Гіпоалергенна дерматологічна композиція

Реферат: Винахід стосується застосування екстракту надземної частини/частин злаку або псевдозлаку, зібраних до появи колоса, для приготування гіпоалергенної дерматологічної композиції, для мінімізації та/або запобігання ризику виникнення алергійних реакцій у людей, схильних до алергії на білок зерна злаків. UA 103210 C2 5 10 15 20 Даний винахід стосується алергії на зернові культури (злаки). В рамках даного винаходу злаки включають родину тонконогих (Роасеае) та псевдозлаки. Термін "злаки" стосується родини Gramineae (злакові), спіле "зерно" (зернівку) яких використовують в їжу, особливо завдяки високому вмісту в ньому крохмалю (Paris R.R., Moyse H. Précis de matière médicale. II Pharmacognosie spéciale. Spermaphytes (continued): nd Angiospermes. Monocotylédones-Dicotylédones. Apétales et Diapétales. 2 Edition. Paris: Masson, 1981, p. 16). Термін "злак" також, як правило, стосується насіння таких рослин. У ботаніці злаки належать до родини Роасеае або Gramineae. Зазначені злаки, як правило, є трав'янистими однодольними рослинами з порожнім стеблом між вузлами (соломиною), що несе розташовані у два ряди листи з найчастіше розщепленою та лігуловмісною піхвою листка. Квітки розташовані у вторинних колосках і найчастіше згруповані в складне колосся або грона, називані "мітелками". Квітка зведена до тичинок і зав'язі: два прилистки або дві колоскові лусочки захищають вторинний колосок, а дві нижні квіткові лусочки, одна з яких є передньою, похилою, обгортаючою, часто щетинконосною, сходяться разом з утворенням квітки. Три виступні тичинки коливаються, приєднані тильною стороною. Зав'язь має один плодолистик із двома опушеними маточками, які безпосередньо прилягають до насінного зачатка та розвиваються кожна в окремий плід, іменований зернівкою; рясний ендосперм є крохмалистим. Це родина включає приблизно 700 родів і 12000 видів. Більшу частину злакових трав використовують для харчових цілей (це - пшениця, ячмінь, жито, овес, сорго, просо, кукурудза, рис і т.д.). Види найчастіше використовуваних злаків представлені нижче в Таблиці 1. Таблиця 1 Основні види споживаних злаків, що належать до родини Роасеае Латинська назва Avena abyssinica Hochst. Avena brevis Roth Avena nuda L. Avena sativa L. Bromus mango E. Desv. Coix lacryma-jobi var. ma-yuen (Rom. Caill.) Stapf Dendrocalamus strictus (Roxb.) Nees Digitaria exilis (Kippist) Stapf Digitaria iburua Stapf Echinochloa esculenta (A. Braun) H. Scholz Eleusine coracana subsp. coracana Eragrostis tef (Zuccagni) Trotter Hordeum vulgare subsp. vulgare Oryza glaberrima Steud. Oryza sativa L. Panicum hirticaule J. Presl Panicum miliaceum subsp. miliaceum Panicum sumatrense Roth Paspalum scrobiculatum L. Pennisetum glaucum (L.) R. Br. Phalaris canariensis L. Secale cereale subsp. cereale Secale strictum subsp. africanum (Stapf) K. Hammer Setaria italica subsp. italica Setaria palmifolia (J. Koenig) Stapf Setaria pumila subsp. pumila Sorghum bicolor subsp. bicolor × triticosecale spp. 25 1 Місцева назва овес голий пайза (плоскуха) дагуса польовиця ячмінь звичайний багаторядний рис голий рис посівний просо звичайне просо африканське канаркова трава справжня жито посівне просо італійське, мишій італійський мишій малий сорго двоколірне, сорго звичайне тритикале UA 103210 C2 Продовження таблиці 1 Основні види споживаних злаків, що належать до родини Роасеае Triticum aestivum subsp. aestivum Triticum aestivum subsp. spelta (L.) Thell. Triticum aestivum subsp. sphaerococcum (Percival) Mackey Triticum monococcum subsp. monococcum Triticum timopheevii subsp. timopheevii Triticum turgidum subsp. carthlicum (Nevski) A. Love & D. Love Triticum turgidum subsp. durum (Desf.) Husn. Тriticum turgidum subsp. polonicum (L.) Thell. Тriticum