Екстракт кори дерева роду corynanthe та його застосування, лікарський засіб, харчовий продукт з лікувальними або профілактичними властивостями і фармацевтичний препарат, що його містить

1. Екстракт кори дерева Corynanthe pachyceras, що містить щонайменше 24 % поліфенолів і щонайменше 8 % алкалоїдів, одержуваний наступним способом: (a) екстрагування сухої та подрібненої кори дерева Corynanthe pachyceras органічним розчинником або сумішшю декількох органічних розчинників, або сумішшю одного або більше органічних розчинників і води при температурі від 10 °С до 100 °С, причому органічний розчинник являє собою спирт або кетон; (b) відділяння екстрагованого рослинного матеріалу від розчину, що екстрагує, наприклад, за допомогою фільтрації; (c) за необхідності, повторне екстрагування рослинного матеріалу за допомогою розчинника згідно з етапом (а) з наступною сепарацією згідно з етапом (b); (d) об'єднання екстрагованих розчинів, отриманих на етапах (b) і (c); (е) випарювання і висушування об'єднаного розчину, отриманого на етапі (d), з отриманням сухого екстракту. 2 (19) 1 3 94434 4 вань серцево-судинної системи і гострих і хронічних больових станів, який містить екстракт за будь-яким з пп. 1-4. 9. Фармацевтичний препарат, що складається з екстракту за будь-яким з пп. 1-4 і придатного ад'юванту, який приготовано у формі для перорального, парентерального або місцевого введення. Даний винахід стосується екстрактів кори дерев роду Corynanthe, а саме Corynanthe Pachyceras, а також їх використання для лікування і профілактики захворювань нижніх відділів сечовипускальних шляхів, сексуальних розладів, порушень метаболізму ліпідів, серцево-судинних захворювань, а також гострих і хронічних больових станів. Даний винахід також стосується лікарських засобів, дієтичних харчових продуктів і фармацевтичних композицій, що містять вказані екстракти. Доброякісна гіперплазія передміхурової залози (ВРН, від англ. Bening Prostatic Hyperplasia) і супутні симптоми з боку нижніх відділів сечовипускальних шляхів (LUTS, від англ. Lower Urinary Tract Symptoms) є однією з найчастіших урологічних патологій у чоловіків. Статистичні дані свідчать про те, що у однієї третини чоловіків у віці старше 50 років спостерігались симптоми LUTS на протязі життя і 25 % з них потрібне хірургічне втручання. Відсоток чоловіків, які страждають від ВРН/LUTS, досягає більш 90 % на 9 десятку життя. В Федеративній Республіці Німеччини близько 4 мільйонів пацієнтів отримують лікування по вказаному комплексу симптомів протягом року. В зв'язку зі збільшенням середньої тривалості майбутнього життя і погіршенням загального стану здоров'я популяції, очікується зростання частоти даної патології в майбутньому (R.B. Moreland et al., J.Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 308, 797). Не дивлячись на суттєву клінічну важливість ВРН/LUTS, етіологія і патогенез вказаних захворювань до теперішнього часу є недостатньо вивченими. Вважається, що окрім похилого віку, ендогенна продукція андрогенів також є важливим фактором, що привертає, у розвитку ВРН. Таким чином, вважається, що BPH є ендокринною патологією чоловіків, що старіють, яка є наслідком перестроювання гормонального фону зі збільшенням віку. З гістологічної точки зору, BPH являє собою доброякісний ріст епітелія та стромальних компонентів передміхурової залози. Оскільки передміхурова залоза розташована в урерті, близько до початкового відділу сечовипускального каналу, при її збільшенні з'являються ознаки обструкції сечовипускальних шляхів, які супроводжуються такими симптомами, як поллакіурія, ніктурія, відчуття неповного спорожнення січового міхура і відстроченого сечовипускання. Результатом застою сечі на пізніх стадіях може бути розвиток ниркової недостатності та уремії. Крім того, в результаті застою сечі і розширення сечовипускального тракту, може розвиватися абактеріальний простатит, супутні інфекції і інфекції, що рецидивують, сечостатевого тракту, які також сприяють розвитку порушень сечовипускання на додаток до обструк тивного компонента. Окрім статистичного компонента, що обумовлений збільшенням передміхурової залози, і механічних порушень сечовипускання, у патогенезі ВРН/ LUTS присутній і динамічний компонент, який пояснюється підвищеним тонусом гладкої мускулатури. Вираженість кожного з вказаних компонентів може суттєво варіювати від пацієнта до пацієнта. Це пояснює той факт, що між розміром передміхурової залози і вираженістю симптомів є лише несуттєва кореляція (C.G. Roehbrom and DA Schwinn, J. Urol. 2004, 171, 1029). По суті, аналогічні зміни тонусу гладкої