Пептиди, що біологічно не розкладаються; інгібітор ангіотензинперетворювального ферменту, лікарський засіб і функціональний харчовий продукт

1. Пептид, що не перетравлюється in vivo, який має Pro на карбоксильному кінці, вибраний з групи, яка складається з Ile-Pro, Glu-Pro, Arg-Pro, Gln-Pro, Met-Pro і Ser-Pro-Pro. 2. Інгібітор ангіотензинперетворювального ферменту, що включає як активний інгредієнт пептид, що не перетравлюється in vivo, який має Pro на карбоксильних кінцях, вибраний з групи, яка складається з Ile-Pro, Glu-Pro, Arg- Pro, Gln-Pro, Met-Pro i Ser-Pro-Pro або їх солей. 3. Лікарський засіб, який має гіпотензивний ефект, що включає інгібітор ангіотензинперетворювального ферменту за п. 2. 4. Функціональний харчовий продукт, який має гіпотензивний ефект, що включає інгібітор ангіотензинперетворювального ферменту за п. 2. (19) UA (21) a200602217 (22) 30.07.2004 (24) 10.07.2009 (86) PCT/JP2004/010929, 30.07.2004 (31) 2003-285007 (32) 01.08.2003 (33) JP (46) 10.07.2009, Бюл.№ 13, 2009 р. (72) ЯМАМОТО НАОЮКІ, JP, МІЗУНО СЕЙІТІ, JP, НІСІМУРА СІНГО (ПОМЕР), JP, ГОТОУ ТАКАНОБУ, JP, МАЦУУРА КЕЙІТІ, JP (73) КАЛПІС КО., ЛТД., JP (56) BALA M. ET AL.: 'Novel peptidomimics as angiotensin-converting enzyme inhibitors: a combinatorial approach' BIOORG.MED.CHEM. vol. 10, 2002, pages 3685 - 3691. HELLBERG S. ET AL.: 'Minimum analogue peptide sets (MAPS)for quantitative structure-activity relantionships' INT.J.PEPT.PROTEIN RES. vol. 37, 1991, pages 414 - 424. GOMAZKOV Q.A. ET AL.: 'Biochemical and physiological activity of novel peptide inhibitors of angi' BYULL.EKSP.BIOL.MED. vol. 222, 1996, pages 279 - 281. HARRIS R.B. ET AL.: 'Dipeptide-hydroxamates are good inhibitors of the angiotensin I-converting enzyme' BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN. vol. 116, 1983, pages 394 - 399. C2 2 (11) 1 3 87278 4 (Хаа може бути будь-якою амінокислотою) з Pro на ність по відношенню до ангіотензин перетворювакарбоксильних кінцях, є такими, що не переварюльного ферменту (скорочено позначеному тут далі як АСЕ), гіпотензивний ефект, антибактерійна акються в живому організмі і здатні ефективно здійстивність, ефект солюбілізації кальцію і імуномодунювати свої функції в живому організмі. Автори люючий ефект, і ці пептиди використовуються в винаходу також виявили, що серед дипептидів і харчових продуктах і лікарських засобах. трипептидів, що мають такі послідовності, ті, які АСЕ перетворює попередник, ангіотензин І в мають визначені послідовності, є особливо чудоангіотензин II, який має судинозвужувальну активвими в інгібуючій АСЕ активності або подібних ність в живих організмах, підіймаючи в результаті властивостях, завершивши тим самим даний винахід. кров'яний тиск. Таким чином, очікується, що пептиди, які мають інгібуючу АСЕ активність, надають Згідно з даним винаходом запропонований пептид, що не переварюється in vivo, який має Pro на гіпотензивну дію, інгібуючи АСЕ, щоб придушити карбоксильному кінці, вибраний з групи, яка склаутворення ангіотензину II в живому організмі. Про дається з Ilе-Pro, Glu-Pro, Arg-Pro, GIn-Pro, Met-Pro такі пептиди, що мають інгібуючу АСЕ активність, повідомлялося в багатьох публікаціях, включаючи i Ser-Pro-Pro. Згідно з даним винаходом запропонований танаступні патентні публікації 1-3. кож інгібітор АСЕ, який містить як активний інгредіОскільки пептиди вбираються через травний тракт в кров, щоб здійснити свої функції в живому єнт пептид, що не переварюється in vivo, який має організмі, очікується, що пептиди, які не переваPro на карбоксильному кінці, вибраний з групи, яка рюються in vivo, будуть володіти такими перевагаскладається з Ilе-Рrо, Glu-Pro, Arg-Pro, GIn-Pro, ми, як висока