zhukovskyi A.M. Menabde & Eritzjan Urochloa deflexa (Schumach.) H. Scholz Urochloa ramosa (L.) T. Q. Nguyen Zizania palustris L. Zea mays subsp. mays L. 5 пшениця м'яка ярова, пшениця пшениця культурна (спельта) пшениця однозернянка культурна пшениця тургідум пшениця тверда пшениця польська кукурудза звичайна Деякі зернові культури, що належать до інших ботанічних родин, є схожими на злаки й називаються псевдозлаками. Приклади таких видів, що належать до злаків, але не є частиною родини Роасеае, які також використовуються й можуть викликати харчову алергію, включають види, перелічені нижче в Таблиці 2. Таблиця 2 Основні споживані види, що належать до злаків, але не до родини Роасеае Латинська назва Amaranthus caudatus L. Amaranthus cruentus L. Amaranthus hypochondriacus L. Chenopodium album L. Chenopodium berlandieri subsp. nuttalliae (Saff.) H.D. Wilson & Heiser Chenopodium pallidicaule Aellen Chenopodium quinoa subsp. quinoa Fagopyrum esculentum Moench Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. Helianthus annuus L. Sesamum indicum L. 10 15 Місцева назва амарант хвостатий, щириця, лисохвіст амарант багряний лобода біла Родина Amaranthaceae Amaranthaceae Amaranthaceae Chenopodiaceae Chenopodiaceae Chenopodiaceae лобода квіноа, перуанський рис Chenopodiaceae гречка посівна, гречка справжня гречка татарська соняшник однорічній кунжут Polygonaceae Polygonaceae Asteraceae Pedaliaceae Зерна злаків та псевдозлаків містять велику кількість білків: структурних білків, біологічно активних білків та резервних білків. Osborne (1907) класифікував їх відповідно до їхньої розчинності на: водорозчинні альбуміни, глобуліни, розчинні у фізіологічних розчинах, проламіни, розчинніу водному етанолі, глютеліни, нерозчинні в перелічених вище розчинниках, частково розчинні в розчинах сечовини або гуанідину. 2 UA 103210 C2 Приклади: Альбуміни Глобуліни Проламіни Глютеліни Пшениця Лейкозини Едестини Гліадини Глютеніни Овес Ячмінь Кукурудза Авеналіни Гліадини Авеніни Гордеїни Горденіни Зеїни Зеаніни Напроти, вміст білків у надземних частинах, зокрема, у листі, складається, головним чином, з: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 мембранних білків хлоропластів (білків, часто зв'язаних з ліпідами та пігментами), розчинних білків хлоропласта (строма): RuBPCase. Листя лободи квіноа, соняшника, вівса, ячменя й Zizania palustris, молодих паростків пшениці, а також паростки кунжуту, рису, пшениці й кукурудзи використовують у косметичних цілях. Наприклад, молоді зелені паростки ячменя використовують як засіб, що сповільнює старіння. Крім того, у відомому рівні техніки розкриті: екстракт листів щириці (Amaranthus), використовуваний як протизапальний лікарський засіб, зокрема, при лікуванні атопічних дерматитів (патентний документ JP 2000143524), композиція, що містить екстракт вівсяної соломи з екстрактом іван-чаю, для лікування запальних реакцій шкіри для місцевого застосування (ЕР1474159), косметична композиція, що захищає проти окиснення за допомогою олії рисових зародків (ЕР 1704898), косметична композиція, яка включає екстракт проростків пшениці (WO9526183), косметичний продукт, що виявляє регенеруючу дію на шкіру, який містить екстракт стебел соняшника (FR2487674). Борошно зі злаків, зокрема, пшеничне борошно, як відомо, при вдиханні викликає астму від борошняного і зернового пилу та риніти. Найсильніша IgE-реакція спостерігалася у випадку альбумінів та глобулінів - білків, які є розчинними в нейтральних розчинах. Однак деякі дослідження також продемонстрували реактивність білків, розчинних в етанолі або кислому середовищі (глютенинів і гліадинів). Останнім часом імуноблотні дослідження сироватки крові пацієнтів з алергією на борошняний та зерновий пил показали, що основні алергени в