мускулатури беруть участь в патогенезі інших захворювань нижніх відділів сечовипускальних шляхів, в тому числі і у жінок, таких, як стресове нетримання сечі, невідкладне нетримання сечі і захворювання, пов'язані з спорожненням січового міхура. В той час, коли термін BPH стосується гістологічного або макроскопічного діагнозу гіперплазії передміхурової залози, супутній термін LUTS, який об'єднує такі стани, як поллакіурія та ніктурія, а також неповне або відстрочене сечовипускання, відіграє більш важливу роль для самих пацієнтів. Існує безліч способів лікування ВРН, від тактики "чекай і спостерігай" ("насторожене спостерігання") до відкритої простатектомії. Завдяки своїй ефективності, трансуретальна резекція передміхурової залози, яка здійснюється у Німеччині приблизно 33500 чоловікам щорічно, вважається золотим стандартом хірургії. Однак, оскільки будьяке інвазійне втручання супроводжується ризиком летального результату, і його неможливо здійснити у більшості пацієнтів, особливо у пацієнтів з невеликим ступенем ВРН, необхідно шукати нові підходи до лікування з використанням лікарських засобів. Окрім фітофармацевтичних препаратів, які звичайно використовуються на ранніх стадіях захворювання, існує безліч лікарських засобів, до яких належать, головним чином, 1-антагоністи і інгібітори 5--редуктази (Е. Koch, Planta Med. 67, 489-500 (2001)). Застосування 1-антагоністів засноване на спостереженні, що динамічний компонент ВРН/LUTS обумовлений підвищеним тонусом гладких м'язів передміхурової залози, який опосередковується підсиленим викидом норадреналіна в синоптичних кінцях нейронів. На даний час повністю доведено, що у передміхуровій залозі головним чином експресуються 1А-адренорецептори і 1Dадренорецептори. Результати клінічних досліджень показують, що застосування блокаторів рецепторів призводить до суттєвого зменшення симптомів і сприяє відновленню сечовипускання з максимальним потоком сечі. Однак, на даний час не існує переконливих доказів на користь того, що 5 вказані лікарські засоби перешкоджають подальшому збільшенню передміхурової залози. Однак, блокатори -рецепторів мають ряд побічних ефектів, до яких належать головокружіння, головні болі, слабкість, ортостатичний колапс, риніт і сексуальна дисфункція (ретроградна еяколяція), котрі обумовлені, головним чином, впливом -блокаторів на рецептори ЦНС та серцево-судинної системи. Отримання підкласів специфічних блокаторів рецепторів, які переважно інгібують а1Аадренорецептори і 1D-адренорецептори, дозволить зменшити частоту виникнення і тяжкість вказаних побічних ефектів. Однак, неселективний 1антагоніст алфузозин такий самий сприятливий профіль побічних ефектів, як і тамсулозин, який вважається уроселективним блокатором 1рецепторів. Окрім фармакодинамічних властивостей, великий внесок в уроселективність препарату вносять також його фармакокінетичні властивості. Отже, наприклад, вплив на артеріальний тиск можна попередити шляхом введення менших доз препарату або шляхом використання композицій з уповільненим вивільненням засобу. Крім того, в регуляції артеріального тиску окрім 1Bрецепторів, беруть участь 1A-рецептори (R.B. Moreland et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 797,204; C.G. Roehrborn and D.G. Schwinn, J. Urol. 171, 1029, 2004), що обмежує можливості отримання уроселективних блокаторів -рецепторів. В цілому, BPH розвивається в присутності біологічно активних чоловічих статевих гормонів. В дійсності, BPH ніколи не спостерігається у чоловіків, яким було здійснено кастрацію у віці до 40 років, або у яких андрогени в передміхуровій залозі не синтезуються або синтезуються в недостатній кількості в результаті гіпофункції гіпофізу. Аналогічно, нормальний розвиток передміхурової залози і розвиток BPH не відбувається у тому випадку, коли існує спадковий дефект або відсутні рецептори до андрогенів (наприклад, у випадку синдрому тестикулярної фемінізації). З біологічної точки зору найбільш важливим андрогеном є дигідротестостерон (DHT від англ., Dihydrotestosteron), який утворюється із тестостерону при дії 5-редуктази. Оскільки DHT головним чином стимулює ріст епітеліальних компонентів при ВРН, пригнічення росту або атрофія залізистого компоненту може бути досягнута за рахунок інгібування 5-редуктази. Однак, стромальний компонент BPH не підлягає впливу зовсім. Наприклад, введення інгібітору 5редуктази фінастерида призводить до зменшення концентрації простатичного DHT аж до 85 %, в той час як середнє зменшення розміру передміхурової залози складає тільки 20 % і відбувається протягом, щонайменше, 12 місяців. Даний