Антитіло для лікування ракових захворювань, при яких експресується клаудин 6

Реферат: Винахід належить до антитіл, здатних зв’язуватися з CLDN6, асоційованим з поверхнею клітини, яка експресує CLDN6 та не спроможних зв’язуватися з CLDN9, асоційованим з поверхнею клітини, яка експресує CLDN9, кон’югату, що включає зазначене антитіло, фармацевтичної композиції, способу інгібування, знищення та способу лікування та/або запобігання захворювань, пов'язаних із клітинами, у яких експресується CLDN6, включаючи захворювання, пов'язані з утворенням пухлин. UA 115969 C2 (12) UA 115969 C2 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В останнє десятиліття антитіла успішно впроваджуються в клінічну практику для застосування при лікуванні раку; вони є найбільш багатообіцяючим терапевтичним засобом в онкології. У порівнянні зі звичайними лікарськими засобами для лікування раку терапевтичні методи, засновані на антитілах, мають потенційно більш високу специфічність і менший спектр побічних ефектів, оскільки антитіла точно розрізняють нормальні й неопластичні клітини і їх дія ґрунтується на менш токсичних імунологічних протипухлинних механізмах, наприклад активації комплементу й мобілізації цитотоксичних клітин імунної системи. Клаудини - це інтегральні мембранні білки, які розташовуються в місцях щільних контактів між епітелієм і ендотелієм. Вважається, що в клаудиновій молекулі є чотири трансмембранні сегменти із двома позаклітинними "петлями", а N- і С-кінці знаходяться у цитоплазмі. Трансмембранні білки родини клаудинів (CLDN) відіграють ключову роль у підтриманні щільних контактів між епітелієм і ендотелієм, а також, можливо, беруть участь у підтриманні цитоскелету та у клітинних сигнальних механізмах. Експресія цих білків суттєво відрізняється у нормальних клітинах і в пухлинних, що, з огляду на їхню мембранну локалізацію, робить їх привабливою мішенню імунотерапії раку; застосування терапевтичних методів, заснованих на антитілах, для прицільного впливу на клаудини при лікуванні раку обіцяє високу специфічність терапевтичного впливу. Однак клінічне застосування терапевтичних впливів, націлених на клаудини, зустрічається з рядом перешкод. У силу повсюдної присутності клаудинів в організмі та їх важливої ролі в підтримуванні щільних контактів необхідна висока специфічність націлених на клаудини терапевтичних впливів, щоб забезпечити максимальну специфічність лікування й звести до мінімуму системну токсичність. Публікація WO 2009/087978 відноситься до антитіл, спрямованих проти калудина-6 і їх застосування як протиракових агентів. Зокрема описуються моноклональні антитіла, позначені AB3-1, AE1-16, AE49-11 і AE3-20. Однак, як показав аналіз методом флуоресцентноактивованого клітинного сортування (FACS), описаний у прикладі 5, жодне із цих антитіл не було специфічним у відношенні до клаудина-6. Антитіла AE3-20 взаємодіяли з CLDN9, тоді як антитіла AE1-16 і AE49-11 проявляли значну реактивність у відношенні CLDN9 і також взаємодіяли з CLDN4. Міцність зв'язування антитіл AB3-1 з CLDN6 була такою ж, як з CLDN9. У прикладі 7 описується, що введення антитіл AE49-11 мишам з модельними пухлинами пригнічувало пухлинний ріст і подовжувало життя. Але з урахуванням неспецифічності використаних у цьому прикладі антитіл залишається неясним, чи дійсно ефект, що спостерігався, був обумовлений зв'язуванням цих антитіл з CLDN6. Таким чином, дотепер не були описані антитіла, специфічні у відношенні до CLDN6, які б вибірково зв'язувалися з поверхнею клітин, у яких експресується CLDN6. А для тих терапевтичних впливів, які ґрунтуються на антитілах націлених на CLDN6, потрібні саме специфічні антитіла. Показане на Фігурі 1 порівняння амінокислотних послідовностей CLDN3, CLDN4, CLDN6 і CLDN9 демонструє високу консервативність CLDN6 відносно інших клаудинів. Високий ступінь гомології CLDN6 з іншими клаудинами, особливо з CLDN9 і CLDN4, і той факт, що в роботі WO 2009/087978 не вдалося одержати антитіла, специфічні до CLDN6, змушують припускати, що неможливо одержати антитіла, які специфічно зв'язуються з CLDN6. Розкриття винаходу Описані в даному документі результати експериментів підтверджують, що у людини CLDN6 експресується в різних ракових клітинах, тоді як у нормальних тканинах його експресія обмежена плацентою. У даному винаході вперше описується успішне одержання антитіл, специфічних у відношенні до CLDN6 і здатних зв'язуватися з поверхнею інтактних клітин, у яких експресується CLDN6. Дослідження інтактних клітин, у яких експресується CLDN6, методом флуоресцентноактивованого клітинного сортування (FACS) продемонструвало специфічне зв'язування антитіл проти CLDN6 у той час як у випадку клітин, у яких експресуються інші клаудинові білки, зокрема CLDN3, CLDN4 та CLDN9, або клітин, у яких не утворюються жоден із цих білків, зв'язування взагалі не спостерігалося. Таким чином, цей винахід несподівано показав, що можна одержати антитіла, які специфічно взаємодіють з CLDN6 на поверхні клітин, у яких експресується CLDN6, але, які не проявляють істотної реактивності у відношенні до інших високогомологічних клаудинів як антигенів. Загалом, цей винахід пропонує антитіла, які будуть корисними як терапевтичні засоби для лікування й/або запобігання захворюванням, при яких відіграють ту або іншу роль клітини, що експресують CLDN6, у яких CLDN6 зв'язаний з їхньою клітинною поверхнею, включаючи захворювання, які супроводжуються утворенням пухлин, зокрема рак, наприклад рак яєчника, у 1 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тому числі аденокарциному яєчника й тератокарциному яєчника, рак легенів, у тому числі дрібноклітинний рак легенів (SCLC) і недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), особливо плоскоклітинну карциному легенів і аденокарциному, рак шлунка, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема базальноклітинну карциному й плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови й шиї, у тому числі злоякісну поліморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому й карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідноклітинну карциному й папілярну карциному, рак нирок, зокрема нирково-клітинну карциному, включаючи світлоклітинну нирково-клітинну карциному й папілярну нирково-клітинну карциному, рак товстого кишківника, рак тонкого кишківника, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкого кишківника й аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, хоріокарциному плацентарної ділянки, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка й ембріональний рак яєчка, рак матки, герміногенні пухлини, наприклад тератокарциному або ембріональну карциному, зокрема герміногенну пухлину яєчка та їх метастазуючі форми. Один з варіантів даного винаходу відноситься до антитіл, які здатні зв'язуватися з CLDN6, асоційованим з поверхнею клітин, у яких експресується CLDN6. Бажано, ці антитіла не здатні в основному зв'язуватися з CLDN9, асоційованим з поверхнею клітин, у яких експресується CLDN9. Бажано, ці антитіла не здатні в основному зв'язуватися з CLDN4, асоційованим з поверхнею клітин, у яких експресується CLDN4 і/або не здатні в основному зв'язуватися з CLDN3, асоційованим з поверхнею клітин, у яких експресується CLDN3. Найбільш бажано, ці антитіла не здатні зв'язуватися ні з яким іншим клаудином, крім CLDN6, асоційованим з поверхнею клітин, у яких експресується зазначений клаудин і є специфічними у відношенні до CLDN6. Бажано, зазначені клітини, у яких експресується зазначений клаудин, є інтактними, зокрема з непорушеною проникністю клітинної мембрани, і зазначений клаудин, асоційований з поверхнею клітини, має нативну конформацію тобто не є денатурованим. Бажано, ці антитіла здатні зв'язуватися з одним або більше епітопами CLDN6 у їх нативній конформації. В одному із втілень даного винаходу запропоновані антитіла здатні зв'язуватися з епітопом, який перебуває у межах позаклітинної частини CLDN6, причому зазначена частина CLDN6 бажано містить яку-небудь амінокислотну послідовність із поміж наступних: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 15, бажано амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 7, більш бажано амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6. Бажано, запропоновані антитіла здатні зв'язуватися з епітопом, який перебуває у межах однієї із наступних амінокислотних послідовностей: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 15, бажано амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 7. В одному із втілень даного винаходу запропоновані антитіла здатні зв'язуватися з CLDN6 шляхом взаємодії із щонайменше одним, бажано більш ніж з одним, наприклад із двома, трьома, чотирма або п'ятьма, бажано з усіма амінокислотними залишками, обраними із групи, яка складається з Thr33, Phe35, Gly37, Ser39, Ile40 і Leu151, бажано шляхом взаємодії із щонайменше одним, бажано з більше ніж одним, бажано з усіма амінокислотними залишками, обраними із групи, яка складається з Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 і Ile40, більш бажано шляхом взаємодії із щонайменше одним, бажано з більше ніж одним, бажано з усіма амінокислотними залишками, обраними із групи, яка складається з Phe35, Gly37, Ser39 і Ile40, або, яка складається з Thr33, Phe35, Gly37 і Ser39, і особливо шляхом взаємодії із щонайменше одним, бажано більше ніж з одним, бажано з усіма амінокислотними залишками, обраними із групи, яка складається з Phe35, Gly37,і Ser39. Бажано, запропоновані антитіла не взаємодіють із одним або більше, бажано всіма амінокислотними залишками, обраними із групи, яка складається з Glu154, Ala155, Arg158 і Gly161, і бажано не взаємодіють із одним або більше, бажано всіма амінокислотними залишками, обраними із групи, яка складається з Arg158 і Gly161. Взаємодію між антитілами й CLDN6, зокрема в його нативній конформації, можна вивчити шляхом мутагенезу на основі сканування аланіном. Мутантні CLDN6 можна характеризувати виходячи з їх здатності зв'язуватися зі специфічними моноклональними антитілами. Порушення зв'язування специфічного моноклонального антитіла з мутантним CLDN6 дозволяє вважати, що амінокислотний залишок, за яким мала місце мутація, важливий для контакту з антитілом. Визначати зв'язування можна, наприклад шляхом проточної цитометрії. В одному втіленні даного винаходу запропоновані антитіла одержують способом, який передбачає стадію імунізації тварини пептидом з амінокислотною послідовністю, яка є будьякою з поміж наступних: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 15, кращою амінокислотною послідовністю є SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 7 або імунологічно еквівалентний пептид, або нуклеотидна послідовність, або клітина-хазяїн, у якій експресується зазначений пептид. 2 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В інших втіленнях даного винаходу CLDN6, з яким здатне зв'язуватися запропоноване антитіло, має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8. Особливо бажано, щоб запропоноване антитіло було здатне зв'язуватися з CLDN6, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, і з CLDN6, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає щонайменше одну, бажано дві, більш бажано всі три послідовності CDR (області, які визначають комплементарність) із послідовності важкого ланцюга антитіла, обрані з поміж SEQ ID NO: 34, 36, 38 і 40 або їх варіантів. На Фігурі 25 послідовності CDR у згаданих вище послідовностях важкого ланцюга антитіла виділені квадратною рамочкою. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає послідовність CDR3 Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, де Xaa1 представляє будь-яку амінокислоту, бажано ароматичну амінокислоту, більш бажано Phe або Tyr, найбільш бажано Tyr, Xaa2 представляє будь-яку амінокислоту, бажано ароматичну амінокислоту, більш бажано Phe або Tyr, найбільш бажано Tyr, і Xaa3 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Leu або Phe, більш бажано Leu. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає послідовність CDR3 Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 або Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, де Xaa1, Xaa2 і Xaa3 представляють амінокислоти, зазначені вище. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає послідовність CDR3 Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, де Xaa1, Xaa2 і Xaa3 представляють амінокислоти, зазначені вище. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає послідовність CDR3 Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, де Xaa1, Xaa2 та Xaa3 представляють амінокислоти, зазначені вище. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло у зазначених вище втіленнях містить послідовність CDR1, яка відповідає SEQ ID NO: 47 або її варіанту, і/або послідовність CDR2, яка відповідає SEQ ID NO: 48 або її варіанту. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає послідовність із антитільного важкого ланцюга, обрану з поміж SEQ ID NO: 34, 36, 38 і 40 або їх варіантів. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, який включає щонайменше одну, бажано дві, більш бажано всі три послідовності CDR із послідовності легкого ланцюга антитіла, обрані з поміж SEQ ID NO: 35, 37, 39 і 41 або їх варіантів. На Фігурі 26 послідовності CDR у згаданих вище послідовностях легкого ланцюга антитіла виділені квадратною рамочкою. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, який включає послідовність CDR3 Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, де Xaa1 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Ser або Asn, найбільш бажано Ser, Xaa2 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Tyr, Ser, Ile, Asn або Thr, більш бажано Tyr, Ser або Asn, найбільш бажано Asn, і Xaa3 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Ser або Tyr, більш бажано Tyr. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, який включає послідовність CDR3 Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, де Xaa1, Xaa2 і Xaa3 представляють амінокислоти, зазначені вище. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить легкийланцюг, який включає послідовність CDR3 Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, де Xaa1, Xaa2 і Xaa3 представляють амінокислоти, зазначені вище. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло, відповідно до зазначених вище втілень, містить легкий ланцюг, який включає послідовність CDR1, яка відповідає SEQ ID NO: 52 або її варіанту, і/або послідовність CDR2, яка відповідає SEQ ID NO: 53 або її варіанту. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить легкий ланцюг, який включає послідовність легкого ланцюга антитіла, обрану з поміж SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 54 і 55 або їх варіантів. У різних втіленнях даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, як зазначено вище, і легкий ланцюг, як зазначено вище. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає щонайменше одну, бажано дві, більш бажано всі три послідовності CDR із послідовності важкого ланцюга антитіла SEQ ID NO: x або її варіанта, і (ii) легкий ланцюг, який включає щонайменше одну, бажано дві, більш бажано всі три послідовності CDR легкого ланцюга антитіла SEQ ID NO: x+1 або її варіанта; де x вибирають з поміж 34, 36, 38 і 40. На Фігурах 25 і 26 відповідно зазначені послідовності CDR у згаданих вище послідовностях важкого й легкого ланцюгів антитіла виділені квадратними рамочками. 3 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає послідовність CDR3, обрану із групи, яка складається з Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp і Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, де Xaa1 представляє будь-яку амінокислоту, бажано ароматичну амінокислоту, більш бажано Phe або Tyr, найбільш бажано Tyr, Xaa2 представляє будь-яку амінокислоту, бажано ароматичну амінокислоту, більш бажано Phe або Tyr, найбільш бажано Tyr, і Xaa3 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Leu або Phe, більш бажано Leu. (ii) легкий ланцюг антитіла, який включає послідовність CDR3, обрану із групи, яка складається з Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, де Xaa1 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Ser або Asn, найбільш бажано Ser, Xaa2 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Tyr, Ser, Ile, Asn або Thr, більш бажано Tyr, Ser або Asn, найбільш бажано Asn, і Xaa3 представляє будь-яку амінокислоту, бажано Ser або Tyr, більш бажано Tyr. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло відповідно до одного зі згаданих вище втілень містить: (i) важкий ланцюг антитіла, яке включає послідовність CDR1, що відповідає SEQ ID NO: 47 або її варіанту і/або послідовність CDR2, що відповідає SEQ ID NO: 48 або її варіанту і/або (ii) легкий ланцюг антитіла, який включає послідовність CDR1, що відповідає SEQ ID NO: 52, або її варіанту і/або послідовність CDR2, що відповідає SEQ ID NO: 53, або її варіанту. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга, обрану з поміж SEQ ID NO 34, 36, 38 і 40 або їх варіантів, бажано SEQ ID NO: 36 або її варіанту, і (ii) легкий ланцюг, який включає послідовність легкого ланцюга антитіла, обрану з поміж SEQ ID NO 35, 37, 39, 41, 54 і 55 або їх варіантів, бажано SEQ ID NO: 35 або її варіанту. