Спосіб очистки людського beta-інтерферону

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для очистки человеческого {Ъ-интерферона» Цель - повышение производительности процесса. Раствор сырого интерферона пропускают через обездвиженный синий агарозный г е л ь , элюируют и элгсат д о полнительно пропускают через х е л а т металлический носитель с остатком хелатирования, включающим по меньстей мере ион одного металла из группы С о + г , N i + z , Zn + 2 « pH контактирования с синим агарозным гелем 5-9, 10 табл. Изобретение относится к медицине, а именно к способу очистки человеческого интерферона, особенно человеческого р-интерферона. Цель изобретения - повышение производительности процесса. Способ осуществляют следующим образом. Сырой интерферон, полученный в р е зультате деятельности клеток ч е л о в е ка, обрабатывают обездвиженным синим носителем. Интерферон, поглощенный на обездвиженном синем носителе, элюируют элюентом. Затем отбираемый р а с т вор интерферона обрабатывают х е л а т металлическим носителем с остатком хелатирования, включающим по меньшей мере ион одного металла, выбранный из группы, состоящей из Со , Ni + и Zn . Интерферон, поглощенный на хелатметапличрском носителе, отделяют от носителя, получая препарат интерФе рона большой чистоты и высокой -концентрации» Раствор сырого интерферона сначала приводят в контакт с обездвиженным синим носителем. Синий краситель можно обездвиживать на любом из разнообразных обычно и с пользуемых носителей, способном соединяться с красителем. В число таких носителей входят (А) соединение красителя через амино-группу антрахиноновой части с агарозой, активированной бромистым цианом; ( в ) соединение красителя с гелем поперечно связанной агарозы способом триазинового соединения через эфирную с в я з ь ; (С) соединение синего декстрана R (декстран, соединенный с синим красителем, фирма "Фармесиэ") с агароэой, активированной бромистым цианом методом триазинового соединения; (Д) соединение синего красителя, связанного с -( О1 со 3 1523046 боковой цепью АФфиа-геля 10® К(Ъирмы "Био-Рад л э б . " именуемой ниже "Био-Рад 1 ) через пептидную свячь с полисахаридным носителем. Модно также использовать другие носители, например поперочко :вяяанныи декстрановый г е л ь , например СеЛадекс•® ( ф и р ма "Лармесиэ") 5 и виниловый полимер с гидроксильными группами а который 10 также можно испоттьзовать как носитель для для хєлатметаплическои хроматографии в следующей стадии к предпочтителен гидрофильный гранулированный полимер, например, ^ о й о п ё р л ^ (фир- 15 ма "Тойо сода к о м п . " ) . Предпочтительно использовать синий агарозовый гель, соответствующий СБ), так как он весьма эффективно связывается с интерфероном, не вызы- 20 вает отделения красителя от носителя, поскольку соединение красителя с носителем является весьма стабильным в условиях рН от 6 до 13, и он легко доступен на рынке. Этот синий агарозо~25 вый гель имеет следующую структуру и реализуется под товарным наименованием -"Блу сефароз С1г-бв"(фирма "сЬарме"Матрекс гель блу А (фирма "Амикон KOPHV; и п Аффи-гель блу 30 SO3H 35 Поперечно связанный агарочовый гель Для контактирования обездвиженного синего носителя с раствором сырого интерферона можно использовать либо порционный метод, либо колонный способ. П р и м е р 1. Раствор сырого интерферона был получен путем обработки человеческих фибробластовых клеток в среде M M Игла, содержавшей E 0,4% метилцеллгшозьґ с гголи 1$ поли С, с последующей обработкой пиклогексимидом и актиномицином Д, К 30 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона б в 2 * и10 им.