Дефектні аденовірусні вектори та їх використання у генній терапії

Данное изобретение относится к новым вирусным векторам, их получению и их использованию в генной терапии. Оно относится также к содержащим вышеуказанные вирусные векторы фармацевтическим композициям. Более конкретно, данное изобретение относится к рекомбинантным аденовирусам, как векторам для генной терапии. Генная терапия заключается в том, чтобы коррегировать дефицит или дефект(мутация, ошибочная экспрессия и т. д.) п утем введения генетической информации в пораженную клетку или орган. Эта генетическая информация может вводиться или in vitro в клетку, извлеченную из органа, и затем измененная клетка снова вводится в организм, или непосредственно in vivo в соответствующую ткань. Во втором случае существуют различные методики, среди которых различные методики трансфекции с применением комплексов ДНК и ДЭАЭ-декстрана [Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], ДНК и липидов [Feigner et al., PNAS 84 (1987) 7413], использованием липосом [Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431] и т. д. Совсем недавно появилось использование вируса в качестве вектора для переноса генов в качестве обещающей альтернативы этим физическим методикам трансфекции. В этом отношении были испытаны различные вирусы на их способность инифицировать определенные клеточные популяции. В частности испытаны ретровирусы(RSV, HMS, MMS и т. д.), вир ус HSV, аденоассоциированные вирусы и аденовирусы. Среди этих вирусов аденовирусы проявляют некоторые интересные свойства для использования в генной терапии. А именно, они имеют достаточно широкий круг хозяев, способны инифицировать клетки в состоянии покоя, не включаются в геном инифицированной клетки и на сегодняшний день не связаны со значительной патологией у людей. Аденовирусы являются вирусами с двунитевой линейной ДНК размером около 36кb. Их геном состоит конкретно из одного обратного повтора(ITR) с последовательностью инкапсидации на его конце из ранних и поздних генов (Cf фиг.1). Главными ранними генами являются гены с L1 по L5. Принимая во внимание свойства аденовирусов, упомянутые выше, они уже использовались для переноса генов in vivo. С этой целью были получены различные векторы, производные аденовирусов, включающие различные гены(В-gal, OTC, &-LAT, цитокинов и т. д.). В каждой из этих конструкций аденовирус был модифицирован так, чтобы сделать его неспособным к репликации в инифицированной клетке. Таким образом, конструкции, описанные в предшествующем прототипе, являются аденовирусами, лишенными областей EI(EIа и/или FIb) и, в случае необходимости и Е3, на место которых встраиваются последовательности гетерологичной ДНК [Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161]. Однако, векторы, описанные в прототипе, имеют много недостатков, которые ограничивают их применение в генной терапии. В частности, все эти векторы включают много вирусных генов, экспрессия которых in vivo нежелательна в рамках генной терапии. К тому же в эти векторы не могут быть включены фрагменты ДНК очень большого размера, что может быть необходимо для некоторых целей. Данное изобретение позволяет устранить эти недостатки. Данное изобретение описывает рекомбинанты аденовируса для генной терапии, способные эффективно переносить ДНК(до 30kb) in vivo, стабильно экспрессировать на высоких уровнях эту ДНК in vivo, при полном ограничении риска продукции вирусных протеинов, трансмиссии вируса, патогенности и т. д. В частности, было обнаружено, что возможно значительно уменьшить размер генома аденовируса без помехи образованию инкапсидированной вирусной частицы. Это удивительно для размера, который наблюдался в случае другого вируса, например, ретровируса, т. к. некоторые последовательности, распределенные по всей длине генома, необходимы для эффективной инкапсидации вирусных частиц. Вот почему реализация векторов, обладающих значительными внутренними делениями, была сильно ограничена. Данное изобретение показывает также, что угнетение основных вирусных генов не мешает никак образованию вирусной частицы как таковой. К тому же, рекомбинанты аденовирусов, полученные таким образом, сохраняют несмотря на значительные модификации их геномной структуры, их полезные свойства сильной инфекционной способности, стабильности in vivo и т. д. Векторы этого изобретения особенно выгодны, так как они дают возможность включения желательных последовательностей ДНК очень большого размера. Так возможно встроить ген, по длине превосходящий 30кb. Это особенно интересно для некоторых патологий, для лечения которых необходима коэкспрессия многих генов, или экспрессия очень больших генов. Так, в случае мышечной дистрофии до настоящего времени было невозможно перенести соответствующую ДНК нативного гена, ответственного за эту патологию(ген дистрофии) из-за его большого размера(14kb). Векторы этого изобретения также очень полезны потому, что они имеют очень мало функциональных вирусных областей, и поэтому отрицательные действия, связанные с использованием вируса в качестве векторов при генной терапии, такие как иммуногенность, патогенность, трансмиссия, репликация, рекомбинация и т. д. сильно снижены и даже устранены. Данное изобретение представляет также, в частности, вир усные векторы, приспособленные для переноса и экспрессии in vivo желательных последовательностей ДНК. Первый объект данного изобретения касается, таким образом, дефектного рекомбинантного аденовируса, содержащего: последовательности ITR, последовательность, делающую возможной инкапсидацию, гетерологичную ДНК-последовательность и в котором: ген EI является нефункциональным и по крайней мере один из генов Е2, Е4, L1 - L5 является нефункциональным. С точки зрения данного изобретения термин "дефектный аденовирус" обозначает аденовирус, неспособный автономно реплицироваться в клетке-мишени. Обычно геном дефектных аденовирусов по этому изобретению, таким образом, лишен по крайней мере последовательностей, необходимых для репликации указанного вируса в ин фицированной клетке. Эти области могут или удаляться(полностью или частично), или превращаться в нефункциональные, или заменяться на другие последовательности, а именно на последовательности гетерологичной ДНК. Повторяющиеся инвертированные последовательности(ITR) представляют начало репликации аденовируса. Они располагаются на концах 3' и 5' вир усного генома(Cf