нейтральних фракціях пшеничного і ячмінного борошна належать до низькомолекулярного діапазону (приблизно 20 кДа). Споживання злаків іноді приводить до целіакії та герпетичного дерматиту. Деякі дослідження виявили найбільш задіяний антиген, який належить до гліадинової фракції розчинних в етанолі білків. Незважаючи на значення злаків у харчуванні людини, припускають, що вони приводять до погіршення стану при атопічному дерматиті, особливо, у дітей. Аналогічно, імунологічні дослідження (по суті, SPT тест - скарифікаційна проба та RAST - радіоалергосорбентний тест) приводять до ідентифікації білків-учасників у пшениці, вівсі, житі, ячмені, рисі, просі й кукурудзі, та демонструють перехресні реакції між пшеницею і ячменем або житом (Varjonen E., Vainio E., Kalimo K., Juntunen-Backman K., Savolainen J., Skin-prick test and RAST responses to cereals in children with atopic dermatitis. Characterization of Ige-binding components in wheat and oats by an immunoblotting method (Відповіді скарифікаційної проби й RAST на злаки у дітей з атопічним дерматитом. Визначення характеристик IgE-зв'язуючих компонентів у пшениці й вівсі методом імуноблотингу) Clin Exp Allergy 1995, 25:1100-1107) (Palosuo K., Alenius H., Varjonen E., Kalkkinen N., Reunala T. Rye γ-70 and γ-35 secalins and barley γ-3 hordein cross-react with ω-5 gliadin, a major allergen in wheat-dependent, exercise-induced anaphylaxis (Перехресні реакції γ-70 і γ-35 секалінів жита й гордеїну γ-3 ячменя з ω-5 гліадином, основним алергеном обумовленої пшеницею анафілаксичної реакції фізичного напруження) Clin Exp Allergy, 2001, 31:466-473). Передбачається, що у випадках, коли спожиті злаки є причиною атопічного дерматиту, задіяні найменш розчинні білки (гліадини й глютеніни). Багато попередніх досліджень показують, що у випадку дітей з атопічним дерматитом істотну роль відіграє харчова гіперчутливість, і видалення з їжі алергенів приводить до клінічного поліпшення. Повідомляється про деякі прояви контактної алергії на косметичні засоби на основі екстрактів зерен злаків (особливо, на білок пшениці, будь то гідролізований або негідролізований, а також кунжут) у людей з підвищеною чутливістю. Було показано, що гідроліз 3 UA 103210 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 білка пшениці, який міг би бути рішенням для зм'якшення алергії, буде навпаки набагато більш сенсибілізуючим (таким, що підвищує чутливість), а структурні зміни, викликані гідролізом, виявляють нові місця зв'язування антигену (Pecquet C., Lauriere M. New allergens in hydrolysates of wheat proteins (Нові алергени в гідролізатах білка пшениці). Rev Fr Allerg Immunol Clin 2003,43: 21-23). Вважається, що людям, схильним до алергії, слід уникати білків зерен злаків як при пероральному, так і при місцевому застосуванні, особливо це стосується дітей. Таким чином, існує необхідність і стійкий попит на косметичні вироби, призначені для людей з підвищеною чутливістю або алергією на зерна злаків. Несподівано та на диво автори винаходу виявили, що косметична композиція, яка містить екстракт надземної частини злаків або псевдозлаків, зібраних краще до появи колоса, не приводить до перехресних реакцій з тими білками, що відповідають за алергію на зерна злаків. Таким чином, метою даного винаходу є забезпечення екстракту надземної частини (частин) злаку та/або псевдозлаку, за винятком зерен, для використання людьми з алергією на білок зернових. Під терміном надземна частина злаку та/або псевдозлаку в даному контексті мається на увазі будь-яка частина, розташована вище рівня землі, за винятком зерен. Краще, щоб "надземні частини злаків та/або псевдозлаків" включали листи та/або стебла та/або вторинні колоски та/або квітки, за винятком зерен. Краще, щоб екстракт згідно з винаходом був екстрактом