Штам бактерій pseudomonas chlororaphis або його біологічно чисті культури, здатні продукувати активні антипатогенні метаболіти, композиція для профілактики захворювань рослин, спосіб профілактики захворювань рослин

1 Штамм баїсгерий Pseudomonas chlororaphis NCIMB 40616 или его биологически чистые культуры, способные продуцировать активные антипатогенные метаболиты, или его мутанты, имеющие по существу такие же характеристики, как и штамм NCIMB 40616 2 Композиция для профилактики заболеваний растений, вызываемых патогенными грибами, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного антипатогенного ингредиента штамм бактерий по п 1 или его культуральную жидкость, ю содержащую его активные антипатогенные метаболиты 3 Композиция по п 2, отличающаяся тем, что патогеном является гриб Drechslera teres 4 Композиция по п 2, отличающаяся тем, что патогеном является грибок Drechslera grammea 5 Композиция по п 2, отличающаяся тем, что патогеном является гриб Drechslera avenae 6 Композиция по п 2, отличающаяся тем, что патогеном является гриб Microdochium nivale 7 Композиция по п 2, отличающаяся тем, что патогеном является гриб Tilletia caries 8 Композиция по п 2, отличающаяся тем, что патогеном является гриб Ustilago avenae 9 Композиция по пп 2 - 8, отличающаяся тем, что активный антипатогенный ингредиент находится в смеси с композицией-носителем, приемлемым для сельскохозяйственной практики 10 Композиция по п 9, отличающаяся тем, что активный антипатогенный ингредиент находится в смеси с жидким носителем 11 Композиция по п 9, отличающаяся тем, что активным антипатогенным ингредиентом насыщен твердый пористый материал 12 Композиция по п 9, отличающаяся тем, что дополнительно содержит клейкие добавки 13 Композиция по п 9, отличающаяся тем, что дополнительно содержит источник питательного вещества 14 Способ профилактики заболеваний растений, вызываемых патогенными грибами, включающий введение эффективной дозы активного антипатогенного ингредиента в окружающую среду, где возбудитель заболевания должен быть подавлен, отличающийся тем, что в качестве активного антипатогенного ингредиента используют штамм бактерий по п 1 или его культуральную жидкость, содержащую его активные антипатогенные метаболиты 15 Способ по п 14, отличающийся тем, что активный антипатогенный ингредиент применяют на семенах 16 Способ по п 14, отличающийся тем, что активный антипатогенный ингредиент применяют на частях растений, выполняющих функции их распространения и вегетации 17 Способ по п 14, отличающийся тем, что активный антипатогенный ингредиент применяют на растениях О (О (О го го 43366 18 Способ по п 14, отличающийся тем, что активный антипатогенный ингредиент применяют на среде для выращивания растения или на среде, где оно растет Изобретение относится к средствам защиты растений, а более конкретно - к новому штамму бактерий Pseudomonas chlororaphis и к использованию в растениеводстве композиций, содержащих этот штамм или продуцированные им антибиотики, для защиты растений от поражения фитопатогенными микроорганизмами Некоторые микробы, способные вызывать болезни растений, приносят значительный вред культурным растениям и соответственно экономические потери Многие из них поражают листья и/или другие надземные части растений, а затем обычно переносятся спорами по воздуху на новые неинфицированные культуры Другие передаются от одного поколения к поколению культур через семена, а некоторые, вызывающие заболевания и причиняющие экономический ущерб микроорганизмы, передаются через почву, оставаясь в ней более или менее пассивными до появления восприимчивой к ним культуры времени немногие штаммы отвечали этим требованиям и поэтому их использовали как коммерческие продукты Согласно изобретению предложено средство биологической борьбы, пригодное и эффективное против поражений растений патогенами в растениеводческих хозяйствах Предложен новый штамм (МА 342) бактерий