едо было добавлено 21 мг белка и 100 мкг. агтгномицика Д ка 1 л , 30 мл геля синей агарозы (*Аффи1 гель блу ^ фирмы "Био-Рад' )» После перемешивания в течение 40 ч и вы 40 45 50 55 держивания в течение 3 ч надосадочная жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой физиологическим раствором, содержащим фосфатнокислоткый буфер„ Надосадочная жидкость была и з в л е ч е на снова 0 Колонну дважды промывали и элюировапИо Использовали следунгщие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (320 мл)і раствор 1,0 М хлористого н а т р и я , содержащий 10 м фосфорМ нокислого натрия (рН 7,2) второй промывочный раствор (280 м л ) : 25%-ный раствор этиленгпиколя ? содержащий 10 м фосфорнокисМ лого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2) элюент (400 м л ) : 55%-ный раствор этиленгликоля^ содержащий 10 м фосфорнокисМ лого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7 , 2 ) О Получен выход частично очищенного интерферона в элюате(300 мл) 81% от исходного раствора интерферона, очищение в 33 р а з а . Б колонну с хелатом пинка (,10 мл; элюат (285 мл) и колонны геля синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мл/г о Посла двойной промывки колонну элкщровапИо Использовали следующие промывочные растворы и элюент! первый промывочный раствор (300 м л ) : дистиллированную воду и 0,Г М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/г в течение 1 ч поочередно второй промывочный раствор (50 мл): 20 м раствор лимоннокислого М натрия (рН 5,0) элюечт: 0,1М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий (рН 4 , 5 ) . Выход хелатцкнковой хроматографии 87%, а общий выход 70%„ Достигнута очистка в 330 р а з . Активность и выход интерферона, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табле1. Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакрчламидкого геля„ Часть конечного элюата подвергли диализу в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) и лиофилировалио После восстановления лиофилированного диализата 2-меркаптоэтанолом в о с с т а новленный материал подвергли э л е к т р о - Ї0 форезу с использованием полиакриламидного геля в присутствии НДС с о г ласно способу Лэмли (Нейчэр, 227, 680-685 ( 1 9 7 0 ) ) для проведения анали з а активности интерферона и к р а с и т е 15 ля с о о . . о о „ блестящей синью R 200. В р е з у л ь т а т е активность интерферона и темно-синяя полоса были обнаружены только в положении, с о о т в е т с т в о в а в шем молекулярному весу примерно 20 23000 о Анализ актиномицина Д о Анализ актиномицина Д был проведен способом биологической пробы 0 Часть конечного элюата обессолили 25 путем гель-хроматографии, используя Сефадекс G 2 5 ^ после добавления сывороточного альбумина человека (1 м г / м л ) . Добавляя дополнительно небольшое количество сывороточного 30 альбумина человека и лактозы обессоленный элюат профильтровали через фильтр 2 мкм и лиофилировали, Актиномицин Д был обнаружен в количестве не больше 0 , 0 0 0 3 м к г / 1 0 6 имоед0 ак35 тивности интерферона. Элюат из колонны геля синей а г а р о зы содержал 0,7 мкг/м актиномицина До Общее количество актиномицина Д составило 210 мкг в Кроме т о г о , присутствие актиномицина Д в элюате из колонны геля синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 нм) и путем биопробы о Часть элюата из колонны геля синей агарозы обессолили способом г е л ь хроматографии с использованием Сефадекс G-25® после добавления челов е ч е с к о г о сывороточного альбумина. Удаляя этиленгликоль, обессоленный элюат лиофилировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/10** и м 0 е д о интерферонной активности актиномицина Д. Пирогенное испытание на кроликах 0 Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилированный материал инъектировали внутривенно трем кроликам (2*10 имоедо/кг 40 45 50 55 массы к р о л и к а ) . Суммирование пнрексии для всех трех кроликов было 0,6 С Интерферон, очищенный по п р е д л а г а е мому способу, оказался отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах„ Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны геля синей агарозы, инъектировали внутривенно трем кроликам ( 2 - 1 0 ^ и м о ед/кг массы кролика )„ Суммирование пирексии для всех трех кроликов было 1,5°С» Интерферон, очищенный согласно способу хроматографии синей агарозы, оказался неопределенно