Кристалічний (r)-(e)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етоксі)-1н-індазол-3-іл)вініл)-1н-піразол-1-іл)етанол

Реферат: Даний винахід стосується кристалічного (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1Ніндазол-3-іл)вініл)-1Н-піразол-1-іл)етанолу, придатного для лікування раку. UA 111725 C2 (12) UA 111725 C2 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фактор росту фібробластів (FGF) визнається як важливий посередник багатьох фізіологічних процесів, таких як морфогенез в процесі розвитку і ангіогенез. Родина рецептора фактора росту фібробластів (FGFR) складається з чотирьох членів (FGFR1-FGFR4), що являють собою глікопротеїни, до складу яких входять екстрацелюлярні імуноглобуліно (Ig)подібні домени, гідрофобна трансмембранна ділянка і цитоплазматична частина, яка містить тирозинкіназний домен. Наслідком зв'язування FGF є димеризація FGFR з подальшим аутофосфорилуванням рецепторів та активацією низхідних сигнальних шляхів. Активація рецепторів є достатньою для рекрутингу і активації специфічних низхідних сигнальних партнерів, які беруть участь у регуляції різних процесів, таких як ріст клітин, клітинний метаболізм та виживання клітин. Таким чином, сигнальний шлях FGF/FGFR справляє плейотропні впливи на багато біологічних процесів, важливих для проліферації, міграції, інвазії та ангіогенезу пухлинних клітин. Відомим у цій галузі є застосування вініліндазолів для лікування раку. Дивись, наприклад, WO200210137 і WO2003101968. Відомими у цій галузі також є інгібітори FGFR. Дивись, наприклад, WO2002022598. PCT/US2010/033487 розкриває аморфну форму (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1-іл)етанолу, що є недостатньо кристалізованим і використовується як інгібітор FGFR. Цей винахід пропонує кристалічний (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1Hіндазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1-іл)етанол, що є сильнодіючим інгібітором FGFR і відрізняється від відомої форми цієї сполуки корисними властивостями, такими як надзвичайно добра придатність до піддавання переробці твердої речовини у великому масштабі, легкість очищення шляхом кристалізації і термодинамічна стійкість в умовах виготовлення та зберігання лікарського засобу. За одним з варіантів здійснення винаходу, кристалічний (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1-іл)етанол являє собою моногідратну форму. Цей винахід також пропонує кристалічний (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1-іл)етанол, що характеризується порошковою рентгенограмою (Cu-джерело випромінювання, λ=1,54059 Å), що містить пік при 14,65 (при 2θ0,1) і один або декілька піків при 3,54, 12,51 або 19,16 (при 2θ0,1). Цей винахід пропонує спосіб лікування раку, де рак вибирають з групи, яку складають рак молочної залози, недрібноклітинний рак легень (NSCL), рак сечового міхура, рак шлунка, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак ободової кишки, множинна мієлома, рак печінки, меланома, рак голови і шиї, рак щитовидної залози, гіпернефроїдний рак, гліобластома і рак яєчок у ссавця, який включає введення ссавцю, який потребує такого лікування, ефективної кількості сполуки або солі за цим винаходом. Цей винахід також пропонує фармацевтичні композиції, що містять сполуку або сіль за цим винаходом у комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, розріджувачами або допоміжними речовинами. За конкретним варіантом здійснення винаходу згадана композиція також містить один або декілька інших терапевтичних агентів. Цей винахід також пропонує сполуку або сіль за цим винаходом для застосування в терапії. Крім того, цей винахід пропонує застосування сполуки або солі за цим винаходом у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Крім того, цей винахід пропонує застосування сполуки або солі за цим винаходом у лікуванні раку. Зокрема, ці раки вибирають з групи, яку складають рак молочної залози, рак легень, рак сечового міхура, рак шлунка, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак ободової кишки, множинна мієлома (гострий мієлолейкоз), рак печінки, меланома, рак голови і шиї, рак щитовидної залози, гіпернефроїдний рак, гліобластома і рак яєчок. Більш конкретно, ці раки вибирають з групи, яку складають рак молочної залози, недрібноклітинний рак легень, рак сечового міхура, рак шлунка, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак ободової кишки, множинна мієлома, рак печінки, меланома, рак голови і шиї, рак щитовидної залози, гіпернефроїдний рак, гліобластома і рак яєчок. Найбільш конкретно, цим раком є недрібноклітинний рак легень. Найбільш конкретно, цим раком є рак шлунка. Найбільш конкретно, цим раком є множинна мієлома. Крім того, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить сполуку або сіль за цим винаходом як активний інгредієнт, для лікування раку, обраного з групи, яку складають рак молочної залози, недрібноклітинний рак легень, рак сечового міхура, рак шлунка, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак ободової кишки, множинна мієлома, рак печінки, меланома, рак голови і шиї, рак щитовидної залози, гіпернефроїдний рак, гліобластома і рак яєчок. 