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO: 36 або її варіант, і (ii) легкий ланцюг, який включає послідовність легкого ланцюга антитіла, обрану з поміж SEQ ID NO 35, 54 і 55 або їх варіантів. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO: 36 або її варіант, і (ii) легкий ланцюг, який включає послідовність легкого ланцюга антитіла, обрану з поміж SEQ ID NO 54 і 55 або їх варіантів. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO: 36 або її варіант, і (ii) легкий ланцюг, який включає послідовність легкого ланцюга антитіла SEQ ID NO 35 або її варіант. В одному із втілень даного винаходу запропоноване антитіло містить: (i) важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO: х або її варіант, і (ii) легкий ланцюг, який включає послідовність легкого ланцюга антитіла SEQ ID NO х+1 або її варіант, де х вибирають з поміж 34, 36, 38 і 40. У кращих втіленнях даного винаходу запропоноване антитіло містить важкий ланцюг, який включає константну область гамма-1 важкого ланцюга, бажано константну область гамма-1 важкого ланцюга антитіла людини, наприклад таку послідовність, як SEQ ID NO: 25, і/або містить легкий ланцюг, який включає константну область каппа легкого ланцюга антитіла, бажано константну область каппа легкого ланцюга антитіла людину, наприклад таку послідовність, як SEQ ID NO: 27. У кращих втіленнях даного винаходу запропоновані антитіла мають одну або більше із наступних активностей: (i) знищують клітини, у яких експресується CLDN6, (ii) інгібують проліферацію клітин, у яких експресується CLDN6, (iii) інгібують утворення колоній клітинами, у яких експресується CLDN6, (iv) опосередковують ремісію, тобто зменшення розмірів, бажано повну ремісію, тобто повне зникнення сформованих пухлин (v) запобігають утворенню або відновленню раніше існуючих пухлин і (vi) пригнічують метастазування клітин, у яких експресується CLDN6. Відповідно, антитіла запропоновані даним винаходом можна застосовувати для досягнення одного або більше з поміж вищевказаних явищ, зокрема при введенні пацієнтові. Знищення клітин і/або інгібування однієї або більше з поміж їх активностей 4 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна використовувати в терапевтичних цілях, як описано в даному документі. Зокрема, знищення клітин, інгібування проліферації клітин і/або інгібування утворення колоній клітин можна використовувати для лікування або запобігання раку, включаючи утворення метастазів. Інгібування проліферації, утворення колоній і/або метастазування клітин можна використовувати, зокрема, для лікування або запобігання утворенню метастазів при раку й метастатичного поширення ракових клітин. Бажано антитіла запропоновані даним винаходом опосередковують знищення клітин, викликаючи лізис, опосередкований комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC), лізис, опосередкований антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (ADCC), апоптоз, гомотипичну адгезію й/або фагоцитоз, бажано викликаючи лізис, опосередкований комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC), і/або лізис, опосередкований антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (ADCC). Даний винахід також включає втілення, у яких запропоновані антитіла проявляють свої описані тут активності, наприклад знищення клітин і/або інгібування однієї або більше клітинних активностей, наприклад проліферації клітин і/або утворення колоній, не викликаючи лізис, опосередкований комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC), лізис, опосередкований антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (ADCC), апоптоз, гомотипову адгезію й/або фагоцитоз. Так, антитіла запропоновані даним винаходом можуть виявляти свою дію просто зв'язуючись із CLDN6 на клітинній поверхні й у такий спосіб блокуючи, наприклад, проліферацію клітин. В одному із втілень даного винаходу запропоновані антитіла не викликають лізис клітин, опосередкований комплемент-залежною токсичністю. Бажано лізис, опосередкований антитілозалежною клітинною цитотоксичністю, відбувається в присутності ефекторних клітин, які в конкретних втіленнях даного винаходу вибирають із групи, яка складається з моноцитів, мононуклеарних клітин, NК-клітин (природних кілерів) і поліморфноядерних лейкоцитів (PMN), а фагоцитоз здійснюється макрофагами. Активність, яка полягає в інгібуванні або зменшенні проліферації клітин, у яких експресується CLDN6, бажано ракових клітин, можна виміряти in vitro, визначаючи проліферацію ракових клітин, у яких експресується CLDN6, за допомогою аналітичного методу з використанням бромдезоксиуридину (5-бром-2-дезоксиуридину, BrdU). Бромдезоксиуридин є синтетичним нуклеотидом, який є аналогом тимідину, який може включатися в новосинтезовану ДНК реплікованої клітини (під час S-фази клітинного циклу), заміщаючи собою тимідин у процесі реплікації ДНК. Визначаючи кількість включеного бромдезоксиуридину, наприклад за допомогою специфічних до нього антитіл, можна виявити клітини, у яких відбувається активна реплікація ДНК. Активність, яка полягає в інгібуванні або скороченні утворення колоній клітинами, у яких експресується CLDN6, бажано ракових клітин, можна виміряти in vitro за допомогою клоногенного тесту. Клоногенний тест – це мікробіологічний метод для вивчення ефективності впливу різних агентів на життєздатність і проліферацію клітин. Його часто використовують в онкологічних дослідженнях для визначення впливу лікарських препаратів і опромінення на пухлинні клітини, що розмножуються. Такий експеримент включає три основні етапи: (i) здійснення досліджуваного впливу на зразок клітин, зокрема ракових клітин, (ii) висівання клітин у посуд для культивування тканини й (iii) ріст клітин. Колонії, що утворюються, фіксують, фарбують і підраховують. Утворення колоній є важливим, оскільки воно зв'язане зі здатністю окремих пухлинних клітин, заселяти органи, формуючи метастази. Інгібуюча активність антитіл щодо утворення колоній відбиває їхню потенційну ефективність в інгібуванні метастазів. Антитіла, які проявляють таку активність, тобто такі, що здатні інгібувати або скорочувати утворення колоній у клоногенному тесті, є особливо корисними для лікування або запобігання метастазам і метастатичного поширення ракових клітин, зокрема тих типів, які обговорюються в даному документі. У кращих втіленнях даного винаходу запропоновані антитіла проявляють одну або більше імуноефекторних функцій проти клітин, які несуть CLDN6 у його нативній конформації, причому ця одна або більше ефекторні функції бажано вибираються із групи, яка складається з комплемент-залежної цитотоксичності (CDC), антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (ADCC), індукції апоптоза й інгібування проліферації; кращими ефекторними функціями є антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність і/або комплементзалежна цитотоксичність. Бажано зазначені одна або більше активності або одна або більше імуноефекторні функції, які проявляються зазначеними антитілами індукуються зв'язуванням зазначених антитіл з CLDN6, бажано з епітопом, розташованим у межах позаклітинної частини CLDN6, причому зазначена позаклітинна частина CLDN6 бажано містить будь-яку амінокислотну послідовність з поміж наступних: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 15, кращою є 5 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 7, більш кращою є амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 6. Відповідно до даного винаходу клітини, у яких експресується CLDN6, бажано відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею. Клітини, у яких експресується CLDN6 або клітини, які несуть на своїй поверхні CLDN6 у його нативній конформації, бажано є пухлинними клітинами, наприклад раковими клітинами, бажано раковими клітинами при ракових захворюваннях, обраних із групи, яка складається з раку яєчника, у тому числі аденокарциноми яєчника й тератокарциноми яєчника, раку легенів, у тому числі дрібноклітинного раку легенів (SCLC) і недрібноклітинного раку легенів (NSCLC), особливо плоскоклітинної карциноми легенів і аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови й шиї, у тому числі злоякісної поліморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідноклітинної карциноми й папілярної карциноми, раку нирок, зокрема нирково-клітинної карциноми, включаючи світлоклітинну нирково-клітинну карциному і папілярну нирково-клітинну карциному, раку товстого кишківника, раку тонкого кишківника, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкого кишківника й аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, хоріокарциноми плацентарної ділянки, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка, раку матки, герміногенних пухлин, наприклад тератокарциноми або ембріональної карциноми, зокрема герміногенної пухлини яєчка та їх метастазних форм. До антитіл запропонованих даним винаходом можна приєднувати один або більше терапевтичних ефекторів, наприклад радіоактивні мітки, цитотоксини, ферменти терапевтичного призначення, агенти, які викликають апоптоз тощо, щоб забезпечити прицільну цитотоксичність, тобто знищення пухлинних клітин. В одному із втілень даного винаходу запропоновані антитіла (i) зв'язуються із клітинами, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 асоційований із клітинною поверхнею й (ii) не зв'язуються із клітинами, у яких не експресується CLDN6 і в яких немає CLDN6, асоційованого із клітинною поверхнею. Антитіла запропоновані даним винаходом бажано (i) опосередковують знищення й/або інгібують проліферацію клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 асоційований із клітинною поверхнею, і (ii) не опосередковує знищення й/або не інгібує проліферацію клітин, у яких експресується CLDN6 і в яких немає CLDN6, асоційованого із клітинною поверхнею. У найкращому втіленні даного винаходу запропоновані антитіла зв'язуються з нативними епітопами CLDN6, що знаходяться на поверхні живих клітин, наприклад з послідовністю SEQ ID NO: 6 або 7. В інших кращих втіленнях даного винаходу запропоновані антитіла є специфічними щодо ракових клітин, у яких експресується CLDN6 і не зв'язуються з раковими клітинами, у яких не експресується CLDN6. Антитіла запропоновані даним винаходом можна одержати з різних видів живих організмів, включаючи (тут перераховані не обмежуючі приклади) мишу, пацюка, кролика, морську свинку й людину. Антитіла запропоновані даним винаходом включають також гібридні молекули, у яких константна область, яка походить від одного виду живих організмів, бажано людини, об'єднана з ділянкою зв'язування антигену, яка походить від іншого виду. Також антитіла запропоновані даним винаходом включають гуманізовані молекули, у яких ділянки зв'язування антигену, який не походить від людини, об'єднані з константними й каркасними областями людського походження. Антитіла запропоновані даним винаходом включають поліклональні й моноклональні антитіла й антитіла IgG2а (наприклад, IgG2a, κ, λ), IgG2b (наприклад, IgG2b, κ, λ), IgG3 (наприклад, IgG3, κ, λ) і IgМ. Але інші ізотипи антитіл теж входять у даний винахід, включаючи IgG1, IgАl, IgА2, секреторний IgА, Igd, IgЕ. запропоновані антитіла можуть бути повнорозмірними антитілами або ж їх антиген зв′язувальними фрагментами, включаючи, наприклад, Fab, F(ab') 2, Fv, одноланцюгові фрагменти Fv або біспецифічні антитіла. Крім того, антиген зв′язувальні фрагменти, включають зв′язувальний домен гібридних імуноглобулінів, який містить (i) поліпептид, який формує зв′язувальний домен (наприклад, варіабельна область важкого ланцюга або варіабельна область легкого ланцюга) який з'єднаний з поліпептидом, який утворює шарнірну область імуноглобулінової молекули, (ii) константна область СН 2 важкого ланцюга імуноглобуліну, з'єднана із шарнірною областю, і (iii) константна область CH 3 важкого ланцюга імуноглобуліну, з'єднана з константною областю CH 2. Такі гібридні білки також описуються в заявках на патент США №№ 2003/0118592 і 2003/0133939. Бажано антитіла запропоновані даним винаходом є моноклональними, гібридними, 6 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людськими або гуманізованими антитілами або фрагментами антитіл. Антитіла запропоновані даним винаходом включають повністю людські антитіла. Такі антитіла можуть бути вироблені трансгенними тваринами (не людиною), наприклад трансгенними мишами, здатними утворювати множинні ізотипи людських моноклональних антитіл проти CLDN6, шляхом V-D-J рекомбінації й перемикання ізотипу. Такою трансгенною твариною, яка утворює поліклональні антитіла, наприклад такі, які описані в заявці на патент США № 2003/0017534, також може бути кролик. Антитіла запропоновані даним винаходом бажано вивільняються з комплексу з CLDN6 з константою дисоціації (KD) приблизно 1-100 нM або менше. Бажано, антитіла запропоновані даним винаходом не проявляють перехресної взаємодії (крос-реактивності) із близькими антигенами клітинної поверхні й тим самим не інгібують їхню функцію. У кращих втіленнях даного винаходу запропоновані антитіла відрізняються однією або більше із наступних властивостей: a) специфічність у відношенні до CLDN6; b) спорідненість зв'язування з CLDN6 близько 100 нM або менше. бажано близько 5-10 нМ або менше й більш бажано близько 1-3 нМ або менше; c) здатність викликати комплемент-залежну цитотоксичність у відношенні клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею; d) здатність інгібувати проліферацію клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею; e) здатність викликати апоптоз клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею; f) здатність викликати гомотипічну адгезію клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею; g) здатність викликати антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність відносно клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, у присутності ефекторних клітин; h) здатність продовжувати життя пацієнта, який має пухлинні клітини, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею; i) здатність зменшувати кількість клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею; j) здатність агрегувати CLDN6 на поверхні живих клітин. Кращі антитіла, описані в даному документі, - це антитіла, вироблені клітинами гібридоми (або отримані з них), які зберігаються в Колекції мікроорганізмів і культур клітин Німеччини Інституту ім. Лейбніца (DSMZ) (Інхоффенштрассе, 7B, 38124 Брауншвейг, Німеччина, Germany), та які мають наступні позначення й реєстраційні номери: 1. GT512muMAB 59A, реєстраційний номер DSM ACC3067, депоновано 21.06.2010; 2. GT512muMAB 60A, реєстраційний номер DSM ACC3068, депоновано 21.06.2010; 3. GT512muMAB 61D, реєстраційний номер DSM ACC3069, депоновано 21.06.2010; 4. GT512muMAB 64A, реєстраційний номер DSM ACC3070, депоновано 21.06.2010; 5. GT512muMAB 65A, реєстраційний номер DSM ACC3071, депоновано 21.06.2010; 6. GT512muMAB 66B, реєстраційний номер DSM ACC3072, депоновано 21.06.2010; 7. GT512muMAB 67A, реєстраційний номер DSM ACC3073. депоновано 21.06.2010; 8. GT512muMAB 55A, реєстраційний номер DSM ACC3089, депоновано 31.07.2010; або 9. GT512muMAB 89A, реєстраційний номер DSM ACC3090, депоновано 31.07.2010. У позначеннях антитіл запропонованих даним винаходом в даному документі відображені позначення самого антитіла й/або клону, який його виробляє, наприклад muMAB 59A. Також кращими є антитіла, які мають специфічність антитіл, які виробляються описаними вище гібридомами або одержані з них, зокрема тих, які містять антигензв′язувальну ділянку або антигензв′язувальний сайт, зокрема варіабельну область, ідентичну до такої антитіл, вироблених описаними вище гібридомами або одержаними з них, або яка має високий ступінь гомології з ними. Мають на увазі, що кращі відповідно до даного винаходу антитіла, мають область CDR, ідентичну до відповідної області антитіл вироблених описаними вище гібридомами або одержаних з них. Під високим ступенем гомології розуміють, що в кожній області CDR може бути від 1 до 5, бажано від 1 до 4, наприклад від 1 до 3 або від 1 до 2 замін. Особливо кращими є антитіла, які є гібридними й гуманізованими формами антитіл, вироблених описаними вище гібридомами або одержаних з них. Таким чином, антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути обраними із групи, яка складається з i) антитіл, вироблених клонами, депонованими під реєстраційним номером DSM ACC3067 (GT512muMAB 59A), DSM ACC3068 (GT512muMAB 60A), DSM ACC3069 7 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A), DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A) або DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A), або одержаних з них; (ii) антитіл, що є гібридними або гуманізованими формами антитіл за пунктом (i); (iii) антитіла, які мають специфічність антитіл за пунктом (i); (iv) антитіла, що містять ділянку зв'язування антигену або сайт зв'язування антигену, як в антитіл за пунктом (i). Ділянка зв'язування антигену або сайт зв'язування антигену, як у антитіл за пунктом (i) може включати