отрицательным к пирогенному испытанию ка кроликах,, П р и м е р 2, Б этом эксперименте испопьзовали раствор сырого и н т е р ферона, подобный использовавшемуся в примере 1, 20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей а г а розы объемом 20 мл (Матрекс гель блу А ^ , фирмы "Амикон к о р п " ) . Колонну трижды промыли и элюировалис Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (200 м л ) : 1 I M хлористый натрий, содержащий 10 м фосфорнокислого М натрия (рН 7 , 2 ) , второй промывочный раствор (200 м л ) : 25%-ный раствор эткленгликоля, содержащий 10 м фосфорнокисМ лого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7 , 2 ) . третий промывочный раствор (40 м л ) ; 40%-ный раствор зтиленгликоля, содержащий 10 м фосфорнокисМ лого натрия и I M хлористого натрия (рН 7 , 2 ) , элюент (200 м л ) : 55%-ный раствор зтиленгликоля, содержащий 10 м фосфорнокислоМ го натрия и 1 М хлористого н а т рия о Хелатцинковую колонну'[5 мл) с о е динили с выходом колонны синей а г а р о зы после начала элюироваиия, и элюат из колонны синей агарозы непосредственно пропускали через хелатцинковую колонну а Затем хелатцинковую к о лонну дважды промыли и элюировали а Промывочные растворы и элюент были следующими: ' 323046 первый промывочный раствор (200 мл): дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) поочередно второй промывочный раствор (20 мл): 20 м лимоннокислый натрий М (рН 5 , 0 ) : элюент: 10 0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий, содержащий ї М хлористого н а т рия. Интерферонная активность, выход, 15 количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл о 2, П р и м е р 3 . 20 л раствора сырого интерферона с интерферонноЙ ак20 тивностью 15-10 им. ед 0 и 60 мг/л общего белка контактировали с 40 мл синеагарозного носителя (Матрекс гель Блу А® фирмы "Амикон к о р п о " ) » Носитель, на который был адсорбиро25 ван интерферон, загрузили на колонну. Затем колонну дважда промыли и элюировали о Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор 30 (400 м л ) : раствор хлористого натрия 1 М, содержащий і0 м фосфорнокислоМ го натрия (рН 7 , 2 ) 0 второй промывочный раствор 35 (400 м л ) : 25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 м ФосфорнокислоМ го натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7»2) О 40 элюент.(400 мл). 100 мл раствора интерферона, отобранного из колонны синей агарозы, пропустили через 5 мл хелатникелевую к о лонну. Использованная колонна хелата 45 никеля была приготовлена так же, как в примере 1, з а исключением того, что вместо раствора хлористого цинка и с пользовали раствор хлористого никеля. Хелатникелевую колонну промыли и 50 элюировапи е Использовали следующие промывочный раствор и элюент: промывочный р а с т в о р : дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) 55 использовали поочередно элюент: 0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый 8 натрий, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4 , 5 ) . Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл о 3„ Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогенных веществ и был отрицательным относительно испытания Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д. П р и м е р 4 . Была повторена процедура примера 3 з а тем исключением, что хелаткобальтовую колонну и с пользовали вместо хелатникелевой к о лонны, причем хелаткобальтовую к о - * " лонну приготовили как в примере 1, но вместо хлористого цийка использовали раствор хлористого кобальта. Элюат (і5 мл) содержал 4,5*10 им„ ед о интерферона (выход 60%) и 0,25 мг белка 0 Удельная активность с о с т а в л я е ла 1 , 8 ' 1 0 ЙМО едо/мг белка. Конечный элюат бьіл отрицательным к испытанию Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д. П р и м е р 5 о Культивировали штамм Е. коли, в котором был и н т е г рирован структурный ген р-интерферон а , и культивированный штамм подвергли процедурам сбора бактерий, измельчения бактерий, удаления нуклеиновой кислоты и осаждения сульфатом аммоний. Белковую фракцию, содержащую |3~интерферон, полученный из штамма Е.