абсорбованість і резистентність до Met-Pro i Ser-Pro-Pro або їх солей. переварювання різними травними ферментами в Згідно з даним винаходом запропонований ліживому організмі. Наприклад, в патентній публікакарський засіб або функціональний харчовий проції 4 указано, що пептиди з низькою молекулярною дукт, які володіють гіпотензивним ефектом, що вагою, що складаються, головним чином, з дипепвключають інгібітор АСЕ. тидів і трипептидів і мають середню довжину ланЗгідно з даним винаходом запропоноване тацюга не більше 3, мають чудову кишкову абсорбокож застосування інгібітору АСЕ при отриманні ваність. Однак, невідомо в деталях, які пептиди функціонального харчового продукту або лікарсьсприяють посиленню резистентності до переварюкого засобу, що володіє гіпотензивним ефектом. Оскільки пептиди, що не переварюються in вання in vivo. vivo, згідно з даним винаходом є дипептидами або Таким чином, бажана розробка пептидів, які трипептидами, що мають особливі послідовності з мають високу абсорбованість і резистентність до переварювання в живому організмі і здатні ефекPro на карбоксильних кінцях, дані пептиди є такитивно виявляти корисні функції, такі як інгібуючу ми, що високо абсорбуються і погано переварюються в живому організмі, і очікувано ефективно АСЕ активність в живому організмі. виявляють такі функції, як гіпотензивний ефект, в Патентна публікація 1: JP-2-62828-A Патентна живому організмі. публікація 2: JP-3-120225-A Патентна публікація 3: Оскільки інгібітор АСЕ згідно з даним винахоJP-6-40944-A Патентна публікація 4: JP-5-252979дом містить як активний інгредієнт вищезгадані A пептиди, що не переварюються in vivo, очікується, Мета даного винаходу - запропонувати нові що даний інгібітор ефективно виявляє інгібіторну пептиди, що не переварюються in vivo, які є висоактивність по відношенню до АСЕ в живому оргакоабсорбованими і такими, що погано переварюнізмі. ються в живому організмі, коли вони вводяться Оскільки лікарський засіб і функціональний перорально або іншим шляхом, і, приблизно, будуть ефективно виявляти такі функції як гіпотензихарчовий продукт згідно з даним винаходом місвний ефект в живому організмі. тять інгібітор АСЕ, очікується, що даний лікарський засіб і функціональний харчовий продукт ефективІнша мета даного винаходу - запропонувати інно виявляють гіпотензивний ефект в живому оргагібітор ангіотензин перетворювального ферменту, нізмі. що містить як активні інгредієнти пептиди, що не Фіг.1 являє собою графік, що показує резульпереварюються in vivo, які є високоабсорбованими тати оцінки in vivo абсорбованості і резистентності абсорбуються і погано переварюються в живому до переварювання Хаа-Рrо і Xaa-Pro-Pro, здійснеорганізмі і ефективно виявляють інгібуючу активної в посилальному прикладі 1. ність по відношенню до ангіотензин перетворюваДаний винахід буде тепер пояснений детальльного ферменту І в живому організмі. но. Пептид, що не переварюється in vivo, згідно з Ще одна мета даного винаходу - запропонувати лікарський засіб або функціональний харчовий даним винаходом є дипептидом або трипептидом, продукт, що містить як активні інгредієнти пептиди, що має Pro на карбоксильному кінці, який складається з, щонайменше, одного з Ile-Pro, Glu-Pro, що не переварюються in vivo, які є високоабсорбоArg-Pro, GIn-Pro, Met-Pro i Ser-Pro-Pro. ваними і погано переварюються в живому організмі і ефективно виявляють гіпотензивний ефект в Термін "пептид, що не переварюється in vivo", живому організмі. в рамках даної заявки, означає дипептид Хаа-Рrо Автори даного винаходу в ході інтенсивних або Хаа-Рrо-Рrо, що має Pro на карбоксильному досліджень з'ясували, що серед дипептидів і трикінці, який має високу резистентність