Спосіб синтезу суміші олігосахаридів

1. Спосіб синтезу суміші олігосахаридів, які включають в себе повторювані ланки формул (фосфат-рибоза-рибітол)n або (рибоза-рибітолфосфат)n 2 (19) 1 3 75579 4 аліл-D-рибітолу (14) перацетатом рибофуранози з 10. Дисахаридні похідні 2,3,4-три-О-бензил-1-Оподальшим деацетилюванням з одержанням 2,3,4(2’,5’-ди-О-бензил-β-D-рибофуранозил)-D-рибітолтри-О-бензил-5-О-аліл-(β-D-рибофуранозил)-D5-О-триетиламонію фосфонат (23) та 2,3,4-три-Орибітолу (4), який піддають абсорбуваннюбензил-1-О-(2’,5’-ди-O-бензил-β-Dдесорбуванню на силікагелі для очищення. рибофуранозил)-D-рибітол-3’-О-триетиламонію 8. Спосіб синтезу дисахаридної проміжної хімічної фосфонат (19) як ключові проміжні хімічні сполуки сполуки 5-О-пропеніл-2,3,4-три-О-бензил-1-Оу процесі олігомеризації за пп. 2-4. (2’,5’-ди-О-бензил-β-D-рибофуранозил)-D-рибітолу 11. Спосіб одержання дисахаридів 2,3,4-три-О(17), який включає в себе процес дибензилування бензил-1-О-(β-D-2’,5’-ди-О-бензил-3’-Одисахариду 2,3,4-три-О-бензил-5-О-аліл-(β-Dтриетиламонійфосфонатрибофуранозил)-Dрибофуранозил)-D-рибітолу (4) оксидом дибутирибітолу (19) або 2,3,4-три-О-бензил-5-Ололова, йодидом тетрабутиламонію, гідридом натриетиламонійфосфонат-1-О-(β-D-2’,5’-ди-Отрію та хлоридом бензилу у співвідношенні 1:0,5бензилрибофуранозил)-D-рибітолу (23) з викорис2:0,001-1:0,5-10:1-5, у розчиннику, наприклад, тотанням як вихідної сполуки дисахариду 5-Олуолі, бензолі, тетрагідрофурані або ксилолі, з пропеніл-2,3,4-три-О-бензил-1-О-(2’,5’-ди-Оодержанням сполуки формули 5 (5-О-аліл-2,3,4бензил-β-D-рибофуранозил)-D-рибітолу, який три-О-бензил-1-О-(β-D-2’,5’-ди-Овключає в себе процес фосфонілування трихлобензилрибофуранозил)-D-рибітолу), з подальшою ридом фосфору-імідазолом із подальшим гідроліізомеризацією алілу до пропенілу. зом пропенілової групи або ацетилювання, гідроліз 9. Дисахарид 5-О-пропеніл-2,3,4-три-О-бензил-1пропенілової групи та фосфонілування трихлориО-(2’,5’-ди-О-бензил-β-D-рибофуранозил)-Dдом фосфору-імідазолом із подальшим деацетирибітол як проміжна хімічна сполука у синтезі похілюванням. дних 2,3,4-три-О-бензил-1-О-(β-D-2',5’-ди-О12. Застосування дисахаридів 2,3,4-три-О-бензилбензил-3’-О1-О-(β-D-2’,5’-ди-О-бензил-3’-Отриетиламонійфосфонатрибофуранозил)-Dтриетиламонійфосфонатрибофуранозил)-Dрибітолу (19) та 2,3,4-три-О-бензил-5-Орибітолу (19) або 2,3,4-три-О-бензил-5-Отриетиламонійфосфонат-1-О-(β-D-2’,5’-ди-Отриетиламонійфосфонат-1-О-(β-D-2’,5’-ди-Обензилрибофуранозил)-D-рибітолу (23). бензилрибофуранозил)-D-рибітолу (23) для синтезу олігосахаридних сумішей за п. 1. Цей винахід має відношення до галузі медицини, зокрема, до хімічного синтезу сумішей олігосахаридів, які є похідними рибозо-рибітолфосфату та які використовуються як активна речовина у вакцинах для запобігання інфекцій, які спричинюються бактерією Haemophilus influenzae типу b (Hib), a також до вакцин, до складу яких входять згадані суміші олігосахаридів. Бактерія Haemophilus influenzae типу b представляє собою серйозну проблему для здоров'я людей цілого світу. Ця бактерія викликає, головним чином у дітей віком до 5 років, менінгіт, пневмонію, епіглотит та інші захворювання дихальних шляхів. На наслідки, у межах від глухоти до тяжкого розумового відставання, у багатьох країнах страждають більш ніж 30% людей, які залишилися у живих після хвороби. Нещодавні визначення ВОЗ вказують на те, що кожного року від захворювань, які викликає бактерія Haemophilus influenzae типу b, у світі вмирає понад 550000 дітей. Очищений капсульний полісахарид бактерії Haemophilus influenzae є здатним до індукування захисного імунітету у дорослих, однак імунна реакція у дітей є дуже слабкою і практично відсутня у маленьких дітей, яким не виповнилося 2 років. Капсульний полісахарид має наведену далі структуру: (1) Було показано, що головною проблемою є сама природа антигену. Оскільки це полісахарид, то він є Т-незалежним антигеном, який є нездатним до стимулювання імунної системи немовлят, яка ще є незрілою. Було показано також, що цю проблему можна вирішити шляхом ковалентного зв'язування (кон'югування) полісахариду з білком, відомим як носій. Продукт, який одержують таким чином, відомий як кон'югатна вакцина, індукує захисний рівень антитіл із двомісячного віку. Чу (Chu) та інші (Infection immunity, 1983, 40, 245-256) одержали кон'югат із нативного капсульного полісахариду та протиправцевої сироватки після активації за допомогою ціаногенброміду. Гордон (Gordon) [патент США №4,496,538] активував природний полісахарид ціаногенбромідом, після чого кон'югував його із протидифтерійною сироваткою за допомогою гідразиду адипінової кислоти. Гілман (Hilman) [патент США №4,459,286] кон'югував природний полісахарид за допомогою 6-амінокапронової кислоти до зовнішнього білка менінгококової мембрани після його попередньої активації. 