фиг.1), отк уда они могут быть легко выделены по классическим методикам молекулярной биологии, известным специалистам. Нуклеотидная последовательность ITR аденовирусов человека(в частности, серотипов Ad2 и Ad5) описана в литературе, так же как и аденовирусов собаки(а именно, CAV1 и C AV2). Что касается аденовируса Ad5, например, левая последовательность ITR соответствует области, содержащей нуклеотиды генома с 1 по 103. Последовательность инкапсидации(также называемой последовательностью Psi) необходима для инкапсидации вирусной ДНК. Эта область, таким образом, должна быть представлена, чтобы дать возможность получения дефектных аденовирусов по этому изобретению. Последовательность инкапсидации локализуется в геноме аденовируса между левой ITR(5') и геном ЕІ(Cf фиг.1). Она может быть выделена или искусственно синтезирована по классическим методикам молекулярной биологии. Нуклеотидная последовательность последовательности инкапсидации аденовирусов человека(в частности, серотипов Ad2 и Ad5) описана в литературе, так же как и аденовирусов собаки( а именно, CAV1 и CAV2). В отношении аденовируса Ad5, например, последовательность инкапсидации соответствует области, включающей нуклеотиды генома со 194 по 358. Существуют различные серотипы аденовирусов, и следовательно, структура и свойства несколько варьируют. Тем не менее эти вирусы демонстрируют сравнимое генетическое строение, и сведения, опубликованные по данному вопросу, могут быть легко воспроизведены специалистом для всех типов аденовирусов. Аденовирусы этого изобретения могут происходить от человека, животного или быть смешанной природы(человеческой и от животных). Что касается аденовирусов человеческого происхождения, предпочтительно использовать те, которые по классификации относятся к группе с. Более предпочтительно из различных серотипов человеческих аденовирусов в рамках данного изобретения использовать аденовирусы типов 2 или 5(Ad2 или Ad5). Как показано выше, аденовирусы этого изобретения могут также иметь происхождение от животных или включать последовательности из аденовирусов животного происхождения. Заявитель на самом деле показывает, что аденовирусы животного происхождения способны инифицировать с большой эффективностью человеческие клетки, и что они не способны размножаться в человеческих клетках, в которых они испытывались [Cf заявка FR 93 05954]. Заявитель также показывает, что аденовирус животного происхождения совсем не транскомплементарен аденовирусу человеческого происхождения, так что полностью устраняется риск рекомбинации и размножения in vivo в присутствии человеческого аденовируса, что могло бы привести к образованию инфицирующей частицы. Использование аденовируса или участков аденовирусов животного происхождения, таким образом, особенно выгодно, так как риск,присущий использованию вируса в качестве вектора в генной терапии к тому же очень мал. Аденовирус животного происхождения, используемый в рамках данного изобретения, может быть собачьим, бычьим, мышиным [например, MAV1, Beard et al., Virotology 75 (1990) 81], овечьим, свиньим, птичьим или еще и обезьяньим(например, SAV). Более конкретно, из птичьих аденовирусов можно упомянуть серотипы с 1 по 10, доступные из АТСС, как, например, штаммы Phelps (АТСС VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A(АТСС VR-827), IBH-2 А(АТСС VR-828), I2-A(АТСС VR-829), T8-A(АТСС VR-83O), К11(АТСС VR-921) и еще штаммы для сравнения(референс-штаммы) АТСС VR-831 по 835. Из бычьих аденовирусов можно использовать различные известные серотипы и особенно те, которые находятся в АТСС(типы с 1 по 8) со штаммами сравнения АТСС VR-313, 314, 639 - 642, 768 и 769. Можно также назвать мышиные аденовирусы FL(ATCC VR-55O) и Е20308(АТСС VR-528), овечий аденовирус типа 5(АТСС VR-1343) или типа 6(АТСС VR-1340); свиной аденовирус 5359, или обезьяньи аденовирусы, особенно те, которые являются референс-аденовирусами в АТСС под номерами VR-591-594, 941-943, 195-203 и т. д. Предпочтительно, из различных аденовирусов животного происхождения в рамках этого изобретения используются аденовирусы или участки аденовирусов собак, и особенно все штаммы аденовирусов CAV2 [штамм Манхэттен или А26/61 (АТСС VR-800), например]. Собачьи аденовирусы были объектом многочисленных структурных исследований. Таким образом, были описаны полные карты рестрикации аденовирусов C AV1 и CAV2 в предшествующей работе [Spibey et al., I. Gen. Virol.70 (1989) 165], и гены Ela, Е3, так же как последовательности ITR были клонированы и секвенированы [смотрите, в частности, Spibey et al., Virus Res. 14(1989) 241; Linne, Virus Res. 23(1992) 119, WO91/11525]. Как указано ранее аденовирусы данного изобретения включают одну гетерологичную последовательность ДНК. Последовательностью гетерологичной ДНК называется вся последовательность ДНК, вводимая в рекомбинантный вирус, который ее переносит и/или экспрессия которой достигается в клетке-мишени. В частности, последовательность гетерологичной ДНК может содержать один или множество терапевтических генов и/или один или множество генов, кодирующи х антигенные пептиды. Терапевтическими генами, которые могут тaким образом переноситься, являются все гены, транскрипция и, в известных случаях, трансляция которых в клетке-мишени производит продукты, имеющие терапевтическое действие. Можно говорить в частности о генах, кодирующих белковые продукты, имеющие терапевтическое действие. Белковым продуктом, кодируемым таким образом, может быть белок, пептид, аминокислота и т. д. Этот белковый продукт может быть гомологичным клетке-мишени(то есть, продуктом, который в норме экспрессируется в клетке-мишени, когда в ней не присутствует никакая патология). В этом случае экспрессия белка дает возможность, например, покрыть недостаточную экспрессию в клетке или экспрессию неактивного или слабоактивного белка в соответствии с модификацией и, кроме того, дает возможность суперпродукции указанного белка. Терапевтический ген может также кодировать мутант клеточного белка, имеющего повышенную устойчивость, измененную активность и т. д. Белковый продукт может также быть гетерологичным клетке-мишени. В этом случае экспрессируемый белок может, например, дополнять или привносить в клетку недостающую активность, давая ей возможность бороться с патологией. Среди терапевтических продуктов по данному изобретению можно привести, в частности, ферменты, производные из крови, гормоны, лимфокины; интерлейкины, интерфероны, TNF и т. д. (FR 9203120), факторы роста, нейротрансмиттеры и их предшественники или ферменты для синтеза, трофические факторы: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, hFGF, NT3, NT5 и т. д.; аполипопротеины: ApoAI, ApoAIV, АроЕ и т.