варіабельну область антитіл за пунктом (i). Даний винахід відноситься також до таких клітин, як клітини гібридоми, які виробляють описані в даному документі антитіла. Кращими є клітини гібридоми, наявні в колекції DSMZ (Inhoffeenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany) з будь-яким з поміж наступних позначень і реєстраційних номерів: 1. GT512muMAB 59A, реєстраційний номер DSM ACC3067, депоновано 21.06.2010; 2. GT512muMAB 60A, реєстраційний номер DSM ACC3068, депоновано 21.06.2010; 3. GT512muMAB 61D, реєстраційний номер DSM ACC3069, депоновано 21.06.2010; 4. GT512muMAB 64A, реєстраційний номер DSM ACC3070, депоновано 21.06.2010; 5. GT512muMAB 65A, реєстраційний номер DSM ACC3071, депоновано 21.06.2010; 6. GT512muMAB 66B, реєстраційний номер DSM ACC3072, депоновано 21.06.2010; 7. GT512muMAB 67A, реєстраційний номер DSM ACC3073. депоновано 21.06.2010; 8. GT512muMAB 55A, реєстраційний номер DSM ACC3089, депоновано 31.08.2010; або 9. GT512muMAB 89A, реєстраційний номер DSM ACC3090, депоновано 31.08.2010. Антитіла проти CLDN6 можна модифікувати, з'єднати або забезпечити спільну експресію з носіями інших специфічностей. В одному конкретному втіленні даного винаходу пропонуються біспецифічні або поліспецифічні антитіла, які мають щонайменше одну першу специфічність у відношенні CLDN6 (наприклад, антитіло проти CLDN6 або його міметик) і другу специфічність у відношенні ефекторної клітини, наприклад специфічність зв'язування з рецептором Fc (наприклад, рецептором Fc-γ, у тому числі Fc-γRI, або будь-яким іншим рецептором Fc) або з рецептором на Т-клітинах, наприклад CD3. Відповідно до сказаного вище даний винахід включає біспецифічні й поліспецифічні молекули, які зв'язуються як з CLDN6, так і з рецептором Fc або з рецептором на Т-клітинах, наприклад CD3. Прикладами рецепторів Fc є рецептор IgG, рецептор Fcγ, наприклад, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) і FcγRIII (CD16). Інші рецептори Fc, наприклад рецептори IgА (наприклад, FcαRI) теж можуть служити мішенями. Рецептор Fc бажано розташовується на поверхні ефекторних клітин, наприклад моноцитів, макрофагів або активованих мононуклеарів. В одному із кращих втілень даного винаходу біспецифічні й поліспецифічні молекули зв'язуються з рецептором Fc у сайті, відмінному від сайту зв'язування цим рецептором імуноглобулінів (наприклад, IgG або IgА), так що зв′язування біспецифічних і поліспецифічних молекул не блокується при фізіологічних рівнях імуноглобулінів. У ще одному варіанті даного винаходу запропоновані антитіла проти CLDN6 модифікують, приєднують або забезпечують спільну експресію з іншими функціональними молекулами, наприклад іншими пептидами або білками (наприклад, Fab'-фрагментами). Так, антитіла запропоновані даним винаходом можна функціонально з'єднати (наприклад, шляхом хімічного приєднання, злиття генетичного матеріалу, нековалентної асоціації тощо) з однією або більше іншими молекулярними структурами, наприклад з іншими антитілами (наприклад, для одержання біспецифічних або поліспецифічних антитіл), цитотоксичними агентами, клітинними лігандами або антигенами (наприклад, для одержання імунокон′югата, наприклад імунотоксина). Антитіла запропоновані даним винаходом можна з'єднати з іншими терапевтичними агентами, наприклад радіоактивними ізотопами, лікарськими низькомолекулярними сполуками протиракової дії, рекомбінантними цитокінами або хемокінами. Таким чином, цей винахід охоплює велику кількість різноманітних кон′югатів антитіл, біспецифічних і поліспецифічних молекул і гібридних білків, які всі здатні зв'язуватися із клітинами, у яких експресується CLDN6 і/або із клітинами, які відрізняються тим, що CLDN6 є асоційованим з їхньою поверхнею; усі ці агенти можна використовувати для прицільного впливу на зазначені клітини. У цілому в контексті даного винаходу всі похідні антитіл, наприклад їх кон′югати, біспецифічні й поліспецифічні молекули й гібридні білки, у даному документі охоплюються терміном "антитіла". В іншому своєму варіанті даний винахід передбачає білки, які зв'язують CLDN6, і які походять не з імуноглобулінових доменів, у тому числі одноланцюгові білки. Такі зв′язувальні білки й способи їх одержання описані, наприклад, у роботі Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 8 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 23 (10): 1257-1268, включеній у даний документ шляхом посилання. Слід урахувати, що все сказане в даному документі відносно імуноглобулінів або зв′язувальних молекул, які з них походять, відповідно може бути застосовне до зв′язувальних молекул, які походять з неімуноглобулінових доменів. Зокрема, використовуючи такі зв′язувальні молекули, які походять з неімуноглобулінових доменів, можна блокувати CLDN6 у клітинах, у яких експресується зазначена мішень і які відрізняються тим, що зазначена мішень асоційована з їхньою поверхнею; у такий спосіб можна досягти терапевтичного ефекту, описаного в даному документі стосовно до антитіл запропонованих даним винаходом, зокрема добитися інгібування однієї або більше з поміж багатьох активностей пухлинних клітин, описаних у даному документі, наприклад проліферації. Можливо також (хоча й не обов'язково) надати таким неімуноглобуліновим зв′язувальним молекулам ефекторних функцій антитіл шляхом, наприклад, з'єднування їх з Fc-областю антитіл. У цілому даний винахід охоплює лікування й/або діагностування захворювань, зокрема онкологічних захворювань, шляхом прицільного впливу на CLDN6, який експресується в клітинах і асоційований з їхньою поверхнею. Цей підхід забезпечує вибіркову ідентифікацію й/або ліквідацію таких клітин і тим самим зведення до мінімуму негативного впливу на нормальні клітини, у яких не експресується CLDN6 і яким не властивий зв'язок CLDN6 з їхньою поверхнею. Бажано захворюваннями для лікування або діагностування є ті, при яких задіяні клітини, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються зв'язком CLDN, наприклад онкологічні захворювання, зокрема ракові захворювання типу тих, що описані в даному документі. В одному з варіантів даного винаходу пропонуються композиції, наприклад фармацевтичні й діагностичні композиції/набори, які включають антитіла або комбінації антитіл запропонованих даним винаходом. Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може містити фармацевтично прийнятний носій і, за необхідності, один або більше допоміжних компонентів, стабілізуючих агентів тощо. В одному конкретному втіленні даного винаходу така композиція включає комбінацію антитіл, які зв'язуються з окремими епітопами або які мають різні функціональні властивості, наприклад здатні викликати цитотоксичність, залежну від комплементу й/або антитілозалежну клітинно-опосередковану цитотоксичність і здатність викликати апоптоз. У цьому втіленні даного винаходу антитіла можуть використовуватися в комбінації, наприклад у вигляді фармацевтичної композиції, яка містить два або більше моноклональних антитіла проти CLDN6. Наприклад, моноклональні антитіла проти CLDN6, які проявляють різні, але такі, що доповнюють одна одну активності, можна поєднувати в одному методі лікування для досягнення бажаного терапевтичного ефекту. В одному кращому втіленні даного винаходу запропонована композиція включає антитіла проти CLDN6, які опосередковують цитотоксичність, залежну від комплементу, разом з іншими антитілами проти CLDN6. які опосередковують апоптоз. В іншому втіленні даного винаходу запропонована композиція включає антитіла проти CLDN6, які опосередковують високо ефективне знищення клітин-мішеней у присутності ефекторних клітин, разом з іншими антитілами проти CLDN6, які пригнічують проліферацію клітин з експресією CLDN6, які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею. Даний винахід також включає одночасне або послідовне введення двох або більше антитіл проти CLDN6, з яких щонайменше одне є гібридним антитілом проти CLDN6 і щонайменше одне інше антитіло є людським антитілом проти CLDN6, причому ці антитіла зв'язуються з тими самими або різними епітопами CLDN6. Бажано спочатку пацієнтові ввести гібридні антитіла проти CLDN6, а потім людські антитіла проти CLDN6, причому людські антитіла проти CLDN6 бажано вводять протягом певного (тривалого) періоду часу, наприклад як підтримуючу терапію. Антитіла, кон′югати, біспецифічні/поліспецифічні молекули й композиції запропоновані даним винаходом можна використовувати в різних способах для інгібування проліферації клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тими, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, і/або для вибіркового знищення клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тими, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, шляхом впливу на ці клітини ефективної кількості зазначених антитіл, кон′югатів, біспецифічних/поліспецифічних молекул і композицій таким чином, що проліферація зазначених клітин пригнічується й/або вони гинуть. В одному й втілень даного винаходу такий спосіб включає знищення клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, за необхідності в присутності ефекторних клітин, наприклад шляхом цитотоксичності, залежної від комплементу, апоптоза, цитотоксичності, залежної від антитіл, фагоцитозу або шляхом комбінованої дії цих механізмів. До клітин з експресією CLDN6, які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею і які можуть бути інгібовані або вбиті за допомогою антитіл запропонованих даним винаходом, відносяться ракові клітини. 9 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла, кон′югати, біспецифічні/поліспецифічні молекули й композиції запропоновані даним винаходом можна використовувати для лікування й/або запобігання різним захворюванням, у яких задіяні клітини, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, шляхом уведення зазначених антитіл пацієнтам, які страждають від цих захворювань. Приклади захворювань, які можна лікувати (наприклад, полегшувати перебіг хвороби) або запобігати таким чином, включають (але не обмежуються перерахованим тут) захворювання, при яких утворюються пухлини. Приклади захворювань, при яких утворюються пухлини і які можна лікувати й/або запобігати зазначеним чином, включають ракові захворювання, наприклад рак яєчника, зокрема аденокарциному яєчника й тератокарциному яєчника, рак легенів, у тому числі дрібноклітинний рак легенів (SCLC) і недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), зокрема плоскоклітинну карциному легенів і аденокарциному, рак шлунка, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема базальноклітинну карциному й плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови й шиї, у тому числі злоякісну поліморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому й карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідноклітинну карциному й папілярну карциному, рак нирок, зокрема нирково-клітинну карциному, включаючи світлоклітинну нирково-клітинну карциному й папілярну нирково-клітинну карциному, рак товстого кишківника, рак тонкого кишківника, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкого кишківника й аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, хоріокарциному плацентарної ділянки, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка й ембріональний рак яєчка, рак матки, герміногенні пухлини, наприклад тератокарциному або ембріональну карциному, зокрема герміногенну пухлину яєчка, та їх метастазуючі форми. В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до способу лікування або запобігання захворювань або розладів, у яких задіяні клітини, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тими, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, який передбачає введення пацієнтові антитіл, кон′югатів, біспецифічних/поліспецифічних молекул і композицій запропонованих даним винаходом. Бажано ці хвороби й розлади є такими, при яких утворюються пухлини, і в конкретних втіленнях даного винаходу їх вибирають із групи, яка складається з раку яєчника, у тому числі аденокарциноми яєчника й тератокарциноми яєчника, раку легенів, у тому числі дрібноклітинного раку легенів (SCLC) і недрібноклітинного раку легенів (NSCLC), особливо плоскоклітинної карциноми легенів і аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови й шиї, у тому числі злоякісної поліморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідноклітинної карциноми й папілярної карциноми, раку нирок, зокрема нирково-клітинної карциноми, включаючи світлоклітинну нирково-клітинну карциному й папілярну нирково-клітинну карциному, раку товстого кишківника, раку тонкого кишківника, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкого кишківника й аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, хоріокарциноми плацентарної ділянки, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка, раку матки, герміногенних пухлин, наприклад тератокарциноми або ембріональної карциноми, зокрема герміногенної пухлини яєчка та їх метастазуючих форм. Бажано CLDN6 експресується на поверхні зазначених клітин. Даний винахід включає застосування описаних у даному документі агентів і композицій для профілактики й лікування онкологічних захворювань, тобто для лікування пацієнтів, які страждають від якого-небудь онкологічного захворювання або для яких підвищений ризик розвитку такого захворювання. В одному з аспектів даного винаходу пропонуються способи інгібування пухлинного росту, які передбачають введення одного (однієї) або більше описаних у даному документі агентів і композицій. Бажано, описані в даному документі агенти й композиції вводять пацієнтам таким чином, що терапевтично активна речовина не потрапляє або в основному не потрапляє в тканини або органи, в яких немає пухлин, у клітинах яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, наприклад плацентарна тканина або плацента. Тому описані в даному документі агенти й композиції можна вводити локально. В одному аспекті даного винаходу пропонуються антитіла, описані в даному документі, для застосування в способах лікування, описаних у даному документі. В одному із втілень даного винаходу пропонується описана в даному документі фармацевтична композиція для застосування в способах лікування, описаних у даному документі. В одному конкретному втіленні даного винаходу пацієнт, якому вводять запропоновані 10 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла, додатково одержує хіміо- або променеву терапію або агенти, які модулюють, тобто підсилюють або інгібують, експресію або активність рецепторів Fc, наприклад рецепторів Fcγ, наприклад цитокінів. Цитокіни для введення в ході зазначеного лікування включають гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (GM-CSF), гамма-інтерферон (IFN-γ) і фактор некрозу пухлин (TNF). Хіміотерапевтичні агенти для введення в ході зазначеного лікування включають, крім інших, антинеопластичні агенти, наприклад доксорубіцин, цисплатин, таксотер, 5-фторурацил. метотрексат, гемцитабін і циклофосфамід. В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до імунізації тварин, наприклад мишей людським CLDN6 або пептидом, який є його фрагментом, для одержання антитіл. Кращими для імунізації є пептиди, обрані із групи, яка складається з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 15 і імунологічно еквівалентних їм пептидів. Тварин дикого типу, а також трансгенних тварин (не людей), можна імунізувати очищеними або збагаченими препаратами антигенів CLDN6 або пептидів, які є їхніми фрагментами, і/або нуклеїновими кислотами й/або клітинами, у яких експресується CLDN6 або його фрагмент. Бажано, з цією метою трансгенні тварини (не люди) повинні бути здатними виробляти множинні ізотипи моноклональних людських антитіл проти CLDN6 (наприклад, IgG, IgА або IgМ) шляхом V-D-J рекомбінації й перемикання ізотипа. Перемикання ізотипа може відбуватися класичним або некласичним шляхом. В іншому аспекті даного винаходу пропонуються В-клітини тварин (не людей), як описано вище. Виділені В-клітини можна потім іморталізувати шляхом злиття із уже іморталізованими клітинами, щоб створити джерело (наприклад, гібридому) антитіл запропонованих даним винаходом. Такі гібридоми, які виробляють антитіла запропоновані даним винаходом, також охоплюються винаходом. В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до способів діагностування, виявлення й спостереження за перебігом онкологічного захворювання, які передбачають виявлення й/або визначення кількості CLDN6 або клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, у зразках біологічного матеріалу, узятих у пацієнта з використанням антитіл запропонованих даним винаходом. Зразки біологічного матеріалу можуть бути взяті в пацієнта з онкологічним захворюванням, яке починається, або з розвиненим захворюванням, або з підозрою на таке захворювання, або з підвищеним ризиком такого захворювання. В одному із втілень способу діагностування, виявлення й спостереження за перебігом онкологічного захворювання відповідно до даного винаходу, зразок біологічного матеріалу й/або контрольний зразок/зразок для порівняння беруть з тканини або органа, які відповідають тканині або органу, що підлягають