коли, растворипи в 25%-ном р а с т в о ре этиленгликоля, содержащем 1 М хлористого натрия и !0 м фосфорнокислоМ го натрия (рН 7 , 2 ) , с целью получения раствора сырого интерферона. Раствор сырого интерферона имел интерферокную активность 5*10 им 0 ед 0 и 20 мг белка на 1 мл„ 40 мл раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мл —j синей агарозы (Матрекс гель блу А фирмы "Амикон к о р п . " ) , уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натрия, содержащем 1 М хлористого натрия„ Колонну дважды промыли с целью удаления примерно 95% белка в растворе сырого интерферона, и элюировалн с фракционированием в каждую фракцию 2 мл. Использовали следующие промывочные растворы и элюенті первый промывочный раствор (10 мл): 25%-ньгЙ раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого н а т 1523046 10 что вместо хелатникелевой колонны рия и 10 м фосфорнокислого н а т М использовали хелатцинковую колонну и рия в качестве злюєнтя испопьзовали 0,2 М второй промывочный раствор (10 мл; pacrsop L-гистидин, ураБновешенный 40%-ный раствор этиленгликол", хлористый натрием (рЯ 7 , 0 ) . содержащий 1 М хлористого н а т Элюат (20 мл) имел 50 10 и м о е д о рия и 10 м фосфорнокислого М интерферона (выход 67%) и 50 г общенатрия го белка. Удельная активность была элюент: 60%-ный раствор этиленгликоля, JQ 1,0-10* им.ед./мг белка 0 П р и м е р 7. Использовали сырой содержащий 1 М хлористого натинтерферон, полученный из человечесрия и 10 нМ фосфорнокислого ких фибробпастовых клеток 5 аналогичнатрия о ный интерферону, использованному в Элюат (12 мл) из колонны синей а г а розы имел интерферонную активность f5 примере I , К 20 л раствора сырого интерферо] , 6 - 1 0 7 им.ед, (выход 80%) и 4,6 мґ на с активностью интерферона 4 2 і 1 0 белка о Средняя удельная активность в и м о е д . и концентрацией белка 70 мг/л каждой фракции была 2,5-10 и м 0 е д 0 / м г добавили 30 мл геля синей агарозы белка (максо і 5-10 и м . е д о / м г б е л к а ) , Элюат подвергли анализу так же, 20 (Matrex Gel Blue A®"Am:сOn c o r p " ) После перемешивания смеси в течение как в примере J . В результате чистота 3 су г и выдержки в течение З й ч удалиинтерферонной активности при молекули надосадочный слой и гель Синей лярном в е с е примерно 19000 составляла агарозы пропустили через колонну, 10-50% (средняя 25%). 6 мл элюата из колонны синей агаро-25 промывая 200 мп 1,0 М раствора х л о ристого натрия, содержащего 10 м М зы пропустили через 1 мл хелатцинкоЛосфата натрия с рН 7,2 (буфер А). вой колонны, уравновешенной 60%-ным Затем колонну дважды проі^ьши0 раствором этиленгликоля, содержащим 1 М хлористого натрия и 1 мМ фосфорПеред элюированием интерферона для нокислого натрия„ Колонну трижды про- зд улучшения очистки к выходу вышеукамыли и злюировали. Использовали с л е занной колонки ггодсоединили1 колонку дующие промывочные растворы и элюент: с 15 мл свежего геля агарозы, у р а в первый промывочный раствор (6 м л ) : новешенного буфером А, содержащим 60%-ный раствор этиленгликоля , 25%-ный раствор этиленгликоля„ После содержащий 1 М хлористого н а т третьей промывки интерферон элюирова35 ли„ Использовали следующие промывочрия и 10 м фосфорнокислого М натрия ные растворы и элюент: второй промывочный раствор (6 м л ) : первый промывочный раствор (200 мл) дистиллированная вода буфер А третий промывочный раствор (6 м л ) : .