до перевапептидів, що мають хорошу абсорбованість in vivo, рювання in vivo пептидазами, коли він вбирається пептиди, які мають дипептидну послідовність Хааз кишечнику в живому організмі. Рrо або трипептидну послідовність Хаа-Рrо-Рrо 5 87278 6 вним ефектом, відмінні від активних інгредієнтів Пептид, що не переварюється in vivo, згідно з даним винаходом може бути отриманий, наприданого інгібітору АСЕ. клад, з відповідних амінокислот звичайним органіІнгібітор АСЕ згідно з даним винаходом може чним синтезом або подібними методами. Альтербути використаний шляхом підмішування в функнативно даний пептид може бути також ціональний харчовий продукт, такий як харчові отриманий, наприклад, розкладанням харчового продукти для певного дієтичного застосування, протеїну, такого як казеїн тваринного молока, вимагаючого гіпотензивного ефекту. Приклади шляхом ферментації молочнокислими бактеріями такого харчового продукту можуть включати напої, з подальшим очищенням або гідролізом харчового йогурт, рідкий харчовий продукт, желе, цукерки, продукт для приготування в автоклаві, цукерки в протеїну ферментативним методом з належним таблетках, печиво, коржики з опарного тіста, хліб, поєднанням протеїназ і пептидаз, з подальшим бісквіти і шоколад. Інгібітор може бути також ввеочищенням. Метою очищення є виділення дипептиду або дений в капсули або таблетки для використання як трипептиду, і воно може являти собою концентрахарчова домішка. цію і очищення відповідною комбінацією методів Приклади очищення для підвищення концентрації пептиду. Даний винахід буде тепер пояснений більш Казеїном молока тварин може бути, напридетально з посиланнями на приклади, які є тільки клад, казеїн з коров'ячого молока, кінського молоілюстративними і не призначені для обмеження ка, козячого молока і овечого молока, причому даного винаходу. коров'яче молоко є особливо переважним. Приклад 1 Інгібітор АСЕ згідно з даним винаходом місЗ числа пептидів, що мають послідовність тить як активні інгредієнти пептиди, що не переваХаа-Рrо або Хаа-Рrо-Рrо, присутню в казеїні корорюються in vivo, які мають Pro на карбоксильних в'ячого молока, Ilе-Рrо, Glu-Pro, Arg-Pro, Gln-Pro, кінцях, і що складаються, щонайменше, з однієї з Met-Pro і Ser-Pro-Pro були синтезовані хімічно послідовностей Ilе-Рrо, Glu-Pro, Arg-Pro, GIn-Pro, (зроблені Toray Research Center, Inc., чистотою не Met-Pro і Ser-Prp-Pro, тобто пептиди, що не перенижче за 85%). Були приготовані розчини кожного з цих пептидів з різними концентраціями, і виміряварюються in vivo, згідно з даним винаходом або їх на інгібіторна активність по відношенню до АСЕ солі. відповідно до методу, обговореного нижче. КонцеСіллю пептиду переважно є фармацевтично нтрація пептиду (мкМ), при якій ефект інгібування прийнятна сіль, така як солі неорганічної кислоти, що включають гідрохлорид, сульфат або фосфат, АСЕ становила 50%, був прийнятий за величину або органічної кислоти, що включають ацетат, ІС50. Результати показані в таблиці 1. або тартрат. АСЕ, отриманий з бичачої легені (вироблений Інгібітор АСЕ згідно з даним винаходом може Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), розчиняли в необов'язково містити різні допоміжні домішки для поліпшення балансу поживних речовин або смаку. 