Pseudomonas chlororaphis с желаемыми характеристиками Полученный штамм депонирован в Национальных Коллекциях промышленных и морских бактерий (National collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)), Абердин, Шотландия, 14 февраля 1994 г, согласно Будапештскому Договору, и ему присвоен регистрационный № 40616 Согласно изобретению также предложена композиция для профилактики заболеваний растений, содержащая в качестве активного ингредиента новый штамм МА 342 или его мутанты с по существу такими же характеристиками, или антипатогенно активные метаболиты или их производные Кроме того, согласно изобретению предложен способ защиты растений от болезней, используя новый штамм МА 342 или его мутанты с по существу такими же характеристиками, или антипатогенно активные метаболиты или их производные На чертеже показан жирнокислотный профиль выделенного штамма МА 342, полученный с помощью Системы Распознавания Патогенных Микроорганизмов (Microbial Identification System) (MIDI, Newark Ltd , USA) Ниже приведена характеристика нового штамма бактерий и описание предпочтительных способов репродукции штамма, приготовления состава и применения на полях или в теплицах Несколько неограничивающих примеров, приведены для более подробной иллюстрации способа и состава согласно изобретению Характеристика нового бактериального штамма МА 342 Морфологические характеристики Морфология колоний на TSA 10 (10 г тригтгон-соевого бульона (Oxoid Ltd) в 1000 мл дистиллированной воды Образует круглые белые, умеренно выпуклые колонии, в виде хорошо видимых прозрачных кристаллов в агаре при высокой плотности клеток Клетки представляют собой грам положительные палочки, флуоресцирующие ярко-желтым светом в Kings среде В (1,5 г К2НРО4, 1,5 г MgSO4 • 7Н2О, 20 г протеолитического пептона (Difco Ltd ), 10 мл глицерина, 15 г агар Bacto (Difco Ltd) в 1000 мл дистиллированной воды) Жирнокислотный анализ Жирнокислотный профиль бактерии показан на фиг 1 Этот анализ был произведен с использованием Системы Распознавания Патогенных Микроорганизмов (Microbial Identification System) (MIDI, Newark Ltd , USA), версия 3 7 Согласно этой программе испытания МА 342 наиболее подобен Pseudomonas chlororaphis с индексом подобия 0,705 Многие методы борьбы с вызывающими заболевания микроорганизмами в растениеводстве требуют значительных финансовых затрат, но их использование для большинства растениеводческих хозяйств экономически необходимо Один из широкоиспользуемых методов - обработка биостатическими или биоцидными химикатами Их в большинстве случаев наносят опрыскиванием на посевы, обрабатывают ими семена или корни, или дезинфицируют почву Другие общепринятые методы включают селекцию культур, стойких к патогенам, и агротехнические мероприятия Все эти общепринятые методы профилактики имеют некоторые недостатки Агротехнические мероприятия эффективны или приемлемы только для решения некоторых проблем, связанных с заболеваниями растений Селекция стойких к болезням культурных растений также возможна или приемлема только в определенных случаях, на нее может потребоваться много времени, а достигнутая стойкость может быть утеряна через некоторое время с появлением новых штаммов патогена Часто высокоэффективны химические соединения, но они могут приводить к нежелательным последствиям для окружающей среды, требуют осторожности в обращении из-за риска для здоровья человека, и, кроме того, они могут стать неэффективными при появлении стойких патогенных штаммов Использование средств биологической борьбы или биопестицидов может быть более эффективным и предпочтительным, чем использование других методов и поэтому такие средства испытывают в широких масштабах Известно, что некоторые штаммы бактерий или грибов подавляют рост различных фитопатогенных микроорганизмов Для эффективного использования такие штаммы должны обладать стабильностью, давать воспроизводимые результаты в полевых условиях и пользователи