второй промывочный раствор (300 мл)і 220 мМ буферный раствор фосфорбуфер А, содержащий 25%-растнокислого натрия, содержащий вор этиленгликоля, 2 М хлористого натрия (рН 6,0)» третий промывочный раствор (120 мгт); элюент; З М раствор хлористого натрия, 0,1 М буферный раствор уксусно- .,содержащий 30 м фосфорнокислоМ кислого натрия, содержащий I M го натрия (рН 7,2) и 30%-ный хлористого натрия (рН 4,0) 10 им о ед ц буфер А, содержащий 55%-ный (выход 50%) и 0 9 4 мг белка. Удельная раствор этиленгликоляо активность была 1•10 нно ед о /мг бел- 50 ка. Конечный элюат подвергли анализу Раствор элюата фракционировали,, как и в примере 1 и обнаружили одну Результаты представлены в т а б л 0 4 о полосу в положении молекулярного веса Фракцию второго элюирования под55 вергли дальнейшей очистке с помощью примерно 19000. Чистота была больше 97%, хелатцинковой хроматографии* Л р и м е р 6 . Была повторена проВ колонну с хелатом цинка (15 мл) цедура примера 3 , за тем исключением/ ввели буфер А, содержащий 50%-ный il 1523ОД6 раствор этиленгликоля. Часть (270 мл) фракции второго элюирования из вышеуказанной колонны синей агарозы развели 27 мл буфера А до получения 50%-ного раствора этиленгликоля и пропустили через колонну с хелатом цинка при скорости потока 30 мл/ч в Все операции проводили при температуре 2-8 С. После двойной промывки 10 колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (200 мл) дистиллированную воду и 0,1 М 15 раствор фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/ч в течение 1 ч поочередно второй промывочный раствор (30 мл) 20 2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 м фосфорнокислоМ го натрия (рН 7,2) злюентї 25 0 , 1 М уксусной кислоты - у к с у с нокислого натрия буферный р а с т вор» содержащий 0 s l M хлористого натрия (рН 7,4)* Активность, выход интерферона, к о 30 личество ' белка и удельная активность этой процедуры очистки представлены в т а б л . 5 , Интерферон из колонны с хелатом цинка подвергли анапиэу посредством 35 электрофореза полиакриламидного геля в присутствии додецилсульЛата натрия (НДС) для определения чистоты 0 Элгоат подвергли пирогекному испытанию с помощью теста Лимулуса, используя 40 обнаруживающий эндотоксин р е а г е н т . Чистота интерферона 90%, элюат отрицательный к испытанию Лимулуса при & содержании интерферона 1,6'10 им 0 ед./мло Сравнительный пример 1. Во вторую колонну геля агарозы (Matrex Gel Blue A®4 мл) загрузили 2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 м М фосфорнокислого натрия, рН 7,2 (бу50 фер Б ) , Часть Фракции (45 мл) второго элюирования из колонны геля синей агарозы,.описанной в примере 7, разбавили 5 мл буфера А и 75 мл буфера В и пропустили через вторую колонну геля си- 55 ней агарозы при скорости потока 20 мл/ч. Бее операции проводили при 15-25°С. 12 Буфер, содержащий 30, 40 и 50%ный раствор этиленгликоля соответственно пропустили через колонну со скоростью потока 20 мл/ч„ Результаты второй хроматографии ґеля синей агарозы представлены в табл.6. Интерферон из элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликоля, из которой колонны геля синей агарозы подвергли такому же анализу, как в примере 7, для определения его чистое ты и проведения пирогенного испытания. Чистота его была 60% и результат испытания Лумулуса положительный» Сравнительный пример 2» Колонну из хелата цинка (50 мл) уравнов пивали при помощи PBS. Неочищенный интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30" *10 ме/мл и концентрацию протеина 70 мг/л, пропускали через колонну хелата цинка с объемной скоростью 100 мл/ч. После промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор И ЭЛЮеНТЕ промывочный раствор (400 мл) дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натрия (рИ 6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч-в течение 1 ч, с чередованием элюент: 0,1 Н буферный раствор уксусной кислоты - ацетата натрия, содержащий 1,0 М хлорида натрия (рН 4,7), Фракцию элюирования на колонне хелата цинка использовали для последующей очистки при помощи хроматографии на голубом агарео Колонну из голубого агара (5 мл) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натрия, содержащим 1,0 М хлорида натрия. Фракцию элюирования из вышеупомянутой колонны хелата цинка пропускали через колонну с голубым агаром с объемной скоростью 10 мл/ч е После двухкратной промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочный раствор и элюант:, первый промывочный раствор (50 млу 1,0 