ефект є клінічно значущим тільки в тому випадку, коли на початок лікування об'єм передміхурової залози перевищує 40 мл. Не зважаючи на те, що андрогени відіграють ключову роль у нормальному розвитку і функціонування передміхурової залози, а також у розвитку ВРН, недостатньо одних тільки чоловічих статевих гормонів для росту клітин передміхурової залози. У безлічі експериментальних дослідів було пока 94434 6 зано, що стимулюючий ефект андрогенів на ріст клітин in vivo опосередковується локальним синтезом факторів росту, а дифузія паракринного або аутокринного механізму за контролем росту епітеліальних і стромальних компонентів передміхурової залози відіграє суттєву роль в розвитку ВРН. На даний час в передміхуровій залозі ідентифіковано безліч факторів росту [EGF], альфатрансформуючий фактор росту- [TGF-], TGF-, основний фактор росту фібробластів (bFGF), фактор росту кератиноцитів [KGF], фактор росту нервів [nGF], інсуліноподібний фактор росту І [IGF-І]. Оскільки BPH дуже часто супроводжується запальною реакцією, яка відіграє важливу роль в патогенезі захворювання, фактор росту тромбоцитів (PDGF), що секретується, наприклад, фібробластами, тромбоцитами і лейкоцитами, можливо, є особливо важливим фактором для проліферації клітин передміхурової залози (C.J. Vlahos et al., J. Cell Biochem. 52, 404-413 (1993)). Фактори росту здійснюють свою біологічну дію шляхом зв'язування з специфічними рецепторами на поверхні клітин, які володіють суттєвою тирозинкіназною активністю. Після зв'язування з лігандом у внутріклітинних доменах рецепторів відбувається фосфорування залишків тирозину, що запускає послідовний каскад внутріклітинних реакцій. Серед вказаних реакцій необхідно відмітити стимулювання синтезу білка і ДНК, а також активацію проліферації клітин. Отже, вважається, що на основі інгібіторів тирозинкінази можна отримати лікарські засоби, які будуть ефективними для лікування захворювань, що супроводжуються підвищеною проліферацією клітин (наприклад, ракових захворювань, атеросклерозу, псоріазу) (A. Levitzki and A. Gazit? Science, 1782-1788 (1995)). Однак, на даний час мало уваги приділяється вказаному механізму дії в світі лікування ВРН. За останні роки в різноманітних епідеміологічних дослідженнях було показано, що між ВРН/ LUTS і частотою еректильної дисфункції (ED, від англ. Erectile Dysfunction) існує тісна кореляція. Наприклад, в дослідженні MSAM-7 було показано, що розповсюдження ED у чоловіків без LUTS у віці від 50 до 80 років складає приблизно 25 %. Даний показник зростає у пацієнтів, що мають важкі симптоми, аж до 80 %. Крім того, частота виникнення ED зростає з появою інших супутніх захворювань, таких як гіпертензія, діабет, гіперхолестеринемія, стенокардія і депресія (М. Shabbir et al., Curr. Med. Res. Opin. 20, 603, 2004). Розслаблення пеніса головним чином опосередковується зв'язуванням норадреналіну з 1Aрецепторами і 1B-рецепторами в печеристих тілах. Тому не дивно, що у чоловіків з ED, що отримували терапію -блокаторами, відмічається покращення сексуальної функції (наприклад, терапію доксазозином або тамсулозином). На противагу цьому, ерекція головним чином опосередковується судинорозширювальною дією оксиду азоту (NO). NO вивільняється з нітрергічних нейронів і додатково синтезується ендотеліальними клітинами печеристих тіл і губчатого тіла. За рахунок стимуляції гіанілатциклази і збільшення синтезу cGMP, NO не викликає релаксації гладком'язових клітин. 7 Таким чином, за рахунок комбінованого 1антагоністичної і 2-антагоністичної дії, NO вважається найбільш сприятливим агентом для лікування ED, оскільки інгібування 1-рецепторів безпосередньо призводить до м'язової релаксації, а інгібування пресинаптичних 2-рецепторів супроводжується посиленим вивільненням NO із нітрергічних нейронів (http://www.bioportfolio.com/ leaddiscoverv/mdi002.ritrn). Революційним в лікуванні ED стало відкриття препарату силденафіл, інгібітора PDE5, який інгібує деградацію cGMP. Однак, силденафіл має безліч побічних ефектів (таких як головний біль, порушення зору, дисперсія, гемодинамічні ефекти). Крім того, існують докази на користь того, що ефективність препарату зменшується зі збільшенням тривалості лікування (М. Shabbir et al., Curr. Med. Res. Opin. 20, 603, 2004). Крім того, приблизно у 30 - 60 % пацієнтів силденафіл не може використовуватися через важкості захворювання і наявності протипоказань. На даний час немає більшого клінічного досвіду по застосуванню нових PDE5 інгібіторів. Такаож для лікування ED активною сполукою є PDE1, однак, його необхідно вводити безпосередньо в уретру. Друга