5 75579 6 В усіх попередніх процесах кон'югування кілька груп капсульного полісахариду та білок-носій об'єднуються ковалентним зв'язком. Здатність до індукування захисного імунітету у немовлят залежить від структури кон'югату. У разі, (2) коли кон'югування відбувається на нативному полісахариді, групи, які приймають участь у об'єднанні з білком, довільно розподіляються вздовж полісахаридного ланцюгу, що дуже ускладнює визначення характеристик кожної партії лікарського препарату. Усі ці вакцини дуже важко аналізувати за доЗагальний вихід становив 7% (Германе (Herпомогою фізико-хімічних методів; унаслідок цього mans) та інші, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas, 1987, загальноприйнятою практикою є оцінка кожної 106, 498-504). Крім того, цей процес мав два голопартії лікарського препарату шляхом визначення вні недоліки: процес включає в себе 11 хроматогімуногенності на експериментальних тваринах. рафічних етапів і захисні групи ключової проміжної Однак поведінка кон'югату в організмі дітей та ексхімічної сполуки не є ідеальними для процесу оліпериментальних тварин відрізняється. гомеризації. На думку ВОЗ [М.Р. Холідей (M.R. Holliday), К. На етапі олігомеризації, або другого етапу сиДжоунс (С. Jones), Biologicals, 1999, 27, 51-53], для нтезу, спосіб, який було використано для здійсзабезпечення стабільної якості контроль кон'югатнення синтезу у розчині шляхом активації ефіру них вакцин повинен грунтуватися на фізикокислоти тривалентного фосфору, забезпечував хімічних методах, які демонструють відтворювавихід у межах від 70% до 90% на цикл, виходячи з ність від однієї партії лікарських препаратів до дисахариду. Головним недоліком такої процедури іншої. є неможливість одержання фрагментів, до складу З метою полегшення цього завдання вакцини яких входить більше ніж 4 повторюваних одиниці, на основі кон'югата повинні мати все більш точне оскільки різко зменшується вихід. Дисахаридна визначення на молекулярному рівні. Одним з альпроміжна хімічна сполука 2 має три різні захисні тернативних рішень цієї проблеми є синтез фраггрупи, що надзвичайно ускладнює деблокування ментів капсульних полісахаридів. Спосіб конструкінцевого продукту. Таким чином, цей дисахарид ювання антигену Haemophilus influenzae типу b не є найпридатнішим для олігомеризації за допошляхом синтезу має два головні етапи, а саме: могою твердофазного хімічного методу синтезу. синтез дисахаридної проміжної хімічної сполуки та Незважаючи на це, повідомлялось про його викоїї олігомеризація. Для здійснення цього синтезу ристання для одержання гексамеру. було розроблено кілька варіантів підходу. У імунологічних випробуваннях (Пітере Ккам Бьювері (Beuvery) та інші [Заявка на європа(Peters Ccam) та інші, Infect. Immunity, 1991, 59, тент ЕР 0276 516; патент СІЛА №5,034,519; Tetra3504-10) повідомлялось лише про кон'югування hedron Lett., 28, 1553, 1987] та Хугерхут (Hoogerтримеру із протиправцевою сироваткою та його hout) та інші [J. Carbohydr. Chem., 7, 1988, 399-416] імуногенність у мишей та мавп. одержали шляхом синтезу фрагмент капсульного Г. Джаст (G. Just), Дж. Апслакіс (J. Upeslacis) полісахариду, до складу якого, за твердженням (заявка на європатент ЕР 0 320 942, Л. Чан (L. авторів, входило від 3 до 20 повторюваних одиChan); Г. Джаст (G. Just), Tetrahedron, 46, 1990, ниць. Для досягнення цієї мети спочатку одержу151-162) також синтезували фрагмент капсульного вали дисахаридну проміжну хімічну сполуку 2, пополісахариду шляхом використання дисахаридної тім, за допомогою твердофазного хімічного методу проміжної хімічної сполуки та синтезу у розчині. Із синтезу або синтезу у розчині, олігомер, який метою одержання оптимальної проміжної хімічної складався з 6 повторюваних одиниць (Елі (ЕНе) та сполуки для синтезування антигену, було обрано інші, Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 108, 1989, 219). інший шлях: 1 — синтез рибітола, 2 — синтез риОлігомери кон'югували з білками або пептидами бозної одиниці з відповідними захисними групами, через спейсер. Кон'югований тример мав таку ж 3 — сполучення рибози та рибітолу та 4 — ввесаму імуногенність у мишей, що і комерційно досдення активної функціональної групи фосфору. тупна вакцина, яку було одержано з капсульного полісахариду. За переважним варіантом втілення, який ілюструє обраний синтетичний шлях, вдавались до стратегії, яку наведено далі: 1 — синтез рибітолу, (3) 2 — сполучення з рибозою, 3 — вибірне введення замісників до рибозної одиниці та 4 — введення активної функціональної групи фосфору. У разі використання цього шляху ключову дисахаридну похідну 2 одержували всього за 15 реакційних етапів. Ця процедура забезпечує одержання проміжної хімічної сполуки З, фосфорамідату, яка, завдяки своїм захисним групам, має переважні властивості для процесу олігомеризації. Для досягнення 7 75579 8 цієї мети необхідною є більша кількість етапів. лише 10-15%, оскільки для забезпечення високого Ключову похідну одержали через 19 етапів із зарівня включення дисахаридної проміжної хімічної стосування 8 хроматографічних процесів очищенсполуки на цикл необхідним є, як правило, велиня. кий надлишок дисахариду, у межах від 3 до 10 Дисахарид 3 олігомеризували у розчині з одемоль-еквівалентів. Надлишок дисахариду втрачаржанням фрагментів капсульного полісахариду, які ється впродовж згаданого процесу. Інша проблема складались з 3 повторюваних одиниць, із виходом полягає у тому, що, як правило, виникає потреба у у межах 70-90% на цикл, виходячи з дисахариду. двох різних похідних, одна з яких є необхідною для Канділ (Kandil) та інші (Syn. Lett., 1992, 555-7), сполучення із твердою основою, а друга для подоЧон (Chon) та інші (заявка WO 93/15205 та патент вження ланцюга. США №5,679,352) за допомогою твердофазного Загальним аспектом усіх попередніх повідомхімічного методу синтезу синтезували фрагменти лень про синтез Hib антигенів, який, у той же сакапсульного полісахариду з використанням тієї ж мий час, становив одну з головних цілей, було самої дисахаридної проміжної хімічної сполуки 3 одержання одного фрагменту чистого олігосахата монометоксиполіетиленгліколю як основи. До риду, який не відрізнявся не лише за своєю струкскладу синтезованих фрагментів входило до 6 турою, але також і за довжиною ланцюга. Все це повторюваних одиниць, вихід на цикл дорівнював було базоване на припущенні, що антиген, який 95%. складається з однієї молекули, є необхідним для Кріван (Krivan) та інші (заявка WO 94/00149) та одержання анти-Hib кон'югатних вакцин більш посНілссон (Nilsson) та інші (J. Carbohydr. Chem., 10, тійної якості внаслідок полегшеного контролю. 1991, 1-22) одержали фрагмент із 10 повторюваБули розроблені нові методи одержання олігоних одиниць із використанням подібної дисахарисахаридних фрагментів шляхом фрагментування дної проміжної хімічної сполуки та твердофазного природних полісахаридів, а також активації суміші хімічного методу синтезу. Цей фрагмент кон'югуолігосахаридів однією з їхніх кінцевих груп. вали через спейсер із Hib-адгезином. Фосфонатну У патентах США №4,808,700 та № 4,761,283, а проміжну хімічну сполуку одержали через 21 етап також у роботі Р.К. Сейда (R.C. Seid) та інших, яку із загальним виходом 5%. Необхідними були також було вміщено у Glycoconjugate J., 1989, 6, 489-498, як мінімум 7 хроматографічних етапів. Процес оліповідомлялось про те, що природний полісахарид гомеризації здійснювали з використанням Ноксидується перйодатом і одержані фрагменти фосфонатів та твердофазного хімічного методу очищають. Суміш олігосахаридних фрагментів синтезу з застосуванням амінованої смоли компаактивується двома кінцевими групами, як показано нії Merrifield. Одержали антиген із 97-99% вклюна наведеній далі схемі. Ці олігосахариди були ченням на цикл. кон'юговані шляхом гідроамінування з білком CRM У роботі Чу Мачадо (Chiu Machado) та інших 197. Як показано на схемі, обидві ділянки кон'югу(J. Carbohydr. Chem., 13, 1994, 465-474) та патенті вання є різними. Після завершення кон'югування Куби № 22424 повідомлялось про ефективну провиникає як мінімум два сімейства кон'югованих цедуру синтезу відповідним чином захищеної риолігосахаридів із різними структурами. З іншого бозної похідної із глюкози. Із використанням цієї боку, наслідком зв'язування одного і того ж олігопохідної ключовий дисахарид одержували за 20 сахариду із двома різними ділянками того ж самореакційних етапів. го білка або із двома різними молекулами білка є Одним з аспектів, який ускладнює застосуванодержання не дуже добре визначеного