М раствор хлорида натрия. ІЗ 523046 содержащий 10 м фосфата натМ рия, рН 7,2 (буфер А) второй промывочный раствор (50 мл] буфер А, содержащий 25% этиленгликоля : элюант ї буфер А, содержащий 55% этиленгликоля . Раствор элюата подвергали фракционированию. Результаты приведены в табл,7. Сравнительный пример З о В качестве исходного материала использовали неочищенный интерферон фибробласта, который имел активность интерферона 7,7-10 ме/мл н концентрацию протеина 35 мг/л. Этот исходный раствор ( 2 , 0 л) смешивали с 5 г (17 мл) шариков "ЦРГ" (пористыми стеклянными шариками с размером пор 350 А) и смесь энергично перемешивали в течение 13 ч . Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр и шарики ЦРГ упаковывали в колонну (диаметр 0,9 см)» Далее колонну промывали J00 мл PBS, a 'затем 0,0ї М раствором глицина-НСЇ при рН 3 , 5 , и элюировали 0,3 М буфером глицина-НСЇ при рН 2 , 0 , содержащим 0,1 мг/мл альбумина сыворотки человека. Ї0 15 20 25 30 14 ра сырого интерферона со скоростью потока 40 мл/ч колонку промывают 2П0 мл дистиллированной воды. Затем копонку элюируют 320 мл 0 , ! М буферного раствора фосфорнокислого натрия (рН 8 , 3 ) . Раствор элюата фракционируют. Результаты приведены в табл.9,. Вторую и третью фракции элюирования используют для последующего способа очистки путем хелатцинковой хроматографии е Колонну с хелатом цинка ( 3 мл, 3 с м ' 3 , 8 см) уравновешивают 0,1 М буферным раствором фосфорнокислого натрия (рН 8 , 3 ) . Вышеуказанные фракция (300 мл) из колонки ЗР-Сефадекса пропускают через хелатцинковую колонну со скоростью потока б мл/ч е После промывки дважды колонну элюируют. Используют следующие промывочный растйор и элюент; * первый промывочный раствор (40 мл): дистиллированная вода и 0,1 М раствор фосфорнокислого натрия (рН 6 , 7 ) , используемые поочередно со скоростью потока 6 мл/ч в течение I ч второй промывочный раствор (б мл): 2 М хлористый натрий, содержащий 20 м фосфорнокислого натМ рия (рН 7,2) Элюаты подвергали диализу с и с пользованием 4-І л 1 М раствора NaCl s элюент: . f буферированного 0,02 М раствором фос0,1 М буферный раствор уксусАата (рН 7 , 4 ) . ная кислота - уксуснокислый Диализированный раствор пропуска- 35 натрий, содержащий 0,1 М хлоли через колонну с хелатом цинка с ристого натрия (рН 4„7) размерами 0,6*7 см, затем колонну промыРезультаты этого способа очистки вали 10 мга 1 М раствора хлорида натрил, приведены в т а б л , 1 0 . буферированного 0,02М раствором фосфаИспользуемый в качестве исходного 40 та (рЫ 7,4) и 10 мл 0,1 Мбуфера ацетата мад-ериала раствор сырого интерферона натрия (рН 5 , 9 ) . Затем колонну элюиимеет рН 7,Зо После отстаивания в т е ровагш 0,1 М буфером ацетата натрия чение 3 0 дней его интерферонная актив(рН 4 ) . ность составляет 38* Ю* им«ед./л и 'никаких изменений в активности интер- . Полученные результаты приведены 45 ферона не обнаружено. Тогда как посв табл.8. ле отстаивания в течение 10 дней раствора сырого интерферона, имеющего Сравнительный пример 4О ИспользурН 2, перед загрузкой его в колонку ют сырой человеческий фибровластный SP-Сефадекса, интерферонная активинтерферон у аналогичный используемо50 ность снижается до 16 10 им.ед./л.му в примере 7 # Это означает, что раствор сырого Раствор сырого интерферона, имеюинтерферона неустойчив при рН 20 щего активность интерферона 38-10 им. Изобретение имеет следующие суе д . / л , концентрацию белка 63 мг/л и 5 щественные признаки и преимущества удельную активность 6 - Ю им„ед./мг 55 по сравнению с известным техничесбелка, регулируют до рН 2 путем доким решением. бавления 6 н. НС1 и загружают в коCnqco6 очистки в соответствии с лонку- SP-Сефадекса (20 мл, 2 см х известным техническим решением вклю" 6 , 4 см). После загрузки 6 л раство 52304ft чает SP-Сефадексовую хроматографию на колонках с последующей хелатметаллической хроматографией о Сырой интерферон s очищаемый в соответствии с известным способов s имеет низкую концентрацию, например используемый в примере 1 сырой интерферон имеет активность интерферона 3,2-10 им 0 е д о / л и концентрацию белка 20 мг/л, 10 а используемый з примере 2 сырой интерферон имеет активность интерферона 5-Ю им.