0,1М боратному буфері при pH 8,3 в кількості 0,1 Приклади таких допоміжних домішок можуть од., щоб отримати розчин АСЕ. 80 мкл розбавлевключати різні вуглеводи, ліпіди, вітаміни, мінераного розчину, отриманого розведенням 5 мг/мл ли, підсолоджувачі, смакові агенти, пігменти і порозчину кожного пептиду, показаного в таблиці 1, ліпшувачі текстури. дистильованою водою згідно з величиною ІС50 для Кількість інгібітору АСЕ для використання моданого пептиду, 200 мкл 5мМ розчину гіпурилже переважно бути вибрана в залежності від виду гістидил-лейцину (зробленого SIGMA), що містить пептидів і їх солей, що містяться у вигляді актив300 мМ NaCl, і 20 мкл розчину АСЕ, приготованого них інгредієнтів, і не особливо лімітована. Наприяк вказано вище, вводили в пробірку і давали проклад, коли інгібітор АСЕ додають до функціональреагувати при 37°С протягом 30 хвилин. ного харчового або подібного продукту для Після цього реакцію переривали доданням 250 регулярного використання людиною, кількість інгімкл 1н хлористоводневої кислоти (виробленої бітору з розрахунку на пептиди може переважно Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Потім додаскладати приблизно від 0,01 до 100 мг/кг за один вали 1,7 мл етилацетату (вироблений Wako Pure прийом без конкретної верхньої межі. Chemical Industries, Ltd.) і перемішували. 1,4 мл Для використання в лікарському засобі, що етилацетатного шару відбирали, вміщували в іншу надає гіпотензивний ефект, інгібітор АСЕ згідно з пробірку і випарювали при 120°С протягом приданим винаходом може бути введений в композиблизно 60 хвилин, щоб отримати висушений процію з фармацевтично прийнятним носієм в різних дукт. Висушений продукт розчиняли в 1 мл дистидозувальних формах відповідно до звичайних мельованої води і вимірювали оптичну густину при тодів. Наприклад, для твердої композиції для пе228 нм екстрагованої етилацетатом гіпурової кисрорального введення даний інгібітор може бути лоти. Як контроль вимірювали оптичну густину змішаний з носієм, і, необов'язково, зв'язуючим, розчину без розбавленого розчину і розчину без розпушувачем, лубрикантом, барвником, коректорозбавленого розчину і без розчину АСЕ. З отриром смаку, коректором аромату або подібним, як маних даних по оптичній густині розраховували потрібно, і приготований в формі таблеток, таблеінгібіторну активність до АСЕ відповідно до настуток з покриттям, гранул, порошків, капсул і т.п. пної формули: Інгібіторна активність до АСЕ (%) = Такий лікарський засіб може необов'язково мі[(А-В)/А]х100 стити інші компоненти, такі як пептиди, що володіють інгібіторною активністю до АСЕ або гіпотензи 7 87278 8 А: (оптична густина розчину без розбавленого пептидів, які мають послідовність Хаа-Рrо і Xaaрозчину, але з розчином АСЕ) -(оптична густина Pro-Pro, присутню в казеїні, аналізували абсорбцію розчину без розбавленого розчину і розчину АСЕ) пептидів в кров після перорального введення у В: (оптична густина розчину з розбавленим щурів, як описано нижче. розчином і розчином АСЕ) - (оптична густина розДвом щурам SD (Sprague Dawley) шеститижчину з розбавленим розчином, але без розчину невого віку вводили перорально 500 мг/тварина АСЕ) кожної Val-Pro-Pro, як приклад Xaa-Pro-Pro, і GlyGly, як дипептид, що не має Pro. Проби крові відТаблиця 1 бирали з ворітної вени з інтервалами, і визначали абсорбцію кожного пептиду в кров. Результати показані на Фіг.1. Послідовність пептидів Величина ІС50 (мкМ) Фіг.1 підтверджує, що Gly-Gly легко переварюIIе-Рrо 443,9 ється in vivo, так що детектується Gly, в той час як Glu-Pro 74,7 Val-Pro-Pro вбирався в кров відносно стабільно. З Arg-Pro 275,2 цих результатів можна чекати, що дипептиди і Gln-Pro 65,8 трипептиди, які мають послідовності Хаа-Рrо і XaaMet -Pro 135,3 Pro-Pro, відповідно, виявляють високу абсорбоваSer-Pro-Pro 44,5 ність і резистентність до переварювання в живому організмі. Таким чином, прийнято, що IIе-Рrо, GluПорівняльний приклад 1 Pro, Arg-Pro, GIn-Pro, Met-Pro i Ser-Pro-Pro згідно з організмі. Для того щоб оцінити абсорбованість і резистентність до переварювання в живому організмі Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601