діагностуванню, виявленню або спостереженню відносно ураженню онкологічним захворюванням; наприклад, онкологічне захворювання, яке повинне бути діагностоване, виявлене або відслідковане, є раком яєчника й зразок біологічного матеріалу й/або контрольний зразок/зразок для порівняння беруть із тканини яєчника. Такі органи й тканини описані в даному документі, наприклад, у зв'язку з різними онкологічними й раковими захворюваннями. В одному із втілень способу діагностування, виявлення й спостереження за перебігом онкологічного захворювання відповідно до даного винаходу зразок біологічного матеріалу й/або контрольний зразок/зразок для порівняння беруть із тканини або органа, у клітинах яких за відсутності пухлини не експресується CLDN6 і вони не відрізняються вираженою присутністю CLDN6 на своїй поверхні. Переважно зазначена тканина не є плацентарною. Як правило, рівень молекул-мішеней у зразку біологічного матеріалу порівнюють із якимнебудь рівнем, прийнятим за контрольний або базовий, і тоді відхилення від цього останнього вважаю ознакою наявності і/або стадії онкологічного захворювання в даного пацієнта. Рівень, узятий для порівняння, може бути таким, який має місце в контрольному зразку (наприклад, у зразку здорової тканини того ж пацієнта) або середньою величиною, установленою за результатами визначення в ряду здорових індивідів. Під відхиленням від зазначеного рівня, узятого для порівняння, розуміють будь-яку істотну зміну, наприклад зменшення або збільшення не менше ніж на 10 %, 20 % або 30 %, бажано не менше ніж на 40 % або 50 % або навіть більше. Переважно, якщо в зразку біологічного матеріалу присутні СLDN6 або клітини, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, або кількість CLDN6 або клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею збільшена в порівнянні з рівнем, узятим для порівняння, то це свідчить про наявність онкологічного захворювання. Як правило, виявлення й/або визначення кількості в способах запропонованих даним 11 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом включає використання мічених антитіл, які специфічно зв'язуються з молекуламимішенями. В одному окремому аспекті даний винахід відноситься до способу виявлення, тобто визначення локалізації або поширення в організмі онкологічного захворювання, наприклад які тканини або органи уражені, який передбачає введення пацієнтові антитіл запропонованих даним винаходом, з'єднаних з детектованою міткою. Виявлення мітки у органі або тканині в зазначеного пацієнта може свідчити про наявність або підвищений ризик розвитку пухлини в цій тканині або органі. Як відзначалося вище, антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути отримані безпосередньо із клітин гібридоми, у яких ці антитіла експресуються, або шляхом клонування й рекомбінантної експресії в клітині-хазяїні (наприклад, у клітинах CHO або лімфоцитах). До прикладів клітин-хазяїнів відносяться також такі мікроорганізми, як Escherichia coli і гриби, наприклад дріжджі. Або ж зазначені антитіла можуть вироблятися рекомбінантним шляхом у трансгенних тварин (не людей) або рослин. Даний винахід включає також втілення, у яких зазначені антитіла виробляютьсяшляхом імунізації або вакцинації in situ (в організмі пацієнта) за допомогою описаних у даному документі методів імунізації. Даний винахід відноситься також до нуклеїнових кислот, які включають гени або нуклеотидні послідовності, які кодують антитіла або їх фрагменти, наприклад який-небудь ланцюг молекули антитіла, як описано в даному документі. Ці нуклеїнові кислоти можуть бути включені у вектор, наприклад у плазміду, косміду, вірус, бактеріофаг або інший вектор за допомогою, наприклад, звичайно застосовуваних для таких цілей методів генетичної інженерії. Вектор може включати також інші гени, наприклад маркерні гени, які дозволять вести відбір у придатних клітинаххазяїнах і за придатних умов. Крім того, вектор може включати регуляторні елементи, які забезпечують необхідну експресію кодуючих послідовностей у придатної клітини-хазяїна. Фахівцям у даній галузі техніки відомі такі регуляторні елементи, включаючи промотор, касети екзонів, які підлягають альтернативному сплайсингу, і кодони ініціації трансляції. Бажано нуклеїнові кислоти запропоновані даним винаходом функціонально з'єднані зі згаданими вище послідовностями, які забезпечують регуляцію експресії в еукаріотичних або прокаріотичних клітинах. Регуляторні елементи, які забезпечують експресію в еукаріотичних або прокаріотичних клітинах, добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Методи створення молекул нуклеїнових кислот відповідно до даного винаходу й векторів, які включають ці молекули, уведення зазначених векторів до відповідно підібраних клітин-хазяїнів й забезпечення експресії потрібних послідовностей, добре відомі в даній галузі техніки. У ще одному своєму аспекті даний винахід відноситься до клітин-хазяїв, які несуть описані в даному документі нуклеїнові кислоти або вектори. Інші ознаки й переваги даного винаходу розкриваються з нижченаведеного докладного опису й формули винаходу. Короткий опис креслень Фігура 1. Вирівнювання послідовностей CLDN3, CLDN4, CLDN6 і CLDN9 Фігура 2. Імунофлуоресцентний аналіз сироватки крові, узятої в мишей, імунізованих для одержання антитіл, специфічних проти CLDN6 (A) Нефіксовані клітини CHO-K1, ко-трансфіковані нуклеїновою кислотою, яка кодує CLDN6, разом із флуоресцентним білком GFP, тестували за допомогою мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 (R&D Systems, MAB3656). CLDN6 локалізований на плазматичній мембрані трансфікованих клітин і на живих клітинах може служити мішенню для специфічних антитіл. (B) Сироватка мишей, використаних для одержання гібридом F3-6C3-H8, містила антитіла, які зв'язуються з CLDN6 на поверхні нефіксованих клітин CHO-K1, ко-трансфікованих нуклеїновою кислотою, яка кодує CLDN6, разом із флуоресцентним білком GFP. Фігура 3. Визначення ендогенної експресії клаудинів у клітинах HEK293T методом ВестернБлотинга Білковий лізат клітин HEK293T, трансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують CLDN3, CLDN4, CLDN6 і CLDN9, відповідно, або контрольних клітин (з якими проробили всі ті ж маніпуляції, але без нуклеїнової кислоти) аналізували методом Вестерн-Блотинга, використовуючи готові наявні у продажу антитіла проти CLDN3(A) (Invitrogen, Cat No. 34-1700), проти CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), проти CLDN6(A) (ARP, 01-8865) і проти CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672). Цими антитілами виявлялася експресія відповідних мішеней тільки у відповідним чином трансфікованих клітинах HEK293T. У нетрансфікованих клітинах HEK293T не спостерігалося ендогенної експресії жодного з перерахованих клаудинів. Фігура 4. Визначення специфічності готових наявних у продажу антитіл проти CLDN 12 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 методом проточної цитометрії Методом проточної цитометрії визначали зв'язування готових наявних у продажу антитіл проти CLDN із клітинами HEK293T, трансфікованими нуклеїновими кислотами, які кодують CLDN3, CLDN4, CLDN6 і CLDN9, відповідно, і з нетрансфікованими клітинами HEK293T. Специфічними до своєї мішені виявилися тільки готові антитіла проти CLDN3. Фігура 5. Визначення специфічності антитіл проти CLDN, отриманих відповідно до даного винаходу, методом проточної цитометрії Методом проточної цитометрії визначали зв'язування антитіл у супернатантах моноклональних субклонів гібридом із клітинами HEK293T, трансфікованих одночасно двома векторами, один з яких кодував CLDN6, CLDN3, CLDN4 або CLDN9, а інший – флуоресцентний маркер. (A) Антитіла в супернатанті моноклонального субклону гібридом F3-6C3-H8 специфічно зв'язувалися із клітинами, трансфікованими CLDN6, але не із клітинами, трансфікованими CLDN3, CLDN4 і CLDN9, відповідно. На противагу до цього антитіла в супернатанті моноклонального субклону гібридом F4-4F7-F2 зв'язувалися із клітинами, трансфікованими CLDN6 або CLDN9. Антитіла в супернатанті моноклонального субклону гібридом F3-6C3-H8 також зв'язувалися із клітинами, трансфікованими варіантом CLDN6 (I143V)-SNP. (B) Антитіла із супернатанта моноклонального субклону гібридом F3-7B3-B4 зв'язувалися із клітинами, трансфікованими CLDN6, CLDN3 або CLDN9. Моноклональні антитіла в супернатанті субклону гібридом F3-3F7-A5 зв'язувалися із клітинами, трансфікованими CLDN6, CLDN4 або CLDN9 Фігура 6. Специфічність зв'язування мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A Зв'язування антитіл проти CLDN6 з людськими білками CLDN6, 3, 4, 9 і CLDN6 SNP (однонуклеотидний поліморфізм) варіант I143V визначали шляхом проточної цитометрії, використовуючи клітини HEK293T із транзиєнтною (тимчасовою) експресією відповідного людського клаудина. Ці клітини одночасно трансфікували флуоресцентним маркером, щоб відрізняти нетрансфіковані клітини (популяції Q1 і Q3) від трансфікованих (популяції Q2 і Q4). Концентрацію антитіл підбирали такою, яка насичує місця зв'язування з CLDN6 (25 мкг/мл). Експресію людських білків CLDN6, 3, 4, 9 і CLDN6-SNP(I143V) підтверджували за допомогою готових наявних у продажу моноклональних антитіл проти клаудину-6 людини (R&D Systems, MAB3656), клаудину-3 людини (R&D Systems, MAB4620) і клаудину-4 людини (R&D Systems, MAB 4219). Фігура 7. Відносна афінність мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A Для визначення відносної афінності аналізували зв'язування антитіл проти CLDN6 з людським білком CLDN6, який стабільно експресується на поверхні клітин HEK293, методом проточної цитометрії. За даними про насичення місць зв'язування будували графік залежності сигналу FACS (середньої інтенсивності флуоресценції) від концентрації антитіл. Розраховували EC50 (концентрацію антитіл, за якої у рівновазі зайнята половина місць їх зв'язування), використовуючи метод нелінійної регресії. Для специфічних у відношенні до CLDN6 антитіл muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A виходили дуже низькі значення EC 50 (200-500 нг/мл) і насичення місць зв'язування досягалося за низьких концентрацій. Фігура 8. Активність, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC), мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A Активність, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю, антитіл проти CLDN6 визначали в люциферазній системі, яка виявляє ендогенний аденозинтрифосфат у нелізованих клітинах. Клітини CHO-K1 зі стабільною експресією людського CLDN6 інкубували з різними концентраціями антитіл muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A. У випадку антитіл MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A спостерігалася залежна від дози цитотоксичність, залежна від комплементу, причому вона виникала за низьких концентрацій антитіл. Фігура 9. Активність, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC), мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 65A і 66B відносно клітин NEC8 з ендогенною експресією CLDN6 і клітин NEC8 LVTS2 54 (нокдаунних за CLDN6) Мишачі моноклональні антитіла проти CLDN6 muMAB 65A і 66B викликали цитотоксичність відносно клітин NEC8 залежно від дози. Специфічність muMAB 65A і 66B відносно мішені підтверджувалася в досліді із клітинами NEC8 LVTS2 54 (нокдаунними за CLDN6). Фігура 10. Терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A на ранніх стадіях розвитку ксенотрансплантата пухлини у мишей, де мишам прищеплювали лінію пухлинних клітин NEC8 13 UA 115969 C2 nu 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Безтімусним мишам лінії Nude-Foxn1 вводили клітини NEC8 з ендогенною експресією CLDN6. Мишачі моноклональні антитіла проти CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B і 67A пригнічували пухлинний ріст у порівнянні з особинами контрольної групи, які одержували замість антитіл фізіологічний розчин. Фігура 11. Специфічність зв'язування гібридних моноклональних антитіл проти CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A і 89A Методом проточної цитометрії визначали зв'язування антитіл проти CLDN6 з людськими білками CLDN6, 3, 4 і 9, використовуючи клітини HEK293 зі стабільною експресією відповідного людського клаудину. Концентрація антитіл була такою, що насичує місця зв'язування (25 мкг/мл). Експресію людських білків CLDN3, 4, 6 і 9 підтверджували за допомогою готових наявних у продажу моноклональних антитіл проти людського клаудину-3 (R&D Systems, MAB4620) і людського клаудину-4 (R&D Systems, MAB 4219), і CLDN6/ 9-реактивних мишачих моноклональних антитіл muMAB 5F2D2, відповідно. Для негативного контролю проробляли ті ж маніпуляції за тих же умов, але без перших антитіл. Фігура 12. Відносна спорідненість моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A і 89A до клітин HEK293-CLDN6 Методом проточної цитометрії визначали зв'язування антитіл проти CLDN6 з людським CLDN6, який стабільно експресується на поверхні клітин HEK293. Результати досліду з насиченням місць зв'язування представляли у вигляді графіка, відкладаючи на осі ординат сигнал FACS (середню інтенсивність флуоресценції), а на осі абсцис – концентрацію антитіл. Розраховували EC50 (концентрацію антитіл, за якої у рівновазі зайнята половина місць їх зв'язування), використовуючи метод нелінійної регресії. Для специфічних у відношенні до CLDN6 антитіл chimAB 64A і 89А виходили дуже низькі значення EC 50 (450-600 нг/мл) і насичення місць зв'язування досягалося за низьких концентрацій. Антитіла chimAB 67A і 61D характеризувалися низьким (1000 нг/мл) і середнім (2300 нг/мл) значеннями EC50 відповідно. Фігура 13. Відносна спорідненість моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A і 89A до клітин NEC8 Щоб визначити спорідненість антитіл проти CLDN6 до пухлинних клітин, в яких ендогенно експресується людський CLDN6, методом проточної цитометрії визначали зв'язування цих антитіл із клітинами лінії NEC8 (рак яєчка). Для специфічних у відношенні до CLDN6 антитіл chimAB 64A і 89А були отримані дуже низькі значення EC 50 (600-650 нг/мл) і насичення місць зв'язування досягалося за низьких концентрацій. Антитіла chimAB 61D і 67A характеризувалися середнім (1700 нг/мл) і високим (6100 нг/мл) значеннями EC50 відповідно. Фігура 14. Відносна спорідненість моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A і 89A до клітин OV90 Щоб визначити спорідненість антитіл проти CLDN6 до пухлинних клітин, у яких ендогенно експресується людський CLDN6, методом проточної цитометрії визначали зв'язування цих антитіл із клітинами лінії OV90 (рак яєчника). Для специфічних у відношенні до CLDN6 антитіл chimAB 64A і 89А виходили дуже низькі значення EC 50 (550-600 нг/мл) і насичення місць зв'язування досягалося за низьких концентрацій. Антитіла chimAB 61D і 67A характеризувалися середніми значеннями EC50 (1500 нг/мл і 2300 нг/мл, відповідно). Фігура 15. Активність, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC), моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A і 89A відносно клітин NEC8 дикого типу й нокдаунних Активність, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю, антитіл проти CLDN6 визначали в люциферазній системі, яка проявляє ендогенний аденозинтрифосфат у нелізованих клітинах. Клітини NEC8 дикого типу (NEC8 LVTS2 77) з ектопічною експресією люциферази інкубували з різними концентраціями антитіл chimAB 61D, 64A, 67A і 89A. Антитіла chimAB 61D, 64A, 67A і 89A впливали на клітини NEC8 залежним від дози чином, тоді як у випадку клітин NEC8, нокдаунних за CLDN6 (NEC8 LVTS2 54), жодне із зазначених антитіл не викликало неспецифічного лізису. Ці результати демонструють специфічні відносно мішені ефекторні функції chimAB 61D, 64A, 67A і 89A. Фігура 16. Активність, яка проявляється антитілозалежною клітинно-опосередкованою цитотоксичністю (ADDC), моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A і 89A відносно клітин NEC8 дикого типу й нокдаунних Активність, яка проявляється залежною від антитіл клітинно-опосередкованою цитотоксичністю (ADDC), антитіл проти CLDN6 визначали в люциферазній системі, яка виявляє ендогенний аденозинтрифосфат у нелізованих клітинах. Клітини NEC8 дикого типу (NEC8 LVTS2 77) інкубували з різними концентраціями антитіл chimAB 61D, 64A, 67A і 89A. Активність антитіл chimAB 61D, 64A, 67A і 89A, що проявляється ADDC, залежала від дози й виникала 14 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 навіть за низьких концентрацій антитіл. Щоб продемонструвати специфічність антитіл відносно мішені, використовували клітини NEC8, які є стабільно нокдаунними за CLDN6 (NEC8 LVTS2 54). Фігура 17. Довгостроковий терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 61D, 64A і 67A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на ранніх стадіях розвитку пухлин nu Безтимусні миші Nude-Foxn1 із ксенографтами клітин NEC8, у яких ендогенно експресується CLDN6, протягом 46 діб одержували антитіла, специфічні до CLDN6. Після цього впливу протягом 60 діб відслідковували пухлинний ріст. Навіть після припинення цієї імунотерапії в мишей, які одержували мишачі моноклональні антитіла muMAB 61D, 64A і 67A росту пухлин не спостерігалося. Фігура 18. Терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 89A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на ранніх стадіях розвитку пухлин nu Використовували безтимусних мишей Nude-Foxn1 із ксенографтами клітин NEC8, у яких ендогенно експресується CLDN6. Розкидані кружечки представляють значення об′єму пухлин у різні моменти часу в ході лікування антитілами в ранній період розвитку ксенографтів NEC8 у nu безтимусних мишей Nude-Foxn1 . У порівнянні з контрольними особинами в мишей, які одержували muMAB 89A, спостерігалося інгібування пухлинного росту (А). Уведення антитіл, специфічних до CLDN6, або PBS (контроль) тривало 47 діб, протягом яких й протягом наступних 51 доби реєстрували ріст пухлин. До кінця експерименту в мишей, які одержували muMAB89A, пухлин не виявлялося – на відміну від контрольних особин, які одержували PBS (B). Фігура 19. Терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 64A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на пізніх стадіях розвитку пухлин Розкидані кружечки представляють значення об′єму пухлин у різні моменти часу в ході лікування антитілами в пізній період розвитку ксенографтів NEC8 у безтимусних мишей Nudenu Foxn1 . При імунотерапії мишачими моноклональними антитілами проти CLDN6 muMAB 64A спостерігалося інгібування росту солідних пухлин, які розвилися із ксенографтів NEC8, у порівнянні з обома контрольними групами, в одній з яких миші одержували PBS без антитіл, а в другий - неспецифічні антитіла. Фігура 20. Довгостроковий терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 64A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на пізніх стадіях розвитку пухлин Через 15 діб після введення пухлинних клітин 15 мишей протягом 45 діб одержували специфічні до CLDN6 антитіла muMAB 64A. Протягом ще 49 діб реєстрували пухлинний ріст (А). Графік, який представляє виживання мишей, показує, що тварини, які одержували специфічні до CLDN6 антитіла muMAB 64A жили довше (B). Фігура 21. Терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 61D, 67A і 89A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на пізніх стадіях розвитку пухлин Розкидані кружечки, трикутники й квадратики представляють значення об′єму пухлин у різні моменти часу в ході лікування антитілами в пізній період розвитку ксенографтів NEC8. Мишачі моноклональні антитіла проти CLDN6 muMAB 61D, 67A і 89A пригнічували пухлинний ріст – на відміну від контрольних впливів (PBS без антитіл і неспецифічні антитіла. Фігура 22. Довгостроковий терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 61D, 67A і 89A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на пізніх стадіях розвитку пухлин Через 17 діб після введення пухлинних клітин миші протягом 42 діб одержували специфічні до CLDN6 антитіла muMAB 61D, 67A і 89A. У період імунотерапії й протягом ще 49 діб реєстрували пухлинний ріст (А). Графік, який представляє виживання мишей, показує, що тварини, які одержували специфічні до CLDN6 антитіла muMAB 61D і 67A жили довше (B). Фігура 23. Терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 64A і 89A у мишей із ксенографтами пухлинних клітин NEC8 дикого типу й клітин NEC8, стабільно нокдаунних за CLDN6 Антитіла muMAB 64A і 89A проявляли терапевтичну дія тільки в мишей із ксенографтами NEC8 дикого типу, а у тварин, яким були введені клітини NEC8, нокдаунні за CLDN6, такого ефекту не спостерігалося, що демонструє специфічність цих антитіл щодо мішені in vivo. Фігура 24. Картування з високим розрізненням епітопів, з якими взаємодіють антитіла chimAB 61D, 64A, 67A і 89A 15 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аланінові мутантні варіанти позначені як "залишок дикого типу номер аланін" або "залишок дикого типу номер гліцин" у випадках наявності в даному положенні аланіну в білка дикого типу; амінокислоти мають однобуквені позначення. Для взаємодії зі специфічними до CLDN6 гібридними антитілами chimAB 61D, 64A, 67A і 89A важливі амінокислотні залишки F35, G37, S39 і, імовірно, T33 першого позаклітинного домена CLDN6. Амінокислотний залишок 140 має істотне значення для зв'язування chimAB 89A і бере участь у зв'язуванні chimAB 61D and 67A. Крім того, амінокислотний залишок L151 другого позаклітинного домена бере участь у взаємодії з антитілами chimAB 67A. Хоча імунофлуоресцентний аналіз підтвердив експресію мутантних варіантів CLDN6 P28A, W30A, G49A, L50A, W51A, C54A і C64A, вони не давали фарбування мембран. Тому не можна виключити взаємодії антитіл запропонованих даним винаходом із цими амінокислотами. У цілому ідентифіковані епітопи узгоджуються з тими ДНК і пептидами домена ЄС1 CLDN6, які використовувалися для імунізації. Фігура 25. Вирівнювання амінокислотних послідовностей варіабельної області важкого ланцюга специфічних до CLDN6 антитіл запропонованих даним винаходом Ділянки, які визначають комплементарність (HCDR1, HCDR2 і HCDR3) показані рамкою. Фігура 26. Вирівнювання амінокислотних послідовностей варіабельної області легкого ланцюга специфічних до CLDN6 антитіл запропонованих даним винаходом Ділянки, які визначають комплементарність (LCDR1, LCDR2 і LCDR3) показані рамкою. Фігура 27. Специфічність зв'язування моноклональних гібриднихантитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS Специфічність зв'язування антитіл проти CLDN6 визначали методом проточної цитометрії, використовуючи клітини HEK293T, тимчасово трансфіковані людськими CLDN6, 3, 4 і 9,відповідно. Щоб відрізняти нетрансфіковані клітини від трансфікованих, клітини одночасно трансфікували флуоресцентним маркером. Концентрація антитіл була такою, яка насичує місця зв'язування (100 мкг/мл). Експресію людських білків CLDN3, 4, 6 і 9 підтверджували за допомогою готових наявних у продажу моноклональних антитіл проти людського клаудину-3 (R&D Systems, MAB4620) і людського клаудину-4 (R&D Systems, MAB 4219), і CLDN6/ 9реактивних мишачих моноклональних антитіл muMAB 5F2D2, відповідно. Моноклональні гібридні антитіла chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS зв'язувалися з CLDN6, але не взаємодіяли з CLDN3, 4 і 9, відповідно. Фігура 28. Відносна спорідненість зв'язування (афінність) моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS із клітинами HEK293CLDN6 Для оцінки відносної спорідненості (афінності) методом проточної цитометрії визначали зв'язування антитіл проти CLDN6 з людським CLDN6, який стабільно експресується на поверхні клітин HEK293. За результатами досліду з насиченням місць зв'язування будували графік залежності сигналу FACS (середньої інтенсивності флуоресценції) від концентрації антитіл. Розраховували EC50 (концентрацію антитіл, за якої у стані рівноваги, зайнята половина місць їх зв'язування), використовуючи метод нелінійної регресії. Специфічні до CLDN6 антитіла характеризувалися подібними низькими значеннями EC50, і насичення місць зв'язування досягалося за низьких концентрацій. Фігура 29. Відносна спорідненість зв'язування (афінність) моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS із клітинами NEC8 Для оцінки відносної спорідненості (афінності) методом проточної цитометрії визначали зв'язування антитіл проти CLDN6 з пухлинними клітинами, у яких ендогенно експресується людський CLDN6, а саме із клітинами лінії NEC8 (рак яєчка). У порівнянні зі специфічними до CLDN6 антитілами chimAB 64A, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS варіант з комбінацією легких ланцюгів mAb206-LCC проявляв утроє більшу афінність стосовно клітин NEC8. У всіх випадках насичення місць зв'язування досягалося за низьких концентрацій. Фігура 30. Відносна спорідненість зв'язування (афінність) моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS із клітинами OV90 Методом проточної цитометрії визначали спорідненість зв'язування (афінність) антитіл проти CLDN6 з людськими клітинами лінії OV90 (рак яєчника). Антитіла, специфічні до CLDN6, характеризувалися подібними низькими значеннями EC50. Варіант c комбінацією легких ланцюгів mAb206-LCC проявляв найбільшу міцність зв'язування із клітинами OV90. Фігура 31a. Активність моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC і mAb206-SUBG, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC) відносно клітин NEC8 дикого типу й нокдаунних клітин NEC8 Активність, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю, антитіл проти CLDN6 визначали в люциферазній системі, яка виявляє ендогенний аденозинтрифосфат у нелізованих 16 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах. Клітини NEC8 дикого типу з ектопічною експресією люциферази інкубували з різними концентраціями антитіл chimAB 64A, mAb206-LCC і mAb206-SUBG. Ці антитіла впливали на клітини NEC8 залежним від дози чином, тоді як у випадку клітин NEC8, нокдаунних за CLDN6 (NEC8 LVTS2 54), жодне з них не викликало неспецифічного лізису. Ці результати демонструють специфічні відносно мішені ефекторні функції chimAB 64A, mAb206-LCC і mAb206-SUBG. Фігура 31b. Активність моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS, яка проявляється комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC) відносно клітин NEC8 Ці антитіла викликали CDC відносно клітин NEC8 залежним від дози чином. У порівнянні з антитілами chimAB 64A варіанти з амінокислотними замінами mAb206-SUBG і mAb206-SUBS мали подібну активність. Фігура 32a. Активність моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS, що проявляється антитілозалежною клітинноопосередкованою цитотоксичністю (ADDC), відносно клітин NEC8 і OV90 Активність антитіл проти CLDN6, яка проявляється антитілозалежною клітинноопосередкованою цитотоксичністю, визначали в люциферазній системі, яка виявляє ендогенний аденозинтрифосфат у нелізованих клітинах. Клітини NEC8 і OV90 інкубували з різними концентраціями гібридних антитіл проти CLDN6. В обох лініях пухлинних клітин усі зазначені антитіла викликали ADCC навіть за низьких концентрацій, причому ефект ADDC залежав від дози. Фігура 32b. Активність моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC і mAb206-SUBG, що проявляється антитілозалежною клітинно-опосередкованою цитотоксичністю (АDDC), відносно клітин NEC8 дикого типу й нокдаунних клітин NEC8 Щоб продемонструвати специфічність антитіл відносно мішені, використовували клітини NEC8, які є стабільно нокдаунними за CLDN6. Фігура 33. Терапевтичний ефект моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 mAb206LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на пізніх стадіях розвитку пухлин nu Використовували безтимусних мишей лінії Nude-Foxn1 із ксенографтами клітин NEC8. Через 17 діб після введення пухлинних клітин мишам уводили специфічні до CLDN6 антитіла mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS і потім реєстрували пухлинний ріст. Розкидані кружечки, трикутники й квадратики представляють значення об′єму пухлин у різні моменти часу в ході лікування антитілами в пізній період розвитку ксенографтів NEC8. У порівнянні з контролем (миші одержували неспецифічні антитіла) моноклональні гібридні антитіла проти CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS пригнічували пухлинний ріст. Фігура 34. Терапевтичний ефект моноклональних гібридних антитіл проти CLDN6 mab206LCC, mab206-SUBG і mab206-SUBS у мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 при впливі на пізніх стадіях розвитку пухлин Для порівняння з Фіг. 33 дані щодо пухлинного росту в часі представлені більш докладно. Видно, що моноклональні гібридні антитіла проти CLDN6 здатні пригнічувати пухлинний ріст (А). Крива виживання показує, що миші, які одержували специфічні до CLDN6 антитіла, жили довше (B). Фігура 35. Картування з високим розрізненням епітопів, з якими взаємодіють антитіла chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS Аланонові мутантні варіанти, які називаються "залишок дикого типу номер аланін"; амінокислоти, які називаються однобуквеними позначеннями. Для взаємодії зі специфічними до CLDN6 гібридними антитілами важливі амінокислотні залишки F35, G37, S39 і, імовірно, T33 першого позаклітинного домена CLDN6. Антитіла chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG і mAb206-SUBS характеризувалися однаковими особливостями зв'язування. Фігура 36. Терапевтичний ефект мишачих моноклональних антитіл проти CLDN6 muMAB 64A щодо утворення метастаз в мишей із ксенографтами пухлинних клітин лінії NEC8 nu Безтимусним мишам лінії Nude-Foxn1 уводили у хвостову вену клітини NEC8, а через три доби ці тварини одержували специфічні до CLDN6 антитіла muMAB 64A. Через 8 тижнів визначали пухлинне навантаження в тканині легенів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Мишачі моноклональні антитіла проти CLDN6 muMAB 64A у порівнянні з контролем (PBS без антитіл) викликали виразне інгібування пухлинного росту. Фігура 37. Імуногістохімічне фарбування ракових і нормальних тканин людини з використанням моноклональних антитіл muMAB 64A, mAB206-LCC і mAB206-SUBG На противагу нормальним тканинам у зрізах пухлин яєчників і яєчок спостерігалося 17 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виражене рівномірне фарбування. Дуже інтенсивне фарбування мембран мало місце в злоякісних епітеліальних клітинах, тоді як сусідні стромальні клітини й незлоякісні епітеліальні клітини не фарбувалися. Ці результати з очевидністю свідчать, що специфічні до CLDN6 антитіла запропоновані даним винаходом специфічно зв'язуються зі злоякісними клітинами, отриманими від пацієнтів з пухлинами. (Пояснення: число тканин, які фарбуюються антитілами/число досліджених тканин). Визначення термінів Щоб зробити легшим розуміння даного винаходу ми спочатку дамо визначення деяким термінам. Додаткові визначення даються по ходу розкриття винаходу. У нижченаведеному описі й у прикладеній формулі винаходу слова "включає" і "містить" та їх похідні (і синоніми, наприклад "до їх числа входить") слід розуміти так (якщо не зазначено іншого), що зазначені члени, цілі числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій входять до розглянутої групи, але не виключено, що до неї входять також інші члени, цілі числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій. Визначений і невизначений артикль та їх аналоги в описі даного винаходу й особливо у формулі винаходу позначають як однину, так і множину, якщо не зазначено іншого або якщо це явно не суперечить конкретному контексту. Діапазони значень приводяться тут для того, щоб коротко вказати всі значення, які входять до даного діапазону, замість того, щоб указувати їх кожне окремо. І, якщо не зазначено іншого, кожне окреме значення включене у даний опис, як ніби воно було назване окремо. Усі описані тут способи можуть бути здійснені в будь-якому потрібному порядку, якщо не зазначено іншого або якщо це явно не суперечить конкретному контексту. Будь-який наведений тут приклад і всі вони разом узяті, а також вживання тут виразів типу "такий/такі, як" або "наприклад" або "у тому числі" служать тільки для ілюстрації даного винаходу і не накладають обмежень на обсяг винаходу, якщо не зазначене іншого. Ніякі словесні конструкції в даному описі не слід тлумачити, як такі, що указують на який-небудь незаявлений елемент, істотний для практичного здійснення даного винаходу. Клаудини – це родина білків, які є дуже важливими компонентами щільних контактів, де вони утворюють навколоклітинний бар'єр, який регулює потік речовин у міжклітинному просторі епітелію. Клаудини є трансмембранними білками; молекули клаудину перетинають мембрану чотири рази, причому й N-кінець, і С-кінець перебувають у цитоплазмі. Перша позаклітинна петля складається у середньому з 53 амінокислотних залишків, друга – із близько 24 амінокислотних залишків. У родині клаудинів білки CLDN6 і CLDN9 є найбільш подібними між собою. У даному документі скорочення "CLDN" означає "клаудин" (claudin) і включає білки CLDN6, CLDN9, CLDN4 і CLDN3. Бажано, CLDN є людським клаудином. Позначення "CLDN6" відноситься переважно до людського CLDN6, зокрема до (i) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8, наприклад, до нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1, або (ii) до білка, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8. Перша позаклітинна петля CLDN6 бажано містить амінокислотні залишки з 28 дo 80, ще краще, амінокислотні залишки з 28 дo 76 амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 2, або амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 8, наприклад амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 7. Друга позаклітинна петля CLDN6 бажано містить амінокислотні залишки з 138 дo 160, бажано амінокислотні залишки з 141 до 159, більш бажано амінокислотні залишки з 145 дo 157 амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 2, або амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 8, наприклад амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 6. Зазначені перша й друга позаклітинні петлі бажано формують позаклітинну частину CLDN6. Позначення "CLDN9" відноситься переважно до людського CLDN9, зокрема до (i) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9 або (ii) до білка, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9. Перша позаклітинна