можливість лікування ED полягає в застосуванні апоморфіну, який є агоністом допаміну в центральній нервовій системі. Його можна використовувати для лікування відносно легких випадків ED. Не зважаючи на те, що даний препарат має відносно мало побічних ефектів (нудота, реакції зі сторони серцевосудинної системи), його сублінгвальне застосування, що направлене на те, щоб уникнути першого етапу метаболізму печінки, на даний час вважається несприятливим (R.B. Moreland et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 308, 797). Таким чином, залишається необхідність у пошуку ефективних лікарських засобів для лікування ED, котрі мають мало побічних ефектів. В публікації 1999 року дослідники зі здивуванням повідомляють про те, що кількість жінок з сексуальною дисфункцією значно перевищує кількість чоловіків з даною проблемою (приблизно 31 %) в США (Е.О. Laumann et al., JAMA 281, 537, 1999). В цілому, сексуальну дисфункцію у жінок класифікують на чотири основні категорії: знижений сексуальний потяг або статева аверсія, знижена сексуальна збудливість, болісний статевий акт (вагінізм, диспарейнія) і порушення оргазму. Вказані порушення спостерігаються в наступних відсоткових співвідношеннях: ЗО % (знижений сексуальний потяг), 20 % (знижена сексуальна збудливість), 10 - 15 % (порушення оргазму), хоча між усіма вказаними варіантами існує тісний взаємозв'язок. Регулярна сексуальна функція у чоловіків і у жінок контролюється за допомогою ряду циклічних процесів, які включають: ментальне очікування (сексуальний потяг), ефективне кровонаповнення судин (ерекція у чоловіків, набухання клітора і зволоження піхви у жінок), оргазм і кінцеве розслаблення. Уся вказана послідовність подій забезпечує збалансованою дією парасимпатичної і симпатичної нервової системи. Ключовим моментом є кровонаповнення судин статевих органів. Оскільки існує аналогія між пенісом та клітором, завдяки 94434 8 схожій анатомічній структурі і іннервації печеристих тіл, вважається, що ті фармакологічні механізми, які застосовуються для лікування еректильної дисфункції у чоловіків, можуть бути ефективними і для лікування сексуальних порушень у жінок, особливо, пов'язаних зі зниженою сексуальною збудливістю. Таким чином, метою даного винаходу є створення лікарських засобів, які позитивно впливають на динамічний і статистичний компонент BPH за рахунок інгібування 1-адренорецепторів і 2адренорецепторів і за рахунок інгібування опосередкованої факторами росту проліферації епітеліальних і стромальних клітин і тому є ефективними для лікування BPH синдрому, LUTS, ED і інших сексуальних розладів у чоловіків і жінок, а також гіперхолестеринемії, функціональних розладів сечового міхура, серцево-судинних захворювань і больових станів. Згідно з даним винаходом поставлена мета здійснюється за рахунок використання екстрактів кори рослин роду Corynanthe, краще, рослин виду Corynanthe pachyceras, для лікування і профілактики захворювань нижнії відділів сечовипускальних шляхів у чоловіків і жінок (наприклад, доброякісної гіперплазії передміхурової залози, LUTS, карциноми передміхурової залози, порушень випорожнення сечового міхура, затримки сечі, стресового нетримання сечі і невідкладного нетримання сечі), сексуальних розладів у чоловіків і жінок (наприклад, імпотенції, еректильної дисфункції, передчасної еяколяції, порушень лібідо, фригідності і аноргазмії), порушень ліпідного обміну (наприклад, гіперхолестеринемії, гіперліпідемії, гіпертригліцеридемії), захворювань серцево-судинної системи (наприклад, дисфункції ендотелія, гіпертонії, атеросклерозу або рестенозу після вазодилятації або операцій шунтування), а також гострих і хронічних больових станах, таких як мігрень, нейропатичні болі (наприклад, у випадку цукрового діабету), фантомні болі в кінцівках, аллодинія, болі після пошкодження тканин або у випадку запальних захворювань (наприклад, постгерпетична невралгія). Іншим об'єктом даного винаходу є екстракти рослин роду Corynanthe, краще, рослин виду Corynanthe pachyceras, які мають збалансоване співвідношення ефективних компонентів, а також лікарські засоби і харчові продукти, що призначені для лікування і профілактики захворювань нижніх відділів сечовипускальних шляхів, сексуальних розладів, порушень ліпідного обміну, серцевосудинних захворювань, а також гострих і хронічних больових станах, котрі характеризуються вмістом екстракту, що заявлено згідно з даним винаходом, а також фармацевтичні композиції для перорального, парентерального або місцевого застосування. Використаний тут термін «харчовий продукт» належить до дієтичного харчового продукту, дієтичної харчової добавки, а також до лікарських харчових добавок і дієтичних харчових добавок. Corynanthe pachyceras (род. Маренові) - це дерево висотою 15 - 20 м з діаметром стовбура до 60 см, що росте у вічнозелених вологих тропічних лісах у Східній Африці (від Сьєрра-Ліоне до Заїра). 