1 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Досвідченому читачеві буде зрозуміло, що всі сполуки за цим винаходом здатні утворювати солі. Сполуки за цим винаходом є амінами, і, відповідно, реагують з будь-якою з ряду неорганічних і органічних кислот з утворенням фармацевтично прийнятної солі, яку одержують шляхом додання кислоти. Такі фармацевтично прийнятні солі, які одержують шляхом додання кислоти, та загальна методика їх одержання є добре відомими у цій галузі. Дивись, наприклад, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977. Термін "виділений у вигляді чистої сполуки" у значенні, вживаному у цьому описі, означає (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1іл)етанол, ступінь чистоти якого дорівнює 99 %. Сполуки за цим винаходом можна одержати по суті так, як показано в наведених нижче препаративних методиках та прикладах. Назви наведених нижче препаративних методик та прикладів надані із застосуванням функції Struct=Name програми ChemDraw  Ultra 10.0. Препаративна методика 1 1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етанол У 12 л тригорлу круглодонну колбу вміщують тетрагідрофуран (THF, 3 л) та діізопропіламін (DIPA, 315 мл, 2,24 моль), і охолоджують до температури -78C. Повільно додають н-бутиллітій (1,6 М розчин у гексанах, 1400 мл, 2,24 моль). Після завершення додавання і встановлення температури на рівні -78C, повільно додають розчин 3,5-дихлорпірідіну (296,7 г, 2,00 моль), який відразу ж утворює розчин жовтого кольору, який змінюється на суспензію червонобрунатного кольору. Після завершення додавання і встановлення температури на рівні -78C повільно додають розчин ацетальдегіду (230 мл, 4,05 моль) в THF (600 мл). Продовжують перемішування при температурі -78C. Через 3 год. видаляють баню з сухим льодом, і розпочинають гасіння реакції шляхом додавання краплями насиченого водного розчину хлориду амонію (1 л). Протягом ночі реакційну суміш витримують при перемішуванні з нагріванням до кімнатної температури (RT). Розбавляють суміш метил-трет-бутиловим ефіром (MTBE, 2 л), насиченим водним розчином хлориду амонію (1 л) і водою (2 л). Розділяють, і промивають органічну складову насиченим водним розчином хлориду натрію (розсолом). Екстрагують водну фазу MTBE (1,5 л). Об'єднують органічні шари, висушують сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують in vacuo. Очищують залишок хроматографією на колонці з силікагелевою основою [25 % розчин етилацетату (EA) в гексанах] з одержанням вказаної в заголовку сполуки + у вигляді масла червоного кольору. Вихід: 352 г (90 %). MS (ES) m/z 192 [M+1] . Препаративна методика 2 (S)-1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етанол Розділяють суміш стереоізомерів, які були одержані при здійснення препаративної методики 1, на колонці CHIRALPAK AD-H з елююваням сумішшю 90 % розчину гептанів/10 % розчину етанолу. Пік 2 являє собою бажаний енантіомер. Для встановлення абсолютної конфігурації, розчиняють зразок продукту в CDCl3 (кінцева концентрація 100 мг/мл). Одержують спектри вібраційного кругового дихроїзму (VCD) та інфрачервоні (ІЧ) спектри з роздільною здатністю 4 -1 см із застосуванням спектрометра ChiralIR FT VCD (компанія BioTools Inc ) з ІЧ-кюветою, обладнаного BaF2 оглядовими вікнами і з траєкторією довжиною 100 мм. Одержують VCD і ІЧ спектри протягом 6 годин з 150 мкл зразком. Представляють дані без згладжування або подальшої обробки даних. Визначають частоту коливань, поглинання та VCD інтенсивність шляхом оптимізації конформеру з найменшою енергією у пакеті Gaussian з базисом B3PW91/631G** на робочій станції з Linux, і імітують відповідні спектри із застосуванням лоренцевої смуги -1 частот 6 см вібраційного кругового дихроїзму. Проведений аналіз показує, що продукт являє + собою S-ізомер. Вихід: 84,37 г (27 %). MS (ES) m/z 192 [M+1] . Препаративна методика 3 (S)-1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етилметансульфонат Розчиняють (S)-1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етанол (5,02 г, 26,14 ммоль) у діхлорметані (DCM, 100 мл), і охолоджують колбу на льодяній бані. Додають триетиламін (ТЕА, 3,5 мл, 25,11 ммоль) з подальшим додаванням краплями метансульфонілхлоріду (2,2 мл, 28,42 ммоль). Видаляють льодяну баню, і витримують реакційну суміш до її нагрівання до кімнатної температури. Через 4 год. гасять реакцію водою (100 мл), і відокремлюють шари. Екстрагують водний шар спочатку DCM (50 мл), потім сумішшю 20 % ізопропіловий спирт (IPA)/ хлороформ (50 мл). Об'єднують органічні екстракти, висушують безводним сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують in + vacuo. Вихід: 7,15 г (100 %). MS (ES) m/z 270 [M+1] . Препаративна методика 4 4-йодо-1-(2-(тетрагідро-2H-піран-2-ілоксі)етил)-1H-піразол 2 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В 1 л тригорлій колбі, спорядженій магнітною мішалкою, захисним шаром азоту і внутрішнім датчиком температури, розчиняють 2-(2-брометокси)тетрагідро-2H-піран (34 г, 156 ммоль) в ацетонітрилі (ACN, 400 мл). Додають 4-йодопіразол (29,34 г, 149,74 ммоль), потім карбонат цезію (73,4 г, 223,02 ммоль). Суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 18 год. Фільтрують реакційну суміш через CELITE, промивають відфільтрований осад ACN, і концентрують фільтрат до одержання масла золотистого кольору. Використовують без + додаткового очищення. Вихід: 47,819 г (99 %). MS (ES) m/z 323 [M+1] . Препаративна методика 5 5-(трет-бутилдиметилсилілокси)-1H-індазол Вміщують у 10 л реакційну посудину з N, N-диметилформамідом (DMF, 2,50 л) 5гідроксиіндазол (150,20 г, 1,12 моль) та 1Н-імідазол (114,35 г, 1,68 моль). Охолоджують суміш до температури 0С, і впродовж 0,5 год. додають трет-бутилдиметилхлорсилан (253,16 г, 1,68 моль). Суміш перемішують при температурі 18C протягом 3 год. Повільно додають воду (2,5 л) до реакційної суміші у льодяній бані при температурі 5C для підтримання внутрішньої температури на рівні приблизно 20C. Переносять суміш на ділильну лійку і екстрагують EA (22,5 л). Об'єднують екстракти, і промивають водою (32,5 л) і розсолом. Висушують органічні розчини безводним сульфатом натрію, фільтрують, і випарюють з одержанням масла червоного кольору. Пропускають масло через шар силікагелю, і елююють елюентом (від 0 % до 30 % EA в гексані) з одержанням вказаної в заголовку сполуки у вигляді масла помаранчового кольору, яке + кристалізується. Вихід: 300 г (100 %). MS (ES) m/z 249 [M+1] . Препаративна методика 6 5-(трет-бутилдиметилсилілокси)-3-йодо-1H-індазол Охолоджують розчин 5-(трет-бутилдиметилсилілокси)-1Н-індазолу (300,00 г, 1,21 моль) в DCM (4,00 л) до температури 10C в 10 л реакційній посудині з оболонкою. До одержаного розчину порціями протягом 0,5 год. додають N-йодосукцинімід (298,89 г, 1,33 моль). Суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 3 год. до забезпечення повної конверсії, за даними, одержаними із застосуванням рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (LC-MS) і тонкошарової хроматографії (TLC). Охолоджують суміш до температури 10C, і гасять реакцію водою (2,5 л). Переносять суміш на ділильну лійку, і екстрагують водний шар DCM (2,5 л). Промивають об'єднані органічні екстракти 10 % водним розчином тіосульфату натрію (5 л) і розсолом. Висушують органічний розчин сульфатом магнію, фільтрують, і концентрують in vacuo з одержанням вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини помаранчевого + кольору. Вихід: 388 г (90 %). MS (ES) m/z 375 [M+1] . Препаративна методика 7 5-(трет-бутилдиметилсилілокси)-3-йодо-1-(тетрагідро-2H-піран-2-іл)-1Н-індазол Охолоджують розчин 5-(трет-бутилдиметилсилілокси)-3-йодо-1Н-індазолу (387,00 г, 1,08 моль) в DCM (2,50 л) і THF (1,00 л) до температури 10C в 10 л реакційній посудині з оболонкою. До одержаної суміші впродовж 0,5 год. додають спочатку метансульфонову кислоту (14,0 мл, 216,02 ммоль), потім 3,4-дигідро-2H-піран (296 мл, 3,24 моль), спостерігаючи невелику екзотермічну реакцію. Перемішують суміш при кімнатній температурі протягом 3 год. Охолоджують реакційну суміш до температури 10C, і гасять реакцію насиченим водним розчином бікарбонату натрію (2 л). Розбавляють суміш водою (2 л), і екстрагують водний шар DCM (2 л). Промивають об'єднані органічні екстракти водою (2 л) і розсолом. Висушують органічну суміш безводним сульфатом натрію, фільтрують, і концентрують in vacuo. Елююють залишок через шар силікагелю елюентом (від 0 % до 10 % EA у гексанах) з одержанням + вказаної в заголовку сполуки. Вихід: 150 г (31 %). MS (ES) m/z 459 [M+1] . Препаративна методика 8 (E)-1-(тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-3-(2-(1-(2-(тетрагідро-2H-піран-2-ілокси)етил)-1Н-піразол-4іл)вініл)-1Н-індазол-5-ол Барботують азотом суміш 5-(трет-бутилдиметилсилілокси)-3-йодо-1-(тетрагідро-2H-піран-2іл)-1Н-індазолу (14 г, 30,54 ммоль) з DMF (150 мл) в 500 мл тригорлій круглодонній колбі, спорядженій магнітною мішалкою, датчиком температури і конденсатором з мембраною, протягом 10 хв. До одержаного розчину додають трибутиламін (TBA, 6,7 г, 36,1 ммоль) та 4,4,5,5-тетраметил-2-вініл-1,3,2-діоксаборолан (7,0 г, 43,18 ммоль), і продовжують барботування протягом 10 хв. До одержаної суміші додають хлорид біс(трифенілфосфін)паладію (II) (0,45 г, 0,63 ммоль), і продовжують барботування протягом іще 0,5 год. Прогрівають суміш при температурі 95-100С впродовж 18 год. Охолоджують реакційну суміш до температури нижче 40C, і додають 