должны иметь возможности применять их в полевых условиях До настоящего 43366 Биохимические характеристики Характеристики, полученные при экспресс-анализе по API 20 NE* Восстановление нитратов Продуцирование индола Превращение глюкозы в кислоту Аргининдигидролаза Уреаза Гидролиз эскулина Гидролиз желатина Р-галактозидаза Усвоение глюкозы Усвоение арабинозы Усвоение маннозы Усвоение маннитола Усвоение N-ацетил-глюкозамина Усвоение мальтозы Усвоение глюконата Усвоение капрата Усвоение адипата Усвоение малата Усвоение цитрата Усвоение фенилацетата Цитохромоксидаза Реакция изолята МА 342 + + + .7 + + + + + API System Ltd , Франция Характеристики, полученные в результате дополнительных анализов Продуцирование Усвоение ксилозы Усвоение сорбита Предпочтительные способы репродукции штамма, приготовления составов и их применения в долевых условиях и теплицах Активные штаммы лучше всего получать во включающем инокуляцию образца процессе ферментации чистой жидкой культуры штамма, выращенной при встряхивании, или в ферментере, заполненном подходящей ферментационной средой Штамм может быть также выращен на стерильной, в частности, на агаризованной поверхности, и когда клетки дадут рост, их можно суспендировать в воде или другой известной жидкой среде В качестве среды для выращивания в принципе пригодны любые известные среды для выращивания бактерий Ферментацию ведут до получения достаточной концентрации клеток, например, примерно 5-Ю9 ед/мл (колониеобразующих единиц)/мл для жидких культуральных сред Полученная таким образом культуральная жидкость или суспензия бактерий может быть использована в таком виде для защиты растений, ее также до использования можно обработать и приготовить состав в соответствии с рецептурой В одном способе обработки клетки бактерий в культуральной жидкости можно убить, например, нагревом, или их можно центрифугировать в осадок, а оставшуюся или надосадочную жидкость, содержащую бактериальные метаболиты, можно использовать для защиты растений как с предварительной очисткой и/или концентрированием, так и без них Суспензии бактерий и культуральные жидкости можно также гомогенизировать в смеси с одним или несколькими известными соединениями или группами соединений, при том, что такие .7 +7 соединения совместимы со штаммами бактерий или их антипатогенно активными метаболитами или их производными Подходящими соединениями могут быть порошкообразные добавки или твердые носители, такие, как тальк, каолин, бентонит или монтмориллонит, известные увлажняемые порошки, питательные вещества-источники углерода (глюкоза, сахароза и фруктоза) или комплексные бактериальные питательные вещества (дрожжевой экстракт, бактериологический пептон или тригтгон), соли металлов, соли жирных кислот, эфиры жирных кислот, ионо- или неиогенные ПАВ, растительные питательные вещества, регуляторы роста растений, фунгициды, инсектициды, бактерициды и им подобные Суспензии бактерий и культуральные жидкости могут быть высушены или лиофилизированы до или после смешивания с подходящими соединениями, а полученный продукт - использован для защиты растения Подходящий способ сушки - например, сушка на воздухе вермикулита, присутствующего в бактериальной культуральной жидкости Препараты бактерий и метаболитов могут быть применены любым способом, известным для обработки семян, частей растений, выполняющих функции их распространения и вегетации, растений и почвы штаммами бактерий разбрызгиванием, опрыскиванием, распылением, опылением, рассеиванием, осаждением, погружением или поливом в соответствии с целями и преобладающими обстоятельствами Обычный расход препарата для обработки семян преимущественно составляет от 10 1 1 до 12 10 12 ед/га, а при опрыскивании от 10 14 до 10 43366 ед/га, или соответствующее количество бактериальных метаболитов Пример 1. Выделение микроорганизма МА 342 Выкопанные корни растения Empetrum nigrum промыли в стерильной водопроводной воде для