відсотка ня синтезу для одержання Hib фрагментів та їх продукту. Усі ці явища викликають гетерогенність використання у вакцинах, є синтез дисахаридної та ускладнюють контроль. проміжної хімічної сполуки. Усі вищенаведені способи відбивають сучасний стан хімії вуглеводів, однак вони мають два головні серйозні технічні недоліки. Використання декількох хроматографічних етапів впродовж синтезу, завдяки чому застосування синтезу у промисловому масштабі стає непрактичним, та кількість З іншого боку, у патенті США № 5,153,312, а етапів синтезу, яка є, як правило, дуже великою. також у роботі П. Константіно (P. Constantino) та Головною проблемою синтезу дисахариду з менінших, яку було вміщено у Vaccine, 1999, 17, 1251шою кількістю реакційних етапів є введення бен63, повідомляється прогідроліз природного полізильних груп до рибозної одиниці. сахариду оцтовою кислотою та очищення одержаПроцес олігомеризації дисахаридної проміжної ної суміші олігосахаридних фрагментів. Продукт хімічної сполуки може здійснюватись у розчині. У активують за допомогою ряду реакцій, під час яких цьому випадку серйозний недолік полягає у тому, спейсер вводять шляхом гідроамінування етиленщо максимальний розмір, який можна одержати, діаміном при високому рН та температурі, що мообмежується 3-4 повторюваними одиницями. Для же негативно вплинути на цілісність олігосахаридздійснення цього процесу можна вдаватись також ної суміші. З іншого боку, частина антигену, до твердофазного хімічного методу синтезу. Хімія можливо, інактивується після відновлення карботвердофазного синтезу надає можливість одернільної кінцевої групи, як показано на наведеній жання олігосахаридів у межах від 6 до 10 повтодалі схемі. У подальшому олігосахаридна амінова рюваних одиниць із високими виходами на цикл. похідна вибірно заміщується активним складним Однак постійно виникають дві серйозні проблеми, ефіром адипінової кислоти на одній зі своїх кінцеякі полягають у тому, що реальний вихід становить 9 75579 10 вих складноефірних функціональних груп. Інша відбувається шляхом гідролізу складного ефіру складноефірна функціональна група залишається кислоти двовалентного фосфору, дуже швидко активною для сполучення з білком. виникають дуже короткі фрагменті, сполучені з білком, які мають менше ніж 4 повторювані одиниці і стають, унаслідок цього, неактивними. Фрагменти з розміром у границях 8-20 повторюваних одиниць є, у принципі, більш стійкими, оскільки після розкладу до половини розміру залишковий фрагмент, сполучений з білком-носієм, буде більшим за 4 повторювані одиниці. Кількість білка-носія, необхідна для вакцинних доз, також є меншою. Однак, відповідно до сучасного технічного стану щодо олігосахаридів Hib, одержання фрагментів розміром 10-20 повторюваних одиниць шляхом синтезу у розчині є неможливим, і їх все ще дуже важко одержувати твердофазними хімічДві вакцини, які були одержані із продуктів ними методами синтезу. Фактично у жодному з фрагментування природного полісахариду, викопопередніх повідомлень не наведено прикладу ристовували для практичного вакцинування велиодержання олігосахаридів такого розміру. Іншим кої кількості дітей. Результати цього вакцинування недоліком є Т-залежність імунної реакції, що є дупродемонстрували можливість використання для же важливим аспектом для одержання доброї імувиготовлення кон'югатної вакцини проти Hib олігонної відповіді у дітей. Т-залежність полісахариду сахариду не одного певного розміру, але цілого зменшується зі збільшенням його розміру (К. Фердіапазону розмірів, з одночасним адекватним коннандес (С. Fernandez), Ε. Сверремарк (Ε. Sverreтролюванням відтворюваності та якості продукту. mark), Cell Immunol., 1994, 153, 67-78). Навіть у разі, якщо кон'югати, одержані цим шляТаким чином, будь-який шлях синтезу Hib анхом, є більш визначеними, аніж ті, які були одертигенів, для того, щоб набути конкурентоспроможжані шляхом прямої активації полісахариду, пракності, повинен зменшити кількість етапів до одертично неможливо здійснити фрагментування жання ключового дисахариду, зменшити кількість природного полісахариду з подальшим введенням хроматографічних етапів, і, зокрема, значно підфункціональної активної групи та одержанням того вищити вихід процесу олігомеризації. ж самого рівня молекулярної визначеності та чисДо складу сумішей олігосахаридів, які одертоти антигену, якого можна досягти шляхом хімічжують шляхом гідролізу природних полісахаридів, ного синтезу. входять