петля CLDN9 бажано містить амінокислотні залишки з 28 дo 76, амінокислотної послідовності показаної в SEQ ID NO: 9. Друга позаклітинна петля CLDN9 бажано містить амінокислотні залишки з 141 дo 159 амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 9. Зазначені перша й друга позаклітинні петлі бажано формують позаклітинну частину CLDN9. Позначення "CLDN4" відноситься бажано до людського CLDN4, зокрема до (i) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10 або (ii) до білка, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10. Перша позаклітинна петля CLDN4 бажано містить амінокислотні залишки з 28 дo 76 амінокислотної 18 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, показаної в SEQ ID NO: 10. Друга позаклітинна петля CLDN4 бажано містить амінокислотні залишки з 141 дo 159 амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 10. Зазначені перша й друга позаклітинні петлі бажано формують позаклітинну частину CLDN4. Позначення "CLDN3" відноситься бажано до людського CLDN3, зокрема до (i) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 11 або (ii) до білка, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 11. Перша позаклітинна петля CLDN3 бажано містить амінокислотні залишки з 27 дo 75 амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 11. Друга позаклітинна петля CLDN9 бажано містить амінокислотні залишки з 140 дo 158 амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 11. Зазначені перша й друга позаклітинні петлі бажано формують позаклітинну частину CLDN3. Описані вище послідовності CLDN включають будь-які варіанти зазначених послідовностей, зокрема мутантні форми, варіанти сплайсингу, конформації, ізоформи, алельні варіанти, варіанти й гомологічні форми різного видового походження, у тому числі ті, які зустрічаються в природі. Алельні варіанти відносяться до змін нормальної послідовності гена, значення яких часто залишається неясним. При визначенні повної нуклеотидної послідовності гена часто виявляються численні варіанти цього гена. Гомологічні форми різного видового походження – це відповідні нуклеотидні або амінокислотні послідовності, наявні в різних видів. Термін "клаудин" (який позначається як "CLDN") охоплює (i) варіанти сплайсинга CLDN, (ii) варіанти посттрансляційної модифікації CLDN, зокрема різні варіанти глікозилювання, наприклад глікозилювання N-кінцевої ділянки поліпептидного ланцюга, (iii) конформаційні варіанти CLDN, (iv) варіанти CLDN, пов'язані з раком, і не пов'язані з раком. Бажано, щоб СLDN був присутній у своїй нативній конформації. Експресія CLDN6 виявлена, наприклад у пухлинній тканині раку яєчника, раку легенів, шлунка, молочної залози, печінки, підшлункової залози, шкіри, при меланомах, раку голови й шиї, саркомах, раку жовчної протоки, нирковоклітинному раку й раку сечового міхура. CLDN6 є особливо кращою мішенню для лікування й/або запобігання раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника й тератокарциноми яєчника, а також раку легенів, включаючи дрібноклітинний рак легенів (SCLC) і недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), у тому числі плоскоклітинну карциному й аденокарциному легенів, рак шлунка, молочної залози, печінки, підшлункової залози, шкіри, зокрема базальноклітинну карциному й плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови й шиї, у тому числі злоякісну поліморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому й карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідноклітинну карциному й папілярну карциному, рак нирок, зокрема нирковоклітинну карциному, включаючи світлоклітинну нирково-клітинну карциному й папілярну нирково-клітинну карциному, рак товстого кишківника, рак тонкого кишківника, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкого кишківника й аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, хоріокарциному плацентарної ділянки, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка й ембріональний рак яєчка, рак матки, герміногенні пухлини, наприклад тератокарциному або ембріональну карциному, зокрема герміногенну пухлину яєчка та їх метастазуючі форми. В одному із втілень даного винаходу ракове захворювання, пов'язане з експресією CLDN6, вибирають із групи, яка складається з раку яєчника, раку легенів, метастазуючого раку яєчника й метастазуючого раку легень. Переважно, рак яєчника є карциномою або аденокарциномою. Переважно, рак легенів є карциномою або аденокарциномою, переважно бронхіолярним раком, наприклад бронхіолярною карциномою або бронхіолярною аденокациномою. В одному із втілень даного винаходу пухлинні клітини, пов'язані з експресією CLDN6, є раковими клітинами зазначених захворювань. Термін "ділянка" стосується частини. Стосовно до таких конкретних структур, як амінокислотна послідовність або білок термін "ділянка" може означати неперервну або складову частину зазначеної структури. Бажано ділянка амінокислотної послідовності містить щонайменше 1 %, щонайменше 5 %, щонайменше 10 %, щонайменше 20 %, щонайменше 30 %, бажано щонайменше 40 %, бажано щонайменше 50 %, ще краще щонайменше 60 %, ще краще щонайменше 70 %, ще більш бажано щонайменше 80 %, і найкраще щонайменше 90 % амінокислотних залишків зазначеної амінокислотної послідовності. Бажано, якщо ділянка є складовою частиною, зазначена складова частина складається з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше частин структури. причому кожна частина є неперервним елементом цієї структури. Наприклад, складова частина амінокислотної послідовності може бути утворена з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше, бажано не більше 4 частин зазначеної амінокислотної послідовності, причому кожна частина бажано містить щонайменше 5 неперервно розташованих амінокислотних залишків, щонайменше 10 неперервно розташованих амінокислотних залишків, бажано щонайменше 20 19 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неперервно розташованих амінокислотних залишків, бажано щонайменше 30 неперервно розташованих амінокислотних залишків даної амінокислотної послідовності. Терміни "частина" і "фрагмент" у даному документі вживаються як синоніми й відносяться до неперервних елементів. Наприклад, частина такої структури, як амінокислотна послідовність або білок, належить до неперервного елемента зазначеної структури. У ділянці, частині або фрагменті структури бажано містяться одна або більше функціональних властивостей зазначеної структури. Наприклад, ділянка, частина або фрагмент епітопа або пептиду бажано імунологічно еквівалентні епітопу або пептиду, з якого вони походять. Термін "позаклітинна ділянка CLDN" у контексті даного винаходу відноситься до частини клаудина, поверненої в позаклітинний простір і бажано доступної ззовні зазначеної клітини, наприклад для антитіл, які перебувають зовні клітини. Бажано, даний термін відноситься до однієї або більше позаклітинних петель або їх частин або до будь-якої іншої позаклітинної частини CLDN, яка бажано є специфічною для зазначеного CLDN. Бажано зазначена частина містить щонайменше 5, щонайменше 8, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 30 або щонайменше 50 амінокислотних залишків або більше. Термін "CLDN, зв'язаний/асоційований з поверхнею клітини" слід розуміти як такий, що стосується нативного CLDN, тобто CLDN у його не денатурованому виді, бажано в природній конформації. Бажано термін "CLDN, зв'язаний/асоційований з поверхнею клітини" означає, що між цим білком і плазматичною мембраною існує зв'язок і що він розташовується на клітинній мембрані, де щонайменше частина СLDN, бажано позаклітинна ділянка, обернена до позаклітинного простору зазначеної клітини і є доступною зовні від неї, наприклад для антитіл, які перебувають поза клітиною. Зв'язок може бути прямим або непрямим. Наприклад, зв'язок може здійснюватися за рахунок одного або більше трансмембранних доменів, однієї або більше ліпідних якірних структур і/або завдяки взаємодії з яким-небудь іншим білком, ліпідом, сахаридом або іншою структурою, яка перебуває на зовнішньому шарі плазматичної мембрани клітини. Наприклад, CLDN, зв'язаний з поверхнею клітини, може бути трансмембранним білком, тобто білком, вбудованим у мембрану (інтегральним мембранним), який має позаклітинну ділянку, або CLDN може бути білком, зв'язаним із клітинною поверхнею за рахунок взаємодії з іншим білком, який є трансмембранним. CLDN6 зв'язаний з поверхнею клітини, якщо він розташовується на її поверхні й доступний для зв'язування з доданими до таких клітин антитілами, специфічними до CLDN6. У кращих втіленнях даного винаходу клітини, які відрізняються тим, що CLDN6 асоційований з їхньою поверхнею - це клітини, у яких експресується CLDN6. Слід підкреслити, що якщо в клітині має місце експресія CLDN6, то CLDN6, пов'язаний із клітинною поверхнею, може бути тільки із числа цих білкових молекул. Вираз "клітина, яка несе CLDN" переважно означає, що зазначена клітина має на своїй поверхні молекули клаудину, тобто він пов'язаний з поверхнею зазначеної клітини. Словосполучення "клітинна поверхня" або "поверхня клітини" використовуються в їхньому звичайному для даної галузі техніки значенні, тобто включають зовнішню поверхню клітини, доступну для зв'язування з білками та іншими речовинами ззовні. Вираз "CLDN, експресований на поверхні клітини" означає, що клаудин, який утворюється в даній клітині, виявляється зв'язаним з її поверхнею. Відповідно до даного винаходу вважається, що в клітинах немає істотної експресії CLDN6 і на них немає істотної кількості цього білка, зв'язаного із клітинною поверхнею, якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні менше, ніж у плацентарних клітинах або в тканині плаценти. Бажано рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні повинні бути менше ніж 10 %, бажано менше ніж 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % або 0,05 % від рівня експресії й кількості цього білка на клітинній поверхні в плацентарних клітинах або в тканині плаценти (або навіть нижче). Бажано, у клітинах не відбувається істотної експресії CLDN6 і на них немає істотної кількості цього білка, зв'язаного із клітинною поверхнею, якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні перевищують такі в непухлинних неракових тканинах, відмінних від тканини плаценти, не більше ніж в 2 рази, бажано не більше ніж в 1,5 рази й бажано не перевищують рівень експресії й кількість СLDN6 на клітинній поверхні в зазначених непухлинних неракових тканинах. Бажано, у клітинах не відбувається істотної експресії CLDN6 і на них немає істотної кількості цього білка, зв'язаного із клітинною поверхнею, якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні нижче межі чутливості методу визначення й/або якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні занадто низькі для того, щоб відбувалося зв'язування специфічних до CLDN6 антитіл, доданих до цих клітин. Відповідно до даного винаходу вважається, що в клітинах експресується CLDN6 і цей білок є на клітинній поверхні, якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні 20 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перевищують такі в непухлинних неракових тканинах, відмінних від тканини плаценти, бажано більше ніж в 2 рази, бажано в 10, 100, 1000 або 10 000 разів. Бажано в клітинах експресується CLDN6 і цей білок є на клітинній поверхні, якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні перевищують межу чутливості методу визначення й/або якщо рівень експресії й кількість CLDN6 на клітинній поверхні достатні для того, щоб відбувалося зв'язування специфічних до CLDN6 антитіл, доданих до цих клітин. Бажано, експресований у клітинах CLDN6 експонується на їхній клітинній поверхні. Термін "рафт (плотик)» означає мікродомен ліпідного бішару клітинної мембрани, збагачений холестерином і сфінголіпідами, який розташований у зовнішньому шарі плазматичної мембрани клітини. Деякі білки здатні зв'язуватися в такі домени, утворювати агрегати або ділянки фокальної адгезії, що впливає на функціонування білків. Наприклад, перенесення молекул CLDN6 у такі структури після того як цей білок зв'язався з антитілами запропонованими даним винаходом, призводить до утворення комплексів високої щільності антиген (СLDN6)-антитіло в плазматичній мембрані. Висока щільність комплексів антиген (СLDN6)-антитіло має значення для ефективної активації системи комплементу при комплемент-залежній цитотоксичності. Відповідно до даного винаходу термін "захворювання/хвороба" відноситься до будь-якого патологічного стану, включаючи рак, зокрема до тем раковим захворюванням, які згадуються в даному документі. Вираз "захворювання за участю клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею", відповідно до даного винаходу означає, що експресія й кількість цього білка на клітинній поверхні в ураженій тканині або органі бажано збільшені в порівнянні зі станом у здоровому органі або тканині. Під збільшенням розуміється збільшення щонайменше на 10 %, зокрема щонайменше на 20 %, щонайменше на 50 %, щонайменше на 100 %, щонайменше на 200 %, щонайменше на 500 %, щонайменше на 1000 %, щонайменше на 10 000 % або навіть більше. В одному із втілень даного винаходу експресія CLDN6 і його наявність на клітинній поверхні мають місце тільки в ураженій тканині, а в здорових тканинах його експресія подавлена. Відповідно до даного винаходу захворювання за участю клітин, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що CLDN6 зв'язаний з їхньою поверхнею, включають онкологічні захворювання, наприклад ракові захворювання. Також відповідно до даного винаходу онкологічні захворювання, наприклад ракові захворювання - це переважно ті, при яких у пухлинних клітинах або ракових клітинах експресується CLDN6 і цей білок пов'язаний з їхньою клітинною поверхнею. У даному документі терміни "онкологічне захворювання", "захворювання, асоційоване з пухлиною" або "онкогенне захворювання" включають захворювання, які відрізняються порушенням регуляції клітинного росту, проліферації, диференціювання, адгезії й/або міграції, що може призводити до утворення пухлин і/або метастазів або до виникнення тенденції до їхнього утворення. Під "пухлинними клітинами" розуміють аномальні клітини, яким властива швидка безконтрольна проліферація й продовження клітинного росту і які продовжують розмножуватися й після того, як фактор, який ініціював клітинний ріст, припинив свою дію. Під "пухлиною" розуміється аномальна група клітин або тканина, яка швидко росте за рахунок безконтрольної проліферації, і яка продовжує рости після припинення дії фактора, який викликав клітинний ріст. Пухлинам властиво часткова або повна відсутність структурної організації й функціональної координації з нормальною тканиною; звичайно пухлина є окремою масою тканини, яка може бути доброякісною, передраковою або злоякісною. Переважно "онкологічне захворювання", "захворювання, асоційоване з пухлиною" або "онкогенне захворювання" відповідно до даного винаходу є раковими захворюваннями, тобто злоякісними захворюваннями, а пухлинна клітина є раковою клітиною. Переважно "онкологічне захворювання", "захворювання, асоційоване з пухлинами" або "онкогенне захворювання" відрізняються тим, що утворюються клітини, в яких експресується CLDN6 і він зв'язаний з їхньою поверхнею, і в пухлинних клітинах експресується CLDN6 і він зв'язаний з їхньою поверхнею. Клітини, у яких експресується CLDN6 і які відрізняються тим, що цей білок зв'язаний з їхньою поверхнею, переважно є пухлинними клітинами або раковими клітинами, переважно тих пухлин і ракових захворювань, які описані в даному документі. Бажано такі клітини не є плацентарними клітинами. Переважно ракові захворювання й злоякісні пухлини відповідно до даного винаходу вибирають із групи, яка складається з раку яєчника, у тому числі аденокарциноми яєчника й тератокарциноми яєчника, раку легенів, у тому числі дрібноклітинного раку легенів (SCLC) і недрібноклітинного раку легенів (NSCLC), особливо плоскоклітинної карциноми легенів і 21 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми й плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови й шиї, у тому числі злоякісної поліморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми й карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідноклітинної карциноми й папілярної карциноми, раку нирок, зокрема нирково-клітинної карциноми, включаючи світлоклітинну нирково-клітинну карциному й папілярну нирково-клітинну карциному, раку товстого кишківника, раку тонкого кишківника, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкого кишківника й аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, хоріокарциноми плацентарної ділянки, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка й ембріонального раку яєчка, раку матки, герміногенних пухлин, наприклад тератокарциноми або ембріональної карциноми, зокрема герміногенної пухлини яєчка та їх метастазуючих форм. Основними типами раку легені є дрібноклітинна карцинома легень (SCLC) і недрібноклітинна карцинома легень (NSCLC). Недрібноклітинну карциному легень поділяють на три основні підтипи: плоскоклітинна карцинома легень, аденокарцинома й