удаления налипшей почвы От молодого корня отрезали кусок длиной 2-3 см, соблюдая стерильность Этот кусок отрезали выше конца корня В этом куске корня сделали маленькие надрезы разогретым скальпелем Затем кусок корня натерли на поверхность агара TSA 10 После прорастания бактерий, микроорганизм МА 342 собрали и на TSA 10 вырастили чистую культуру Пример 2. Сохранение микроорганизма МА 342 Чистую культуру в небольшой ампуле подвергли глубокому замораживанию при -70°С В качестве вещества-протектора замороженной культуры использовали 10%-й раствор глицерина в водопроводной воде с рН 7,15 после автоклавирования После замораживания при -70°С ампулы хранили при -20°С Для длительного хранения образец подвергли лиофилизации После прорастания в течение 48 часов на агаре TSA 10 бактериальный газон соскребли с агаризованной поверхности, смешали с протектором лиофилизированной культуры (50 г Dextran T 70 (Pharmacia Fine Chemicals Ltd), 50 г Na-L-glutamate (Kebo ДВ) в 1000 мл дистиллированной воды), разлили в небольшие ампулы (20 мл) и поставили в лиофильную сушку Hetosicc (Heto Ltd , Denmark) на 24 часа После лиофилизации ампулы закрыли газонепроницаемыми резиновыми пробками и оставили на хранение при 4°С Пример 3. Действие Ма 342 против Microdochium mvole при первичном отборе в теплице Бактерии использовали для обработки семян пшеницы следующим образом 24-часовые культуры на TSA 10, выращенные при 15°С, соскребли с агаризованной поверхности 9-сантиметровой чашки Петри и смешали с 40 мл питательного бульона (SNB 18 г сахарозы, 5 г бактериального пептона (Oxoid Ltd), 2 г дрожжевого экстракта (Oxoid Ltd ), 0,5 г К2НРО4 и 0,25 г MgSO4 • 7Н2О в 1000 мл дистиллированной воды с рН 7',2-7',4) и 40 мл 2% в отношении массы к объему раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (CMC) в стерильной дистиллированной воде Этой смесью полили семена, через 20 мин излишек смеси слили, а семена высушили под вентилятором в течение ночи Для обработки семян в этом тепличном анализе взяли две банки и засеяли в каждую по 50 семян Банки 18 см диаметром и 4 см высотой были заполнены на 2/3 нестерилизованной коммерческой торфяной смесью (Enhetsjord К Normal), с добавлением 20% по объему песка До обработки бактериями семена озимой пшеницы (культурный сорт "Kosack") искусственно заразили патогеном Microdochium nivale Патоген культивировали в течение 7 дней в бульоне картофельной декстрозы (24 г бульона картофельной декстрозы (Difco Ltd ) в 1000 мл дистиллированной воды) при комнатной температуре на роторной качалке Полученную кашицу гомогенизировали в кухонном смесителе и вылили на семена Через 30 мин жидкость слили, а семена оставили сушиться под вентилятором на ночь Таким образом инвазированные семена затем обработали штаммом МА 342 и высеяли в банки, как было описано выше После высевания банки накрыли стеклянными крышками и поставили в темное место при 6°С Через 5 дней крышки сняли, каждую банку полили 100 мл воды и поместили пятилитровый пластиковый мешок, который поддерживали две деревянные палки Затем банки поместили в теплицу при 12-15°С на 8 дней Опыт на семенах заключался в следующем 1 Штаммом МА 342 бактерии Р chlororaphis, смешанным с SNB/CMC, обработали семена, инвазированные патогеном М nivale 2 Семена, инвазированные патогеном М nivale, составляли контрольную группу больных 3 Необработанные семена составляли контрольную группу здоровых Эффект подавления заболевания зафиксировали в процентах появления всходов здоровых (те без мицелий) растений среди посеянных Результаты типичного первичного анализа с патогеном М nivale представлены в таблице 1 Таблица 1 Влияние штамма МА 342 на всхожесть и проявление заболевания озимой пшеницы, выращенной из семян, инвазированных патогеном М nivale Вид обработки Всхожесть, % Здоровые растения среди посеянных, % 1 МА342 87 81 2 Контроль (зараженные) 13 1 3 Контроль (необработанные) 90 89 Пример 4. Действие МА 342 против