фракції обох розмірних діапазонів, наслідНе існує явних переваг у контролюванні кон'юком чого є використання переваг кожного з них та гатних вакцин ані у разі використання олігосахазменшення їхніх недоліків. У разі, якщо подібні риду певного розміру, ані у разі використання сусуміші вдасться одержати шляхом синтезу, їхньою міші олігосахаридів за розміром, однак, однорідних перевагою буде вміщення обох розмірних діапазоза рештою своєї структури. Це було продемонстнів. Оскільки така суміш буде одержуватись шляровано за допомогою аналітичних методів, які відхом синтезу, вона буде більш визначеною та чисповідають сучасному технічному рівню і які дозвотою і буде вміщувати спейсер у точній пропорції та ляють легко визначити склад суміші положенні. олігосахаридів Hib (П. Константіно (P. Constantino) Цей винахід, зокрема, має відношення до хіміта інші, Vaccine, 1999, 17, 1251-1263 та Д. Пріеті чного синтезування сумішей олігосахаридів, які (D. Prioeti) та інші, European Carbohydrate Sympoбуло одержано з рибозо-рибітол-фосфату та які sium, Galway, липень 1999 року, РВ014). використовують як активну речовину у вакцинах З іншого боку, не існує різниць у імунологічних для запобігання інфекцій, які викликаються Haeвластивостях вакцини, яка складається з суміші mophilus influenzae типу b (Hib), а також до вакцин, олігосахаридів Hib за розміром, або з олігосахаридо складу яких входять згадані олігосахаридні суду одного розміру у разі, коли фрагмент є більшим міші. за 3 повторювані одиниці (С. Піллаі (S. Рillaі) та До складу олігосахаридних сумішей, які одерінші, Infection and Immunity, 1991, 59, 4371-6; A.A. жують хімічним синтезом за цим винаходом, вхоКенділ (А.А. Kandil) та інші, Glycoconjugate J., 1997, дять повторювані одиниці формул (фосфат14, 13-7 та Петерс ККАМ. (Peters ССАМ) та інші, рибоза-рибітол)n або (рибоза-рибітол-фосфат)n, Infect. Immunity, 1991, 59, 3504-10). як мінімум 5 сполук структури А або В, які предДодаткові обставини ускладнюють вибір одноставляють повторювану одиницю капсульного пого оптимального розміру з усіх точок зору. Оліголісахариду Haemophilus influenzae типу b та розрісахариди, які складаються з 4-6 повторюваних зняються лише за n, причому значення n одиниць, синтезуються з більшою легкістю і їхній знаходиться у межах від 4 до 25 (n≥4 та ≤25), та де розмір, як правило, є достатнім для індукування R1 або R2 — спейсер для кон'югування з носієм, за адекватної імунної відповіді. Однак кількість білкаумови, що R1 cnencep у разі, коли R2=H, або носія, яка є необхідною для цієї вакцини, є дуже R2=спейсер у разі, коли R1=H. великою, і стійкість олігосахариду у вакцині є гіршою, оскільки унаслідок процесу розкладу, який 11 Цей винахід має також відношення до імуногенів, до складу яких входять такі олігосахаридні суміші, до вакцин, до складу яких входять згадані імуногени, та до способів одержання таких олігосахаридів у формі сумішей. Крім того, цей винахід включає в себе використання вакцин, самостійно або у поєднанні з іншими вакцинами, для запобігання інфекцій, які викликаються Haemophilus influenzae типу b. За допомогою цього винаходу можна одержати, шляхом хімічного синтезу, однорідну суміш олігосахаридів добре визначеного розміру та більш ефективним шляхом. Ця суміш має більш високу чистоту і її одержують за допомогою простішого технічного способу. Було встановлено також, що кон'югатні вакцини, одержані з суміші за цим винаходом, є переважнішими унаслідок їх виготовлення та простішими щодо контролю. Іншою ціллю цього винаходу є спосіб синтезу для одержання вищезгаданої олігосахаридної суміші, який відрізняється тим, що є одноетапним способом, який включає в себе контрольовану реакцію поліконденсації між ключовою дисахаридною проміжною хімічною сполукою, спейсером та промотором, а також відрізняється тим, що середній розмір антигену може контролюватись пропорцією кожної складової, порядком додання складових та тривалістю реакції. Іншою ціллю цього винаходу є використання вищезгаданих імуногенів для одержання вакцин проти хвороб, які викликаються Haemophilus influenzae типу b, з або без використання ад'ювантів та інших домішок. Іншою з цілей цього винаходу є використання сумішей, опис яких було наведено перед тим, для одержання змішаних вакцин з іншими вакцинами, кон'югатними або ні, наприклад, із вакциною проти гепатиту В, асоційованою коклюшно-дифтерійноправцевою вакциною, вакциною проти менінгококів А, В, С, вакциною проти пневмококів 1, 5, 6В, 6А, 14, 19F, 19А, 23F та протиполіомієлітною вакциною. Іншою ціллю цього винаходу є оптимізація способу синтезування ключового дисахариду, необхідного для синтезування Hib олігосахаридів. Оптимізація полягає у відкритті нової вибірної реакції бензилування, яка у разі використання з дисахаридом 4, забезпечує можливість його перетворення на дисахарид 5, з введенням бензильних захисних груп до рибозної одиниці на одному етапі, завдяки чому весь процес стає значно корот 75579 шим та простішим. 