдрому Хантера) може бути безпосередньо введений до спинномозкової рідини (ліквору) суб'єкта, що потребує лікування, у високих концентраціях, не викликаючи суттєвих несприятливих ефектів у суб'єкта. Найбільш дивно, автори даного винаходу виявили, що заміщуючий фермент може бути доставлений у простому фізіологічному розчині або буферній композиції без застосування синтетичної СМР. Ще більш несподіваним є те, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу не призводить до суттєвих побічних ефектів, таких як 13 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 тяжка імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, у деяких варіантах реалізації інтратекальну доставку відповідно до даного винаходу можна застосовувати при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії (наприклад, без індукції імунної толерантності з використанням попередньої обробки або попередньої підготовки). [0121] У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує ефективну дифузію до різних тканин головного мозку, що призводить до ефективного заміщення ферменту в різних тканинах-мішенях на поверхні головного мозку, до неглибоких і/або глибоких областей головного мозку. У деяких варіантах реалізації інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує достатню кількість заміщуючого ферменту, який циркулює в периферичній системі кровообігу. У результаті в деяких випадках інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу призводить до доставки заміщуючого ферменту до периферичних тканин, таких як печінка, серце й нирки. Цей результат є несподіваним і може бути особливо корисним для лікування лізосомних хвороб накопичення, що зачіпають як ЦНС, так і периферичні компоненти, які, як правило, потребують як регулярного інтратекального введення, так і внутрішньовенного введення. Припускається, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу може дозволити зменшити дози і/або частоту внутрішньовенної ін'єкції без шкоди для терапевтичного ефекту при лікуванні периферичних симптомів. [0122] Згідно з даним винаходом запропоновані різні несподівані й корисні ознаки, які забезпечують ефективну та зручну доставку заміщуючого ферменту до різних тканин мозку, що призводить до ефективного лікування лізосомних хвороб накопичення, прояв яких пов'язаний із ЦНС. [0123] Різні аспекти даного винаходу докладно описані в наступних розділах. Використання розділів не призначене для обмеження даного винаходу. Кожний розділ можна застосувати до будь-якого аспекту даного винаходу. У даній заявці використання "або" означає "і/або", якщо не зазначено інше. Заміщуючі ферменти Білок ідуронат-2-сульфатази (I2S) [0124] У деяких варіантах реалізації, способи і композиції, запропоновані в даному винаході, застосовують для доставки білка ідуронат-2-сульфатази (I2S) до ЦНС для лікування синдрому Хантера. Підходящий білок I2S може являти собою будь-яку молекулу або фрагмент молекули, яка може замінити активність природної ідуронат-2-сульфатази (I2S) або відновити один або декілька фенотипів чи симптомів, асоційованих із недостатністю I2S. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, являє собою поліпептид, який має N-кінець і C-кінець та амінокислотну послідовність, практично аналогічні або ідентичні зрілому білку I2S людини. [0125] Як правило, білок I2S людини продукується у вигляді попередника. Попередник I2S людини містить сигнальний пептид (амінокислотні залишки 1-25 повнорозмірного попередника), пропептид (амінокислотні залишки 26-33 повнорозмірного попередника) і ланцюг (залишки 34550 повнорозмірного попередника), який може додатково піддаватися процесингу з утворенням 42 кДа-ланцюга (залишки 34-455 повнорозмірного попередника) і 14 кДа-ланцюга (залишки 446550 повнорозмірного попередника). Як правило, попередник також відноситься до повнорозмірного попередника або повнорозмірного білка I2S, який містить 550 амінокислот. Амінокислотні послідовності зрілої форми (SEQ ID NO:1) з видаленим сигнальним пептидом і повнорозмірного попередника (SEQ ID NO:2) типового дикого типу або природного білка I2S людини наведені в Таблиці 1. 14 UA 115649 C2 Таблиця 1 Ідуронат-2-сульфатаза людини Зріла форма Повнорозмірний попередник 5 10 15 20 25 30 SETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNID QLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFN SYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDD SPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDV PEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKE FQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVP YGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTS DHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPY LDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFH VELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNS DKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSD PLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ ID NO:1) MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLR PSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRR PDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSN HTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVP EGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLY PLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDF QRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEH GEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLME PGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHF RFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIR TIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLL MP(SEQ ID NO:2) [0126] Таким чином, у деяких варіантах реалізації заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, являє собою зрілий білок I2S людини (SEQ ID NO: 1). У деяких варіантах реалізації, підходящий заміщуючий фермент може являти собою гомолог або аналог зрілого білка I2S людини. Наприклад, гомолог або аналог зрілого білка I2S людини може являти собою модифікований зрілий білок I2S людини, який містить одну або декілька амінокислотних замін, делецій і/або інсерцій у порівнянні з білком дикого типу або природним білком I2S (наприклад, SEQ ID NO:1), зберігаючи при цьому суттєву частину активності білка I2S. Так, у деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, є практично гомологічним зрілому білку I2S людини (SEQ ID NO: 1). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше гомологічну SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, практично ідентичний зрілому білку I2S людини (SEQ ID NO: 1). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичну SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, містить фрагмент або частину зрілого білка I2S людини. [0127] Як альтернатива, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, являє собою повнорозмірний білок I2S. У деяких варіантах реалізації, підходящий заміщуючий фермент може являти собою гомолог або аналог повнорозмірного білка I2S людини. Наприклад, гомолог або аналог повнорозмірного білка I2S людини може являти собою модифікований повнорозмірний білок I2S людини, який містить одну або декілька амінокислотних замін, делецій і/або інсерцій у порівнянні з білком дикого типу або природним повнорозмірним білком I2S (наприклад, SEQ ID NO: 2), зберігаючи при цьому суттєву частину активності білка I2S. Так, у деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, є практично гомологічним повнорозмірному білку I2S людини (SEQ ID NO: 2). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 15 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше гомологічну SEQ ID NO: 2. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, практично ідентичний SEQ ID NO: 2. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичну SEQ ID NO: 2. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, містить фрагмент або частину повнорозмірного білка I2S людини. У даній заявці повнорозмірний білок I2S зазвичай містить послідовність сигнального пептиду. Інші лізосомні хвороби накопичення і заміщуючі ферменти [0128] Очікується, що способи та композиції згідно з даним винаходом можна застосовувати для лікування інших лізосомних хвороб накопичення, зокрема лізосомних хвороб накопичення, які мають етіологію і/або симптоми ЦНС, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: аспартилглюкозамінурію, хворобу накопичення холестеринових ефірів, хворобу Вольмана, цистиноз, хворобу Данона, хворобу Фабрі, ліпогрунуломатоз Фарбера, хворобу Фарбера, фукозидоз, галактазидоз I/II типів, хворобу Гоше I/II/III типу, лейкодистрофію глобоїдних клітин, хворобу Краббе, хворобу накопичення глікогену II, хворобу Помпі, GM1-гангліозидоз I/II/III типу, GM2-гангліозидоз I типу, хворобу Тея-Сакса, GM2-гангліозидоз II типу, хворобу Сандхофа, GM2гангліозидоз, α-манозидоз I/II типу, β-манозидоз, метахроматичну лейкодистрофію, муколіпідоз типу I, сіалідоз типу I/II, муколіпідоз II/III типу, хворобу клітинних включень, муколіпідоз типу IIIC, муколіпідоз III типу, мукополісахаридоз I типу, мукополісахаридоз II типу, мукополісахаридоз IIIA типу, синдром Санфіліппо, мукополісахаридоз IIIB типу, мукополісахаридоз IIIC типу, мукополісахаридоз IIID типу, мукополісахаридоз IVA типу, синдром Моркіо, мукополісахаридоз IVB типу, мукополісахаридоз VI типу, мукополісахаридоз VII типу, синдром Слая, мукополісахаридоз IX типу, множинний дефіцит сульфатази, нейронний цероїдний ліпофусциноз, хворобу Баттена CLN1, хворобу Баттена CLN2, хворобу Німана-Піка типу A/B, хворобу Німана-Піка типу C1, хворобу Німана-Піка типу C2, пікнодизостоз, хворобу Шиндлера I/II типу, хворобу Гоше і хворобу накопичення сіалових кислот. [0129] Докладний огляд генетичної етіології, клінічних проявів і молекулярно-біологічних механізмів лізосомних хвороб накопичення докладно викладений у роботі Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, Mcgraw Hill, (1995). Таким чином, ферментна недостатність при вищезгаданих захворюваннях відома фахівцям у даній області, деякі з таких захворювань наведені як приклади в Таблиці 2 нижче: Таблиця 2 Назва хвороби Хвороба Помпа Недостатність ферменту Кисла α1,4-глюкорозилаза GM1 гангліозидоз Хвороба Тея-Сакса GM2 гангліозидоз: AB варіант Хвороба Сандхофа Хвороба Фабрі Хвороба Гоше Метахроматична лейкодистрофія Хвороба Краббе Хвороба Німана-Піка, типи A іB Хвороба Німана-Піка, тип C β-галактозидаза β-гексозамінідаза A GM2 активаторний білок Речовини, що накопичуються Глікоген α1,4-зв'язані олігосахариди GM1 гангліозид GM2 гангліозид GM2 гангліозид β-гексозамінідаза A і B α-галактозидаза A Глюкоцереброзидаза Арилсульфатаза A GM2 гангліозид Глобозиди Глюкозилцерамід Сульфатиди Галактозилцерамідаза Кисла сфінгомієліназа Галактоцереброзид Сфінгомієлін Пошкодження естерифікації холестерину Невідомо Кисла керамідаза Кисла ліпаза Сфінгомієлін Хвороба Німана-Піка, тип D Хвороба Фарбера Хвороба Вольмана 16 Сфінгомієлін Церамід Холестеринові ефіри UA 115649 C2 Таблиця 2 Синдром Хурлера (MPS IH) α-L-ідуронідаза A Гепаран N-сульфатаза Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран сульфатаза Синдром Шая (MPS IS) α-L-ідуронідаза Хурлер-Шай (MPS IH/S) α-L-ідуронідаза Синдром Хантера (MPS II) Ідуронат сульфатаза B α-N-ацетилглюкозамінідаза Гепаран сульфатаза C Ацетил-CoA-глюкозамімінід ацетилтрансфераза Ацетилглюкозамін-6сульфатаза β-галактозидаза Арилсульфатаза B β-глюкоронідаза α-манозидаза β-манозидаза α-L-фукозидаза N-аспартил-βглюкозоамінідаза α -нейромінідаза Недостатність лізосомного захисного білка α-N-ацетилгалактозамінідаза N-ацетилглюкозоамін-1фосфотрансфераза Те ж, що й при ML II Гепаран сульфатаза Інфантильна хвороба накопичення сіалових кислот Інфантильний нейроцероїдний ліпофусциноз Муколіпідоз IV Цистин транспортний білок Сіаловий кислий транспортний білок Сіаловий кислий транспортний білок Пальмітоїл-білкова тіоестераза Невідомо Вільний цистин Вільна сіалова кислота глюкуронова кислота Вільна сіалова кислота глюкуронова кислота Ліпофусцини Просапозин Сапозини A, B, C і D Синдром Санфіліппо типу (MPS IIIA) Синдром Санфіліппо типу (MPS IIIB) Синдром Санфіліппо типу (MPS IIIC) Синдром Санфіліппо типу (MPS IIID) Моркіо B (MPS IVB) Марото-Ламі (MPS VI) Синдром Слая (MPS VII) α-манозидоз β-манозидоз Фукозидоз Аспартилглюкозамінурія D Сіалідоз (Муколіпідоз I) Галактосіалідоз (синдром Голдберга) Хвороба Шиндлера Муколіпідоз II (I-клітинна хвороба) Муколіпідоз III (псевдоХантер полідистрофія) Цистиноз Хвороба Салла 5 10 Гепаран сульфатаза Кератан сульфат Дерматан сульфат Маноза/олігосахариди Маноза/олігосахариди Фукозил олігосахариди Аспартилглюкозамін аспарагіни Сіалілолігосахариди Сіалілолігосахариди Гепаран сульфат Гангліозиди кислоти і і і гіалуронові [0130] Способи згідно з даним винаходом можна застосовувати для доставки будь-яких заміщуючих ферментів. У даній заявці заміщуючі ферменти, підходящі для даного винаходу, можуть включати будь-який фермент, який може діяти як такий, що заміщує, щонайменше частково, активність недостатнього або відсутнього лізосомального ферменту при лізосомній хворобі накопичення, яка підлягає лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент здатний знизити накопичені речовини в лізосомах, або він може полегшити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. [0131] У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти можуть являти собою будь-які лізосомальні ферменти, про які відомо, що вони пов'язані з лізосомною хворобою накопичення, яку лікують. У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти обрані з ферментів, перерахованих у Таблиці 2. 17 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0132] У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати послідовність дикого типу або природну послідовність. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати змінену послідовність, по суті ідентичну або гомологічну послідовності дикого типу або природній послідовності (наприклад, таку, що має щонайменше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ідентичністю відносно послідовності дикого типу або природної послідовності). [0133] Заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може бути отриманий будьяким доступним способом. Наприклад, заміщуючі ферменти можуть бути отримані рекомбінантним шляхом з використанням системи клітини-хазяїна, в якій експресуються нуклеїнові кислоти, які кодують заміщуючий фермент. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути отримані шляхом активації ендогенних генів. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути частково або повністю отримані шляхом хімічного синтезу. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти також можуть бути виділені з природних джерел. [0134] При отриманні ферментів рекомбінантним шляхом можна застосовувати будь-яку систему експресії. Наприклад, відомі системи експресії включають, наприклад, яйцеклітини, бакуловіруси, рослини, дріжджі або клітини ссавців. [0147] У деяких варіантах реалізації, ферменти, підходящі для даного винаходу, отримують у клітинах ссавців. Необмежуючі приклади клітин ссавців, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають лінію мишачої мієломи BALB/с (NSO/I, ECACC No: 85110503); ретинобласти людини (PER.C6, Crucell, Лейден, Нідерланди); лінію CV1 нирок мавпи, трансформовану SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); лінію клітин нирки ембріона людини (293 або 293 клітини, субклоновані для росту в суспензійній культурі, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59,1977.); клітинну лінію фібросаркоми людини (наприклад, HT1080); клітини нирок дитинчат хом'яка (BHK, ATCC CCL 10); клітини яєчника китайського хом'ячка +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); клітини Сертолі миші (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); клітини нирки мавпи (CV1 ATCC CCL 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клітини цервікальної карциноми людини (Hela, ATCC CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клітини печінки пацюків buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клітини легені людини (W138, ATCC CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, HB 8065); клітини пухлини молочної залози миші (MMT 060562, ATCC CCL51); клітини TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 клітини; клітини FS4 і лінію гепатоми людини (Hep G2). [0135] У деяких варіантах реалізації, запропоновані способи відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючи ферментів, які виробляються клітинами людини. У деяких варіантах реалізації, способи, які пропонуються, відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючих ферментів, які виробляються клітинами СНО. [0136] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, які доставляються з використанням способу згідно з даним винаходом, містять молекулу, яка зв'язується з рецепторами на поверхні клітин головного мозку, що сприяє поглинанню клітинами і/або націлюванню на лізосоми. Наприклад, такий рецептор може являти собою катіон-незалежний маноза-6-фосфат рецептор (CI-MPR), який зв'язується з залишком маноза-6-фосфату (M6P). Крім того, CI-MPR також зв'язується з іншими білками, у тому числі IGF-II. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, містить залишки M6P на поверхні білка. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може містити біс-фосфорильовані олігосахариди, які мають більш високу афінність зв'язування з CI-MPR. У деяких варіантах реалізації, підходящий фермент містить щонайменше приблизно 20 %-біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. У інших варіантах реалізації, підходящі ферменти можуть містити приблизно 10 %, 15 %, 18 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. Хоча такі бісфосфорильовані олігосахариди можуть природно бути присутніми в ферменті, слід зазначити, що ферменти можуть бути модифіковані з отриманням ферментів, які містять такі олігосахариди. Наприклад, підходящі заміщуючі ферменти можуть бути модифіковані з використанням деяких ферментів, які здатні каталізувати перенос N-ацетилглюкозаміна-Lфосфату з UDP-GlcNAc в положенні 6'α-1,2-зв'язаних маноз на лізосомальні ферменти. Способи і композиції для отримання і застосування таких ферментів описані, наприклад, Canfield et al. у патенті США № 6537785 і патенті США № 6534300, кожний із яких включений до даної заявки за допомогою посилання. 18 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 [0137] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти для застосування в даному винаході можуть бути кон'юговані або гібридизовані з молекулами, що обумовлюють спрямовану доставку (таргетинг) до лізосом, які здатні зв'язуватися з рецептором на поверхні клітин головного мозку. Підходящими молекулами для лізосомного таргетингу є IGF-I, IGF-II, RAP, p97 і їх варіанти, гомологи або фрагменти (наприклад, включаючи їх пептиди, що мають послідовність, щонайменше на 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 % ідентичну послідовності зрілого пептиду людини IGF-I, IGF-II, RAP, p97 дикого типу). [0138] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, не модифіковані для покращення доставки або транспорту таких агентів через ГЕБ і до ЦНС. [0139] У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок включає групу для спрямованої доставки (наприклад, послідовність, яка забезпечує спрямовану доставку до лізосом) і/або пептид для проникнення через мембрану. У деяких варіантах реалізації, послідовність для спрямованої доставки і/або пептид для проникнення через мембрану є невід'ємною частиною терапевтичної молекули (наприклад, через хімічний зв'язок, через утворення гібридного білка). У деяких варіантах реалізації, послідовність для спрямованої доставки містить манозо-6фосфатну групу. У деяких варіантах реалізації, послідовність для спрямованої доставки містить групу IGF-I. У деяких варіантах реалізації, послідовність для спрямованої доставки містить групу IGF-II. Склади [0140] У деяких варіантах реалізації, бажані ферменти додають до стабільних складів для інтратекальної доставки. Деякі варіанти реалізації даного винаходу основані, щонайменше частково, на виявленому факті, що різні композиції, описані в даній заявці, сприяють ефективній доставці й розподілу одного або більше терапевтичних агентів (наприклад, ферменту I2S) у тканинах-мішенях, клітинах і/або органелах ЦНС. Серед іншого, композиції, описані в даній заявці, здатні солюбілізувати високі концентрації терапевтичних агентів (наприклад, ферменту I2S) і придатні для доставки таких терапевтичних агентів до ЦНС суб'єктів при лікуванні захворювань, що мають пов'язаний із ЦНС компонент і/або етіологію (наприклад, синдрому Хантера). Композиції, описані тут, також характеризуються покращеною стабільністю та покращеною переносимістю при введенні до ЦНС суб'єкта (наприклад, інтратекально), що цього потребує. [0141] До даного винаходу для інтратекальної доставки зазвичай застосовували традиційний небуферний ізотонічний сольовий розчин і розчин Елліотта В, який являє собою штучну СМР. Порівняння складу СМР і розчину Елліотта В наведене в Таблиці 3. Як показано в Таблиці 3, концентрації речовин у розчині Елліотта В близькі до таких у СМР. Розчин Елліотта В, однак, містить дуже низькі концентрації буфера і, відповідно, не може забезпечити адекватну буферну ємність, необхідну для стабілізації терапевтичних агентів (наприклад, білків), особливо протягом тривалого періоду часу (наприклад, у ході зберігання). Крім того, розчин Елліотта В містить деякі солі, які можуть бути несумісними зі складами, призначеними для доставки деяких терапевтичних агентів і зокрема білків або ферментів. Наприклад, солі кальцію, присутні в розчині Елліотта В, сприяють осадженню білків і тим самим знижують стабільність складу. Таблиця 3 + Розчин СМР Розчин Елліотта В 45 50 + ++ ++ Na мЕкв/л 117137 K мЕкв/л Ca мЕкв/л Mg мЕкв/л HCO3 мЕкв/л 2,3 2,2 2,2 22,9 149 2,6 2,7 2,4 22,6 Cl мЕкв/л 113127 132 pН Фосфор мг/л Глюкоза мг/л 7,31 1,2-2,1 45-80 6,07,5 2,3 80 [0142] Таким чином, у деяких варіантах реалізації, склади, придатні для доставки до ЦНС відповідно до даного винаходу, не є синтетичною або штучною СМР. [0143] У деяких варіантах реалізації, склади для доставки до ЦНС складені таким чином, що вони є стабільними або ж сповільнюють чи запобігають деградації терапевтичного агента (наприклад, ферменту I2S), який входить до їхнього складу. У даній заявці термін "стабільний" відноситься до можливості терапевтичного агента (наприклад, ферменту I2S) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усі або більшість видів передбачуваної біологічної активності і/або фізико-хімічну цілісність) протягом тривалого періоду часу. Стабільність 19 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента може бути оцінена протягом тривалого періоду часу (наприклад, переважніше протягом щонайменше 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). У даному контексті стабільний склад є таким складом, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свою фізичну і/або хімічну цілісність та біологічну активність при зберіганні й при проведенні з ним різних операцій (наприклад, у ході заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена на основі утворення високомолекулярних агрегатів, на основі втрати ферментативної активності, формування пептидних фрагментів і за зміщенням профілів заряду. [0144] Стабільність терапевтичного агента має особливо важливе значення. Стабільність терапевтичного агента може бути також оцінена за біологічною активністю й фізико-хімічною цілісністю терапевтичного агента протягом тривалого періоду часу. Наприклад, стабільність у цей момент часу може бути зіставлена зі стабільністю в більш ранній момент часу (наприклад, при складанні в день 0) або може бути зіставлена зі стабільністю терапевтичного агента без допоміжних речовин, і результати цього порівняння виражені у відсотках. Переважно, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом зберігають щонайменше 100 %, щонайменше 99 %, щонайменше 98 %, щонайменше 97 %, щонайменше 95 %, щонайменше 90 %, щонайменше 85 %, щонайменше 80 %, щонайменше 75 %, щонайменше 70 %, щонайменше 65 %, щонайменше 60 %, щонайменше 55 % або щонайменше 50 % біологічної активності терапевтичного агента або фізико-хімічної цілісності протягом тривалого періоду часу (наприклад, при вимірюванні щонайменше 6-12 місяців, при кімнатній температурі або при спеціальних умовах зберігання). [0145] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, бажані ферменти) є розчинними в складах згідно з даним винаходом. Термін "розчинний" стосовно терапевтичних агентів згідно з даним винаходом відноситься до здатності таких терапевтичних агентів утворювати гомогенний розчин. У переважному варіанті розчинність терапевтичного агента в розчині, в якому його вводять і з яким він транспортується до сайту-мішені дії (наприклад, клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до цільових ділянок-мішеней. Декілька факторів можуть впливати на розчинність терапевтичних агентів. Наприклад, фактори, які можуть впливати на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх косолюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції складені так, що солі кальцію виключаються з таких композицій. [0146] Підходящі склади, що перебувають у стані водного розчину, перед ліофілізацією, у ліофілізованій або відновленій формі, можуть містити терапевтичний агент, що цікавить дослідника, у різних концентраціях. У деяких варіантах реалізації, склади можуть містити білок або терапевтичний агент, що представляє інтерес, у концентрації з діапазону приблизно від 0,1 мг/мл до 100 мг/мл (наприклад, приблизно від 0,1 мг/мл до 80 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 60 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 40 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 25 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 60 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 40 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 25 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 15 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, приблизно від 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, приблизно від 1 мг/мл до 10 мг/мл, приблизно від 1 мг/мл до 20 мг/мл, приблизно від 1 мг/мл до 40 мг/мл, приблизно від 5 мг/мл до 100 мг/мл, приблизно від 5 мг/мл до 50 мг/мл або приблизно від 5 мг/мл до 25 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, склади за даним винаходом можуть містити терапевтичний агент у концентрації приблизно 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл або 100 мг/мл. [0147] Склади за даним винаходом у вигляді водних розчинів або відновлених ліофілізованих розчинів характеризуються їх переносимістю. У даній заявці терміни "переносимий" і "переносимість" відносяться до здатності фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом не викликати небажаної реакції у суб'єкта, якому вводять таку композицію, або, в альтернативному варіанті, не викликати серйозних побічних реакцій у суб'єкта, якому вводять подібну композицію. У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом добре переносяться суб'єктами, яким вводять подібні композиції. [0148] Багато терапевтичних агентів, зокрема білки і ферменти згідно з даним винаходом, потребують контрольованого рН і специфічних допоміжних речовин для підтримки їхньої розчинності та стабільності у фармацевтичній композиції згідно з даним винаходом. У Таблиці 4 20 UA 115649 C2 Наведені типові аспекти прикладів білкових складів, які підтримують розчинність і стабільність білкових терапевтичних агентів згідно з даним винаходом. Таблиця 4 Параметр pН Тип буфера Концентрація буфера Регулятор тонічності Поверхневоактивна речовина Інше 5 10 15 20 25 30 35 40 Показовий діапазон/Тип Від 5 до 7,5 Ацетат, сукцинат, цитрат, гістидин, фосфат або Трис 5-50 мМ NaСl, цукри, маніт Полісорбат 20, полісорбат 80 Амінокислоти (наприклад, аргінін), від десятків до сотень мМ Призначення Для стабілізації Іноді також для стабілізації Для підтримки оптимального pН Може також впливати на стабілізацію Для підтримки pН Може також стабілізувати й додавати йонної сили Для створення ізоосмотичного або ізотонічного розчинів Для надання стійкості до поверхні розділення та при зміщенні Для збільшення розчинності та стабільності Буфери [0149] pН складу є додатковим фактором, який здатний змінити розчинність терапевтичного агента (наприклад, ферменту або білка) у водному складі або складі перед ліофілізацією. Відповідно, склади згідно з даним винаходом переважно включають один або декілька буферів. У деяких варіантах реалізації, водні склади включають кількість буфера, достатню для підтримки оптимального рН зазначеної композиції приблизно між 4,0-8,0 (наприклад, приблизно 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,2; 6,4; 6,5; 6,6; 6,8; 7,0; 7,5 або 8,0). У деяких варіантах реалізації, рН складу композиції перебуває між приблизно 5,0-7,5, між приблизно 5,5-7,0, між приблизно 6,07,0 між приблизно 5,5-6,0, між приблизно 5,5-6,5 між приблизно 5,0-6,0, між приблизно 5,0-6,5 і між приблизно 6,0-7,5. Підходящі буфери включають, наприклад, ацетат, цитрат, гістидин, фосфат, сукцинат, трис(гідроксиметил)амінометан ("Трис") та інші органічні кислоти. Концентрація буфера і діапазон рН фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом є факторами керування або регулювання переносимості складу. У деяких варіантах реалізації, буферний агент є присутнім у концентрації з діапазону від приблизно 1 мМ до приблизно 150 мМ або від приблизно 10 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 15 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 20 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 25 мМ до приблизно 50 мМ. У деяких варіантах реалізації, підходящий буферний агент є присутнім у концентрації приблизно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 75 мМ, 100 мМ, 125 мМ або 150 мМ. Тонічність [0150] У деяких варіантах реалізації, склади, що перебувають у стані водного розчину, перед ліофілізацією, у ліофілізованій або відновленій формі, містять ізотонічний агент для підтримки ізотонічності складу. Як правило, "ізотонічний" означає, що склад, який розглядається, по суті має такий же осмотичний тиск, як і кров людини. Ізотонічні склади в загальному випадку мають осмотичний тиск від приблизно 240 мОсм/кг до приблизно 350 мОсм/кг. Ізотонічність можна виміряти з використанням, наприклад, тиску парів або осмотичної точки заморожування. Приклади ізотонічних агентів, включають, але не обмежуються перерахованими, гліцин, сорбіт, маніт, хлорид натрію й аргінін. У деяких варіантах реалізації, підходящі ізотонічні агенти можуть бути присутніми у водних складах і/або складах перед ліофілізацією в концентрації приблизно 0,01-5 % (наприклад, 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 або 5,0 %) за масою. У деяких варіантах реалізації, склади для ліофілізації містять ізотонічний агент для підтримки ізотонічності складів перед ліофілізацією або відновлених складів. [0151] Хоча ізотонічні розчини, як правило, є переважними для парентерального введення складів, застосування ізотонічних розчинів може змінити розчинність для деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було продемонстровано, що злегка гіпертонічні розчини (наприклад, до 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) і цукровмісні розчини (наприклад, до 2 % сахарози в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) добре переносяться. Найпоширенішою прийнятою композицією болюсного складу для ЦНС є фізіологічний розчин (приблизно 150 мМ NaСl у воді). 21 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стабілізуючі агенти [0152] У деяких варіантах реалізації, склади можуть містити стабілізуючий агент або ліопротектор для захисту білка. Як правило, підходящий стабілізуючий агент являє собою цукор, нередукуючий цукор і/або амінокислоту. Приклади цукрів включають, але не обмежуються перерахованими, декстран, лактозу, маніт, сорбіт, рафінозу, сахарозу й трегалозу. Приклади амінокислот включають, але не обмежуються перерахованими, аргінін, гліцин і метіонін. Додаткові стабілізуючі агенти можуть включати хлорид натрію, гідроксиетилкрохмаль і полівінілпіролідон. Кількість стабілізуючого агента в ліофілізованому складі є в загальному випадку такою, що склад буде ізотонічним. Проте, гіпертонічні склади також можуть бути підходящими. Крім того, кількість стабілізуючого агента не повинна бути занадто низькою, такою, при якій має місце неприйнятна деградація/агрегація терапевтичного агента. Приблизні концентрації стабілізуючого агента в композиції можуть варіювати від 1 мМ до 400 мМ (наприклад, від 30 мМ до 300 мМ, від 50 мМ до 100 мМ) або, навпаки, від 0,1 % до 15 % (наприклад, від 1 % до 10 %, від 5 % до 15 %, від 5 % до 10 %) за масою. У деяких варіантах реалізації, співвідношення масової кількості стабілізуючого агента і терапевтичного агента становить приблизно 1:1. У інших варіантах реалізації, співвідношення маси стабілізуючого агента і терапевтичного агента може становити приблизно 0,1:1; 0,2:1; 0,25:1; 0,4:1; 0,5:1; 1:1; 2:1; 2,6:1; 