4-йодо-1-(2-(тетрагідро-2H-піран-2-ілоксі)етил)-1Hпіразол (9,8 г, 30,42 ммоль). До одержаної суміші додають октагідрат гідроксиду барію (19,3 г, 60,3 ммоль) і воду (13 мл), і продовжують барботування протягом 10 хв. Додають до реакційної 3 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 суміші комплекс (1,3 г, 1,56 ммоль) хлориду 1,1'-біс(дифенілфосфіно)фероценпаладію (II) і DCM, і продовжують барботування протягом 0,5 год. Прогрівають суміш при температурі 95С в атмосфері азоту протягом 3 год. Розбавляють суміш EA, і фільтрують через шар Celite . Промивають цей шар розсолом (400 мл), і розділяють шари фільтрату. Промивають органічний шар розсолом, і екстрагують об'єднані водні шари EA. Об'єднують органічні розчини, і концентрують до одержання масла брунатного кольору. Розчиняють вказане масло у DCM (100 мл), і наносять на шар силікагелю. Елююють згаданий шар силікагелю елюентом (50 % розчин EA в гексанах, потім 70 % розчин EA в гексанах) з одержанням масла світло-брунатного кольору. Розтирають з MTBE (100 мл) до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді + твердої речовини. Вихід: 5 г (37 %). MS (ES) m/z 439 [M+1] . Препаративна методика 9 5-((R)-1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1-(тетрагідро-2H-піран-2-іл)-3-((E)-2-(1-(2(тетрагідро-2H-піран-2-ілокси)етил)-1H-піразол-4-іл)вініл)-1H-індазол У 250 мл тригорлій круглодонній колбі, спорядженій внутрішнім датчиком температури, зворотним холодильником з подвійним охолодженням, захисним шаром азоту і магнітною мішалкою, суспендують (E)-1-(тетрагідро-2H-піран-2-іл)-3-(2-(1-(2-(тетрагідро-2H-піран-2ілокси)етил)-1H-піразол-4-іл)вініл)-1H-індазол-5-ол (10,0 г, 22,83 ммоль) і карбонат цезію (7,88 г, 23,94 ммоль) у ACN (92 мл), і нагрівають до температури 60C. До згаданої суспензії додають (S)-1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етилметансульфонат (7,03 г, 26,02 ммоль), і перемішують протягом ночі. Охолоджують реакційну суміш до кімнатної температури, фільтрують, і промивають сухий залишок ACN. Концентрують фільтрат, і очищують залишок хроматографією на колонці з силікагелевою основою (2-4 % (2М розчину аміаку в метанолі)/DCM). Об'єднують фракції продукту, і концентрують in vacuo до одержання піни білого кольору. Вихід: 12,5 г (86 %). + MS (ES) m/z 612 [M+1] . Препаративна методика 10 (аморфна форма) (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1іл)етанол N N OH Cl N O N Cl 30 35 40 45 50 N H Вміщують до 250 мл тригорлої круглодонної колби, спорядженої краплинною лійкою, впускним отвором для азоту, внутрішнім датчиком температури і магнітною мішалкою, метанол (57 мл), і охолоджують на льодяній бані. До вмісту колби через краплинну лійку повільно додають ацетилхлорид (20 мл, 281,03 ммоль). До одержаного розчину через краплинну лійку додають 5-((R)-1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1-(тетрагідро-2H-піран-2-іл)-3-((E)-2-(1-(2(тетрагідро-2H-піран-2-ілокси)етил)-1H-піразол-4-іл)вініл)-1H-індазол (7,1 г, 11,59 ммоль), розчинений в метанолі (40 мл). Після завершення додавання, видаляють льодяну баню, нагрівають суміш до кімнатної температури, і перемішують протягом 4 год. Концентрують реакційну суміш in vacuo до одержання піни жовтого кольору. Розчиняють піну жовтого кольору в метанолі (10 мл), і повільно додають до насиченого водного розчину бікарбонату натрію (120 мл). Суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Згадану суміш фільтрують, промивають тверду речовину водою (100 мл), і висушують під вакуумом. Рекристалізують тверду речовину з гарячої суміші EA/метанол/гексани з одержанням вказаної в заголовку цільової сполуки у вигляді твердої речовини білого кольору. Вихід: 2,1 г (41 %). MS (ES) m/z 444 + [M+1] . Приклад 1 (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1іл)етанолу моногідрат, Форма 1: Реакційну посудину продувають азотом, і завантажують (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1-іл)етанол і суміш розчинників, яку складають 11 % води та ацетонітрил. Одержану суспензію нагрівають до внутрішньої температури 66-68C з одежанням розчину. Вказаний розчин повільно охолоджують до температури 56-58C, після чого засівають суспензією зародків кристалізації у суміші 11 % вода/ацетонітрил, і повільно перемішують. Вказану реакційну суміш спочатку охолоджують до температури 48-50C, а потім до температури 19-20C. 4 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 30 Продукт виділяють фільтрацією у присутності потоку азоту з відносною вологістю щонайменше 80 %, що проходить через твердий осад. Згодом рівень вологості в потоці азоту змінюють на 40 %, та продовжують висушування, в результаті чого одержують вказану в заголовку сполуку. Слід звернути увагу на те, що затравний кристал одержують так: реакційну посудину продувають азотом, і завантажують (R)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4іл)етокси)-1Н-індазол-3-іл)вініл)-1Н-піразол-1-іл)етанол