9 94434 10 Деревина звичайно використовується для будівництва, а також для отримання цементу і штукатурки. Висушена кора широко використовується у традиційній медицині. Кору жують при застуді і використовують у формі відвару при лепрі, розладах шлунку, діареї або порушень зі сторони серцево-судинної системи і нирок. Кору заварюють як чай і застосовують в якості антипиретичного агента у випадку малярії, і в якості афродизіаку і засобу, що розслаблює. Кора дерева Corynanthe pachyceras містить приблизно 6 % індоалкалоїдів, які поділяють на наступні групи: алкалоїди коріантеїну (наприклад, дигідрокориантеїн, кориантеїн, кориантеідин) або алкалоїди йохимбіну (наприклад, кориантин, йохимбін). Для певних алкалоїдів корианти значення має їх антагоністична активність по відношенню до -адренорецепторів. Крім того, описується їх активність по відношенню до лейшманів і плазмодію малярії з помірною цитотоксичністю (D. Staerk et al., Planta Med. 2000, 66, 531, 2000). В заявці на патент від 1971 року розкривається антигіпертензивна і седативна дія водного розчину сухого екстракту кори дерева виду Cojynanthe pachyceras (ВЕ758049, Omnium Chimique SA, 1971). Авторами даного винаходу зі здивуванням було виявлено, що спиртові або кетонові, краще водно-спиртові екстракти кори дерев роду Corynanthe, а саме дерева роду Corynanthe pachyceras, володіють багатьма додатковими біологічними ефектами, включаючи інгібування клітинної проліферації, ендотеліо-залежна властивість розширювати судини, властивість знижувати рівень холестерину, анальгетичний і антиоксидантний ефект, окрім антагоністичної дії по відношенню до 1-адренорецепторів і 2-адренорецепторів. Зазначений широкий спектр біологічних ефектів дозволяє припустити, що дані екстракти можуть використовуватися для лікування різноманітних захворювань. До даних захворювань належать ВРН, LUTS, сексуальні розлади у чоловіків і жінок, функціональні розлади сечовипускання, гіперхолестеринемія, атеросклероз, дисфункція ендотелію і больові стани. Ефективність екстрактів, що заявлені згідно з даним винаходом, по відношенню до перелічених захворювань, підтверджується представленими нижче фармакологічними дослідами. В даних дослідах доводиться, що для ефективності екстрактів, що заявлені згідно з даним винаходом, необхідна наявність у їх складі поліфенолів як активних інгредієнтів на додаток до алкалоїдів. Таким чином термін «поліфеноли» належить до ароматичних сполук, які мають щонайменше дві гідроксильні групи, які можуть бути присутні у мономерній, олігомерній або полімерній формі. Екстракти, що містять обидві групи сполук, мають перевагу по відношенню до ізольованих екстрактів дерев роду Corynanthe pachyceras, завдяки сукупному ефекту зазначених сполук. Екстракти кори дерева роду Corynanthe pachyceras, що заявлені згідно з даним винаходом 11 94434 12 і містять поліфеноли і алкалоїди, можуть бути отримані за допомогою наступного способу: (a) екстрагування сухої і подрібненої кори дерева роду Corynanthe органічним розчинником або водою або сумішшю одного або більше органічного розчину і/або води при температурі від 10C до 100°С; (b) відділяння екстрагованого рослинного матеріалу від розчину, що екстагує, наприклад, за допомогою фільтрації; (c) за необхідністю, повторне екстрагування рослинного матеріалу за допомогою розчинника згідно з пунктом (а) з наступною сепарацією згідно з пунктом (b); (d) об'єднання екстрагованих розчинів, отриманих на етапах (b) і (с); (e) випарювання і висушування об'єднаного розчину, отриманого на етапі (d), з отриманням сухого екстракту. Кращими органічними розчинниками, які можуть використовуватися на етапі (а), є спирти, кетони, при цьому із спиртів в кращому варіанті використовується етанол. В найкращому варіанті киуористовувати суміш спирту і води. При здійсненні екстракції на етапі (а) необхідно брати до уваги можливість додаткового здійснення вилужування і фільтрації. Згідно з загальним правилом етап (с) здійснюється одноразово, однак змінення етапу (с) або багаторазове повторення також можливе. Висушування на етапі (е) може здійснюватися за допомогою будь-якого відомого способу, такого як ліофілізація або висушування у вакуумі при кімнатній або підвищеній температурі. Дерево Corynanthe pachyceras застосовується як найкращий представник