Dzechslera teres при вторичном отборе в теплице При этом отборе штамм МА 342 выращивали в течение 46 часов в полуконцентрирован ном (15 г/л) тригтгон-соевом бульоне (Difco Ltd ) на роторной качалке в темноте при 18-20°С Затем естественно зараженные патогеном D teres семена ячменя культурного сорта "Golp" смешали в пластиковом мешке с полученной суспензией бак 43366 терий из расчета 300 мл на 1 кг семян, и после перемешивания мешок встряхивали около 4 мин Обработанные таким образом семена сушили под вентилятором при комнатной температуре в течение одного дня, а затем высеяли в банки, как описано в Примере 3 Три засеянные банки на обработку поместили сначала в темное помещение при 6°С на 7 дней, а затем в теплицу при около 20°С, как описа но в Примере 3 Для выявления эффекта от обработки подсчитали количество появившихся ростков растений и количество растений с пораженной первой листвой Бактериальное действие сравнивали с необработанными контрольными образцами и семенами, обработанными фунгицидом Panoctme Plus 400 (гуазатин 150 г/л + имазалил 10 г/л), Rhone-Poulenc Ltd , при дозе 4 мл на килограмм семян Таблица 2 Действие штамма МА 342 и фунгицида Panoctme Plus 400 на ячмень, зараженный D teres, при обычном вторичном тепличном отборе Вид обработки Появившиеся ростки, % Растения с пораженной первой листвой, % Контроль 92,5 13,0 Panoctme Plus 400, 4 мл/кг 95,5 0,0 МА 342, 300 мл/кг 96,1 0,0 Пример 5. Действие МА 342 на патогены растений в полевых условиях Полевые испытания проводили в виде рандомизированных блоков с повторением от трех до восьми раз на участках с размерами от 0,15 м2 (один эксперимент с Т canes) до примерно 15 м2 (большинство экспериментов) Эти участки находились в разных местностях Швеции и в большинстве случаев на суглинистых почвах с содержанием гумуса примерно 3 % Обработку семян бактериями и препаратом Panoctme Plus 400 проводили так, как описано в Примере 4 После того, как обработанные семена высушили вентилятором, их оставили при комнатной температуре на различное время перед вы севанием на полевые участки Все семена, за исключением инвазированных патогеном N canes, были естественно инвазированы или заражены различными болезнями Семена озимой пшеницы (культурный сорт "Kosack") были искусственно инвазированы спорами N canes путем смешивания 2 г зараженных N canes колосков с 1 кг семян пшеницы Действие МА 342 на Tilletia caries Это действие определяли по частоте появления зараженных колосков во время созревания Результаты, полученные во время двух испытаний в 1991/92 г и двух испытаний в 1992/93 г, представлены в Таблице 3 Разница между бактериальной обработкой и фунгицид ной существенна в 1992/93 г Таблица 3 Действие суспензии штамма МА 342 на Tilletia caries, поражающую зерно Вид обработки Инфицированные колоски, % 1991/92 1992/93 Контроль 23 65 Panoct 400*, 4 мл/кг 2 24 МА 342, 300 мг/кг 0 9 Panoctme 400 (гуазатин 150 г/л), Rhone-Poulenc Ltd Действие МА 342 на Drechslera teres, , D Gzammea, D avenae и Ustilago avenae В полевых экспериментах с этими патогенами измеряли число проросших и число инфицированных растений на м , а также в большинст ве экспериментов - урожайность злаков, вес тысячи зерен и вес гектолитра зерен Действие на Drechslera teres Результаты полевых испытаний в 1991 -1993гг и действие D teres на ячмене в тех случаях, где проводили испытания, показаны в таблицах 4, 5 и 6 43366 Таблица 4 Результаты четырех полевых экспериментов на ячмене, зараженном Drechslera teres в 1991 г, приведены средние показатели экспериментов, проведенных в Алнарпе, Ланне, Стренгнесе и Ультуне Вид обработки Урожайность, кг/га Кол-во растении на м2 Кол-во инфиц. растении на м2 Вес гектолитра, Вес кг 1000 зерен, Контрольная 4970 361 47 64,7 41, 5 Pan Plus 400, 4 мл 5390 353 1 66,3 43,8 MA 342, 300 мл/кг 5480 353 1 66,0 43,7 г Таблица 5 Результаты пяти полевых экспериментов на ячмене, зараженном Drechslera teres в 1992 г, приведены