і суміш розчинників, яку складають 11 % води та ацетонітрил. Одержану суспензію нагрівають до внутрішньої температури 70 °C з одержанням розчину. Згаданий розчин після цього повільно охолоджують з проходженням кристалізації, фільтрують, і сушать. Ця сполука є сильнодіючим інгібітором FGFR і може мати корисні властивості порівняно з відомою формою, такі як надзвичайно добра придатність до піддавання переробці твердої речовини у великому масштабі, легкість очищення шляхом кристалізації і термодинамічна стійкість в умовах виготовлення та зберігання лікарського засобу. Сполука Прикладу 1. порошкова рентгенограма Порошкову рентгенограму одержують із застосуванням дифрактометру PANalytical X'Pert™ Pro MPD PW3040 Pro, спорядженого джерелом випромінювання CuKa (λ=1,54059 Ǻ (напруга: 45 кВ і сила струму: 40 мА)), яке одержують з використанням джерела Optix з тонким фокусуванням. Зразок розміщують між шарами плівки товщиною 3 мкм, аналізують в трансмісивній геометрії і обертають з частотою 1 об/с для оптимізації орієнтаційної статистики. Перед проведенням цього дослідження аналізують зразок кремнію (стандартний еталонний матеріал 640с NIST (Національний інститут стандартів і технологій)), щоб перевірити положення піку кремнію 111. Для цього матеріалу аналізують одну рентгенограму, одержану із застосуванням дифрактометру PANalytical, і статистичний вплив переважної орієнтації і положення частинок оцінюють шляхом порівняння з результатами аналізу імітованої рентгенограми монокристалу. Для фокусування випромінювання джерела CuKa через зразок і на детектор застосовують еліптично градуйоване багатошарове дзеркало. Дифрактограми одержують із застосуванням сканувального позиційно-чутливого детектору (X'Celerator), розташованого на відстані 240 мм від зразку. Дані одержують у межах від 1,01 градуса 2 θ до 39,99 градуса 2 θ з кроком 0,017 градуса 2 θ і швидкістю сканування 1,2 градуса/хв, дифузорною діафрагмою (0,5 градуса) і діафрагмою розсіяного випромінювання (0,25 градуса). Обмежувач пучка застосовується для того, щоб звести до мінімального рівня фон, породжений розсіюванням у повітрі. Для падаючих і дифрагованих пучків застосовують щілини Соллера з метою зведення до мінімального рівня аксіальної розбіжності пучків. Зареєстровані піки наведені в Таблиці 1. Застосовується 5 % поріг інтенсивності. 35 Таблиця 1 Зареєстровані піки для сполуки Прикладу 1, порошкова рентгенограма. 2θ 3,540,10 7,080,10 10,620,10 12,510,10 13,000,10 13,600,10 14,180,10 14,650,10 14,970,10 15,490,10 16,240,10 16,590,10 17,060,10 17,760,10 18,490,10 19,160,10 20,370,10 21,670,10 Міжплощинна відстань d (Å) 24,9750,726 12,4850,179 8,3280,079 7,0750,057 6,8120,053 6,5120,048 6,2450,044 6,0460,041 5,9190,040 5,7220,037 5,4590,034 5,3440,032 5,1980,030 4,9950,028 4,7980,026 4,6320,024 4,3610,021 4,1010,019 5 Інтенсивність (%) 45 10 9 78 37 16 13 100 29 16 35 24 26 20 9 68 44 8 UA 111725 C2 Таблиця 1 Зареєстровані піки для сполуки Прикладу 1, порошкова рентгенограма. 2θ 21,890,10 22,170,10 23,020,10 24,330,10 25,250,10 25,930,10 26,160,10 26,770,10 27,230,10 28,250,10 28,590,10 29,560,10 5 10 15 20 25 30 35 40 Міжплощинна відстань d (Å) 4,0610,018 4,0100,018 3,8630,017 3,6590,015 3,5280,014 3,4360,013 3,4060,013 3,3310,012 3,2750,012 3,1590,011 3,1230,011 3,0220,010 Інтенсивність (%) 8 22 54 15 27 49 16 10 15 10 11 13 Отже, належним чином підготовлений зразок Прикладу 1 може бути охарактеризований порошковою рентгенограмою із застосуванням CuKα-джерела випромінювання як такий, що має дифракційні піки (значення 2-тета), як описано в Таблиці 1, і, зокрема, з піками при 14,65 у поєднанні з одним або декількома піками при 3,54, 12,51 та 19,16; і, більш конкретно, з піком при 14,65; з допустимим відхилом для кута дифракції у 0,1 градуса, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, у 0,01 градуса. До багатьох форм злоякісних захворювань людини припускається причетність регуляції шляху FGF/FGFR, що відхиляється від норми. FGFRs і FGFs часто надекспресуються при численних ракових захворюваннях, і їх експресія часто корелює з негативним прогнозом. Активуючі мутації у кіназному домені FGFR були знайдені у пухлин декількох типів, у тому числі раку молочної залози, недрібноклітинного раку легень, раку сечового міхура, раку шлунка, раку передміхурової залози, раку ободової кишки і множинної мієломи. Геномна ампліфікація локусу FGFR також була виявлена у багатьох хворих на рак молочної залози, рак шлунка і рак легенів. Надекспрессія FGFRs або FGFs також була виявлена у пухлинах багатьох різних типів, таких як рак сечового міхура, множинна мієлома, рак передміхурової залозиі рак легенів. Інші ракові захворювання, для лікування яких сприятливою могла б бути інгібувальна терапія шляху родини FGFR, охоплюють гострий мієлолейкоз, рак печінки, меланому, рак