3:1; 4:1; 5:1; 10:1 або 20:1. У деяких варіантах реалізації, підходящий для ліофілізації стабілізуючий агент є ліопротектором. [0153] У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, підходящі для даного винаходу, містять аморфні матеріали. У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, підходящі для даного винаходу, містять значну кількість аморфних матеріалів (наприклад, склади на основі сахарози). У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, підходящі для даного винаходу, містять частково кристалічні/частково аморфні матеріали. Наповнювачі [0154] У деяких варіантах реалізації, підходящі для ліофілізації склади можуть додатково включати один або більше наповнювачів. "Наповнювач" являє собою сполуку, яка додає маси ліофілізованій суміші й бере участь у формуванні фізичної структури ліофілізованої таблетки. Наприклад, наповнювач може покращувати зовнішній вигляд ліофілізованої таблетки (наприклад, по суті однорідної ліофілізованої таблетки). Підходящі наповнювачі включають, але не обмежені перерахованими: хлорид натрію, лактозу, маніт, гліцин, сахарозу, трегалозу, гідроксиетил крохмаль. Показові концентрації наповнювачів становлять від 1 % до 10 % (наприклад, 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, 2,5 %, 3,0 %, 3,5 %, 4,0 %, 4,5 %, 5,0 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 %, 7,0 %, 7,5 %, 8,0 %, 8,5 %, 9,0 %, 9,5 % і 10,0 %). Поверхнево-активні речовини [0155] У деяких варіантах реалізації, є бажаним додавання поверхнево-активної речовини до складів. Приклади поверхнево-активних речовин включають нейонні поверхнево-активні речовини, такі як полісорбати (наприклад, полісорбат 20 або 80); полоксамери (наприклад, полоксамер 188); тритон; додецилсульфат натрію (ДСН); лаурилсульфати натрію; октилглікозиди натрію; лаурилсульфат; мірістил-, лінолеїл- або стеариновий сульфобетаїн; лаурил-, мірістил-, лінолеїл- або стеариновий саркозин; лінолеїл-, мірістил- або цетилбетаїн; лауроамідопропіл; кокамідопропіл, лінолеамідопропіл; мірістамідопропіл; пальмідопропіл або ізостеарамідопропіл-бетаїни (наприклад, лауроамідопропіл); мірістарнідопропіл-, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропіл-диметиламіни; натрію метилкокоїл- або динатрію метилофеїл-таурати і ПАР серії MONAQUATTM (Mona Industries, Inc, Патерсон, штат НьюДжерсі), поліетиленгліколь, поліпропілгліколь і співполімери етилену, і пропіленгліколь (наприклад, Pluronics, PF68 і т.д.). Як правило, кількість поверхнево-активної речовини є такою, що вона зменшує агрегацію білка і зводить до мінімуму утворення часток або спінювання. Наприклад, поверхнево-активна речовина може бути присутньою в композиції в концентрації приблизно 0,001-0,5 % (наприклад, приблизно 0,005-0,05 % або приблизно 0,005-0,01 %). Зокрема поверхнево-активна речовина може бути присутньою в композиції в концентрації приблизно 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 % або приблизно 0,5 % і т.д. Як альтернатива або доповнення, поверхнево-активну речовину можна додати до ліофілізованого складу, складу перед ліофілізацією і/або відновленого складу. [0156] Інші фармацевтично прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори, наприклад, описані в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), можна включати до складу (і/або ліофілізованого складу і/або відновленого складу) за умови, що вони не виявляють несприятливої дії на бажані характеристики складу. Прийнятні носії, наповнювачі або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах та концентраціях і включають, але не обмежуються перерахованими, додаткові буферні агенти; консерванти; 22 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 співрозчинники, антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; хелатуючі агенти, наприклад, ЕДТА; комплекси металів (наприклад, Zn-білкові комплекси); біорозкладні полімери, наприклад, поліефіри; і/або солеутворюючі протийони, наприклад, натрій. [0157] Склади, які перебувають у стані водного розчину, перед ліофілізацією, у ліофілізованій або повторно розчиненій формі, відповідно до даного винаходу можуть бути оцінені на основі аналізу якості продукції, часу відновлення (якщо склад ліофілізований), якості повторного розчинення (якщо склад ліофілізований), високої молекулярної маси, вологості й температури склування. Як правило, аналіз якості білка і продуктів включає аналіз швидкості руйнування продукту з використанням методів, що включають, але не обмежені перерахованими: ексклюзійну ВЕРХ (SE-HPLC), катіонообмінну ВЕРХ (CEX-HPLC), рентгенівську дифракцію (РД), модульовану диференціальну скануючу калориметрію (МДСК), ВЕРХ зі зворотною фазою (RP-HPLC), багатокутове світлорозсіювання (MALS), флуоресценцію, поглинання в ультрафіолеті, нефелометрію, капілярний електрофорез (КЕ), електрофорез в ДСН-ПААГ (SDS-PAGE) і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, оцінка продукту відповідно до даного винаходу може включати стадію оцінки зовнішнього вигляду (зовнішній вигляд рідини або таблетки). [0158] Як правило, склади (ліофілізовані або водні) можуть зберігатися протягом тривалого часу при кімнатній температурі. Температура зберігання може коливатися від 0 °С до 45 °C (наприклад, 4 °C, 20 °C, 25 °C, 45 °C і т.д.). Склади можуть зберігатися протягом періоду від декількох місяців до декількох років. Строк зберігання, як правило, становить 24 місяці, 12 місяців, 6 місяців, 4,5 місяці, 3 місяці, 2 тижні або 1 місяць. Склади можуть зберігатися безпосередньо в контейнері, який застосовується для введення, що дозволяє виключити стадію переносу. [0159] Склади можуть зберігатися безпосередньо в ліофілізаційному контейнері (якщо вони ліофілізовані), який може функціонувати як посудина для відновлення, щоб виключити стадію переносу. Крім того, ліофілізований лікарський склад може бути дозований із невеликим інкрементом для зберігання. У процесі зберігання в цілому необхідно уникати впливів, які призводять до руйнування білків, у тому числі, без обмежень, впливів сонячних променів, ультрафіолетового випромінювання та інших форм електромагнітного випромінювання, надмірного тепла або холоду, швидкого теплового шоку й механічного шоку. Ліофілізація [0160] Способи відповідно до даного винаходу можна використовувати для ліофілізації будьяких матеріалів, зокрема терапевтичних агентів. Як правило, склад перед ліофілізацією додатково містить відповідний вибір допоміжних речовин або інших компонентів, наприклад, стабілізаторів, буферних агентів, наповнювачів і поверхнево-активних речовин для запобігання руйнування/деградації (наприклад, агрегації, дезамідування і/або окиснення білка) цільової сполуки в процесі сублімаційного сушіння та зберігання. Склад для ліофілізації може включати один або декілька додаткових інгредієнтів, включаючи ліопротектори або стабілізуючі агенти, буфери, наповнювачі, ізотонічні агенти й поверхнево-активні речовини. [0161] Після змішування речовини, що представляє інтерес, і додаткових компонентів склад ліофілізують. Ліофілізація зазвичай включає три основні стадії: заморожування, первинне сушіння і вторинне сушіння. Заморожування є необхідним для перетворення води в лід або деяких аморфних компонентів складу в кристалічну форму. Первинне сушіння являє собою стадію, на якій лід видаляють із замороженого продукту прямою сублімацією при низькому тиску й температурі. Вторинне сушіння являє собою стадію, на якій із матриці продукту видаляють зв'язану воду, використовуючи дифузію залишкової води до випаровуючої поверхні. Температура продукту при вторинному сушінні, як правило, вища, ніж при первинному сушінні. Див. Tang X. et al. (2004) "Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: Practical advice, " Pharm. Res., 21:191-200; Nail S.L. et al. (2002) "Fundamentals of freeze-drying, " in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail S.L. editor New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353; Wang et al. (2000) "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, ” Int. J. Pharm., 203:1-60; Williams N.A. et al. (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review.” J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59. Як правило, будь-який спосіб ліофілізації можна використовувати в зв'язку з даним винаходом. [0162] У деяких варіантах реалізації, під час початкового заморожування продукту можна впровадити стадію відпалювання. Стадія відпалювання може скоротити загальний час циклу. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь теорією, припускають, що відпалювання може сприяти кристалізації допоміжної речовини та утворенню більших кристалів льоду в зв'язку з повторною кристалізацією дрібних кристалів, які утворювалися при переохолодженні, що, в свою чергу, покращує відновлення. Як правило, стадія відпалювання включає інтервал чи 23 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 коливання температури при заморожуванні. Наприклад, температура заморожування може становити -40 C, а на стадії відпалювання температуру підвищують, наприклад, до -10 C, і підтримують на цьому рівні протягом заданого періоду часу. Час здійснення стадії відпалювання може коливатися від 0,5 години до 8 годин (наприклад, 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3; 4; 6 і 8 годин). Температура відпалювання може перебувати між температурою заморожування і 0 C. [0163] Ліофілізацію можна виконати в контейнері, наприклад, пробірці, пакеті, пляшці, лотку, флаконі (наприклад, скляному флаконі), шприці або будь-якому іншому підходящому контейнері. Контейнери можуть бути одноразовими. Ліофілізацію також можна виконувати у великих або невеликих масштабах. У деяких випадках може бути бажаним ліофілізувати склад білка в тому ж контейнері, в якому передбачається відновлення білка для запобігання стадії переносу. Контейнер у цьому випадку може, наприклад, являти собою 3, 4, 5, 10, 20, 50 або 100 мл флакон. [0164] Для цієї мети є доступною велика кількість різних ліофілізаторов, наприклад, напівпромисловий сушильний апарат Hull pilot scale dryer (SP Industries, США), лабораторний ліофілізатор Genesis (SP Industries) або будь-який ліофілізатор, здатний контролювати задані параметри ліофілізації. Ліофілізацію здійснюють шляхом заморожування складу і наступної сублімації льоду з замороженого вмісту при температурі, підходящій для первинного сушіння. При початковому заморожуванні температура складу знижується до менш, ніж приблизно -20 C (наприклад, -50 C, -45 C, -40 C, -35 C, -30 C, -25 C і т.д.), як правило, не більше, ніж на приблизно 4 години (наприклад, не більше, ніж на приблизно 3 години, не більше, ніж на приблизно 2,5 години, не більше, ніж на приблизно 2 години). При цих умовах температура продукту, як правило, перебуває нижче від евтектичної точки або температури руйнування складу. Як правило, температура первинного сушіння змінюється від приблизно -30 C до -25 C (за умови, що при первинному сушінні продукт залишається нижче температури плавлення) при підходящому тиску, зазвичай приблизно від 20 до 250 мТорр. Склад, розмір і тип контейнера (наприклад, скляного флакона), який містить зразок, а також об'єм рідини в основному визначають час, необхідний для сушіння, який може варіюватися від декількох годин до декількох днів. Стадію вторинного сушіння здійснюють при температурі приблизно 0-60 °C, у залежності, в першу чергу, від типу й розміру контейнера та типу використаного терапевтичного білка. Аналогічно, об'єм рідини в основному визначає час, необхідний для сушіння, який може варіюватися від декількох годин до декількох днів. [0165] У загальному випадку, ліофілізація призводить до одержання ліофілізованого складу, в якому вміст вологи становить менше, ніж приблизно 5 %, менше, ніж приблизно 4 %, менше, ніж приблизно 3 %, менше, ніж приблизно 2 %, менше, ніж приблизно 1 %, і менше, ніж приблизно 0,5 %. Повторне розчинення [0166] Оскільки фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом, як правило, при введенні суб'єктові перебувають у формі водного розчину, у деяких варіантах реалізації фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом є ліофілізованими. Такі композиції повинні бути відновленими шляхом додавання одного або більше розчинників перед введенням суб'єктові. На необхідній стадії, як правило, у відповідний час перед введенням пацієнтові, ліофілізований препарат можна відновити за допомогою розчинника до бажаної концентрації білка у відновленому складі. [0167] Відповідно до даного винаходу можна використовувати різні розчинники. У деяких варіантах реалізації, підходящий для відновлення розчинник являє собою воду. Воду, яка використовується як розчинник, можна обробляти різними способами, включаючи зворотний осмос, дистиляцію, дейонізацію, фільтрацію (наприклад, фільтрацію активованим вугіллям, мікрофільтрацію, нанофільтрацію) і комбінації цих способів обробки. У загальному випадку, вода повинна бути придатною для ін'єкцій, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, стерильну воду або бактеріостатичну воду для ін'єкцій. [0168] Додаткові приклади розчинників включають буферні розчини для регулювання pН (наприклад, фізіологічний розчин з фосфатним буфером), стерильний фізіологічний розчин, розчин Елліотта, розчин Рінгера або розчин декстрози. Підходящі розчинники можуть необов'язково містити консервант. Приклади консервантів включають ароматичні спирти, наприклад, бензиловий спирт або фенол. Використовувану кількість консерванту визначають шляхом оцінки різних концентрацій консерванту для сумісності з білком і тестування ефективності консерванту. Наприклад, якщо консервант являє собою ароматичний спирт (наприклад, бензиловий спирт), він може бути присутнім у кількості приблизно 0,1-2,0 %, приблизно 0,5-1,5 % або приблизно 1,0-1,2 %. 24 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0169] Розчинники, придатні для даного винаходу, можуть включати різні добавки, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, буферні агенти для регулювання pН (наприклад, Трис, гістидин), солі (наприклад, хлорид натрію) та інші добавки (наприклад, сахарозу), у тому числі й описані вище (наприклад, стабілізуючі агенти, ізотонічні агенти). [0170] Відповідно до даного винаходу, ліофілізовану речовину (наприклад, білок) можна відновити до концентрації щонайменше 25 мг/мл (наприклад, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл, щонайменше 100 мг/мл) і в будь-якому діапазоні між цими значеннями. У деяких варіантах реалізації, ліофілізовану речовину (наприклад, білок) можна повторно розчинити в концентрації з діапазону від приблизно 1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл (наприклад, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 5 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 25 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 30 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 100 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути вищою, ніж концентрація в складі перед ліофілізацією. Високі концентрації білка в повторно розчиненому складі вважаються особливо цінними, коли передбачається підшкірна або внутрішньом'язова доставка повторно розчиненого складу. У деяких варіантах реалізації, концентрація білка в повторно розчиненому складі може бути приблизно в 2-50 разів (наприклад, приблизно 2-20 разів, приблизно 2-10 разів або приблизно 2-5 разів) вищою від концентрації в складі перед ліофілізацією. У деяких варіантах реалізації, концентрація білка в повторно розчиненому складі може бути щонайменше приблизно в 2 рази (наприклад, щонайменше приблизно в 3, 4, 5, 10, 20, 40 разів) вищою від концентрації в складі перед ліофілізацією. [0171] Повторне розчинення відповідно до даного винаходу можна виконати в будь-якому контейнері. Приклади контейнерів, підходящих для винаходу, включають, але не обмежуються перерахованими, наприклад, пробірки, флакони, шприци (наприклад, однокамерні або двокамерні), пакети, пляшки й лотки. Підходящі контейнери можуть бути виготовлені з будьяких матеріалів, наприклад, скла, пластику, металу. Контейнери можуть бути одноразовими або багаторазовими. Відновлення також можна виконувати у великих або невеликих масштабах. [0172] У деяких випадках може бути бажаним ліофілізувати склад білка в тому ж контейнері, в якому передбачається відновлення білка для запобігання стадії переносу. Контейнер у цьому випадку може, наприклад, являти собою 3, 4, 5, 10, 20, 50 або 100 мл флакон. У деяких варіантах, підходящий контейнер для ліофілізації та повторного розчинення являє собою двокамерний шприц (наприклад, шприци Lyo-Ject® (Vetter)). Наприклад, двокамерний шприц може містити як ліофілізовану речовину, так і розчинник, кожний із яких перебуває в окремій камері, розділені пробкою (див. Приклад 5). Для відновлення до пробки з боку розчинника можна приєднати поршень і шляхом натискання на нього перенести розчинник до камери з продуктом, так що розріджувач може контактувати з ліофілізованою речовиною і може відбуватися відновлення, як описано вище (див. Приклад 5). [0173] Фармацевтичні композиції, склади й пов'язані з ними способи згідно з даним винаходом є корисними для доставки різних терапевтичних агентів до ЦНС суб'єкта (наприклад, інтратекально, інтравентрикулярно або інтрацистернально) і для лікування супутніх захворювань. Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом є особливо корисними для доставки білків і ферментів (наприклад, при замісній ферментній терапії) до організму пацієнтів, що страждають на лізосомні хвороби накопичення. Лізосомні хвороби накопичення являють собою групу порівняно рідкісних спадкових розладів обміну речовин, які є результатом дефектів функції лізосом. Лізосомні захворювання характеризуються накопиченням нерозщеплених макромолекул у лізосомах, що призводить до збільшення розмірів та кількості таких лізосом і в остаточному підсумку – до клітинної дисфункції та клінічних аномалій. Доставка до ЦНС [0174] Припускається, що різні стабільні склади, описані тут, як правило, підходять для доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи. Стабільні склади відповідно до даного винаходу можна використовувати для доставки до ЦНС за допомогою різних способів і шляхів, включаючи інтрапаренхімальне, інтрацеребральне, внутрішньошлуночкове церебральне (IЦВ), інтратекальне (наприклад, інтратекальне через поперековий відділ, інтратекальне через задню мозочково-мозкову цистерну) введення та будь-які інші способи і шляхи ін'єкцій прямо або непрямо до ЦНС і/або ПНС, але не обмежуючись ними. 25 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інтратекальна доставка [0175] У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до ЦНС у складі, описаному в даному документі. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до центральної нервової системи шляхом введення до спинномозкової рідини (ліквору) суб'єктові, що потребує такого лікування. У деяких варіантах реалізації, для доставки бажаного заміщуючого ферменту (наприклад, білка I2S) до СМР застосовують інтратекальне введення. У даній заявці інтратекальне введення (також відоме як інтратекальна ін'єкція) відноситься до ін'єкції до спинномозкового каналу (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можуть застосовуватися різні методики, включаючи, без обмежень, церебровентрикулярні ін'єкції через трепанаційний отвір або цистерни, або спинномозкову пункцію, або тому подібне. Приклади способів описані в роботах Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 і Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179, зміст яких включений до даної заявки за допомогою посилання. [0176] Відповідно до даного винаходу фермент може бути ін'єктованим до будь-якої області навколо спинномозкового каналу. У деяких варіантах реалізації, фермент ін'єктують до поперекової області або цистерни, або інтравентрикулярно до простору мозкового шлуночка. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, до відділу хребта L2-S1. Як правило, інтратекальні ін'єкції через поперековий відділ або поперекову область також називають "поперековою ІТ доставкою" або "поперековим ІТ введенням". Термін "задня мозочково-мозкова цистерна" відноситься до простору навколо й нижче від мозочка через отвір між черепом і верхньою частиною хребта. Як правило, інтратекальне введення через цистерну також згадується як "доставка до задньої мозочково-мозкової цистерни". Термін "шлуночок мозку" відноситься до порожнини мозку, яка продовжується в центральному каналі спинного мозку. Як правило, ін'єкції в мозкову порожнину шлуночка називають інтравентрикулярною церебральною (ІЦВ) доставкою. [0177] У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до поперекового ІТ введення або доставки, наприклад, доставки між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш конкретно, L2-S1 відділу хребта. Припускається, що поперекове ІТ введення або доставка відрізняється від доставки до задньої мозочково-мозкової цистерни тим, що поперекове ІТ введення або доставка відповідно до даного винаходу забезпечує кращу й більш ефективну доставку до дистального каналу хребта, в той час як цистернова доставка, крім усього іншого, як правило, не забезпечує доставку складу до дистального каналу хребта. Пристрій для інтратекального введення [0191] Різні пристрої можна застосовувати для інтратекальної доставки відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації, пристрій для інтратекального введення містить порт введення рідини (наприклад, ін'єкційний порт): порожній резервуар (наприклад, катетер), який включає перший отвір для рідини, сполучений із вхідним портом для рідини, і другий отвір для рідини, виконаний із можливістю введення до спинного мозку, і блокуюче пристосування для блокування введення порожнистої основної частини до спинного мозку. Як приклад, але не обмеження, на Фігурі 62 показано, що підходяще блокуюче пристосування включає одну або більше опуклостей, виконаних на поверхні порожнистої основної частини, і блокуюче кільце виконане з можливістю установки над однією або більшим числом опуклостей для запобігання вислизанню порожнистої основної частини (наприклад, катетера) зі спинного мозку. У різних варіантах реалізації, порт введення рідини включає резервуар. У деяких варіантах реалізації, порт введення рідини включає механічний насос (наприклад, інфузійний насос). У деяких варіантах реалізації, імплантований катетер з'єднують із резервуаром (наприклад, для болюсної доставки) або з інфузійним насосом. Порт введення рідини може бути таким, що імплантується, або бути зовнішнім. [0178] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення може бути виконане або з використанням спинномозкової пункції (тобто повільний болюс) або через систему доставки порт-катетер (наприклад, інфузія або болюс). У деяких варіантах реалізації, катетер вводять між пластинками поперекових хребців, і наконечник вставлений до міжоболонкового простору до бажаного рівня (як правило, L3-L4) (На Фігурі 63). [0179] Однократна доза, підходяща для інтратекального введення зазвичай є невеликою в порівнянні з внутрішньовенним введенням. Зазвичай інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу підтримує баланс складу СМР, а також внутрішньочерепний тиск суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка здійснюється при відсутності відповідного вилучення СМР у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, об'єм, підходящий для однократної 26 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дози, може бути, наприклад, меншим за 10 мл, 8 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1,5 мл, 1 мл, 0,5 мл, або в деяких варіантах реалізації, об'єм, підходящий для однократної дози, може становити приблизно 0,5-5 мл, 0,5-4 мл, 0,5-3 мл, 0,5-2 мл, 0,5-1 мл, 1-3 мл, 1-5 мл, 1,5-3 мл, 1-4 мл або 0,5-1,5 мл. У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу включає стадію попереднього вилучення необхідної кількості спинномозкової рідини. У деяких варіантах реалізації, перед ІТ введенням видаляють менше, ніж 10 мл (наприклад, менше, ніж 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1 мл) СМР. У тих випадках підходящий об'єм однократної дози може становити, наприклад, більше 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл або 20 мл. [0180] Різні інші пристрої можуть бути використані для здійснення інтратекального введення терапевтичної композиції. Наприклад, склади, що містять бажані ферменти, можуть бути надані для використання з резервуаром Омайя, який зазвичай застосовують для інтратекального введення лікарських засобів при менінгеальному карциноматозі (Lancet 2: 983-84, 1963). Зокрема в цьому способі вентрикулярну трубку вводять через отвір, сформований у передньому розі спинного мозку, і підключають до резервуара Омайя, встановленого під шкірою голови, і резервуар проколюють підшкірно для інтратекальної доставки