д. (FR 93 051125), дистрофии или минидистрофин (FR 9111947), гены-супрессоры опухолей: p53 Rb, Papla DCCk-rev и т. д. (FR 93 04745), гены, кодирующие факторы, участвующие в коагуляции: факторы VII, УIII, IX и т. д. Терапевтический ген может также быть геном или антисмысловой последовательностью, экспрессия которых в клетке-мишени дает возможность контролировать экспрессию генов или транскрипцию клеточной мРНКЮ. С этих последовательностей, например, в клетке-мишени могут транскрибироваться РНК, комплементарная клеточной мРНК и блокировать таким образом их трансляцию в белок, соответствующая методика описана в патенте ЕР 140308. Как показано выше, последовательность гетерологичной ДНК может также включать один или множество генов, кодирующих антигенный пептид, способный генерировать у человека имунный ответ. В этом особом случае осуществления изобретение дает возможность реализации таким образом вакцин, позволяющих иммунизировать человека, особенно против микроорганизмов или вирусов. Можно, в частности, говорить об антигенных пептидах, специфичных для вируса Эпштейна-Барра, вируса ВИЧ, вируса гепатита В(ЕР 185573), вируса псевдобешенства и специфичных для опухолей(ЕР 259212). В основном, последовательность гетерологичной ДНК включает как последовательности, обеспечивающие экспрессию терапевтического гена, так и/или ген, кодирующий антигенный пептид в инфицируемой клетке. Можно упомянуть последовательности, которые естественно ответственны за экспрессию рассматриваемого гена, когда эти последовательности способны функционировать в инфицируемой клетке. Можно также сказать о последовательностях различного происхождения(ответственных за экспрессию других белков или полностью синтетических). А именно, можно упомянуть промоторные последовательности генов эукариотов или вирусов. Например, можно говорить о промоторных последовательностях генома той клетки, которую хотят инфицировать. Также можно сказать о промоторных последовательностях генома вируса, включая используемый аденовирус. В этом отношении можно привести в качестве примера промоторы генов ЕIА, MLP, CMV, RSV и т. д. Кроме того, эти последовательности экспрессии могут модифицироваться путем добавления последовательностей активации, регуляции и т. д. С другой стороны, когда встраиваемый ген не содержит последовательностей экспрессии, он может помещаться в геном дефектного вируса после такой последовательности. С другой стороны, последовательность гетерологичной ДНК может также содержать в обратном направлении от терапевтического гена сигнальную последовательность, обеспечивающую секрецию терапевтического продукта из клетки-мишени. Эта сигнальная последовательность может быть природной сигнальной последовательностью терапевтического продукта, но могут быть также названы совсем другие функциональные сигнальные последовательности или искусственная сигнальная последовательность. Как показано здесь ранее, векторы этого изобретения имеют по крайней мере один нефункциональный ген из Е2, Е4, L1 - L5. Рассматриваемый вирусный ген можно сделать нефункциональным с помощью всех известных специалистам методик, а именно путем супрессии, замещения, делении или добавлением одного или многих оснований в него или рассматриваемые гены. Такие модификации могут быть получены in vitro(на выделенной ДНК) или in situ, например, или с помощью методов генной инженерии, или путем обработки мутагенами. В качестве мутагенных средств можно привести, например, физические средства, такие как жесткое облучение(рентгеновское, гамма, ультрафиолетовое и т. д.) или химические средства, способные воздействовать на различные функциональные группы оснований ДНК, и, например, алкилирующие средства(этиленметансульфонат(ЭМС), N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, N-нитрохинол ин-1оксид(NXO)), интеркалируюшие средства и т. д. Под делецией в данном изобретении подразумевается любая супрессия рассматриваемого гена. А именно, можно говорить о всей или части области, кодирующей указанный ген, и/или о всей или части промоторной области транскрипции указанного гена. Супрессия может быть выполнена путем расщепления с помощью соответствующи х ферментов рестрикции, затем лигирования, в соответствии с классическими методами молекулярной биологии, тaк, как показано в примерах. Генетические модификации могут также осуществляться путем разрушения генов, например, по методу, первоначально описанному Rothstein [Meth. EnzymoL, 101 (1983) 202]. В данном случае вся кодирующая последовательность или ее часть предпочтительно разрушается, чтобы сделать возможной замену путем гомологичной рекомбинации геномной последовательности на нефункциональную последовательность или мутантную. Там, где указанные генетические модификации могут локализоваться, это - в части, кодирующей рассматриваемый ген, или вне кодирующей области, и, например, в областях, ответственных за экспрессию и/или регуляцию транскрипции указанных генов. Нефункциональный характер указанных генов может, таким образом, проявляться продукцией неактивного белка вследствие стр уктурных или информационных модификаций, отсутствием продукции, продукцией белка, имеющего измененную активность, или продукцией природного белка на сниженном уровне или в соответствии с желаемым способом регуляции. С другой стороны, некоторые изменения, такие как точечные мутации, по природе способны исправляться или быть ослаблены с помощью клеточных механизмов. Такие генетические изменения представляют в таком случае ограниченный интерес для производства. Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы свойство нефункциональности было бы совершенно стабильным сегрегационно и/или необратимым. По преимуществу ген становится нефункциональным в результате частичной или полной делеции. Предпочтительно, дефектные рекомбинантные аденовирусы этого изобретения лишены поздних генов аденовируса. Наиболее преимущественный способ этого изобретения состоит в получении рекомбинантного дефектного аденовируса, включающего: последовательность ITR, последовательность, обеспечивающую инкапсидацию, последовательность гетерологичной ДНК и область, несущую ген или часть гена Е2. Другой особенно выгодный способ этого изобретения состоит в получении дефектного рекомбинантного аденовируса, содержащего: последовательность ITR, последовательность, обеспечивающую инкапсидацию, последовательность гетерологичной ДНК и область, несущую ген или часть гена Е4. Всегда, особенно при преимущественном способе, векторы этого изобретения обладают, кроме того, функциональным геном Е3 под контролем гетерологичного промотора. Наиболее предпочтительно, когда векторы обладают частью гена Е3, обеспечивающей возможность экспрессии белка gp19Л. Дефектные рекомбинантные аденовирусы по этому изобретению могут быть получены различными способами. Первый способ состоит в трансфекции ДНК в дефектный рекомбинантный вирус, полученный in vitro(или путем лигирования, или через плазмидную форму) в компетентной клеточной линии, то есть несущую при культивировании все функции, необходимые для комплементации дефектного вируса. Эти функции предпочтительно интегрированы в геном клетки, что позволяет избежать риска рекомбинации и придает повышенную стабильность клеточной линии. Получение таких клеточных линий описано в примерах. Второй подход состоит в контранфекции, соответствующей клеточной линии ДНК дефектного рекомбинантного вируса, полученного in vitro(или путем лигирования, или в форме плазмиды) и ДНК хелперного вируса. По этому методу не нужно располагать компетентной клеточной линией, способной восполнять дефектные функции рекомбинантного аденовируса. Часть этих функций на деле восполняется хелперным вирусом. Этот хелперный вирус должен сам быть дефектным, и клеточная линия при культивировании несет необходимые функции для его дополнения. Получение дефектных рекомбинантных вирусов этого изобретения по этому методу также показано в примерах. Среди клеточных линий, используемых в рамках этого второго подхода, можно, в особенности, назвать линию клеток почки эмбриона человека 293, клеток KB, клеток Hela, MDCK, GHK и т. д.(Cf примеры). Затем, векторы, которые размножены, выделяют, очищают и амплифицируют по классическим методикам молекулярной биологии. Данное изобретение, таким образом, имеет отношение также и к клеточным линиям, инфицируемым аденовирусом, подразумевая интегрирование в их геном функции, необходимой для дополнения дефектного рекомбинантного аденовируса, такого, как описанный ранее. В частности оно касается клеточных линий, включающих интегрированные в их геном области Е1 и Е2(а именно, области, кодирующей белок 72К), и/или Е4 и/или ген рецептора для глюкокортикоидов. Предпочтительно, эти линии получены для части линии 293 или gm DBP6. Данное изобретение относится также ко всей фармацевтической композиции, содержащей один или несколько дефектных рекомбинантных аденовирусов, таких, которые описаны выше. Фармацевтические композиции этого изобретения могут быть сформированы для введения путем местного применения, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутриглазного, трансдермального введения и т. д. Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемые носители для инъекционных форм. Можно, в частности, назвать растворы солей(мононатриевый фосфат, динатриевый фосфат, хлорид натрия, калия, кальция или магния, и т. д., или смеси этих солей), стерильные, изотонические или высушенные композиции, особенно лиофилизированные, которым по потребности путем добавления стерилизованной воды или физиологической сыворотки придают вид(состав) инъекционных растворов. Дозы вируса, используемые для инъекции, могут быть адаптированы в зависимости от различных параметров, и особенно в зависимости от используемого способа введения, затрагиваемой патологии, гена, который нужно экспрессировать, и от продолжительности искомого лечения. Обычно, рекомбинантные аденовирусы по этому изобретению готовятся и вводятся в дозах, содержащих от 10 до 10бое/мл, и предпочтительно от 10 до 10бое/мл. Термин бое("бляшкообразующая единица") соответствует инифицирующей способности раствора вируса, и определяется по инфицированию соответствующей клеточной культуры и подсчету, обычно через 5 дней, числа бляшек инфицированных клеток. Методики определения титра бое вирусного раствора хорошо представлены в литературе. В соответствии со встроенной последовательностью гетерологичной ДНК аденовирусы этого изобретения могут использоваться для лечения или предотвращения многих патологий, включая генетические болезни(дистрофию, цистофиброз и т. д.), нейродегенеративные болезни(Альцгеймера, ПаркинсонаALS и т. д.), раковых заболеваний, патологий, связанных с растройствами коагуляции или с дислипопротеинемиями, патологиями, связанными с вирусными инфекциями(гепатиты, SIDA и т. д.) и т. д. Данное изобретение будет более полно описано с помощью примеров, которые следуют далее, и которые должны рассматриваться как иллюстративные, а не ограничивающие. Описание рисунков Фиг.1. Генетическое строение аденовируса Ad5. Полная последовательность Ad5 доступна на основе базы данных и позволяет специалисту выбрать или создать любой сайт рестрикции и таким образом выделить всю область из генома. Фиг.2. Карта рестрикции аденовируса CAV2 штамм Манхэттен(по Spibey et al., упомянутой выше). Фиг.3. Создание дефектных вирусов этого изобретения путем лигирования. Фиг.4. Конструкция рекомбинантного вируса, несущего ген Е4. Фиг.5. Конструкция рекомбинантного вируса, несущего ген Е2. Фиг.6. Конструкция и общий вид плазмиды рРУ32. Фиг.7. Общий вид плазмиды рРУ55. Фиг.8. Общий вид плазмиды р2. Фиг.9. Общий вид промежуточной плазмиды, используемой для построения плазмиды pITRL 5-E4. Общие методики молекулярной биологии Классические методы, используемые в молекулярной биологии, такие, как препаративная экстракция плазмидной ДНК, центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте хлорида цезия, электрофорез в агарозном или акриламидном геле, очистка фрагментов ДНК путем электроэлюции, экстракция белков фенолом или фенолом-хлороформом, осаждение ДНК в солевой среде этанолом или изопропанолом, трансформация Е. coll и т. д. хорошо известны специалистам и широко описаны в литературе [Maniatis t. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Плазмиды типа pBR322, pUC и фаги серии MI3 закуплены(Bethesda Research Laboratories). Для лигирования фрагменты ДНК могут быть разделены по их размеру путем электрофореза в агарозном или акриламидном геле, экстрагированы фенолом или смесью фенола/хлороформа осаждены этанолом и затем инкубированы в присутствии ДНК-лигазы фага Т4(Biolabs) по рекомендациям поставщика. Заполнение выступающи х концов 5' может быть осуществлено с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы IE с Li(Biolabs) по спецификации производителя. Устранение выступающих концов 5' выполняется путем осторожной обработки нуклеазой S1. Направленный мутагенез in vitro с помощью синтетических олигодезоксинуклеотидов может выполняться по методу, разработанному Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764], с использованием набора фирмы Amersham. Ферментативная ампликация фрагментов ДНК с помощью метода PCR [Polvmerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Sciene 230(1985) 1350-1354; Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155(1987) 335-350] может осуществляться при использовании "DNA thermal cycler"(Perkin Elmer Cetus) по описанию изготовителя. Определение нуклеотидных последовательностей может выполняться по методу, разработанному Sanger et al. [Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467] с использованием набора фирмы Amersham. Используемые клеточные линии В примерах, которые следуют ниже, используются или могут использоваться следующие клеточные линии: Линия 293 клеток почки эмбриона человека [Graham et al., I. Gen.Virol. 36(1977) 59]. Эта линия содержит конкретно встроенную в ее геном левую часть человеческого аденовируса Ad5(12%). Линия клеток KB человека: выделенная из эпидермальной карциномы человека, эта линия доступна из АТСС(Nxpaн. CCL 17), так же как доступны и условия ее культивирования. Линия клеток Hela человека: полученная из карпиномы человеческого эпителия, эта линия доступна в АТСС(Nхран. CCL 2), также доступны и условия ее культивирования. Линия клеток MDCK собаки: условия культуры клеток MDCK были описаны в частности Macataey et al., Science 44 (1988) 9. Линия клеток gm DBP6 [Brough et al., Virology 190(1992) 624]. Эта линия была образована клетками Hela, несущими ген аденовируса Е2 под контролем LTR MMTV. Примеры Пример 1 Этот пример показываетвозможность рекомбинантного аденовируса, лишенного основных вирусных генов. Для этого была создана серия мутантов с делецией в аденовирусе путем лигирования in vitro, и каждый из этих мутантов был котрансфицирован с вирусом-хелпером в клетки КВ. Эти клетки не позволяют размножаться вирусу, де фектному по Ε1, причем транскомплементация направлена на область Е1. Были получены различные мутанты с делецией на основе аденовируса Ad5 путем расщепления и затем лигирования in vitro. Для этого по методике, описанной [Lipp et al. I. Virol 63 (1989) 5133], выделена вирусная ДНК из Ad5, подвергнута расщеплению в присутствии различных ферментов рестрикции(Cf фиг.3), затем продукт расщепления лигировали в присутствии Т4 ДНК-лигазы. Размер различных делеций затем контролировали в 0,8% агарозном геле с ДСН(SDS). Эти мутанты затем картировали(Cf фиг.3). Эти различные мутанты несут следующие области: mt1: датирования между фрагментами Ad5 0-20642(Saul) и (Saul)33797-35935 mt2; датирования между фрагментами Ad5 0-19549(Ndel) и (Ndel)31089-35935 mt3: лигирования между фрагментами Ad5 0-10754(Ааtll)и (Ааtll)25915-35935 mt4: лигирования между фрагментами Ad5 0-11311(MluI) и (MluI)24392-35935 mt5: лигирования между фрагментами Ad5 0-9462(SaII) и (Xhol)29791-35935 mt6: лигирования между фрагментами Ad5 0-5788(XhoI) и (Xhol)29791-35935 mt7: лигирования между фрагментами Ad5 0-3665(SphI) и (Sphl)31224-35935 Каждый из мутантов, полученных выше, был контрасфицирован с вирусной ДНК Ad.RSVBGal [Stratford-Pemcaudet et al., I. Clin. Invest. 90 (1992) 626] в клетки KB в присутствии фосфата кальция. Клетки собирали через 8 дней после трансфекции и супернатанты культуры собирали, затем амплифицировали в клетках КБ до получения накоплений 50 чашек для каждой трансфекции. Сначала из каждого образца была выделена эписомная ДНК и разделена в градиенте хлорида цезия. В каждом случае наблюдались две четкие полосы вируса, которые выделяли и анализировали. Более тяжелая соответствовала вирусной ДНК Ad.RSVBGal, и более легкая - ДНК рекомбинантного вируса, произведенная путем лигирования(фиг.3). Титр, полученный для этой последней составляет около 10бое/мл. Вторая серия мутантов с делецией в аденовирусе создавалась путем лигирования in vitro по той же самой методологии. Эти другие мутанты несут следующие области: mt8: лигирования между фрагментами 0-4623(ApaI) Ad RSVBGal и (Apal)31909-35935 Ad5 mt9: лигирования между фрагментами 0-10178(BgIll) Ad RSVBGal и (ВаmHl)21562-35935 Ad5 Эти мутанты, несущие ген LacZ под контролем промотора LTR вируса RSV, затем коинфицировали в клетки 293 в присутствии вирусной ДНК Н2 1808 [Weinberg et al., I. Virol.57 (1986) 833], которая лишена области Е4. По этой второй методике транскомлементация направлена на Е4, а не на Е1. Эта методика позволяет также, как описано выше, получать вирусные рекомбинанты, обладающие только вирусным геном, но не областью Е4. Пример 2 В этом примере описывается получение дефектных рекомбинантных аденовирусов по этому изобретению путем котрансфекции ДНК рекомбинантного вируса, включенной в плазмиду, с вирусомхелпером. Для этого была сконструирована плазмида, несущая примыкающие ITR Ad5, последовательность инкапсуляции, ген Е4 под контролем соответствующе го промотора и в качестве гетерологичного гена ген LacZ под контролем промотора LTR вируса RSV(фи г.4). Эта плазмида, обозначенная pE4Gal, была получена путем клонирования и лигирования следующи х фрагментов(фиг.4): фрагмента Hindlll-SacII, происходящего из плазмиды pFGI44 [Graham et al., EMBO I. 8 (1989) 2077]. Этот фрагмент несет последовательности ITR Ad5 от головы к хвосту и последовательность инкапсидации: фрагмент Hindlll (34920) - Sacll (352). фрагмента Ad5, содержащегося между сайтами SacII(расположенном на уровне пары оснований 3827) и PstI(расположенном на уровне пары оснований 4245); фрагмента pSP 72(Promega), содержащегося между сайтами PstI(pb 32) и Sall(pb 34); фрагмента Xhol-Xbal плазмиды pAdLTRGallX, описанного в Stratford-Perricaudet et al (ICI 90 (1992) 626). Этот фрагмент несет ген LacZ под контролем LTP вируса RSV. фрагмента Xbal(pb 40) - Ndel(pb 2379) плазмиды pSP 72; фрагмента Ndel(pb 31089) - Hindlll(pb 34930) Ad5. Этот фрагмент, локализованный в правом конце