крупноклітинна карцинома легень. На частку аденокарциноми доводиться приблизно 10 % усіх випадків раку легень. Ракові ураження цього виду звичайно помітні на периферії легенів – на противагу дрібноклітинного й плоскоклітинного раку, яким властива більш центральна локалізація. Рак шкіри – це злоякісні новоутворення в шкірі. Найпоширенішими раковими захворюваннями шкіри є базальноклітинний рак, плоскоклітинний рак і меланома. Злоякісна меланома – досить агресивне захворювання. Воно обумовлене неконтрольованим ростом пігментних клітин, які називаються меланоцитами. Відповідно до даного винаходу карцинома (рак) - це злоякісна пухлина, джерелом походження якої є епітеліальні клітини того або іншого органа. Бронхіолярна карцинома – це рак легень, джерелом походження якого є, як уважаються, епітелій дрібних дихальних шляхів (бронхіол); при цьому захворюванні неопластична тканина простирається уздовж стінок альвеол і проростає невеликими масами усередині альвеол. У деяких клітинах виявляється муцин, який є присутнім і в альвеолах, де також є денудовані клітини. Аденокарцинома – це пухлина, джерелом походження якої є залозиста тканина. Залозиста тканина відноситься до епітеліальної тканини, яка включає шкіру, залози й різноманітні вистілки порожнин і органів. У процесі ембріонального розвитку епітелій походить із ектодерми, ендодерми або мезодерми. Для того, щоб клітини можна було назвати аденокарциномними, вони не обов'язково повинні бути частиною залози – досить того, що вони здатні до секреції. Така карцинома зустрічається у вищих тварин і людини. Високо диференційована аденокарцинома схожа на залозисту тканину, з якої вона походить, тоді як мало диференційована аденокарцинома може бути на неї зовсім не схожа. Шляхом фарбування клітин у матеріалі біопсії патологоанатом може визначити, чи розглянута пухлина є аденокарциномою або ж іншим злоякісним утворенням. Аденокарциноми можуть виникати в різних тканинах організму, оскільки ті або інші залози є в ньому всюди. У кожної залози свій специфічний склад секрету, але всяка клітина, що проявляє екзокринну функцію, уважається залозистою і її злоякісна форма називається аденокарциномною. Злоякісні аденокарциноми проростають в інші тканини й часто дають метастази, якщо розвивалися досить довго. Найбільш поширений тип карциноми яєчника – аденокарцинома. Аденокарцинома яєчника включає серозну, муцинозу, світлоклітинну та ендометриоїдну аденокарциноми. Цистаденокарцинома – це злоякісна форма поверхневої епітеліально-стромальної пухлини, різновид раку яєчника. Поверхневі епітеліально-стромальні пухлини – це група неопластичних утворень у яєчнику, які, як уважається, походять із поверхневого епітелію яєчника (видозміненого перітонеума) або з ектопічної ендометриоїдної тканини або тканини фалопієвої труби. Такі пухлини становлять більшість усіх онкологічних уражень яєчника. Тератокарциномою називають герміногенну пухлину, яка представляє собою суміш тератоми й ембріональної карциноми, або хоріокарциноми, або тієї й іншої. Хоріокарцинома - це злоякісна трофобластична пухлина, досить агресивна, яка звичайно розвивається із плаценти. Для неї характерним є раннє поширення через кров у легені. Саркома – це рак сполучної тканини (кісткової, хрящової, жирової), при якому відбувається проліферація клітин, які походять з мезодерми, на відміну від карцином, походження яких епітеліальне. Синовіальна саркома – ракове ураження м'яких тканин в області суглобів кінцівок, яке зустрічається досить рідко. Нирковоклітинна карцинома, відома також під назвами "нирковоклітинний рак" або 22 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "нирковоклітинна аденокарцинома", - це рак нирок, який розвивається у вистілці проксимальних звивистих канальців, де відбувається фільтрація крові й відведення відходів. На сьогоднішній день нирковоклітинна карцинома є найпоширенішим раковим ураженням нирок у дорослих; із усіх пухлин сечостатевої системи це ракове захворювання відрізняється найвищою летальністю. Нирковоклітинна карцинома підрозділяється на світлоклітинну й папілярну. Світлоклітинна нирковоклітинна карцинома зустрічається частіше інших форм нирковоклітинної карциноми. Клітини світлоклітинної нирковоклітинної карциноми під мікроскопом виглядають дуже блідими або прозорими. Також часто зустрічається папілярна нирковоклітинна карцинома. При цьому захворюванні в більшості випадків пухлина утворює характерні невеликі пальцеподібні вирости (папіли). Герміногенна пухлина – це новоутворення, джерелом походження якої є клітини зародкової лінії. Герміногенні пухлини можуть бути злоякісними (раковими) або доброякісними. Клітини зародкової лінії в нормі перебувають у гонадах (яєчниках або сім′яниках). Герміногенні пухлини, які виникають поза гонадою (наприклад, в області голови й шиї, у роті, у області тазу; в ембріонах, у немовлят і маленьких дітей – найчастіше по середній лінії тіла, зокрема на кінці куприка) можуть бути вродженими дефектами, що виникли внаслідок помилок у ході індивідуального розвитку. Розрізняють два основні класи герміногенних пухлин – семіноми й несеміномні пухлини. Останні включають тератокарциноми, ембріональні карциноми, пухлини жовточного міхура, хоріокарциноми й диференційовані тератоми. Більшість клітинних ліній, отримані з несеміномних пухлин, еквівалентні ембріональним карциномам, тобто вони складаються повністю зі стовбурових клітин, які не диференціюються за звичайних умов, хоча деякі такі пухлини можуть реагувати на індуктори диференціювання, наприклад на ретиноєву кислоту. Метастаз – це результат поширення ракових клітин з місця первинного злоякісного ураження в інші частини тіла. Метастазування, тобто утворення метастазів, є дуже складним процесом, який залежить від відділення злоякісних клітин від первинної пухлини, їх проникнення в міжклітинний матрикс, проникнення крізь базальну мембрану й ендотелій у порожнині тіла й у просвіт судин, перенесення кров'ю й включення в органі-мішені. Коли утворюється нова пухлина, її ріст залежить від проростання крізь неї судин. Метастази нерідко утворюються навіть після видалення первинної пухлини, тому що в організмі можуть залишитися пухлинні клітини або компоненти, здатні до метастазування. В одному із втілень даного винаходу термін "метастази" відноситься до віддалених метастазів, тобто тих, що перебувають поза областю поширення від первинної пухлини лімфатичними судинами і вузлами у регіоні ураженого органа. Клітини вторинної пухлини (метастазу) такі ж, як у первинній пухлині. Це означає, наприклад, що якщо рак яєчника метастазує у печінку, то вторинна пухлина складається з аномальних клітин яєчника, а не з аномальних клітин печінки. Відповідно, ця пухлина в печінці називається метастатичним раком яєчника, а не раком печінки. Термін "лікування" означає введення пацієнтові описаної в даному документі речовини або композиції з метою запобігти або ліквідувати хворобу, включаючи зменшення пухлини в розмірах або числа пухлин у даного хворого; призупинення або уповільнення прогресування захворювання; інгібування або уповільнення розвитку нового захворювання в даного пацієнта; зниження частоти прояву або тяжкості симптомів і/або рецидивів в пацієнта, у якого на даний момент має місце рак або ж він був раніше; і/або продовження, тобто збільшення тривалості, життя хворого. Термін "лікування захворювання" включає лікування, скорочення тривалості хворобливого стану, полегшення тяжкості його перебігу, запобігання розвитку або інгібування прогресування патологічного процесу або погіршення стану хворого або затримку початку розвитку захворювання або його симптомів. Вираз "перебувати в групі ризику", "існує ризик розвитку захворювання", "підвищений ризик розвитку захворювання" означають, що для даного індивіда (хворого, пацієнта) імовірність розвитку того або іншого захворювання, зокрема раку, вище "нормальної", тобто середньої, у даній популяції. Крім того, ризик розвитку захворювання, зокрема раку, підвищений для індивідів, у яких було дане захворювання в минулому або воно є на даний час, тому що в такого індивіда можливе продовження розвитку цього захворювання. Для індивідів, у яких був або є на даний час рак, також підвищена ймовірність метастазування рака. Термін "імунотерапія" відноситься до лікування, при якому використовуються ті або інші імунологічні процеси. У контексті даного винаходу терміни "захищати", "запобігати", "профілактичний", "превентивний" або "захисний" відносяться до запобігання або лікування, або до того й іншого разом виникнення й/або поширення пухлини в індивіда. У контексті даного 23 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу термін "імунотерапія" бажано відноситься до активної імунізації або вакцинації пухлини. Профілактичне застосування імунотерапії, наприклад уведення композиції запропонованої даним винаходом, бажано захищає пацієнта від розвитку пухлинного росту. Терапевтичне застосування імунотерапії, наприклад терапевтичне введення композиції запропонованої даним винаходом, може вести до інгібування розвитку/росту пухлини, що включає уповільнення розвитку/росту пухлини, зокрема до переривання прогресу пухлини, що бажано веде до її ліквідації. Застосування імунотерапії в лікувальних цілях може захистити індивіда, наприклад, від поширення або метастазування існуючої пухлини. Термін "імунізація" або "вакцинація" означає процес уведення індивідові антигену для того, щоб викликати в нього імунну відповідь із метою лікування або профілактики. Терміни "індивід", "особа", "хворий", "пацієнт", "об'єкт лікування/профілактики" або "організм" уживаються в даному документі як синоніми й відносяться до хребетних, бажано до ссавців. Наприклад, ссавці в контексті даного винаходу – це люди й інші примати, свійські тварини (собаки, кішки, вівці, велика рогата худоба, кози, свині, коні тощо), лабораторні тварини (миші, пацюки, кролики, морські свинки тощо), а також тварини, які втримуються в неволі (наприклад, у зоопарку). Термін "тварина" у даному документі включає також людину. Терміни "індивід", "особина", "об'єкт лікування/профілактики" можуть також включати значення "пацієнт/хворий", тобто тварин, бажано людей, які страждають від тієї або іншої хвороби, переважно від хвороби, пов'язаної з експресією CLDN6, переважно від онкогенного захворювання, наприклад раку. Термін "ад′ювант" відноситься до речовин, які продовжують або підсилюють або прискорюють імунну відповідь. Композиції запропоновані даним винаходом бажано проявляють свою дію без додавання ад′ювантів. Проте, композиції запропоновані даною заявкою на патент можуть містити будь-який відомий ад′ювант. До ад′ювантів відносяться різні речовини, наприклад олійні емульсії (наприклад, ад′ювант Фрейнда і його модифікації), мінеральні речовини (наприклад, квасці), продукти бактеріального походження (наприклад, токсин Bordetella pertussis), ліпосоми, імуностимулюючі комплекси. Приклади ад′ювантів: монофосфорил-ліпід-A (MPL Smithkline Beecham), сапоніни, наприклад QS21 (Smithkline Beecham), DQS21 (Smithkline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, і QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неповні ад′юванти Фрейнда, повні ад′юванти Фрейнда, вітамін Е, монтанід, квасці, СpG-олігонуклеотиди (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) і різні емульсії типу "вода в олії", одержані з олій, які підлягають біологічному розщепленню, наприклад скваленів і/або токоферолу. Відповідно до даного винаходу зразок може бути будь-яким, який можна використовувати відповідно до даного опису, зокрема біологічним зразком, наприклад зразком тканини, включаючи рідини тіла й/або клітинні зразки, і який може бути отриманий звичайними методами, наприклад шляхом біопсії, включаючи пункційну біопсію, шляхом забору крові, бронхіального аспірата, мокротиння, сечі, калу або інших рідин тіла. Відповідно до даного винаходу термін "біологічний зразок" також включає фракції біологічних зразків. Термін "антитіло" відноситься до глікопротеїнів, які містять щонайменше два важкі (Н) ланцюги й два легкі (L) ланцюги, з'єднані між собою дисульфідними зв'язками, і включає будьяку речовину/молекулу, яка містить ділянку, що зв'язує антиген. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла та їх фрагменти або похідні, у тому числі (перераховані тут приклади не є обмежуючими): людські моноклональні антитіла, гуманізовані моноклональні антитіла, гібридні моноклональні антитіла, одноланцюгові антитіла, наприклад scFv і фрагменти антитіл, які зв'язують антиген, наприклад фрагменти Fab і Fab'; також цей термін включає всі рекомбінантні форми антитіл, (наприклад, антитіла, які експресуються в прокаріот), деглікозильовані антитіла й будь-які антиген-зв′язувальні фрагменти й похідні, описані в даному документі. Кожний важкий ланцюг антитіла складається з варіабельної області (позначається скороченням VH) і константної області. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області (скорочено VL) і константної області. Області VH і VL можна далі підрозділити на гіперваріабельні ділянки, які називаються ділянками, які визначають комплементарність (CDR), між якими є більш консервативні за структурою ділянки, які називаються каркасними (FR). Кожна варіабельна область як легкого, так і важкого ланцюга утворена трьома CDR і чотирма FR, які розташовуються в наступному порядку (рахуючи від N-кінця до С-кінця поліпептидного ланцюга): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області легких і важких ланцюгів містять зв′язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування молекули імуноглобуліну із тканинами або факторами власного організму, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Clq) системи комплементу. Відповідно до даного винаходу вираз "щонайменше одна з послідовностей CDR" переважно 24 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 позначає щонайменше одну послідовність CDR3. Вираз "послідовності CDR ланцюга антитіла" переважно відноситься до ділянок CDR1, CDR2 і CDR3 важкого або легкого ланцюга антитіла. Відповідно до даного винаходу якщо вказується, що який-небудь ланцюг антитіла містить конкретну послідовність CDR, наприклад послідовність CDR3, це означає, що зазначена конкретна послідовність CDR або утворює ділянку CDR, наприклад ділянку CDR3 зазначеного ланцюга антитіла (тобто ділянка CDR складається із зазначеної конкретної послідовності CDR), або утворює частину ділянки CDR, наприклад ділянки СDR3 зазначеного ланцюга антитіла (тобто ділянка CDR містить зазначену конкретну послідовність CDR). Якщо відповідно до даного винаходу вказується, що антитіло містить конкретний важкий ланцюг і/або конкретний легкий ланцюг, наприклад ланцюг, який містить певні послідовності CDR, то бажано, щоб обидва важкі ланцюги й/або обидва легені ланцюги даного антитіла кожен складається з певного важкого ланцюга й/або певного легкого ланцюга. Термін "гуманізовані антитіла" відноситься до молекул, у яких є антиген-зв′язувальна ділянка, джерелом походження якої є в основному нелюдський імуноглобулін, а в основі іншої частини молекули є послідовність і/або структура людського імуноглобуліну. У такого антитіла антиген-зв′язувальна ділянка може містити або повністю варіабельні домени, приєднані з константним доменам, або тільки області, які визначають комплементарність (CDR), приєднані до каркасних ділянок варіабельних доменів. Ділянки, які зв'язують антиген, при цьому можуть бути нативними або ж модифікованими шляхом однієї або більше амінокислотних замін, наприклад модифікованими таким чином, щоб була більшою подібність до імуноглобулінів людини. У деяких формах гуманізованих антитіл зберігаються всі послідовності CDR (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить усі шість послідовностей CDR з мишачого антитіла). В інших формах гуманізованих антитіл є одна або більше послідовностей CDR, змінених у порівнянні з вихідним антитілом. Термін "гібридні антитіла" відноситься до таких антитіл, у яких одна частина кожної амінокислотної послідовності як легких, так і важких ланцюгів гомологічна відповідним послідовностям антитіл, які походять від певного виду тварин або належать до певного класу, у той час як інша частина тієї ж послідовності гомологічна відповідним послідовностям інших антитіл. Звичайно варіабельні області як легких, так і важких ланцюгів подібні до варіабельних областей антитіл, які походять від одного виду ссавців, а константні частини гомологічні послідовностям антитіл, які походять від іншого виду. Одна з явних переваг таких гібридних форм полягає в тому, що варіабельна область може походити з відомих джерел, що зручно, тому що можна використовувати легко доступні В-клітини або гібридоми від інших (не від людини) організмів у комбінаціях з константними областями, які походять з, наприклад, препаратів людських клітин. Якщо варіабельні області порівняно легко одержати і їх специфічність не залежить від джерела, то константні області, будучи людськими, з меншою ймовірністю викличуть імунну відповідь у людини при введенні таких антитіл, ніж викликали б константні області, які походять від іншого виду живих