роду Corynanthe. Екстракті кори дерева роду Corynanthe, що заявлені згідно з даним винаходом, містять як поліфеноли, так і алкалоїди у співвідношенні, що є необхідним для оптимального використання. Тому, вміст поліфенолів в кращом варіанті складає щонайменше 15 %, в більш кращому варіанті щонайменше24 %, а вміст алкалоїдів в кращому варіанті складає щонайменше 8 %, в найкращому щонайменше 12 %. Типовими поліфенолами, які були виділені авторами даного винаходу з дерева виду Corynanthe pachyceras, є епікатехін, процианідин В2 і процианідин Cl Звичайно, поліфеноли Corynanthe pachyceras не обмежуються трьома зазначеними сполуками. Вміст окремих поліфенолів визначають шляхом встановлення загального вмісту поліфенолів за допомогою методу Фоліна-Чикальтеу. Додатково або альтернативно можна визначити також вміст епікатехіна, процианідина В2 і процианідина C1 Вміст зазначених алкалоїдів є сумою кількостей окремих алкалоїдів коринантину, -йохимбіну, коринантеїну, дигідрокоринантеїну і коринантеїну. Екстракти і фракції екстрактів, що заявлені згідно з даним винаходом, можуть вводитися у формі крапель, порошку, гранул, таблеток, що вкриті оболонкою (драже) або капсул, найкраще перорально. Однак, можливим є парентеральне введення у формі розчину для ін'єкцій або місцеве введення у формі крема, мазі, супозиторіїв, пластирів або аналогічних лікарських форм. Для отримання таблеток екстракт змішують з підходящим фармацевтично доступним адїювантом, таким як лактоза, целюлоза, двооксид силікону, кроскармелоза і стеарат магнію, і пресують в таблетки, які можуть при необхідності мати покриття, що складається, наприклад, з гідроксимети 13 94434 лпропілцелюлози, поліетиленгліколя, барвників (таких як двооксид титану, оксид заліза) і талька. Екстракти, що щаявлені згідно з даним винаходом, також можуть бути включені до складу капсул, можливо, при додаванні ад'ювантів, таких як стабілізатори, наповнювачі і т.ін. Щоденно вводиться доза екстракту, що складає від 5 до 2000 мг, краще від 10 до 1000 мг, і найкраще від 50 до 500 мг. Ефективність екстрактів кори дерева роду Corynanthe pachyceras, що заявлені згідно з даним винаходом, підтверджується в експериментах, що описані нижче. Фармакологічні дослідження Дослідження властивості зв'язуватися з адренорецепторами Дослідження взаємодій екстрактів дерева Corynanthe і фракцій зазначених екстрактів з адренорецепторами здійснюють за допомогою аналіза рецепторного зв'язування з використанням з використанням мембран клітин головного мозку щурів. Для отримання клітинних мембран, щурів чоловічої статі лінії Спраг-Доулі (150-250 г) умеертвляють CO2 наркозом, після чого видаляють головний мозок (без мозочка). Після видалення крові, що згорнулася, і мозкових оболонок об'єм головного мозку Спраг-Доулі зменшується у десять разів за допомогою льодяного гомогенізуючого буфера (50мМ Tris-НСІ, рН 7.4) і гомогенізують в охолодженому на льоді гомогенізаторі. Клітинний гомогенат центрифугують протягом 10 хвилин при 50000 g (4°С) і осад вдруге суспендують в льодяному буфері, що гомогенізує. Після додаткового центрифугування (10 хвилин при 4C і 50000 д) клітинні мембрани промивають за допомогою буфера, що зв'язує (50мМ Tris-HCI, 0,5 мМ ЕДТА, 0,01 % аскорбінова кислота, 10 мкМ парп'лин, рН 7.4) і зберігають порціями (1 мл) при - 80°С. Екстракти, що заявлені згідно з даним винаходом, або їх алкалоїдні або поліфенольні фракції розчиняють за допомогою DMSO в 150 мкл зв'язу 14 ючого буфера і інкубують разом з 50 мкл мембран клітин головного мозку (2,5 мг/мл білка) і 50 мкл радіоактивного ліганда у зв'язуючому буфері протягом 45 хвилин при кімнатній температурі. Для дослідження взаємодій з 1-адренорецепторами в 3 якості радіоактивного ліганда використовують Нпразозин (300 пМ, специфічна активність 80 Кі/ммоль). Неспецифічне зв'язування вимірюють в 3 присутності 2 мкМ фентоламіну. Н-клонідин (1 мкМб специфічна активність 55,5 Кі/ммоль) використовують у якості радіолиганда для визначення зв'язування з 2-дренорецепторами. Дослідження неспецифічного зв'язування з 2дренорецепторами здійснюють в присутності 10мкМ йохмбіну. Реакційні суміші послідовно фільтрують через скловолоконний фільтр (тип GF/B), який попередньо обробляють поліетилениміном (0,2 % дист. вода) протягом ночі. Потім фільтри двічі відмивають за допомогою 3 мл льодяного зв'язуючого буфера, після чого висушують протягом 24 годин при 60°С. Визначення радіоактивності зв'язування здійснюють після переноса фільтрів в 4 мл сцинтиляційної рідини (безпечний фільтр Zinsser-Anaiytik) в бета-лічильнику. Відсоток інгібу3 вання