12 Ціллю цього винаходу є також оптимальна процедура синтезування проміжної сполуки 4, яка забезпечує її одержання з високим рівнем чистоти усього за 11 реакційних етапів та без застосування хроматографічних процесів. Іншою ціллю цього винаходу є використання олігосахаридів, опис яких було наведено перед тим, для виявлення та кількісного визначення анти-Hib антитіл шляхом їх кон'югування з імунологічно інертними речовинами, наприклад, поліакриламідом, полістиролом, латексом. Новизна цього винаходу полягає у складі одержаної олігосахаридної суміші, яка відповідає повторюваній одиниці капсульного полісахариду Haemophilus influenzae типу b зі спейсером для кон'югування лише одним зі своїх кінців у положенні, попередньо визначеним синтезом, і яка завжди відповідає однаковій правильній та гомогенній структурі. До складу олігосахаридної суміші входять фрагменти двох різних розмірних діапазонів, головним чином, від 4 до 8 та від 8 до 20, завдяки чому використовуються переваги кожного діапазону та зменшуються недоліки, які б могла мати кожна група окремо. На додаток до цього, новизна цього винаходу полягає у самому способі одержання такої суміші шляхом хімічного синтезу, який забезпечує одержання продукту з високою відтворюваністю та ефективністю. Крім того, за допомогою цього винаходу демонструється також, що усього одна реакція забезпечує одноетапне введення бензильних захисних груп до рибозної одиниці і, таким чином, підвищує ефективність одержання ключової дисахаридної похідної для синтезу таких олігосахаридів. Синтез дисахаридної проміжної хімічної сполуки розпочинається з одержання похідної 5-О-аліл2,3,4-три-О-бензил-Б-рибітолу 14 за допомогою 9 хімічних реакцій, які представлено на наведеній далі схемі. D-рибоза перетворюється на ізопропіліденову похідну 6 за процедурою, опис якої було наведено раніше (Леонарт (Leonart) та інші, J. Het. Chem., 1966, 3, 485). Положення 5 алілують за допомогою алілброміду за умов фазового перенесення з подальшим гідролізом ізопропіліденової групи сірчаною кислотою у метанолі з одержанням похідної 8, яку піддають бензилуванню бензилхлоридом та гідридом натрію у диметилформаміді. 13 Метильну групу гідролізують сумішшю оцтової кислоти та хлористоводневої кислоти з подальшим відновленням борогідридом натрію. Похідна 5-О-аліл-2,3-ДИ-О-бензил-О-рибітол 11 абсорбується силікагелем та вибірно екстрагується шляхом перколяції спочатку циклогексаном, потім хлороформом. Ця процедура забезпечує очищення на високому рівні, не вдаючись до традиційних хроматографічних способів. Далі, похідна 11 тритилюється трифенілхлорметаном до піридину, бензилується бензилхлоридом та гідридом натрію у диметилформаміді і, нарешті, гідролізується оцтовою кислотою з одержанням кінцевої рибітолової похідної, яку очищають дистилюванням. Рибітолова похідна 14 рибозилюється перацетатом рибофуранози 15, як показано на наведеній далі схемі. Після деацетилювання з повторним застосуванням способів абсорбування-десорбування одержують тріол 4 з великим виходом, не вдаючись до жодних традиційних хроматографічних етапів. Після цього тріол 4 піддають реакції дибензилування, яку було відкрито у межах цього винаходу. Ця реакція забезпечує одержання похідної 5 після очищення шляхом хроматографування на колонках. Алільну групу проміжної хімічної сполуки 5 ізомеризують до пропенілу з подальшим введенням фосфонату до 3 вільного положення рибозної одиниці. Видалення пропенільної групи забезпечує одержання ключової проміжної похідної 19. Подібним же чином, шляхом ацетилювання гідроксильної функціональної групи у положенні 3 похідної 17, із подальшим гідролізом пропенілу, введенням фосфонату до положення 5 та деацетилюванням продукту, одержують ключовий дисахарид 23, який має фосфонат у положенні 5 та вільну гідроксильну функціональну групу у положенні 3. 