голови і шиї, рак щитовидної залози, рак підшлункової залози, гіпернефроїдний рак, гліобластому і рак яєчок. Окрім їх ролі у формуванні і розвитку пухлини, FGFs і FGFRs також відіграють роль ключових регуляторів ангіогенезу, особливо під час росту пухлини. Вісь FGF/FGFR також відіграє важливу роль у збільшенні кількості інших стромальних клітин пухлини, таких як асоційовані з пухлиною фібробласти. Результатом підвищувальної регуляції FGFs також є розвиток стійкості до антиангіогенної та хіміотерапії інших видів. Нарешті, дрібномолекулярні інгібітори FGFRs продемонстрували протипухлинну активність на декількох передклінічних моделях пухлин, і наразі досліджуються в клініці. Загалом, шлях FGF/FGFR має важливе значення для декількох важливих клітинних процесів в ракових клітинах. З цих причин терапія на основі цілеспрямованого впливу на сигналізацію FGFRs та/або FGF може справляти дію як безпосередньо на пухлинні клітини, так і на пухлинний ангіогенез. Сполуку, одержану за препаративною методикою 10, перевіряли по суті як описано нижче в наведених далі дослідженнях: ферментному аналізі FGFR1 (зв'язування на фільтрах), ферментному аналізі FGFR3 (зв'язування на фільтрах), дослідженні FGF9-індукованого р-ERK на основі клітин RT-112 (у присутності BSA (бичачий сироватковий альбумін)) і дослідженні з виявлення фосфорилування ERK (Thr202/Tyr204) засобами AlphaScreen SureFire на основі ендотеліальних клітин пупкової вени людини (HUVEC). Ці дослідження продемонстрували, що сполука, одержана за препаративною методикою 10, є інгібітором шляху родини FGFR і має протиракову активність. Отже, результати, одержані з аморфною формою (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етокси)-1H-індазол-3-іл)вініл)-1H-піразол-1-іл)етанолу, є показовими для результатів, які були одержані зі сполукою за цим винаходом. Кристалічні форми вказаної сполуки є корисними, оскільки вони відрізняються від відомої форми цієї сполуки такими властивостями, як надзвичайно добра придатність до піддавання переробці твердої речовини у великому масштабі, легкість очищення шляхом кристалізації і термодинамічна стійкість в 6 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 умовах виготовлення та зберігання лікарського засобу. Ферментний аналіз FGFR1 і FGFR3 (зв'язування на фільтрах) FGFR1 або FGFR3 кіназу (0,15 нг/мкл людського FGFR1 або 0,32 нг/мкл людського FGFR3) інкубують у 50 мкл буфера, що містить 10 мМ розчин 4-(2-гідроксиетил)-1піперазинетансульфонової кислоти (HEPES), рН 7,5, 8 мМ розчин трис(гідроксиметил)амінометану (Tris-HCl), рН 7,5, 5,0 мМ розчин дитіотреітолу (DTT), 10,0 мкМ розчин аденозинтрифосфату (АТР), 10 мМ розчин MnCl2, 150 мМ розчин NaCl, 0,01 % розчин 33 TRITON X-100, 0,5 мікроКюрі Р-АТР і 0,05 мкг/мкл полі(Glu-Tyr). Реакцію проводять у 50 мкл об'ємі при кімнатній температурі протягом 30 хв, після чого реакцію гасять додаванням 130 мкл 10 % розчину H3PO4. Реакційну суміш (120 мкл) переносять на 96-лунковий планшет зі скловолоконним фільтром (1,0 мкм), інкубують при кімнатній температурі протягом 20-30 хв, після чого тричі промивають на TITERTEK ZOOM 0,5 % розчином H3PO4. Перед доданням 40 TM мкл MicroScint 20 (компанія Packard) та подальшим підрахунком із застосуванням лічильника Wallac Micobeta, лунки висушують на повітрі. Для випробування сполуки на інгібування, згадану сполуку надають у вигляді 10 мМ концентрованого розчину у диметилсульфоксиді (DMSO). Перед доданням реакційної суміші на планшет з фільтром для визначення активності сполуки згадану сполуку послідовно розбавляють у пропорції 1:3 у 20 % розчині DMSO для одержання 10-точкової кривої залежності "доза-ефект" і розбавляють у пропорції 1:5 (від концентрації 20 мкМ до кінцевої концентрації 0,001 мкМ у розчині DMSO із кінцевою концентрацією 4 %) на реакційному планшеті У контрольних лунках вміщений лише 4 % DMSO, у той час як вихідний рівень визначають із застосуванням контрольних лунок, що містять 0,1 М розчин етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA). Значення ступеня інгібування у відсотках для кожної зі згаданих 10 концентрацій обчислювали за даними контрольних лунок на кожному планшеті, і одержану 10-точкову криву залежності згодом аналізували із застосуванням програмного забезпечення ActivityBase (IDBS) з використанням 4-параметричного логістичного рівняння і абсолютних значень IC50, визначених за кінцевою підгонкою кривої. Мінімальні значущі співвідношення (MSR) для оцінюваної IC50 при проведенні ферментного аналізу FGFR1 і FGFR3 становили 1,38 і 1,47, відповідно. IC50 сполуки, одержаної за препаративною методикою 10, для FGFR1 і FGFR3, за результатами цих аналізів, становить 0,0077 мкМ і 0,0064 мкM, відповідно. Ці дані показують, що сполука, одержана за препаративною методикою 10, є сильнодіючим інгібітором ферментів FGFR1 і FGFR3. р-ERK з BSA індуковане FGF9 Клітини