специфічного зв'язування Н-празозину з а13 адренорецепторами або Н-клонідину з 2дренорецепторами розраховують по відношенню до контролю, який аналізують паралельно. Половину максимальної концетрації, що інгібує (величини IC50) розраховують за допомогою нелінійного розрахунку регресії. Результати дослідження представлені в Таблиці 1. Очевидно, що екстракт кори дерева роду Corynanthe, заявлений згідно з даним винаходом, 3 інгібує зв'язування H-празозину з 13 адренорецепторами і Н-клонідину з 2дренорецепторами, даний ефект загалом обумовлений присутністю алкалоїдів. Таблиця 1 Інгібування зв'язування Н-празозина з 1-адренорецепторами 3 і H-клонідина з 2-дренорецепторами, відповідно 3 3 3 Інгібування зв'язування Н-празозина і Н-клонідина (половина максимальної концентації, що інгібує, ІС50) 1-зв'язування 2- зв'язування Екстракт, заявлений згідно з даним винаходом (Приклад 1) Поліфенольна фракція (Порівняльний Приклад 1) Алкалоїдна фракція (Порівняльний Приклад 2) 0,8 мкг/мл 2,1 мкг/мл 10 мкг/мл немає інгібування 10 мкг/мл немає інгібування 0,05 мкг/мл 1 мкг/мл Дослідження інгібування клітинної проліферації, що опосередкована факторами росту Вплив екстрактів в цілому і їх окремих фракцій на клітинну проліферацію, індукований факторами росту, вивчають на фібробластах лінії NIN-3T3 мишів. Клітини культивують в середовищі Ігла, що модифіковане по Дульбекко (DMEM)1 збагаченого 10 % фетальною телячою сироваткою (FCS), 2мМ глутаміну і розчином антибіотика/антимікотика. Культиваційне середовище регулярно заміняють двічі на тиждень. Через 4 дні після останнього пересіву, адгезовані клітини відкрепляють від поверхні колби для культивування клітин за допомогою розчину трипсин/ЕДТА і суспендують при щільнос 15 94434 ті 50000 клітин на мл в DMEM, що збагачена 0,5 % FCS. Потім клітини переносять в об'ємі 200 мкл на лунку на планшети для мікротитрування (F-форма) і інкубують при 37C протягом 96 годин. Після заміщення середовища (DMEM без FCS) і додавання сполук через 60 хвилин додають рекомбінантний людський фактор росту тромбоцитів BB (PDGFBB) і концентрації 10 нг/мл. Потім клітини культивують знову протягом 24 годин при 37C в інкубаторі. За 6 годин до збирання клітин в кожну лунку 3 додають 0,5 мкКі метил- Н-тимідину. По закінченні періоду інкубації планшети для мікротитрування центрифугують протягом 5 хвилин при 400 д, а клітинний супернатант акуратно збирають піпеткою. Клітини відкріплюють від поверхні колби за 16 допомогою розчину трипсин/ЕДТА, а потім збирають на скловолоконних фільтрах (тип G-10, ІСН201) за допомогою клітинного колектора (lnotech). 3 Включення Н-тимідину в нові синтезовані ДНК визначають за допомогою лінійного аналізатора (LB 2842, Berthold). Інгібування клітинної проліферації в присутності екстрактів та їх фракцій визначають при порівнянні з контролем, який аналізують паралельно у кожному випадку. Результати дослідження представлені в Таблиці 2. Отримані результати демонструють, що екстракти, які заявлені згідно з даним винаходом, володіють властивістю інгібувати клітинну проліферацію, при цьому даний ефект обумовлений головним чином поліфенольною фракцією. Таблиця 2 Інгібування PDGF-індукованої проліферації NIN-3T3 фібробластів Половина максимальної концентрації, що інгібує Екстракт, заявлений згідно з даним винаходом (Приклад 1) Поліфенольна фракція (Порівняльний Приклад 1) Алкалоїдна фракція (Порівняльний Приклад 2) Дослідження ефекту судинорозширення Для вивчення ефекту судинорозширення екстактів і їх фракцій, що заявлені згідно з даним винаходом, досліджують їх вплив на скорочення ізольованої аорти щурів лініі Спраг-Доулі (Janvier, Le Genest, France). Одразу ж після діставання органи переносять у розчин Тірода (в мМ: NaCI 118,2; NaHCO3 24,8; KCI 4,6; CaCI2 2,5; MgSO41,2; KH2PO4 1,2; глюкоза 10) і залишають для очищення від сполучної тканини. Потім готують судинні кільця завтовшки 4 мм. Для окремих експериментів видаляють ендотелій. Для цього кільця аорти розміщують на стальній конюлі, обережно здавлюють на канюлі, при цьому найвнутрішній шар видаляється шляхом обертання з наступним просуванням у повздовжньому напрямку. Кільця аорти фіксують у чані для органів (20 мл; Hugo Sachs, Hugstetten), що заповнений розчином Тірода, за допомогою металічних гачків. Середовище для культивування (37°С) постійно насичують вуглецем (рН 7,4). В експериментах по визначенню розширення судин, попередньо звужених фенілефрином (PE), до розчина Тірода поступово додають наступні сполуки: пропанолол-НСІ (6мкМ, RBI), кортікостерон- HCI (6 мкМ, Sigma) і дезипрамін (0,6 мкМ, Sigma). Для експериментів