надземної частини (частин) злаку та/або псевдозлаку, зібраного до появи колоса. У контексті даного винаходу, фраза "надземні частини злаку та/або псевдозлаку, зібраного до появи колоса" стосується надземних частин злаку або псевдозлаку, зібраного після проростання насінин (через приблизно від 2 тижнів до 2 місяців після проростання насінин) під час стадії виходу в трубку аж до, але виключаючи, появу колоса. У контексті даного винаходу, термін "вихід у трубку" стосується фази росту, що відповідає росту стебла в довжину, та вступу у фазу колосіння, перед цвітінням. Краще, екстракт згідно з винаходом одержують із надземної частини (частин) пшениці, рису, ячменя або вівса, краще, вівса. Екстракт надземної частини (частин) вівса, краще використовуваний згідно з винаходом людьми, схильними до алергії на білок зернових, містить від 2 до 15 % флавоноїдів та від 0,2 до 2 % авенакозидів А і В, краще, від 5 до 10 % флавоноїдів ізовітексин-2"-О-арабінопіранозиду та ізоорієнтин-2"-О-арабінопіранозиду та/або менше 1 м.ч. (мільйонна частка, ррт) білків, краще, менше 0,5 м.ч., і ще краще, менше 0,3 м.ч. білків. Використовуваний екстракт надземної частини (частин) вівса відрізняється вмістом у ньому цільових флавоноїду й сапоніну. Останні аналізують за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, застосовуючи один із двох різних методів, придатних для кожного типу сполук. Кількості цих різних молекул змінюються залежно від умов екстракції. Основними флавоноїдами є ізовітексин-2"-О-арабінопіранозид та ізоорієнтин-2"-0-арабінопіранозид. Основними сапонінами є авенакозиди А і В. Це бісдесмозидні стероїдні сапоніни. Краще, екстракт згідно з винаходом є екстрактом надземної частини (частин) пшениці, рису або вівса, зібраних до появи колоса, і краще, надземної частини (частин) вівса, зібраного до появи колоса. Краще, екстракт згідно з винаходом є екстрактом, отриманим в органічному розчиннику. Екстракт згідно з винаходом може бути приготовлений шляхом екстрагування органічним розчинником надземної частини (частин) злаку або псевдозлаку (приблизно від 2 тижнів до 2 місяців після проростання насінин під час стадії росту в довжину до появи колоса, крім неї) після сушіння й здрібнювання. Зокрема, використовують органічний розчинник, вибраний з групи, що складається з кетонів, складних ефірів, С1-С4-спиртів та їх сумішей в будь-яких змішуваних пропорціях. Краще використовують органічний розчинник, вибраний з групи, що складається з ацетону, метилетилкетону, метилізобутилкетону, етилацетату, С 1-С4-спирту та їх суміші в будьякій змішуваній пропорції. Екстракцію краще проводять при перемішуванні або статично. Екстракцію проводять при кип'ятінні зі зворотним холодильником або при кімнатній температурі. Краще, екстракцію проводять при співвідношенні рослина/розчинник у діапазоні від 1:7 до 1:20, краще, від 1:8 до 1:12. Краще, екстракцію проводять протягом від 30 хвилин до 48 годин, найкраще, протягом від 60 до 120 хвилин. Екстракція може повторюватися 2 або 3 рази. 4 UA 103210 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Макуху, отриману на стадії екстракції, потім відокремлюють від екстракту шляхом центрифугування або фільтрацією, після чого розчин може бути тією чи іншою мірою сконцентрований до одержання сухої маси. Відбілювальна обробка може проводитися або шляхом знежирення за допомогою концентрування, осадження й фільтрації, або шляхом додавання до концентрованого або неконцентрованого екстрагувального розчину абсорбуючого субстрату, такого як активоване вугілля або абсорбційна смола. На стадії сушіння може бути доданий субстрат у ваговому співвідношенні по відношенню до екстрагованої сухої речовини в діапазоні від 1 до 75 %. Субстрат може бути цукром, таким як мальтодекстрин, лактоза, діоксидом