75579 14 Структуру одержаних продуктів в усіх випадках було підтверджено ядерним магнітним резонансом 1Н та 13С, а також експериментами з кореляцією Н-Н та Н-Х. Чистоту було перевірено тонкошаровим хроматографуванням або високоефективним тонкошаровим хроматографуванням. Розпочинаючи з похідних 18 або 22, можна одержати похідні 24 та 25, які використовуються також як акцептори у реакції поліконденсації, як буде показано. Реакцію олігомеризації вивчали за різних обставин, завжди на основі лише трьох компонентів, ключового дисахариду (19 або його аналогу 23), промотора реакції, яким може бути півалоїлхлорид, адамантан-1-карбонілхлорид або інший стерично загальмований хлорангідрид, та третього компоненту, який різко охолоджує реакційну суміш і, одночасно з цим, вводить спейсер. До складу цього компоненту входить активна функціональна група або її попередник у кінцевому положенні, як, наприклад, 24, 25 або 26. Роль спейсера у разі, коли 24, 25 або 26 — 5азидо-З-оксапентанол, можуть відігравати будь-які інші сполуки з загальною формулою R1-Y-OH, де Υ — спейсерний ланцюг, яким може бути аліфатичний ланцюг. До складу аліфатичного ланцюга може входити ароматичний ланцюг, вставлений до нього, або ряд гетероатомів у кількості від 0 до 5. R1 представляє собою функціональну групу у кінцевому положенні спейсера і може бути NH2, 15 75579 COOR, СНО, SH або будь-яким з їхніх попередників. Для декількох випадків було розроблено оптимальні умови реакції поліконденсації, наприклад, з дисахаридом 19, спейсером 5-азидо-3окса-пентанолом 26 та півалоїлхлоридом у суміші дихлорметану-піридину одержують суміш, яка, після оксидування та хроматографування на Sephadex LH-20 з метанолом, забезпечує одержання фракції, до складу якої входять олігомери 27, з 7085% виходом на основі дисахариду. Суміш 27 олігосахаридів гідрогенізували у суміші метанолу-етилацетату-води-оцтової кислоти у присутності паладію на деревному вугіллі з одержанням суміші 28 неочищених олігосахаридів. У разі необхідності активації спейсерної групи, процес краще здійснювати на наступному етапі. Наприклад, до суміші 28 олігомерів додають Nгідроксисукцинімідиловий ефір βмалеімідопропіонової кислоти у диметилформаміді. Після закінчення реакції одержаний розчин розбавляють дистильованою водою та піддають ультрафільтрації під тиском азоту через мембранний фільтр зі смугою пропускання 1000. Одержаний таким чином продукт 30 представляє собою активну олігосахаридну суміш, придатну до використання у процесі кон'югації. Структуру одержаних продуктів в усіх випадках було підтверджено ядерним магнітним резонансом 1H та 13С, а також експериментами з кореляцією Н-Н та Н-Х. Білки дериватизували тіопропіоновою кислотою шляхом введення тіолу, замаскованого під дисульфід. Для цієї дериватизацїї можна використовувати такі реактиви, як SPDP або DSP (динатрійфосфат), з подальшим реагуванням з дитіотреїтолом у атмосфері азоту. Надлишок реактивів може видалятись для зовнішнього білка мембрани Neisseria meningitidis або для протиправцевої сироватки шляхом осадження за допомогою водного розчину етанолу (20-95%) з подальшим центрифугуванням. Цей процес для зовнішнього білка мембрани Neisseria meningitidis ілюстровано на наведеній далі схемі. 16 DSP — динатрійфосфат; DTT — дитіотреїтол; ОМР — зовнішній білок мембрани. Білок, який було піддано обробці тіолом, змішують у інертній атмосфері з активним олігосахаридом, який попередньо було профільтровано через фільтр з порами 0,2мкм та ліофілізовано. Реакційну суміш різко охолоджували холодним етанолом з осадженням продукту та подальшим центрифугуванням та ультрафільтруванням. За альтернативним варіантом надлишок активаційних реактивів може видалятись з кон'югату шляхом ультрафільтрації. За допомогою обох процесів відокремлення майже весь некон'югований з білком олігосахарид видаляється, що значно підвищує та стабілізує якість кінцевого продукту. Суміш 30 олігосахаридів може кон'югуватись з іншим носієм, наприклад, ліпідами. Так, наприклад, шляхом реакції з 2,3діоктадецилоксипропілсукцинімідилбутандіоатом 33 у присутності карбодііміду одержують кон'югат 34. Кон'югат суміші синтетичних олігосахаридів та білків може розбавлятись або відновлюватись у відповідному фізіологічному буферному розчині та може змішуватись з домішками, наприклад, ад'ювантами, консервантами тощо, з метою одержання кінцевої вакцинної лікарської форми. Подібним же чином, вакцина може змішуватись перед або під час процесу виготовлення з іншими вакцинами, що належать до типу тих, які використовують на сучасному етапі у програмах