організмів. Втім, дане визначення не обмежується цим конкретним прикладом. Термін "ділянка, яка зв'язує антиген" (антиген-зв′язувальна ділянка) антитіла (або просто – "ділянка зв'язування") у даному документі відноситься до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Показано, що функція зв'язування антигену може здійснюватися фрагментами антитіла, тобто вся його послідовність для цього не потрібна. Приклади зв′язувальних фрагментів, охоплених терміном "антигензв′язувальна ділянка", включають: (i) фрагменти Fab - одновалентні фрагменти, які складаються з доменів VL, VH, CL і CH; (ii) фрагменти F(ab') 2 – двовалентні фрагменти, що містять два фрагменти Fab, з'єднаних дисульфідним "містком" у шарнірній області; (iii) фрагменти Fd, які складаються із доменів VH і CH; (iv) фрагменти Fv, які складаються із доменів VL і VH одного "плеча" молекули антитіла, (v) фрагменти dАb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), які складаються із домена VH; (vi) ізольовані ділянки, що визначають комплементарність (CDR) і (vii) комбінації двох або більше ізольованих CDR, які за необхідності можуть бути з'єднані синтетичною лінкерною структурою. Також, хоча два домена фрагмента Fv-VL і VH – кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, застосовуючи технологію рекомбінантної ДНК, за допомогою лінкерної структури, що дозволяє одержувати їх як єдиний поліпептидний ланцюг, у якому області VL і VH становлять пару, що утворює одновалентну молекулу (яка називається одноланцюговим Fv, скорочено scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла теж охоплюються терміном "антиген-зв′язувальна ділянка" антитіла. Інший приклад – гібридні білки типу "зв′язувальний домен-імуноглобулін", що містять (i) поліпептид, який є зв′язувальним доменом і приєднаний до поліпептиду, який представляє собою шарнірну область молекули 25 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліну, (ii) константну область важкого ланцюга імуноглобулінової молекули CH2, приєднану до шарнірної області, і (iii) константну область важкого ланцюга імуноглобулінової молекули CH3, приєднану до константної області CH2. Поліпептид, який формує зв′язувальний домен, може бути варіабельною областю важкого ланцюга або варіабельною областю легкого ланцюга. Гібридні білки типу "зв′язувальний домен-імуноглобулін" також описані в заявках на патент США 2003/0118592 і 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл отримані із застосуванням звичайних методів, відомих фахівцям у даній галузі техніки; можливість практичного використання таких фрагментів виявляється в такий же спосіб, як інтактних антитіл. Термін "епітоп" відноситься до антигенної детермінанти молекули, тобто до тієї частини молекули, яка розпізнається імунною системою, наприклад, яка розпізнається антитілами. Наприклад, епітопи є дискретними просторовими структурами на антигенній молекулі, які розпізнаються імунною системою. У контексті даного винаходу епітоп бажано походить із білка CLDN. Епітопи звичайно складаються з хімічно активних поверхневих груп, наприклад амінокислотних залишків або бічних ланцюгів цукрів, і мають специфічні властивості відносно просторової структури й електричного заряду. Розрізняють конформаційні й неконформаційні епітопи: перші втрачають здатність до зв'язування в присутності денатуруючих розчинників, а другі ні. Епітопи таких білків, як клаудини, бажано містять неперервні (секвенціальні) або складові (переривчасті, комбіновані) ділянки зазначених білків і містять бажано від 5 до 100, бажано від 5 до 50, більш бажано від 8 до 30, найбільш бажано від 10 до 25 амінокислотних залишків; наприклад, епітоп може бути довжиною бажано 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислотних залишків. Термін "переривчастий (складний, комбінований) епітоп" у даному документі означає конформаційний епітоп на білковій антигенній молекулі, сформований щонайменше двома роздільними ділянками первинної структури (амінокислотної послідовності) цього антигенного білка. Термін "молекула з подвійною специфічністю" ("біспецифічна молекула") позначає будьякий агент, наприклад білок, пептид або білковий або пептидний комплекс, який має дві різні специфічності зв'язування. Наприклад, така молекула може зв'язуватися (взаємодіяти) з (а) антигеном клітинної поверхні й (b) рецептором Fc на поверхні ефекторної клітини. Термін "поліспецифічна молекула" або "гетероспецифічна молекула" позначає будь-який агент, наприклад білок, пептид або білковий або пептидний комплекс, який має більш ніж дві різні специфічності зв'язування. Наприклад, така молекула може зв'язуватися (взаємодіяти) з (а) антигеном клітинної поверхні й (b) рецептором Fc на поверхні ефекторної клітини (b) і (с) ще щонайменше з одним іншим компонентом. Відповідно, даний винахід включає (але не обмежується перерахованим тут) молекули із двома, трьома, чотирма й багатьма специфічностями зв'язування, спрямовані CLDN6 і проти інших мішеней, наприклад рецепторів Fc на ефекторних клітинах. Термін "біспецифічні антитіла" також включає диантитіла. Диантитіла є бівалентними біспецифічними антитілами, у яких домени VH і VL синтезуються як єдиний поліпептидний ланцюг, але з використанням лінкерної структури, занадто короткої, щоб допустити об'єднання двох доменів одного й того ж ланцюга, тим самим змушуючи з'єднуватися комплементарні домени різних ланцюгів, так що створюються дві ділянки зв'язування антигену (див., напр., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). У даному документі термін "гетероантитіло" відноситься до двох або більше антитіл, похідні або антиген-зв′язувальні ділянки яких з'єднані разом, причому щонайменше два з них мають різну специфічність. Ці різні специфічності включають специфічність зв'язування з рецептором Fc на ефекторних клітинах і специфічність зв'язування з антигеном або епітопом на клітинімішені, наприклад на пухлинній клітині. Антитіла, описані в даному документі, можуть бути людськими. Термін "людське антитіло" у даному описі позначає антитіла, які мають варіабельні й константні області, які походять з імуноглобулінових послідовностей зародкової лінії людини. Людські антитіла запропоновані даним винаходом можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються імуноглобуліновими послідовностями зародкової лінії людину (наприклад, мутації, які виникли шляхом випадкового або ж спрямованого (сайт-специфічного) мутагенезу in vitro або шляхом соматичних мутацій in vivo. Термін "моноклональні антитіла" у даному документі відноситься до препаратів антитіл, які включають молекули одного складу й будови. Моноклональне антитіло має єдину специфічність зв'язування й спорідненість до певного епітопу. В одному із втілень даного винаходу моноклональні антитіла виробляються гібридомами, які включають В-клітини, отримані від тварин (не людини), наприклад мишей, злиті з іморталізованими клітинами. 26 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "рекомбінантні антитіла" у даному документі включає всі антитіла, отримані, експресовані, синтезовані або виділені за допомогою методів, які використовують рекомбінацію, наприклад (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, з миші), трансгенної або трансхромосомної щодо генів імуноглобулінів, або з отриманої від нього гібридоми, (b) антитіла, виділені з клітини-хазяїна, трансформованої таким чином, щоб у ній експресувалось дане антитіло, наприклад із трансфектом, (с) антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл, і (d) антитіла, отримані, експресовані, синтезовані або виділені будь-якими іншими способами з використанням сплайсинга генів імуноглобулінів з іншими послідовностями ДНК. Термін "трансфектома" у даному документі включає рекомбінантні еукаріотичні клітинихазяї, у яких експресуються антитіла, наприклад клітини СНО, NS/0, HEK293, HEK293T, клітини рослин або грибів, включаючи дріжджі. Термін "гетерологічні антитіла" у даному документі визначається відносно трансгенного організму, який виробляє такі антитіла. Цей термін відноситься до антитіл, які мають амінокислотну послідовність або, які кодовані нуклеотидною послідовністю, яка відповідає такій в організмі, який не є трансгенним, і джерелом походження яких, як правило є організм не того виду, до якого відноситься трансгенний організм. Термін "гетерогібридні антитіла" у даному документі відноситься до антитіл, у яких легкі ланцюги й важкі ланцюги походять від різних організмів. Наприклад, антитіла, у яких важкий ланцюг людський, а легкий ланцюг мишачий, є гетерогібридними. Даний винахід включає всі антитіла й похідні антитіл, описані в даному документі, які з метою даного винаходу охоплюються терміном "антитіла". Термін "похідні антитіл" відноситься до будь-яких модифікованих форм антитіл, наприклад до кон′югатів антитіл та іншого агента або антитіла, або фрагмента антитіла. Антитіла, описані в даному документі, бажано є ізольованими. Під ізольованими антитілами в даному документі мають на увазі антитіла в основному без домішок інших антитіл з іншими антигенними специфічностями (наприклад, ізольовані антитіла, які специфічно зв'язуються з CLDN6, в основному не містять антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від CLDN6). Ізольовані антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом, ізоформою або варіантом людського CLDN6, можуть, однак, проявляти перехресну реактивність у відношенні інших, споріднених антигенів, наприклад від інших видів живих організмів (наприклад, гомологічних CLDN6). Крім того, ізольоване антитіло в основному не містить іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. В одному із втілень даного винаходу "комбінація ізольованих моноклональних антитіл" означає антитіла з різними специфічностями, об'єднані в певній композиції. Відповідно до даного винаходу антитіла здатні зв'язуватися з певною мішенню, якщо вони мають значну спорідненість до зазначеної певної мішені й зв'язуються із зазначеною певною мішенню в стандартних аналітичних системах на зразок описаних у даному документі. Бажано антитіла здатні зв'язуватися з деякою мішенню, якщо зв'язування зазначених антитіл із зазначеною мішенню на поверхні інтактних клітин можна виявити й виміряти методом проточної цитометрії (FACS). Краще зв'язування антитіл із зазначеною мішенню можна виявити й виміряти при концентрації антитіл 10 мкг/мл або менше, 5 мкг/мл або менше, або 2 мкг/мл або менше. Краще зв'язування антитіл із зазначеною мішенню можна виявити й виміряти при концентрації антитіл 50 нМ або менше, 30 нМ або менше, або 15 нМ або менше. Спорідненість (спорідненість зв'язування) часто кількісно визначають константою рівноваги реакції дисоціації (KD). Бажано термін "значна спорідненість" відноситься до зв'язування з визначеною мішенню, -5 -6 -7 -8 -9 для якого (KD) = 10 M або менше, 10 M або менше, 10 M або менше, 10 M або менше, 10 -10 -11 -12 M або менше, 10 M або менше, 10 M або менше, або 10 M або менше. Для антитіл запропонованих даним винаходом бажано величина EC50 при зв'язуванні з CLDN6 становить 6500 нг/мл або менше, 3000 нг/мл або менше, 2500 нг/мл або менше, 2000 нг/мл або менше, 1500 нг/мл або менше, 1000 нг/мл або менше, 500 нг/мл або менше, 400 нг/мл або менше, 300 нг/мл або менше, 200 нг/мл або менше або 100 нг/мл або менше. Антитіла не здатні (практично) зв'язуватися з даною мішенню, якщо відсутня значна спорідненість до зазначеної мішені й при використанні стандартних аналітичних систем не виявляється значного зв'язування цих антитіл із зазначеною мішенню. Бажано, антитіла не здатні (практично зв'язуватися з даною мішенню, якщо при аналізі методом проточної цитометрії (FACS) не виявляється зв'язування із зазначеною мішенню на поверхні інтактних клітин. Переважно зв'язування антитіл із зазначеною мішенню не виявляється при концентрації антитіл до 2 мкг/мл, бажано до 5 мкг/мл, бажано до 10 мкг/мл, бажано до 20 мкг/мл, ще краще до 50 мкг/мл, особливо до 100 мкг/мл або до 150 мкг/мл, до 200 мкг/мл або більше. Переважно 27 UA 115969 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування антитіл із зазначеною мішенню не виявляється при концентрації антитіл до 15 нМ, бажано до 30 нМ, бажано до 50 нМ, бажано до 100 нМ, бажано до 150 нМ або до 170 нМ, до 300 нМ, до 600 нМ, до 1000 нМ, до 1300 нМ або більше. Переважно зв'язування антитіл із зазначеною мішенню не виявляється при концентрації насичення, антитіл для зв'язування з даною мішенню, тобто з CLDN6. Бажано значна спорідненість антитіл до даної мішені відсутня, 3 4 5 6 якщо KD щонайменше в 10, 100, 10 , 10 , 10 або 10 раз більше, ніж KD для зв'язування з визначеною мішенню, з якою дані антитіла здатні зв'язуватися. Наприклад, якщо KD для -7 зв'язування даних антитіл з певною мішенню, з якою вони здатні зв'язуватися, становить 10 M, то KD для зв'язування цих антитіл з мішенню, до якої немає значної спорідненості, буде -6 -5 -4 -3 -2 -1 щонайменше 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або 10 M. Антитіла є специфічними до певної мішені, якщо вони здатні зв'язуватися із зазначеною певною мішенню, але не здатні зв'язуватися з іншими мішенями, тобто не мають значної спорідненості до інших мішеней і в стандартних аналітичних системах не виявляється значного зв'язування з іншими мішенями. Відповідно до даного винаходу антитіла є специфічними у відношенні до CLDN6, якщо вони здатні зв'язуватися з CLDN6, але не здатні зв'язуватися з іншими мішенями, зокрема з іншими клаудиновими білками, відмінними від CLDN6, наприклад з CLDN9, CLDN4, CLDN3 і CLDN1. Бажано, антитіла є специфічними у відношенні CLDN6, якщо спорідненість до інших клаудинових білків, відмінних від CLDN6, наприклад до CLDN9, CLDN4, CLDN3 і CLDN1, і зв'язування з ними не перевищують істотну спорідненість і зв'язування з білками, не споріднених з клаудинами, наприклад з бичачим сироватковим альбуміном (BSA), казеїном, людським сироватковим альбуміном (HSA) або з неклаудиновими трансмембранними білками, наприклад з білками MHC або з рецептором трансферину або з будь-яким іншим відомим поліпептидом. Бажано антитіла є специфічними до певної мішені, якщо вони 3 4 5 зв'язуються із певною мішенню з KD, величина якого щонайменше в 10, 100, 10 , 10 , 10 або 6 10 разів менша, чим KD для зв'язування з мішенню, у відношенні якої ці антитіла не є специфічними. Наприклад, якщо KD для зв'язування даних антитіл з певною мішенню, у -7 відношенні якої вони є специфічними, становить 10 M, то KD для зв'язування цих антитіл з -6 -5 -4 -3 -2 мішенню, до якої вони не є специфічними, буде щонайменше 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 -1 M або 10 M. Зв'язування антитіл з мішенню можна визначити експериментальним шляхом за допомогою будь-якого придатного методу; див., наприклад, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), і способів, описаних у даному документі. Спорідненість можна легко визначити за допомогою звичайно застосовуваних для цієї мети методів, наприклад шляхом рівноважного діалізу; за допомогою біосенсорів Biacore 2000 шляхом стандартної процедури згідно з інструкціями виробника; шляхом радіоімунологічного аналізу з використанням радіоактивно міченого антигену-мішені або будьяким іншим шляхом, відомим фахівцям у даній галузі техніки. Аналіз даних щодо спорідненості можна проводити, наприклад, методом, описаним в роботі Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Scl, 51:660 (1949). Числові значення параметрів спорідненості для даної взаємодії антитіло-антиген можуть варіювати залежно від умов їх визначення, наприклад від концентрації солей, величини рН. Таким чином, визначені експериментальним шляхом значення спорідненості або інших параметрів, які характеризують взаємодію антитіла з антигеном, можуть варіювати залежно від умов визначення, наприклад від концентрації солей і величини рН. Таким чином, при вимірюваннях спорідненості та інших параметрів, які характеризують взаємодію антитіла з антигеном, наприклад KD і IC50, бажано використовувати стандартизовані розчини антитіл і антигенів та стандартні буферні розчини. Унікальною властивістю антитіл запропонованих даним винаходом є їхня здатність зв'язувати клаудин 6 клітинної поверхні. Це демонструється результатами аналізу клітин, у яких експресується клаудин 6, методом проточної цитометрії. Для того, щоб визначити зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, у яких експресуються клаудини, можна застосувати метод проточної цитометрії. Коротко, це здійснюють наступним чином. Клітини потрібних ліній, у яких експресуються пов'язані з мембраною клаудини (вирощені за стандартних умов культивування) змішують із розчином антитіл (у різній концентрації) в PBS, який містить 2 % інактивованої нагріванням FCS і 0,1 % NaN3 при 4 °C протягом 30 хв. Потім клітини промивають, після чого вони взаємодіють із флуоресцентно міченими другими антитілами за тих же умов, за яких проводилася реакція з першими антитілами. Зразки аналізують шляхом FACS, реєструючи пряме й бічне світлорозсіювання кожної окремої клітини й визначають зв'язування мічених антитіл. Термін "зв'язування", відповідно до даного винаходу, відноситься переважно до 28