заміщуючого ферменту, який вводять до резервуару. Інші пристрої для інтратекального введення терапевтичних композицій або складів описані в патентах США №6217552, включених до даної заявки за допомогою посилання. Крім того, склад може бути введений інтратекально, наприклад, шляхом однократної ін'єкції або інфузії. Слід розуміти, що лікувальна доза може являти собою або одноразову дозу, або багаторазову дозу. [0181] Для ін'єкції склади даного винаходу можуть бути приготовані у вигляді рідких розчинів. Крім того, фермент може входити до складу в твердому вигляді і може бути повторно розчиненим або суспендованим безпосередньо перед застосуванням. Ліофілізовані форми також передбачені. Ін'єкція може бути, наприклад, у вигляді болюсної ін'єкції або безперервної інфузії ферменту (наприклад, із використанням інфузійних насосів). [0196] У одному варіанті реалізації даного винаходу, фермент вводять шляхом латеральної церебровентрикулярної ін'єкції в головний мозок суб'єкта. Ін'єкцію можна здійснити, наприклад, через трепанаційний отвір у черепі суб'єкта. У іншому варіанті реалізації, фермент і/або інший фармацевтичний склад вводять до шлуночка мозку суб'єкта через хірургічно введений шунт. Наприклад, ін'єкція може бути здійснена в бічні шлуночки, які мають більший розмір. У деяких варіантах реалізації, може бути також здійснена ін'єкція в третій і четвертий шлуночки, розмір яких менший. [0197] У ще одному варіанті реалізації, фармацевтичні композиції, які застосовуються в даному винаході, вводять у вигляді ін'єкцій до великої цистерни або поперекової області суб'єкта. [0198] У іншому варіанті реалізації способу згідно з даним винаходом, фармацевтично прийнятний склад забезпечує безперервну доставку суб'єктові, наприклад, "повільне вивільнення" ферменту або іншої фармацевтичної композиції, яка застосовується в даному винаході, протягом щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох тижнів або більш тривалого періоду часу, після того як фармацевтично прийнятні склади вводять суб'єктові. [0182] У даній заявці термін "уповільнена доставка" відноситься до безперервної доставки фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом in vivo протягом тривалого періоду часу після введення, переважно щонайменше декількох днів, тижня або декількох тижнів. Уповільнена доставка композиції може проявлятися, наприклад, у тривалому терапевтичному ефекті введеного ферменту протягом тривалого періоду часу (наприклад, уповільнена доставка ферменту може проявлятися в триваючому зменшенні об'єму запасних гранул у суб'єкта). Крім того, уповільнена доставка ферменту може бути продемонстрована при визначенні присутності ферменту in vivo протягом тривалого періоду часу. Доставка до тканин-мішеней [0200] Як уже обговорювалося вище, одна з несподіваних і важливих ознак даного винаходу полягає в тому, що терапевтичні агенти, зокрема заміщуючі ферменти, вводяться з використанням способів згідно з даним винаходом, і композиції згідно з даним винаходом здатні ефективно й широко дифундувати через поверхню мозку й проникати до різних шарів або областей мозку, у тому числі до глибоких областей мозку. Крім того, способи згідно з даним винаходом і композиції згідно з даним винаходом відносяться до ефективної доставки терапевтичних агентів (наприклад, ферменту I2S) до різних тканин або нейронів спинного мозку, у тому числі до поперекової області, до якої важко здійснювати спрямовану доставку з використанням існуючих способів доставки до ЦНС, таких як ІЦВ ін'єкція. Крім того, способи згідно з даним винаходом і композиції згідно з даним винаходом забезпечують доставку 27 UA 115649 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 достатньої кількості терапевтичних агентів (наприклад, ферменту I2S) у кров і до різних периферичних органів і тканин. [0183] Таким чином, у деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок (наприклад, фермент I2S) надходять до центральної нервової системи суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок (наприклад, ферменти I2S) надходить до однієї або більше тканин-мішеней головного мозку, спинного мозку і/або периферичного органа. У даній заявці термін "тканина-мішень/цільова тканина" відноситься до будь-якої тканини, ураженої лізосомною хворобою накопичення, яку лікують, або будь-якої тканини, в якій лізосомний фермент, рівень якого знижений, експресується в нормі. У деяких варіантах реалізації, тканинимішені включають тканини, в яких виявлена аномально висока кількість субстрату ферменту, наприклад, накопиченого в лізосомах клітин тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають схильність до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, які демонструють патології, симптоми або ознаки, асоційовані з такою хворобою. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатній лізосомальний фермент у нормі експресується на високому рівні. У даній заявці тканина-мішень може являти собою тканину-мішень головного мозку, тканину-мішень спинного мозку і/або периферичну тканину-мішень. Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче. Тканини-мішені головного мозку [0202] У цілому, головний мозок може бути розділений на різні відділи, шари і тканини. Наприклад, менінгеальні тканини являють собою систему мембран, яка включає центральну нервову систему, у тому числі головний мозок. Мозкові оболонки містять три шари, в тому числі тверду мозкову оболонку, павутинну тканину і м'яку мозкову оболонку. Зазвичай основною функцією мозкових оболонок і спинномозкової рідини є захист центральної нервової системи. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок відповідно до даного винаходу доставляють до одного або декількох шарів мозкових оболонок. [0184] Головний мозок складається з трьох основних відділів, у тому числі півкуль головного мозку, мозочка і стовбура мозку. Півкулі головного мозку розташовані вище від більшості інших структур головного мозку й покриті корковим шаром. Під півкулями головного мозку лежить стовбур мозку, який нагадує стебло, до якого прикріплені півкулі головного мозку. У задній частині мозку під півкулями головного мозку і за стовбуром мозку перебуває мозочок. [0204] Проміжний мозок, який знаходиться недалеко від середньої лінії головного мозку і вище від середнього мозку, включає таламус, метаталамус, гіпоталамус, епіталамус, преталамус і претектум. Середній мозок, який також називають мезенцефалоном, містить дах, тегумент, вентрикулярний мезоцелій і церебральні ніжки, червоне ядро і черепні нерви III ядра. Середній мозок пов'язаний із зором, слухом, керуванням рухом, сном/неспанням, уважністю та регуляцією температури. [0205] Області тканин центральної нервової системи, включаючи головний мозок, можуть бути охарактеризовані на основі глибини тканин. Наприклад, тканини ЦНС (наприклад, головний мозок) можуть бути охарактеризовані як поверхневі тканини або неглибокі, тканини середньої глибини і/або глибокі тканини. [0185] Відповідно до даного винаходу терапевтичний білок (наприклад, заміщуючий фермент) може бути доставлений до будь-якої підходящої тканини-мішені мозку, пов'язаної з хворобою суб'єкта, яку лікують. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, заміщуючий фермент) відповідно до даного винаходу доставляють до поверхневих або неглибоких тканин-мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляються до тканин-мішеней мозку на середній глибині. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до глибоких тканин-мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до комбінації поверхневих або неглибоких тканин-мішеней головного мозку, тканин-мішеней головного мозку середньої глибини і/або глибоких тканинмішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до глибоких тканин мозку, що лежать щонайменше на 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм і глибше (або внутрішні) від зовнішньої поверхні мозку. [0186] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше поверхневих або неглибоких тканин головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку знаходяться в межах 4 мм від поверхні головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку обрані з тканин м'якої мозкової оболонки, кори головного мозку, гіпокампу, простору Вірхова-Робіна, кровоносних судин у просторі ВР, 28