раку сечового міхура людини лінії RT112 висівають з густиною 5000 клітин на лунку в 100 мкл RPMI 1640 (компанія Gibco 11875-085) з доданням 10 % ембріональної бичачої сироватки (FBS, компанія Gibco 10082-147) і 1 % розчину пеніцилін/стрептоміцин (компанія Gibco 15140-122) на 96-лункові планшети CELLBIND (компанія Corning 3340), та інкубують протягом ночі при температурі 37C. Наступного ранку середовище для вирощування видаляють і замінюють на 100 мкл RPMI 1640, доповненого 20 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (BSA). Після 3 год. інкубування при температурі 37C до кожної лунки додають 3 послідовно розведену сполуку в RPMI 1640 з 20 мг/мл BSA в 6 % DMSO. Таким чином одержують 10-точкову криву залежності "доза-ефект" у межах 10-0,005 мкМ в 1 % DMSO. Інкубацію продовжують протягом 1 год. при температурі 37C. Клітини стимулюють 50 мкл розчину (50 мкг/мл) FGF9 (компанія R&D Systems 273-F9) у безсироватковому RPMI з одержанням кінцевої концентрації FGF9, яка дорівнює 500 нг/мл. Клітини фіксують шляхом додання 30 мкл 25 % розчину формальдегіду у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS) (3,7 % кінцева концентрація формальдегіду), і інкубують впродовж 30 хв при кімнатній температурі. Клітини тричі промивають PBS з подальшим доданням 100 мкл холодного метанолу, і інкубують протягом 30 хв при температурі -20C. Метанол видаляють, а клітини обробляють PBS, що містить 0,1 % Triton X-100 (PBST), тричі промивають PBS, і інкубують впродовж 15 хв при кімнатній температурі. Після цього клітини інкубують протягом ночі при температурі 4С з обережним струшуванням в 50 мкл розчину (розведення 1:400) першого антитіла p-p44/42 МАРК (компанія Cell Signaling 9101S), доповненого 2 % BSA, 0,01 % суміші 1 інгібіторів фосфатаз (компанія Sigma P2850), 0,01 % суміші 2 інгібіторів фосфатаз (компанія Sigma P5726) і 0,01 % суміші інгібіторів протеаз (компанія Sigma P8340). Наступного ранку планшети двічі промивають PBST і двічі PBS, після чого протягом 1 год. інкубують при кімнатній температурі у темряві у 80 мкл Alexa Fluor 488 козячого анти-кролячого IgG H+L допоміжного антитіла (компанія Invitrogen A11034), розведеного у відношенні 1:1000 в PBS з 1 % BSA і 0,1 % суміші 1 інгібіторів фосфатаз, 0,01 % суміші 2 інгібіторів фосфатаз і 0,01 % суміші інгібіторів протеаз. Клітини тричі промивають PBS з подальшим доданням 100 мкл розведення (1:200) пропідія йодиду (PI) (компанія Molecular Probe P-3566) в PBS, після чого інкубують у темряві 7 UA 111725 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 1 год. Кількість р-ERK позитивних клітин та загальну кількість клітин на лунку ™ визначають ACUMEN EXPLORER (компанія ТТР LabTech Ltd) із застосуванням 500-530 нм і 575-640 нм оптичного фільтру для Alexa 488 і PI, відповідно. Загальну середню інтенсивність pERK/лунку, з використанням значень для Alexa 488, у подальшому перетворюють на ступінь інгібування у відсотках з використанням значень, які були одержані для MIN (10 мкМ розчин позитивної контрольної сполуки в DMSO) і MAX (тільки DMSO) контрольних серій на тому ж самому планшеті. Значення ступеня інгібування у відсотках і дані щодо залежності ступеня інгібування у відсотках від концентрації для згаданих 10 точок у подальшому аналізують із застосуванням 4-параметричного сигмоїдального рівняння "доза-ефект" з визначенням відносних значень IC50 за одержаною кривою. Мінімальне значуще співвідношення (MSR) для оцінюваної IC 50 при проведенні аналізу FGF9-індукованого p-ERK з BSA становило 2,7. IC50 сполуки, одержаної за препаративною методикою 10, за результатами цього аналізу, дорівнює 0,0004 мкМ. Ці дані показують, що сполука, одержана за препаративною методикою 10, є сильнодіючим інгібітором FGF9індукованого фосфорилування ERK в людських ракових клітинах. Виявлення фосфорилування ERK (Thr202/Tyr204) засобами AlphaScreen SureFire в ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC) Вплив сполуки на інгібування FGF-рецептору 1 визначають шляхом моніторингу фосфорилування ERK (pERK) у відповідь на стимулювання основного фактору росту фібробластів (b-FGF) в ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC). Рівні утвореної pERK визначають із застосуванням системи ALPHASCREEN  SUREFIRE (компанія TGR Biosciences, TGRES50K). Ця система являє собою гомогенний формат кількісного аналізу із застосуванням сендвіч-імуноаналізу із захопленням фосфорилованої досліджуваної речовини з її подальшим виявленням із застосуванням сенсибілізованих антитілом гранул ALPHASCREEN  (компанія Perkin Elmer) для одержання підсиленого сигналу. Клітини HUVEC відновлюють і зберігають у середовищі для вирощування, що складається з основного живильного середовища для культивування ендотеліальних клітин (компанія Clonetics, CC-3132), доповненого 10 % FBS, 0,4 % бичачого мозкового екстракту, 0,1 % гідрокортизону, 0,1 % гентаміцину