средние показатели экспериментов, проведенных в Сваалефе, Нигорде, Келбеке, Ультуне и Ребексдалене Вид обработки Урожайность, кг/га Кол-во растений на м2 Кол-во инфиц. растений на м2 Вес гектолитра, Вес кг 1000 зерен, г Контрольная 4290 358 48 67,9 51,7 Pan Plus 400, 4 мл 4380 378 1 67,8 50,5 MA 342, 300 мл/кг 4300 380 1 68,3 52,6 Таблица 6 Результаты двух полевых экспериментов на ячмене, зараженном Drechslera teres в 1993 г, приведены средние показатели экспериментов, проведенных в Келбеке и Ультуне Урожайность, кг/ га 6310 Кол-во инфицированных растений на м 2 74 Pan Plus 400, 4 мл 6730 1 MA 342, 200 мл/кг 6720 5 Вид обработки Контроль ты Действие на Drechslera graminea Результаэкспериментов с семенами, зараженными D graminea, проведенных в 1991-1993 гг, приведены в таблицах 7, 8 и 9 Таблица 7 Результаты одного полевого эксперимента с ячменем, зараженным D graminea (1991 г, Уппсала) Урожайность, кг/ га 3440 Кол-во инфицированных растений на м 2 31 Pan Plus 400, 4 мл 4160 2 MA 342, 200 мл/кг 4390 1 Вид обработки Контроль 43366 Таблица 8 Результаты пяти полевых экспериментов с ячменем, зараженным D grammea в 1992 г, приведены средние показатели экспериментов, проведенных в Свалефе, Нигорде, Келбеке, Ультуне и Ребексдалене Вид обработки Урожайность, кг/га Кол-во растений на м2 Кол-во инфиц. растений на м2 Вес гектолитра, Вес кг 1000 зерен, г Контроль 2590 383 101 66,2 40,2 Pan Plus 400, 4 мл 3470 381 5 66,6 39,9 MA 342, 300 мл/кг 3460 368 7 66,2 39,8 Таблица 9 Результаты двух полевых экспериментов в 1993 г с ячменем, зараженным D grammea, приведены средние показатели экспериментов, проведенных в Келбеке и Ультуне Урожайность, кг/ га 2810 Кол-во инфицированных растений на м2 46 Pan Plus 400, 4 мл 4160 1 MA 342, 200 мл/кг 3990 8 Вид обработки Контроль Действие на Drechslera avenae Результаты экспериментов с семенами овса, зараженного D avenae, проведенных в 1991-1993 гг, приведены в таблицах 10, 11 и 12 Таблица 10 Результаты экспериментов с одного участка овса ("Puhti"), зараженного D avenae 1991 г, Уппсала Урожайность, кг/ га 4940 Кол-во инфицированных растений на м2 74 Pan Plus 400, 4 мл 4860 32 MA 342, 200 мл/кг 5090 17 Вид обработки Контроль Таблица 11 Результаты четырех полевых экспериментов в 1992 г с овсом ("Puhti" и "Vital"), зараженным D avenae, приведены средние показатели экспериментов, проведенных в Свалере и Ультуне Вид обработки Контроль Pan Plus 400, 4 мл MA 342, 300 мл/кг Урожайность, кг/га Кол-во растений на м2 Кол-во инфиц. растений на м2 3990 4080 4000 428 456 445 22 13 3 Вес гектолитра, Вес кг 1000 зерен, г 57,5 57,8 57,4 35,4 35,5 35,0 Таблица 12 Результаты эксперимента с участка овса ("Vital"), зараженного D avenae (1993 г, Уппсала) Урожайность, кг/ га 7570 Кол-во инфицированных растений на м2 79 Pan Plus 400, 4 мл 7870 14 MA 342, 200 мл/кг 7680 27 Вид обработки Контроль 43366 Действие на Ustilago avenae В полевых экспериментах с колосьями овсянки, зараженной U avenae, было подсчитано число колосков овсянки или их процентное содержание на м2 или их % В период созревания урожайность не определяли Результаты трех экспериментов в 1991-1993 гг приведены в Табл 13 Таблица 13 Результаты трех экспериментов с овсом, зараженным Ustilago avenae (1991-1993 гг, Уппсала) Вид обработки 1991 г., кол-во колосков на м2 1992 г., инфицированные растения, % 1993 г., кол-во колосков на м2 Контроль 7 10,6 95 Pan Plus 400, 4 мл 3 8,7 не испыт MA 342, 300*, мл/кг 1 1,7 15 * 300 мл в 1991 и 1992 гг, 200 мл в 1993 г Пример 6. Применение МА 342 для обработки семян и других участков растения Обработка семян водным составом, содержащим МА 342 Бактериальные суспензии, полученные как описано в Примерах 3 и 4, смешали с каждым из следующих веществ или соединений Порошок талька (Kebo Lab AB), 48 г/л бактериальной суспензии Tween 20 (Merck Ltd), 20 мл/л бактериальной суспензии Metocel (сложный эфир целлюлозы, Sveola К е т і АВ), 12 г на литр