кремнію або будь-яким іншим косметологічно прийнятним субстратом. Краще, щоб цей екстракт був отриманий екстракцією ацетоном або сумішшю ацетон/вода, що містить до 20 % води. Ацетоновий або водно-ацетоновий, що містить до 20 % води, екстракт містить цільові молекули, флавоноїди й сапоніни, і в значній мірі збіднений білками. Фактично, методи аналізу для визначення білків, описані в Європейській фармакопеї, виявляються безрезультатними, а електрофоретична міграція під час електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію після осадження з ацетону та проявлення за допомогою кумасі блакитного або нітрату срібла показує відсутність смуги, яка свідчить про наявність білка. Нанесення контрольної проби на цей самий електрофорез дозволяє оцінити межу виявлення білка як таку, що відповідає приблизно 1 нг, і, таким чином, вміст білка в даному екстракті становить менше 1 м.ч. (на основі кількості екстракту, нанесеного на гель). Краще, щоб зазначений вміст білка становив менше 0,5 м.ч., ще краще, менше 0,3 м.ч. білків. Ще однієї метою даного винаходу є використання екстракту надземної частини (частин) злаків та/або псевдозлаків, за винятком зерен, людьми, схильними до алергії на білок зернових. Ще одна мета даного винаходу стосується використання екстракту надземної частини (частин) злаків та/або псевдозлаків, за винятком зерен, для приготування гіпоалергенної дерматологічної композиції, тобто композиції, що мінімізує та/або запобігає ризикам виникнення алергійних реакцій у людей, схильних до алергії на білок зернових. Ще одна мета даного винаходу стосується використання косметичної гіпоалергенної композиції, що містить екстракт надземної частини (частин) злаків та/або псевдозлаків, людьми, схильними до алергії на білок зернових. Дерматологічна або косметична композиція, використовувана згідно з винаходом, може, зокрема, містити добавки й допоміжні засоби для приготування лікарської форми, такі як емульгувальні речовини, загусники, гелеутворювачі, нейтралізатори води, ліофілізуючі добавки, стабілізатори, барвники, ароматизатори та консерванти. Дерматологічна або косметична композиція, використовувана згідно з винаходом, також включає традиційні дерматологічно сумісні наповнювачі. Вона може бути приготовлена у вигляді емульсії вода-у-маслі (W/O) або масло-у-воді (O/W), гетерогенної емульсії, такої як, наприклад, емульсія вода-у-маслі-у-воді (W/O/W) або емульсія масло-у-воді-у-маслі (O/W/O), або ж у вигляді водної дисперсії чи масляної дисперсії, гелю або аерозолю. Дерматологічно сумісні наповнювачі можуть бути будь-якими наповнювачами, відомими фахівцю в даній області техніки, придатними для одержання композиції, призначеної для місцевого застосування у формі крему, лосьйону, гелю, мазі, емульсії, мікроемульсії, засобу для розпилення, шампуню тощо. Краще, щоб дерматологічна або косметична композиція, використовувана згідно з винаходом, містила від 0,1 до 10 % мас. екстракту надземної частини (частин) злаку або псевдозлаку, за винятком зерен, від загальної маси композиції. Краще, щоб зазначена композиція включала екстракт надземної частини (частин) злаку згідно з винаходом у кількості від 0,1 до 5 % мас. від загальної маси композиції. Короткий опис графічних матеріалів Фіг. 1: Порівняння профілів сумарного білка із зерен та молодих паростків вівса методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (12,5 % поліакриламідний гель) у присутності додецилсульфату натрію при проявленні за допомогою кумасі блакитного. Фіг. 2: Вестерн-блотинг, фарбування ферментами з поліклональними антитілами проти білків надземних частин. Фіг. 3: Вестерн-блотинг, фарбування ферментами з поліклональними антитілами проти білків зерен. Наступні приклади ілюструють винахід, не обмежуючи його. Приклад 1: Приготування