сульфату, амфотерицину-В і 0,1 % рекомбінантного людського фактору епідермального росту, до 7 пасажу. Для проведення цього аналізу клітини збирають за стандартними методиками з подальшим підрахуванням. Клітини (20000/лунку) висівають в 100 мкл середовища для вирощування на 96-лункових планшетах, покритих полі-Dлізином (BD, 354640). Планшети інкубують протягом ночі при температурі 37С, з 5 % СО2. У день проведення аналізу клітини культивують у 100 мкл безсироваткового EBM (основного живильного середовища для культивування ендотеліальних клітин), що містить 1,5 % FBS і 20 мг/мл BSA, протягом 3 год. при температурі 37С з 5 % CO2, а потім обробляють 20 мкМ 3 послідовно розбавленим розчином сполуки у безсироватковому середовищі протягом 1 год. при температурі 37C. Таким чином одержують 10-точкову криву залежності "доза-ефект" для 100,005 мкМ в 1 % DMSO. Після обробки сполукою впродовж 1 год. клітини стимулюють 50 мкл bFGF (компанія Sigma, F0291, кінцева концентрація b-FGF становить 50 нг/мл) при температурі 37С протягом 15 хв. З лунок, що містять клітини і 50 мкл стимулювального b-FGF, одержують MAX сигнал, а клітини у лунках з 10 мкМ розчином позитивної контрольної сполуки і 50 мкл стимулювального b-FGF  дають MIN сигнал. Після цього згадане середовище видаляють, додають 50 мкл/лунку лізисного буфера 1 SUREFIRE (складова набору TGR Biosciences SUREFIRE), і продовжують інкубацію при кімнатній температурі протягом 10 хв при обережному струшуванні. Для виявлення pERK, 6 мкл лізату і 10 мкл реакційної суміші (60 частин реакційного буферу/10 частин активаційного буферу/по 0,6 частини донорних і акцепторних гранул, компанія Perkin Elmer, 6760617R) переносять на 384-лунковий проксипланшет (компанія Perkin Elmer, 6006280). Планшет герметизують та інкубують при кімнатній температурі протягом 2 год. при обережному струшуванні, а потім зчитують із застосуванням планшет-рідеру Perkin Elmer EnVision, спорядженого TurboModule з використанням стандартних установлень ALPHASCREEN (Ex680 нм і Em520-620 нм). Дані випромінювання перетворюють на значення у відсотках ступеня інгібування, що визначають за MAX (тільки DMSO) та MIN (10 мкМ розчин позитивної контрольної сполуки в DMSO) контролями на кожному планшеті, після чого дані, які відповідають десятиточковій концентрації сполуки, підганяють до чотирипараметричного логістичного рівняння із застосуванням ACTIVITYBASE 4,0 і визначають IC50. Аналіз виявлення фосфорилування ERK (Thr202/Tyr204) засобами ALPHASCREEN SUREFIRE має мінімальне значуще співвідношення (MSR) для IC50 2,1. IC50 сполуки, одержаної за препаративною методикою 10, за результатами цього аналізу дорівнює 0,0006 мкМ. Ці дані показують, що сполуки, одержаної за препаративною методикою 10, є 8 UA 111725 C2 5 10 15 сильнодіючим інгібітором bFGF-індукованого фосфорилування ERK в ендотеліальних клітинах пупкової вени людини. Сполуці за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, надають форму фармацевтичної композиції, яка вводиться різними шляхами. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, такі композиції є призначеними для перорального або внутрішньовенного введення. Такі фармацевтичні композиції і способи їх одержання є добре відомими у цій галузі. Дивись, наприклад, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (D. Troy, et al., st eds., 21 ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005). Сполуки за цим винаходом, як правило, є ефективними в широкому діапазоні доз. Наприклад, добові дози зазвичай лежать в межах від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 100 мг/кг маси тіла. У деяких випадках рівні доз нижчі нижньої межі вищевказаного діапазону можуть бути більш ніж достатніми, в той час як в інших випадках ще більші дози можуть бути застосовані без спричинення жодного шкідливого побічного ефекту, і тому вищевказаний діапазон доз не є призначеним для будь-якого обмеження обсягу цього винаходу. Слід розуміти, що фактично введена кількість сполуки буде визначатися лікарем у світлі відповідних обставин, в тому числі стану, що підлягає лікуванню, вибраному шляху введення, фактично введеної сполуку або сполуки, віку, маси, реакції окремого пацієнта і тяжкості симптомів у пацієнта. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 1. Кристалічний моногідрат (R)-(Е)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)етоксі)-1Н-індазол-3іл)вініл)-1Н-піразол-1-іл)етанолу, який характеризується порошковою рентгенограмою (Сuджерело випромінювання, λ=1,54059 Å), що має піки при 3,54, 12,51, 14,65, 20,37, 23,02 та 19,16 (2θ±0,1°). 2. Сполука за п. 1, яка є виділеною у вигляді чистої сполуки. 3. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за будь-яким із попередніх пунктів у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або допоміжною речовиною. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9