генома Ad5, содержит область Е4 под контролем соответствующего ему промотора. Он был клонирован на уровне сайтов Ndel(2379) плазмиды pSP 72 и Hindlll первого фрагмента. Эта плазмида была получена путем клонирования различных фрагментов в указанных областях плазмиды pSP 72. Понятно, что эквивалентные фрагменты могут быть получены специалистами, исходя из других источников. Плазмида pE4Gal затем котрансфируется с ДНК вируса H2d1808 в клетки 293 в присутствии фосфата кальция. Затем получают рекомбинантный вирус, как описано в примере 1. Этот вирус несет в качестве единственного вирусного гена ген Е4 аденовируса Ad5(фиг. 4). Его геном имеет размер около 12 кb, такой, который дает возможность встройки гетерологичной ДНК весьма большого размера(до 20kb). К тому же специалист может легко заменить ген LacZ на совершенно другой терапевтический ген из тех, которые упомянуты выше. С другой стороны этот вир ус несет некоторые последовательности, происходящие из плазмиды pSP 72, которые могут исключаться с помощью классических методик молекулярной биологии, если необходимо. Пример 3 В этом примере описывается получение другого дефектного рекомбинантного аденовируса по этому изобретению путем коинфицирования с помощью вируса-хелпера, ДНК рекомбинантного вируса, включенного в плазмиду. Для этого была создана плазмида, несущая примыкающие ITR Ad5, последовательность инкапсидации, ген Е2 Ad2 под контролем собственного промотора и, в качестве гетерологичного гена, ген LacZ под контролем промотора LTR вируса RSV(фиг.5). Эта плазмида, обозначенная как pE2Gal, была получена путем клонирования и дотирования следующи х фрагментов(фиг.5): фрагмента Hindlll-SacII, происходящего из плазмиды pFG144 [Graham et al., EMBO I. 8 (1989) 2077]. Этот фрагмент несет последовательности ITR Ad5 от головы к хвосту и последовательность инкапсидации: фрагмент Нindlll (34920) - SacII (352). Он был клонирован вместе со следующим фрагментом на уровне сайтов HindIII(16) - Pstl(32) плазмиды pSP 72; фрагмента Ad5 содержащегося между сайтами SacII(локализованного на уровне пары оснований 3827) и PstI(локализованного на уровне пары оснований 4245). Этот фрагмент был клонирован на уровне сайта SacII предшествующего фрагмента и сайта PstI(32) плазмиды pSP 72; фрагмента pSP 72(Promega), содержащегося между сайтами PstI(pb 32) и Satl(34); фрагмента Xhol-Xbal плазмиды pAdL TR GallX, описанного Stratford-Perricaudet et al. (ICI 90 (1992) 626). Этот фрагмент несет ген LacZ под контролем LTR вируса RSV. Он был клонирован на уровне сайтов Sall(34) и Xbal плазмиды pSP 72. фрагмента pSP 72(Promega), содержащегося между сайтами Xbal(pb 34) и Ваmlll(pb 46); фрагмента ВаmHl(21606) - Smal(pb 27339) Ad2. Этот фрагмент генома Ad2 содержит область Е2 под контролем его соответствующего промотора. Он был клонирован на уровне сайтов ВаmHl(46) и EcoRV плазмиды pSP 72. фрагмента EcoRV(pb 81) - Hindlll(pb 16) плазмиды pSP 72. Эта плазмида была получена путем клонирования различных фрагментов в указанные области плазмиды pSP 72. Понятно, что специалисты могут получить эквивалентные фрагменты, исходя из других источников. Далее плазмида рЕ2Cаl контрансфицировалась вместе с ДНК вируса H2d1802, лишенной области Е2 [Rice et al. I. Virol. 56 (11985) 767] в клетки 293, в присутствии фосфата кальция. Рекомбинантный вирус затем получали, как описано в примере 1. Этот вирус несет в качестве единственного вирусного гена ген У2 аденовируса Ad2(фи г.5). Его геном имеет размер около 12kb, такой, который дает возможность встройки гетерологичной ДНК весьма большого размера(до 20кb). Таким образом, специалист может легко заменить ген LacZ на любой другой терапевтический ген, такой, который упомянут выше. С другой стороны, этот вирус несет некоторые последовательности, происходящие из промежуточной плазмиды, которые могут быть устранены с помощью классических методик молекулярной биологии, если необходимо. Пример 4 В этом примере описывается создание клеточных линий, комплементирующи х области Е1, Е2 и/или Е4 аденовируса. Эти линии позвoляют создавать конструкции рекомбинантных аденовирусов по этому изобретению, лишенных этих областей, не прибегая к использованию вируса-хелпера. Эти вирусы получены путем рекомбинации in vivo и могут включать важные гетерологичные последовательности, В описанных клеточных линиях, области Е2 и Е4, потенциально цитотоксичные, помещены под контроль индуцируемого промотора: LTR MMTV(Pharmacia), который индуцируется дексаметазоном или нативным или в минимальной форме, описанной в PNAS 90 (1993) 5603; или подавляемой тетрациклином системой, описанной Gossen Bujard [PNAS 89 (1992) 5547]. Понятно, что могут использоваться другие промоторы, и в частности варианты LTP MMTV, несущие, например, гетерологичные области регуляции(а именно, "энхансерную" область). Линии этого изобретения были созданы путем трансфекции соответствующи х клеток в присутствии фосфата кальция фрагментом ДНК, несущим указанные гены(области аденовируса и/или ген рецептора для глюкокортикоидов) под контролем промотора транскрипции и терминатора(сайта полиаденилирования). Терминатор может быть или природным терминатором трансфицируемого гена или другим терминатором, как например терминатор раннего мессенджера вируса SV40. Предпочтительно, фрагмент ДНК несет также ген, дающий возможность селекции трансформированных клеток, как например ген устойчивости к генетицину. Ген устойчивости может нести также фрагмент другой ДНК, контрансфицируемой с первой. После трансфекции трансформированные клетки отбирали, и их ДНК анализировали для подтверждения интеграции фрагмента ДНК в геном. Эта методика позволяет получить следующие клеточные линии: 1. Клетки 293, обладающие геном 72К области Е2 Ad5 под контролем LTR MMTV; 2. Клетки 293, обладающие геном 72К области Е2 Ad5 под контролем LTR MMTV и геном рецептора для глюкокортикоидов; 3. Клетки 293, обладающие геном 72К области Е2 Ad5 под контролем LTR MMTV и областью Е4 под контролем LTR MMTV; 4. Клетки 293, геном 72К области Е2 Ad5 под контролем LTR MMTV, областью Е4 под контролем LTR MMTV и геном рецептора для глюкокортикоидов; 5. Клетки 293, обладающие областью Е4 под контролем LTR MMTV; 6. Клетки 293, обладающие областью Е4 под контролем LTR MMTV и геном рецептора для глюкокортикоидов; 7. Клетки gm DBP6, обладающие областями Е1А и Е1B под контролем их собственного промотора и областью Е4 под