по визначенню розширення судин після стимуляції за допомогою U-46619 додають індометацин (2,8 мкМ, Sigma). Тиск органів вимірюють ізометрично за допомогою силового трансдуктора (Statham UC2, Hugo Sachs) під попереднім навантаженням 1,0 г і реєструють за допомогою 4-канального записуючого пристрою (Linearcorder, Graphtec). Після фази врівноважування протягом 30 хвилин домагаються чотирьох скорочень за допомогою PE (0,15 мкг/мл, EK 0,74 мкМ) з інтервалом у 15 хвилин для досягнення належного скорочення органів. Після четвертого додавання PE, додають сполуки, що тестуються, в зростаючих концентраціях до досягнення концент 5,4 мкг/мл 3,0 мкг/мл 12,2 мкг/мл раційного максимуму (кумулятивний ефект). В кінці експерименту залежність розширення судин від ендотелію тестують шляхом введення ацетилхоліну (0,25 мкг/мл, EK 1,38 мкМ). Аналогічний експеримент здійснюють також для вивчення ефекту, який розслаблює, на кільця аорти без ендотелія. Після фази врівноважування протягом 30 хвилин, домагаються трьох скорочень за допомогою PE (0,15 мкг/мл, EK 0,74 мкМ). Після досягнення максимального скорочення після третього введення PE наносять ацетилхолін (0,25 мкг/мл, EK 1,38 мкМ), щоб підтвердити повне видалення ендотелію. Після вимивання ацетилхоліну, через 25 хвилин індукують скорочення за допомогою PE і додають сполуку, що тестується, у зростаючих концентраціях. Аналіз ефекту, що розслаблює, після індукованого скорочення U-46619 (0,022 мкг/мл, EK 0,063 мкМ) або KCI (3 мкг/мл, EK 40 мкМ) здійснюють аналогічно тому, як і при використанні PE. Ефект, що розслаблює, екстрактів по відношенню до антагоністів визначають у відсотках. Величини ІС50 визначають за допомогою нелінійного регресивного аналізу кривих концентрація-ефект за допомогою програми Prism 3.0 (GraphPad Software Inc.). Результати експерименту показані в таблиці, що представлена нижче. Отримані дані свідчать про те, що ефект судинорозширення екстрактів, що заявлені згідно з даним винаходом, після стимуляції PE, здійснюють як алкалоїдні фракції, так і фракції, що не містять алкалоїдів. Розслаблюючий ефект фракції, що не містить алкалоїдів, повністю залежить від наявності інтактного ендотелію. Ефект судинорозширення даної фракції, що залежить від ендотелію, також можна замінити після попереднього скорочення судинних кілець U-46619 або КСІ-деполяризації, очевидно, він заснований на підвищеному викиданні NO клітинами ендоте 17 94434 лію. На противагу цьому, ефект алкалоїдних фракцій головним чином заснований на присутності інгредієнтів, що володіють -блокуючими власти 18 востями, і тому спостерігається і після видалення ендотелію. Таблиця 3 Дослідження ефекту судино розширення Розширення судин, PE-скорочення, інтактний ендотелій Екстракт, заявлений згідно з даним винаходом (Приклад 1) Поліфенольна фракція (Порівняльний Приклад 1) Алкалоїдна фракція (Порівняльний Приклад 2) Розширення судин, PE-скорочення, ендотелій видалений Розширення судин, KCI-скорочення, інтактний ендотелій ED50: Розширення судин, U-46619скорочення, інтактний ендотелій 25 мкг/мл ED50: 0,7 мкг/мл 6,3 мкг/мл 74% 61% ED50: 25 мкг/мл ED50: 25 мкг/мл 16 мкг/мл неактивна 16 мкг/мл 25% ED50: ED50: 25 мкг/мл 25 мкг/мл 0,22 мкг/мл 0,23 мкг/мл 15% неактивна Вивчення анти-гіперхолестеринемічного ефекту Ефект екстрактів, що заявлені згідно з даним винаходом, на рівень холестерину в плазмі, вивчають на мишах лінії NMRI (Janvier, Le Genest, France) з гіперхолестеринемією, що індукується введенням розчину Triton WE-1339. Мишей тримають в стандартних умовах (21C, 60% відносної вологості, 12/12 годинний цикл зміни дня і ночі), вони мають вільний доступ до води та гранульованої їжі (Altromin 1324). Triton WE-1339 (400 мг/кг, Sigma) розчиняють в фізіологічному розчині і вводять тваринам в каудальну вену (10мг/кг). Для перорального введення тваринам, що тестуються, екстракт розчиняють в 0,2 % суспензії агару і вводять за 24 години і 1 годину до ін'єкції розчину Triton WE-1339, а також через 6 годин після ін'єкції через зонд (450 мг/кг в 10 мл/кг). Тваринам із контрольної групи водять тільки носій (0,2 % агар, 10 мл/кг). За годину до введення розчину Triton WE1339, а також через 6 годин, 24 години і 48 годин після ін'єкції, у мишей з каудальної вени забирають зразки крові (32 мкл) за допомогою гепаринизованого катетера і терміново заміряють рівень холестерину (Reflotron, Boehringer Mannheim). На Фіг. 1 показано вплив перорального введення екстракту (450 мг/кг), що заявлено згідно з даним винаходом, на рівень холестерину у мишей з Triton WE-1339-індукованої гіперхолестеринемією (# означає Р