бактериальной суспензии Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd), 1 г на литр бактериальной суспензии Bond (Newman Agrochemicals Ltd), 1 г на литр бактериальной суспензии В других экспериментах бактериальную суспензию центрифугировали при 10000 g в течение примерно 10 мин , а полученные гранулы ресуспендировали в 0,1 М MgSO4 или в пептонной воде (5 г бактериологического пептона (Oxoid Ltd) на литр водопроводной воды) После тщательного перемешивания полученными суспензиями обработали семена (см Пример 4 для несмешанных бактериальных суспензий) Обработка семян лиофилизированными бактериями Бактерии МА 342, выращенные на культуре, выращиваемой при встряхивании (см Пример 4), центрифугировали и полученные гранулы ресуспендировали в растворе молочных сливок (200 г порошка молочных сливок фирмы Semper AB, Швейцария, на литр стерильной дистиллированной воды), используемом в качестве протектора модифицированных бактерий Смесь заморозили в закрытых стеклянных банках, а затем лиофилизировали в этих банках в течение примерно 48 часов в лиофильной сушке Hetosicc (Heto Ltd , Дания) Полученный порошок оставили до применения при 4°С в пластиковых мешках или в пластиковых бутылях с завинчивающимися крышками Для обработки семян порошок перемешали в воде, или в других водных растворах, а затем обра ботали семена (см Пример 4 для бактериальной суспензии), или его смешивали в пластиковом контейнере с семенами всухую, тщательно встряхивая смесь (примерно 10 г порошка на кг семян) Гранулирование семян, обработанных МА 342 Бактерии МА 342, выращенные на культуре, выращиваемой при встряхивании, (см Пример 4) перемещали в пропорции 1 1 по объему с клейким веществом (2 % в отношении массы к объему водного раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы или 50 % в отношении массы к объему водного раствора гуммиарабика) Этой смесью обработали семена (см Пример 4) Затем в пластиковый мешок добавили избыточное количество бентонита (Dresser Minerals Inc) или порошка талька (Kebo Lab AB), мешок надули и сильно потрясли в течение нескольких минут После этого семена разложили на большие подносы под вентилятором и оставили сохнуть при комнатной температуре Опрыскивание побегов растений бактериальной суспензией Бактериями МА 342, выращенных на культуре, выращиваемой при встряхивании, (см Пример 4) заполнили пластиковые ручные опрыскиватели или опрыскиватели с приводом затем опрыскали листву и побеги растений В другом случае бактерии сначала центрифугировали при 10000 g в течение десяти минут, осадок ресуспендировали в водопроводной воде и полученную бактериальную суспензию использовали для опрыскивания листвы и побегов растений Пример 7. Действие очищенных метаболитов из МА 342 против заболеваний, вызванных Drechslera teres, при экспериментах в теплицах Штамм МА 342 вырастили за 48 часов в полуконцентрированном (15 г/л) триптон-соевом бульоне (Difco Ltd) на роторной качалке в темноте при 18-20°С Полученную суспензию бактерий центрифугировали при 48000 g в течение 30 мин , а затем метаболиты в надосадочной жидкости подвергли дальнейшей чистке в патронах Sep-pak С 18 (Walers Associates) следующим образом 1 80 мл надосадочной жидкости влили в Spe-pak, активированному 10 мл метанола 43366 2 Sep-pak промыли сначала 5 мл 30 % этанола, а затем 5 мл 40 % этанола 3 Метаболиты элюировали 5 мл 70 % этанола 4 70 % этанол-элюата выпарили в роторном испарителе, оставив примерно 1,5 мл водного раствора Затем его разбавили водопроводной водой до объема 6,5 мл Семена ячменя культурного сорта "Golf", естественно зараженные D teres, погрузили в эти 6,5 мл водного раствора метаболитов на 30 мин , а затем посеяли в банки по 50 семян Банки накрыли стеклянными крышками и поместили в темное место при 6°С Через 9 дней крышки сняли и банки поместили в теплицу при 15-22°С на примерно 2 недели Число проросших и число пораженных болезнью растений подсчитали (см Пример 4) Для