екстракту надземних частин вівса, зібраного до появи колоса, екстракцією ацетоном 5 UA 103210 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 400 кг висушених надземних частин вівса, зібраного до появи колоса, розмелюють і потім поміщають у реактор з 10 об'ємами суміші ацетон/вода при перемішуванні протягом 1 години при кімнатній температурі. Після розділення фаз тверда/рідка одержують перший екстракт. Макуху екстрагують знову 10 об'ємами суміші ацетон/вода протягом 1 години при кімнатній температурі при перемішуванні. Після розділення твердої/рідкої фаз одержують другий екстракт і об'єднують його з першим. Отриманий в результаті розчин концентрують до вмісту води 1,33 об./кг, після чого фільтрують. Отриманий у такий спосіб екстракт сушать за допомогою мікрохвиль після додавання мальтодекстринової підкладки (25 %/нативний екстракт, достатня кількість (qsp)). Таким способом одержують 36 кг порошку блідо-коричневого кольору, що містить 6 % флавоноїдів (ізовітексин-2"-О-арабінопіранозиду та ізоорієнтин-2"-О-арабінопіранозиду) і 0,6 % авенакозиду В, при цьому вміст білка в отриманому у такий спосіб екстракті становить менше 0,3 м.ч. Приклад 2: Біохімічне та імунологічне порівняння екстракту зерна злаку й екстракту надземних частин того ж злаку, зібраного до появи колоса. Відсутність перехресних реакцій між екстрактами зерна злаків і екстрактами надземних частин було продемонстровано за допомогою біохімічних (екстракція й визначення білка) та імуноферментних методів (специфічна детекція наявності білка шляхом утворення антитіла). Екстракт білка зернових може бути приготовлений у такий спосіб: Зерна розмелюють і екстрагують гідроксидом натрію при рН 8. Після фільтрації фільтрат осаджують додаванням соляної кислоти до рН 5,4. Після центрифугування осад відбирають, поміщають у водний розчин та діалізують проти води в діалізному мішку, що має поріг відключення 6-8 кДа, при температурі 4 °C протягом ночі. Екстракт надземних частин може бути приготовлений у такий спосіб: Зі свіжого матеріалу: - екстракцією шляхом солюбілізації в буферному розчині Tris. HCl з величиною рН 8,0, фільтрацією й наступною серією з двох осаджень із ацетону для видалення солей, або: - екстракцією шляхом солюбілізації у відновному буфері Леммлі при рН 7,5, що містить сечовину та тіосечовину, фільтрацією й наступною серією з двох осаджень із ацетону для видалення солей. Із сухого матеріалу: екстракцією протягом 27 годин шляхом солюбілізації у відновному буфері Леммлі при рН 7,5, що містить сечовину й тіосечовину, фільтрацією й наступною серією з двох осаджень із ацетону для видалення солей. Біохімічні та імунологічні дослідження Біохімічні методи І. Електрофорез Принцип дії: Методом специфічного дослідження білків є електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію: в присутності додецилсульфату натрію негативно заряджені білки переміщаються в поліакриламідному гелі в напрямку катода в залежності тільки від їхньої маси, білки визначають за допомогою барвників, таких як кумасі блакитний або нітрат срібла. Використовуваний позитивний контроль відповідає або екстракту сумарного білка в надземній частині вівса до появи колоса, або екстракту сумарного білка зерна, отриманим як описано вище. II. Ілюстративний результат - Фіг. 1 Порівняння профілів сумарного білка зерна й надземних частин вівса до появи колоса за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі (12,5 % поліакриламідний гель) у присутності додецилсульфату натрію при проявленні за допомогою кумасі блакитного. Профіль електрофорезу, показаний на Фіг. 1, виявляє істотну відмінність у білковому складі обох досліджуваних екстрактів, особливо стосовно основних білків. Однак єдиним способом, що дозволяє упевнитися в якісній відмінності між цими двома серіями білків, є використання імунологічних методів зі специфічним розпізнаванням антиген-антитіло. Імунохімічний метод Цей метод вимагає, насамперед, одержання антитіл проти всіх білків у надземних частинах або в зернах. Із цією метою екстракти всіх білків надземних частин і зерен одного й того самого виду вводять в організм кроликів. Потім із сироватки крові тварин одержують поліклональні антитіла. 