контролем LTR MMTV. Пример 5 В этом примере описывается получение дефектных рекомбинантных аденовирусов по этому изобретению, геном которых лишен генов Е1, Е3 и Е4. По предпочтительному способу осуществления, проиллюстрированному в примере и в примере 3, геном рекомбинантных аденовирусов этого изобретения модифицирован так, чтобы гены Е1 и Е4 были бы по крайней мере нефункциональными. Такие аденовирусы обладают прежде всего способностью включения важных гетерологичных генов. С другой стороны, эти векторы имеют высокую безопасность, потому что деления области Е4, которая участвуе т в регуляции экспрессии поздних генов, стабильности поздних ядерных РНК, прекращения экспрессии белков клетки-хозяина и эффективности репликации вирусной ДНК. Эти векторы обладают, таким образом, фоновым шумом транскрипции, и экспрессия вирусных генов сильно снижена. И, наконец, по особенно предпочтительному способу, эти векторы могут производиться до титров, сравнимых с таковыми диких аденовирусов. Эти аденовирусы получали, начиная с плазмиды pPY55, несущей модифицированную правую часть генома аденовируса Ad5, или путем трансфекции с хелперной плазмидой(также примеры 1, 2 и 3), или с помощью дополняющей линии(пример 4). 5.1. Создание плазмиды ρΡΥ55 а) Построение плазмиды ρΡΥ32 Фрагмент Ауrll-Всll плазмиды pFG144 [F. L. Graham et al. EMBO I. 8(1989) 2077-2085], соответствующий правому концу генома аденовируса Ad5, сначала был клонирован между сайтами Xbal и ВаmHl вектора рlС19Н, начиная с контекста dam-. Это давало плазмиду pPY23. Интересной характеристикой плазмиды ρΡΥ23 яявляется то, что сайт Sall, происходящий из мультисайта клонирования вектора рlС19Н, остается единственным и что он располагается около правого конца генома аденовируса Ad5. Фрагмент Наеlll-SalI плазмиды pPY23, который содержит правый конец генома аденовируса Ad5, начиная с сайта Наеlll, располагается в положении 35614 и затем клонируется между сайтами EcoRV и Xhol вектора рlС2ОН, что дает плазмиду pPY29. Интересной характеристикой этой плазмиды является то, что сайты Xbal и Clal, происходящие из мультисайта клонирования вектора pICOH, располагаются около соединения EcoRV/Наеlll полученного в результате клонирования. Кроме того, это соединение модифицирует нуклеотидный контекст непосредственно примыкающий к сайту Clal, который теперь становится метилируемым в контексте dam+. Фрагмент Хbаl(30470)-Маеll(32811) генома аденовируса Ad5 затем клонировали между сайтами Xbal и Clal плазмиды pΡΥ29, полученной начиная с контекста dam-, что дает плазмиду pΡΥ30. Фрагмент SstI плазмиды рРУ30, который соответствует последовательности генома аденовируса Ad5 с сайта SstI в положении 30556 до правого конца, в заключение клонировали между сайтами SstI вектора рlС20Н, что дает плазмиду pPY31, карта рестрикции вставки которой, локализованной между сайтами Hindlll, дана на фиг.6. Плазмида pPY32 была получена после частичного расщепления плазмиды pΡΥ31 с помощью Bglll, с последующим полным расщеплением с помощью ВаmHl, а затем повторным лигированием. Плазмида pPY32 соответствует, таким образом, делеции генома аденовируса Ad5, расположенной между сайтом ВаmHl плазмиды pPY31 и сайтом Bglll, локализованном в положении 30818. Карта рестрикции фрагмента Hindlll плазмиды pPY32 дана на фиг.6. Особенность плазмиды pΡΥ32 состоит в том, что она обладает уникальными сайтами Sall и Xbal. b) Построение плазмиды pPY47 Фрагмент ВаmHl(21562)-Хbаl(28592) генома аденовируса Ad5 сначала клонировали между сайтами ВаmHl и Xbal вектора рlС19Н, полученного начиная с контекста dam-, что давало плазмиду pPY17. Эта плазмида содержит, таким образом, фрагмент Hindlll(26328)-BglII(28133) генома аденовируса Ad5, который может быть клонирован между сайтами Hindlll и Bglll вектора pIC20R, для получения плазмиды pPY34. Особенность этой плазмиды состоит в том, что сайт ВаmHl, происходящий из мультисайта клонирования, располагается непосредственно вблизи сайта Hindlll(26328) генома аденовируса Ad5. Фрагмент BamHI(21562)-HindIII(26328) генома аденовируса Ad5, происходящий из плазмиды pPY17, затем клонируется между сайтами ВаmHl и Hindlll плазмиды pPY34, что дает плазмиду pΡΥ39. Фрагмент ВаmHl-XbaI плазмиды pΡΥ39, полученной начиная с контекста dam-, содержащий часть генома аденовируса Ad5, заключающегося между сайтами ВаmHl(21562) и BglII(28123), затем клонировали между сайтами ВаmHl и Xbal вектора рРlС19Н, полученного, начиная с контекста dam-. Это дает плазмиду pPY47, интересной особенностью которой является то, что сайт Sall, происходящий из мультисайта клонирования, локализуется вблизи сайта Hindlll(фиг.7). с) Построение плазмиды pPY55 Фрагмент Sall-Xbal плазмиды pPY47, полученной начиная с контекста dam-, и который содержит часть генома аденовируса Ad5, начиная с сайта ВаmHl(21562) до сайта BglII(28133), клонировали между сайтами Sall и Xbal плазмиды pPY32, что давало плазмиду pΡΥ55. Эта плазмида непосредственно может использоваться для получения рекомбинантных аденовирусов, лишенных, по крайней мере, области Е3(деления между сайтами Bglll, расположенными в положениях 28133 и 30818 генома аденовируса Ad5) и полной области Е4(делеция между сайтами Маеll(32811) и Наеlll(35614) генома аденовируса Ad5(фи г.7). 5.2. Получение аденовируса, содержащего по крайней мере однo делению в области Е4, и предпочтительно, по крaйней мере в областях Е1 и Е4. а) Получение путем котрансфекции с вирусом-хелпером Е4 клеток 293. Принцип, основанный на транскомплементации между "минивирусом"(вирус-хелпер), эспрессирующим область Е4, и рекомбинантным вирусом, лишенным по крайней мере Е3 и Е4. Эти вирусы были получены или путем лигирования in vitro, или после рекомбинации in vivo по следующей стратегии: (I) ДНК вир уса Ad-d1324 [Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543] и плазмиду pPY55, расщепленные BamHI, сначала лигировали in vitro, зaтем котрансфицировали с плазмидой pEAGal(описанной в примере 2) в клетки 293. (ll) ДНК вируса Ad-d1324, расщепленную EcoRI и плазмиду pPY55, расщепленную ВаmHl котрансфицировали с плазмидой pE4Gal в клетки 293. (lll) ДНК аденовируса Ad5 и плазмиду pPY55, расщепленные ВаmHl, лигировали и затем котрансфицировали с плазмидой pE4Gal в клетки 293. (IV) ДНК аденовируса Ad5, расщепленную ЕсоRl и плазмиду pPY55, расщепленную ВаmHl, котрансфицировали с pEAGal в клетки 293. Стратегии (I) и (ll) позволяют получить рекомбинантный