едо/л и концентрацию белка 25 мг/л 0 Известное техническое решение имеет в виду очистку сырого 15 интерферона с относительно низкой концентрацией о Предлагаемый способ очистки включает хроматографию на обездвиженном синем носителе с последующей х е л а т 20 металлической хроматографией,, Б соответствии с этим способом очистки сырой интерферон с высокой концентрацией (например, сырой интерферон, используемый в примере 7, имеет а к 25 тивность интерферона 42 '10 и м о е д 0 / л и концентрацию белка 70 мг/л] может быть удовлетворительно очищено Кроме т о г о , как видно из примера 7, в котором использовали сырой ин30 терферон с высокой концентрацией, извлечение продукта по известному способу составило самое большое 47%. Таким образом, известный способ непри годен для очистки сырого интерферо35 на с высокой концентрацией,, Это с т а новится более очевидным из сравнения результатов примера 7 с результатами сравнительного примера 4 (в обоих примерах материалом для очистки был сырой интерферон с высокой концентрацией ) „ рацией, так и с высокой концентрациейв Известный способ имеет недостаток, заключающийся в том,что перед загрузкой колонки SP-Сефадекса сырой интерферон обязательно делают сильнокислотным^ поскольку интерферонная активность при таком кислотном состоянии заметно теряется, как показано в сравнительном примере Uо Этот недостаток известного способа не обнаруживается в изобретении, поскольку хроматографию на обездвиженном синем носителе осуществляют в условиях почти нейтрального рН. П р и м е р 8 О Используемый раствор неочищенного интерферона получают путем обравотки клеток человеческого фибробласта с использованием методики, аналогичной примеру 1. К раствору неочищенного интерферона> который имеет активность интерферона, равную 30000 ед о /л, белковую концентрацию, равную 0,11 мг/мл и рН 7,2, прибавляют 6 н о раствор НС1 или 1 н„ раствор NaOH с тем, чтобы довести рН до 2,3, 4,5,6>7,8,9 или 10. Устойчивость каждого раствора неочишенного интерферона испытывают путем определения титра, оставшегося после отстаивания каждого раствора неочищенного интерферона при температуре 4°С в течение 16 ч. Ниже приведены результаты испытания, выраженные в процентном содержании рН Устойчиво сть,% 83 2 69 3 80 4 90 5 ПриИзвлечение,% Сравни97 6 45 мер тельный 100 7 7 пример 8 4 9 94 10 80 1-я очистительЗатем 15 мл каждого раствора неная стадия 71 • » 50 очищенного интерферона помещают в 2-я очистительполипропиленовую центрифукную пробирная стадия 20 69 ку» в которую также помещают 0,05 мл синего красителя в качестве носителя (Matrex Gel Blue А®)и смесь перемешиПрименение известного способа ог55 вают при 4 W C в течение 16 ч. После раничивается сырым интерфероном с удаления иадосадочного слоя и промываотносительно низкой концентрациейо ния дважды 2,5 мл 10 мМ раствора фосПредлагаемый способ применим к сырофат натрия - 1 н ь NaCl (рН 7„2) 2 мл му интерферону как с низкой концент !7 10 м фосфата натрия - 1 н о NaCl М (рН 7 , 2 ) , содержащего 55%-ный этиленгликоль, прибавляют к носителю,, После центрифугирования удаляют надосадочный слой, содержащий частично очищенный интерферон0 Затем определяют количества потерянного интерферона (общее содержание интерферона,, не абсорбированного 10 на носителе, и интерферона, содержащегося в промывном растворе) и восстановленного интерферона. Ниже приведены результаты^ ные в процентном содержаниио 15 рн Потеря, Восстанов% ление, % 5 2 64 3 13 50 4 20 46 20 5 9 65 6 70 7 7 7 68 8 8 73 9 б 25 67 10 6 18 523046 50 Как видно из вышеприведенных результатов, когда рН раствора неочищенного интерферона был доведен до 5-9, раствор неочищенного интерферона оставался устойчивым и восстановление частично очищенного интерферона было высоким, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ очистки человеческого ^-интерферона путем контактирования раствора неочищенного интерферона с сорбентом, обработки сигнала элюан^ом с последующей металл-келатной хроматографией полученного элюата, при которой носитель содержит хелатообразующий остаток, а в качестве иона Со42- или Н і + 2 или Z n + 2 и элюции целевого продукта гнетидином или кислотным буферным раствором, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения производительности процесса, в качестве сорбента используют синий агарозный гель, а контактирование проводят при рН 5-9о Т а б л и ц а Характеристика Объем, мл Общая ак тивность Выход, % интерферо Общий белок, мг на, *10 6 им о ед а Исходный материал Раствор сырого интерферона Колонны геля синей сахарозы Надосадочная жидкость 1-й промьпочный раствор 2-й промывочный раствор Фракция элюирования Хелатцинковая колонна Загрузочный раствор Пропускаемый раствор 1-й промывочный раствор 2-й промывочный раствор 1-я фракция элюата 2-я фракция элюата Эбщая фр акция элюат а 30,000 186 630 32,000 3 0s2 1,4 150 285 143 14 285 5 7 300 0,6 1,8 50 10 20 30 10 60 64 3,0-10" 15 300 активность. им,ед о /мг белка 20 280 Удельная 570 320 124 81 32 34 10 15 1,0 0,16 1,2 1 1,0 І0 2,5-10 6-Ю 7 4-Ю 8 1,040* 19 20 523ОД6 Т а б л и ц а 2 Характеристика Объем Исходный материал Раствор сырого интерсЬерона Раствор, пропущенный через синеагарозную колонну 1-й промывочный раствор 2-й промывочный раствор 3-й промывочный раствор Хел атцинковая колонна Пропущенный раствор 1-й промывочный раствор 2-й промывочный раствор Общая фракция элюировання Общая интерферонная активность, •106 им.ед. Выход Общий белок, мг 1240 Удельная активность, им.ед./мг белка 1,1-10' 20,000 1А2 20,000 10 7 1060 200 1 0,7 ПО 200 1 0,7 1 40 20 14 20 200 2 1,4 5 200 1,3 0,9 2 20 27 19 1 2,710 20 82 58 0,4 2,1*10 1,0-10 Т а б л и ц а З Характеристика Объем, мл Исходные материалы Раствор сырого интерферона Колонна синей а г а розы 1-й промывочный раствор 2-й промывочный раствор Элюент Хелатникелевая колонна , Загрузочный раствор Пропущенный раствор 1-й промывочный раствор 2-й промывочный раствор Элюат 20,000 Общая интерферонная активность (*10 б им в ед о ) Выход, г 300 400 260 100 Общий белок, мг Удельная активность, им.ед./мг белка 2,5-Ю 87 270 1,0-10 74 0,55 1 -10' 65 0,7 20 55 5 1200 21 22 523046 Т а б л и ц а 4 Характеристика Объем, л Раствор сырого интерферона Надосадочный слой 1-й промывочный раствор 2-й промывочный раствор 3-й промывочный раствор 1-я фракция элюирования 2-я фракция элюирования 3-я фракция элюирования Выход» Общая и н терферонная а к тивность, * 1 0 6 им.едо % Общий белок, мг Удельная активность, МО им,ед./мг белка 20 20 840 20 2, 4 1375 1170 61 1.7 0,4 і 0,,1 14 7 0,32 11 1, 3 20 60 0,12 12 и4 13 -90 0,03 4 5 8 50 0.42 0,12 600 71 1. 3 24 2 550 11 • • 2500 Т а б л и д Характеристика Раствор сырого интерферона Пропущенный через колонну Промытый Фракция элюирования Объемt л 300 Общая и н терферонная активность, х10 им о ед, Выход, % 22 248 77 52 270 Удельная а к тивность, МО им,ед„/мг Общий белок мг белка 15,4 390 300 а 5 6 13, 5 69 2500 11 200 5200 30000 1 .0 0 .9 Т а б л и ц а б Харкктеристика Раствор сырого и н т е р ферона Пропущенный через колонну Эл киров ание' 30%-ным раствором этиленгликоля 40%-ным раствором эгиленгликоля 50%-ным раствором этиленгликоля Объем, мл Общая и н терферонная а к тивность, *10 6 им„ед. Выход, % Общий белок, мг Удельная активность. v10 им,ед в /мг белка 2.5 2500 1.6 1,7 60 7 11 0,21 3300 16 26 42 0,15 17000 16 5 8 0,07 7100 125 62 125 1 16 б п и ц ' 7 і v/иЩізЯ Характеристика Объем Общее содержание протеина, мг аК ТИВНОСТЬ иед, МО6 ЕЙ Колонна из хелата цинка Неочищенный ИФН Пропускается через Промывка Фракция элюирования Колонна из голубого агара Пропускается через 1-я промывка 2-я промывка Фракция элюирования 1-я 2-я Всего Удельная актив Извлечение, г ность. vl О4 ЕИ/мг протеина 120 12 5 90 280 240 4_ 2,4 43 5 125 100 10 4 3750 75 200 50 50 0,12 0,23