6 UA 103210 C2 5 10 15 20 25 30 Мета полягає в тому, щоб продемонструвати, що білки надземної частини вівса до появи колоса відрізняються від білків зерен, і що при цьому відсутня перехресна реакція між білками зерен та білками надземної частини. - Антитіла, спрямовані проти білків надземної частини вівса до появи колоса, у порівнянні з білками зерен вівса, - Антитіла, спрямовані проти білків зерен вівса, у порівнянні з білками надземної частини вівса до появи колоса, з використанням методів ELISA (імуноферментного аналізу) і вестерн-блотингу. I. Прямий ELISA ELISA (імуноферментний аналіз) є імунохімічним методом визначення наявності антигену в розчині. Принцип дії полягає у фіксації білків у досліджуваному розчині в лунці планшета з наступною обробкою антибілковими поліклональними антитілами. Далі друге антитіло анти-IgG кролика, з'єднане з ферментом, покаже після промивання наявність антигену в лунці планшета за допомогою простої колориметричної реакції. II. Вестерн-блотинг Принцип дії: Метод вестерн-блотингу полягає в електрофорезі в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію білкової суміші з наступним фарбуванням шляхом специфічної взаємодії антиген-антитіло. При цьому будуть виявлятися тільки ті білки, які розрізняються за допомогою поліклональних антитіл. Перші антитіла потім розрізняються другим антитілом (в даному контексті - антитілом анти-IgG кролика), з'єднаним з ферментом, таким як лужна фосфатаза. Ілюстративний результат - Фіг. 2 і З Перехресні реакції між білками зерна й антитілами, спрямованими проти білків надземної частини вівса до появи колоса (Фіг. 2), і перехресні реакції між білками надземної частини вівса до появи колоса й антитілами, спрямованими проти білків зерна (Фіг. 3). Метод вестерн-блотингу підтверджує перші результати, отримані за допомогою ELISA, а саме, що білки надземної частини вівса до появи колоса відрізняються від білків зерна й перехресні реакції між ними відсутні. Пацієнт, імунізований проти білків зерна вівса за допомогою дієти, не буде, таким чином, реагувати на екстракт надземної частини (без зерен), навіть якщо він містить білки. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 45 1. Застосування екстракту надземної частини/частин злаку або псевдозлаку, зібраних до появи колоса, для приготування гіпоалергенної дерматологічної композиції, для мінімізації та/або запобігання ризику виникнення алергійних реакцій у людей, схильних до алергії на білок зерна злаків. 2. Застосування за п. 1, де злак є пшеницею, рисом, ячменем або вівсом. 3. Застосування за п. 2, де злак є вівсом. 4. Застосування за п. 3, де екстракт містить від 2 до 15 % флавоноїдів і від 0,2 до 2 % авенакозидів А і В. 5. Застосування за п. 3 або 4, де екстракт містить від 5 до 10 % флавоноїдів ізовітексин-2''-Оарабінопіранозиду та ізоорієнтин-2''-О-арабінопіранозиду. 6. Застосування за будь-яким з пунктів 3-5, де екстракт містить менше 1 м. ч. білків. 7. Застосування за п. 1, де псевдозлак є гречкою, лободою квіноа або кунжутом. 8. Застосування гіпоалергенної косметичної композиції, що містить екстракт надземної частини/частин злаку або псевдозлаку, зібраних до появи колоса, для мінімізації та/або запобігання ризику виникнення алергійних реакцій у людей, схильних до алергії на білок зерна злаків. 7 UA 103210 C2 8 UA 103210 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9