вирус, лишенный областей Е1, Е3 и Е4; стратегии (lll) и (IV) позволяют получить рекомбинантный вирус, лишенный области Е1, но выражающий какой-нибудь трансген, может использоваться вместо ДНК вируса Ad-de324 в соответствии со стратегиями (I) или (ll), в целях получения рекомбинантного вируса, лишенного областей Е1, Е3 и Е4 и выражающей указанный трансген. b) Получение с помощью клеточных линий, транскомплементирующи х функции Е1 и Е4. Принцип, положенный здесь в основу, то т, что линия клеток, производная от линии, экспрессирующей область Е1, например, линия 293, и также экспрессирующая по крайней мере открытые рамки считывания ORF6 и ORF6/7 области Е4 аденовируса Ad5 под контролем промотора, например, индуцируемого, способна транскомплементировать сразу обе области Е1 и Е4 аденовируса Ad5. Такие линии описаны в примере 4. Рекомбинантный вирус, лишенный областей Е1, Е3 и Е4, может, таким образом, быть получен путем лигирования in vitro или путем рекомбинации in vivo по методикам, описанным здесь выше. Какая бы методика не использовалась для получения вирусов, лишенных по крайней мере области Е4, после трансфекции в эти использованные клетки наблюдался цитопатический эффект(показывающий продукцию рекомбинантных вирусов). Затем клетки собирали, разрушали путем трех циклов замораживанияразмораживания в их супернатанте, затем центрифугировали при 4000об/мин в течение 10 минут. Супернатант, полученный таким образом, затем амплицировали на свежей клеточной культуре(клетки 293 по методикам а) и клетки 293, экспрессирующие область Е4 по методике b)). Затем вирус очищали от мембран и его ДНК анализировали по методу Hirt(упомянутому выше). Концентраты штамма вируса получали затем в градиенте плотности хлоида цезия. Пример 6 В этом примере описывается получение дефектных рекомбинантных аденовирусов, геном которых лишен генов Е1, ЕЗ, L5 и Е4. Эти векторы особенно предпочтительны, потому что область L5 кодирует последовательность, которая является белком, чрезвычайно токсичным для клетки. Эти аденовирусы получили, начиная с плазмиды р2, несущей модифицированную правую часть генома аденовируса Ad5, путем котрансфекции с различными хелперными плазмидами. Они могут быть также получены с помощью дополняющей линии. 6.1. Построение плазмиды р2. Эта плазмида содержит всю правую область генома аденовируса Ad5, начиная с сайта ВаmHl(21562), из которой удален фрагмент, заключенный между сайтами Xbal(28592) и Avrll(35463), несущей гены Е3, L5 и Е4. Плазмида р2 была получена путем клонирования и лигирования следующих фрагментов в плазмиду pIC19R, расщепленную ВаmHl и дефосфорилированну(см. фиг.8): фрагмента генома аденовируса Ad5, содержащегося между сайтами ВаmHl(21562) и Xbal(28592), и правого конца генома аденовируса Ad5(содержащего правую ITR), начиная с сайта Ανrll(35463) по сайт Bcll(соответствующий ВаmHl). 6.2. Построение хелперной плазмиды(pITRL5-E4), несущей ген L5. Хелперная плазмида pITRL5-E4 привносит гены Е4 и L5. Она соответствует плазмиде pE4Gal, описанной в примере 2, несущей, кроме того, область L5, кодирующую нить(последовательность) под контролем промотора MLP аденовируса Ad2. Плазмида pITRL5-E4 была построена следующим образом(фиг.9 и 10): был синтезирован олигонуклеотид из 58pb, содержащий в направлении 5' - 3' сайт Hindlll, ATG нити и последовательность, кодирующую нить до сайта Ndel в положении 31089 генома аденовируса Ad5. Последовательность этого нуклеотида дана здесь ниже в ориентации 5' - 3': AAGCTTATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTC AACCCCGTGTATCCATATG Сайты Hindlll на 5' и Ndel на 3' подчеркнуты одной линией, ATG нити подчеркнута двойной линией. Фрагмент Sspl-Hindlll, содержащий последовательность промотора MLP, следующую за состоящим из 3-х частей лидером аденовируса Ad2 был выделен из плазмиды pMLP10 [Ballay et al., (1987)UCLA Symposia on molecular and cellular biology, New series. Vol 70, Robinson et al. (Eds) New-York, 481]. Этот фрагмент был встроен вместе с олигонуклеотидом из 58pb, описанным здесь выше, между сайтами Ndel и EcoRV плазмиды pIC19R с получением промежуточной плазмиды(см. фиг.9). Фрагмент SacII(затупленный)-Ndеl плазмиды pE4Gal(пример 2) затем вводили в промежуточную плазмиду между сайтами Sspl и Ndel с получением плазмиды pITRL5-E4 (фиг.10). 6.3. Получение дефектных рекомбинантных аденовирусов, содержащих делецию в областях Е1, Е3, L5 и Е4. а) Получение путем котрансфекции с вирусом-хелпером клеток 293. Принцип основан на транскомплементации между "минивирусом"(вирус-хелпер), экспрессирующим область L5 или области Е4 и L5 и рекомбинантным вирусом, лишенным, по крайней мере, Е3, Е$ и L5. Эти вирусы были получены или путем лигирования in vitro, или после рекомбинации in vivo по следующим стратегиям: (I) ДНК вируса Ad-d1324 [Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543] и плазмиду p2, расщепленные ВаmHl, сначала лигировали in vitro, затем котрансфицировали с плазмидой-хелпером pITRL5-E4(пример 6.2) в клетки 293. (ll) ДНК вируса Ad-d1324, расщепленную EcoRI и плазмиду р2, расщепленную ВаmHl, котрансфицировали вместе с плазмидой pITRL5-E4 в клетки 293. (lll) ДНК аденовируса Ad5 и плазмиду р2, расщепленные ВаmHl, лигировали, затем котрансфицировали вместе с pITRL5-E4 в клетки 293. (IV) ДНК аденовируса Ad5, расщепленную EcoRI и плазмиду р2, расщепленную ВаmHl, котрансфицировали вместе с pITRL5-E4 в клетки 293. Стратегии (I) и (ll) позволяют получать рекомбинантный аденовирус, лишенный областей Е1, Е3, L5 и Е4; стратегии (lll) и (IV) позволяют получать рекомбинантный аденовирус, лишенный областей Е3, L5 и Е4. Разумеется, ДНК рекомбинантного вируса, лишенная области Е1, но выражающая какой-нибудь трансген, может использоваться вместо ДНК вируса Ad-d1324 по стратегиям (I) или (ll) в целях получения рекомбинантного вируса, лишенного областей Е1, Е3, L5 и Е4 и экспрессирующего указанный трансген. Методики, описанные здесь выше, могут также использоваться с вирусом-хелпером, несущим только область L5, при использовании клеточной линии, способной экспрессировать области Е1 и Е4 аденовируса, такой, которая описана в примере 4. С другой стороны, также можно использовать дополняющую линию, способную экспрессировать области E1, E4 и L5, так, чтобы полностью освободиться от вируса-хелпера. После трансфекции вирусные продукты извлекают, амплифицируют и очищают при условиях, описанных в примере 5.