контроля использовали необработанные семена и семена, обработанные надосадочнои жидкостью, не очищенной в патроне Sep-pak и не содержащей клетки МА 342 Таблица 14 Действие очищенных метаболитов из МА 342 и надосадочнои жидкости, содержащей клетки МА 342, на D teres на ячмене при обычных испытаниях в теплице Вид обработки % проросших растений % растений с поражением первой листвы Контроль (необработанные семена) 97, 0 21, 6 Надосадочная жидкость с клетками МА 342 99,0 1,0 Выпаренный элюат без клеток 99, 0 0,0 Пример 8 Результаты сравнительных испытаний штамма МА 342 и 11 других изолятов бактерий Pseudomonas chlororaphis, полученных из разных коллекций культур Одиннадцать разных не шведских изолятов Pseudomonas chlororaphis (см Табл 1) испытали вместе со штаммом МА 342 на действие против пятнистости листьев ячменя и на индукцию ответа в биохимических тестах согласно системе тестирования API 20 NE Дополнительно, образцы сравнивали по появлению колоний и кристаллических образований на чашках агара Эти одиннадцать не шведских изолятов были из различных стран и де понированы в четырех разных признанных коллекциях культур (Табл 1) Тест на способность подавлять заболевания при испытаниях в теплице Тесты были проведены с ячменем, зараженным Drechslera teres (см Пример 4) и для обеспечения адекватного сравнения все изоляты были испытаны одновременно Как видно из Таблицы 1, результаты показывают, что МА 342 уникален в том смысле, что ни один из других испытаний изолятов не обладает таким свойством как МА 342 при таком тестировании, а именно - способность подавлять инфекцию, вызванную Drechslera teres Таблица 1 Названия образцов, страны происхождения и действие МА 342 и 11 других изолятов Р chlororaphis на ячмень, зараженный D teres при испытаниях в теплице Название образцов Страна происхождения МА342 USDA B2075 USDAB1869 USDAB14874 USDAB14869 USDAB1854 NCTC 10686 NCTC 7357 DSM 6508 АТСС 9446 АТСС 17414 АТСС 17811 Контроль (необработанные растения) Швеция Чехословакия Новая Зеландия США, Колорадо США, Иллинойс США, Луизиана Англия Англия Германия США США США Индукция ответа при биохимических тестах согласно системе тестирования API 20 NE Тесты проводились как описано выше Результаты приведены в Табл 2 Они показывают, что МА 342 и в этом отношении уникален и отли Действие на пятнистость листьев при испытаниях в теплице. Зараженные растения после обработки конкретным изолятом, % 9 53 60 56 58 43 54 58 56 61 50 58 71 чается от остальных 11 испытанных изолятов Некоторые из испытанных изолятов нельзя считать согласно этому тесту главными среди видов Pseudomonas chroloraphis 43366 Таблица 2 Ответ, индуцированный различными изолятами, использованными в нескольких биохимических тестах согласно системе тестирования API 20 NE "+" означает положительный ответ, "-" -нет/отрицательный ответ Свойства в тестах по API 20 NE Испытанный изолят МА 342 В 2075 В NCTC NCTC DSM АТСС АТСС АТСС 1869 14874 14869 1854 10686 7357 6508 9446 17414 17811 Восстановление нитратов Продуцирование индола Превращение глюкозы в кислоту Аргининдигидролаза Уреаза Гидролиз эскулина Гидролиз желатина Р-галактозидаза Усвоение глюкозы Усвоение арабинозы Усвоение маннозы Усвоение маннитола Усвоение глюкозамина Усвоение мальтозы Усвоение глюконата Усвоение капрата Усвоение адината Усвоение малата Усвоение цитрата Усвоение фенилацетата Цитохромоксидаза Сравнение появления колоний и образования кристаллов на чашках агара Изоляты культивировали в чашках Петри на TSA 10, как описано выше Наблюдали небольшую разницу в появлении колоний различных изолятов, но по этому признаку все изоляты различить нельзя Однако, изолят МА 342 был единственным, который образовывал типичные прозрачные кристаллы в агаре и по этому свойству его можно было отличить от всех других изолятов 10 43366 НАЧАЛО 1,643 10,101 10,402 13,560 ОСТАНОВКА Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3-72-89 (03122) 2-57-03 11