вакцинації немовлят до 1-річного віку. Наприклад, шляхом змішування з зовнішнім білком мембрани (ОМР) Neisseria meningitidis типу b, можна одержати комбіновану вакцину проти Hib та проти менінгіту типу В. Шляхом змішування з DTP можна одержати комбіновану тетравалентну вакцину проти Hib, коклюшу, дифтерії та правця. Імуногенність кон'югатної вакцини між олігосахаридами 30 та зовнішніми білками мембрани менінгококів демонстрували на декількох тваринних моделях. Присутність антитіл проти капсульного 17 75579 18 полісахариду Hib, індукованих вакциною, виявляли Гідроліз. Одержаний з попередньої реакції сиза допомогою твердофазного імуноферментного роп розчиняють у 1,5л діоксану. Додають НС1 (2N, методу (ELISA) (Д.К. Фіппс (D.C. Phipps) та інші, J. 1,5л) і систему нагрівають при температурі 75Immunolog. Methods, 1990, 135, 121-8). Результати 80°С. Через 2год реакцію припиняють і фази відопоказано на Фіг.2-5. кремлюють. Водну фазу двічі екстрагують 200мл Вакцина, до складу якої не входив оксид алюдихлорметану, змішані органічні фази випарюють. мінію, більш активну відповідь у кролів індукувала Концентрований продукт розчиняють у дихлормепершими дозами. Однак після других доз різниця тані (1л) і послідовно промивають водою (400мл), між препаратами зникала. У обох випадках спонасиченим розчином бікарбонату натрію (300мл) стерігався високий титр антитіл. та водою (400мл) і сушать сульфатом натрію та У разі пацюків лінії Sprague-Dawley вакцина, випарюють. яку одержали із двох кон'югатів, які різнились співВідновлення. Одержаний сироп розчиняють у відношенням вуглеводів-білка, також показала етанолі (800 мл) і систему охолоджують до темпевисокі титри анти-Hib антитіл. ратури 20°С. Після цього додають 24г NaBH4 СуУ мишей лінії Balb с вакцина, яку одержали з міш перемішують впродовж 1,5год при кімнатній такого ж кон'югату, індукувала високі титри антитіл температурі; після завершення реакції надлишок проти капсульного полісахариду. борогідриду видаляють за допомогою оцтової кисСуміш 30 олігосахаридів може сполучатись із лоти до рН 7-8. Розчин фільтрують та випарюють. матрицями, наприклад, поліакриламідом. ОдержаЗалишок розчиняють у 500мл дихлорметану, органий продукт може використовуватись для виявнічний розчин промивають водою, сушать сульфалення анти-Hib антитіл у вакцинованих людей та том натрію та використовують у нижченаведеному імунізованих лабораторних тварин. Суміш може прикладі. сполучатись також з латексом та використовуваПриклад 2: Очищення 5-0-аліл-2,3-ді-0-бензилтись для виявлення антитіл у хворих або вакцино0-рибітолу 11 ваних людей. Поліакриламід, активований за меДо розчину неочищеного 5-О-аліл-2,3-ді-Отодом Н. Бовіна (N. Bovin) (Glycoconjugate J., 1998, бензил-О-рибітолу 11 з попереднього прикладу у 15, 431-446), реагує з сумішшю 30 олігосахаридів. дихлорметані додають 300г силікагелю і суміш Відносна здатність HbO-HSA (олігосахарид вірусу вручну перемішують до адсорбування продукту гепатиту В-людський сироватковий альбумін), ретвердою фазою. Суспензію випарюють під вакуукомендованої речовини для виявлення анти-Hib мом для видалення дихлорметану. Силікагель, антитіл, та поліакриламідного кон'югату 30, покаякий вміщує продукт, вносять до фільтрузана на Фіг.6. Краще відношення реакції до шуму перколятору. Домішки видаляють шляхом екстраодержали із продуктом, до складу якого входили гування циклогексаном впродовж 48 год. Екстраксинтетичні олігосахариди. ційний розчинник заміняють на дихлорметан для Робочі приклади: екстрагування продукту з одержанням хроматогПриклад 1: Синтез 5-О-аліл-2,3-ді-О-бензил-Орафічно чистого сиропу блідо-жовтого кольору. рибітолу 11 Вихід 75-95%. ЯМР13С δ 60,7 (С-1), 70,2 (С-4), Алілування. 100г метил 2,3-О-ізопропіліден-D71,0, 71,7, 72,0, 73,6 (PhCH2C-5, ОСН2СН=), 79,2, рибофуранозиду розчиняють у 70мл алілброміду і 79,3 (С-2,3), 117,1 (СН2=), 127,5-128,2 (Ph), 134,3 перемішують у присутності 75мл водного 50% роз(СН=), 138,9. 138,1 (Cipso). чину гідроксиду натрію та 2,6г тетрабутиламонію Приклад 3: Синтез 5-О-аліл-2,3,4-три-Ойодиду впродовж 12 год. Перемішування припибензил-Б-рибітолу 14 няють і одержані фази відокремлюють. Водну фаТритилювання. 100г 5-0-аліл-2,3-ді-0-бензил-0зу екстрагують дихлорметаном (70 мл), змішані рибітолу 11 з попереднього прикладу сушать під органічні фази сушать та випарюють. вакуумом та розчиняють у 600мл піридину. До цьоГідроліз. Одержаний сироп розчиняють у 1,5л го розчину додають 75г хлортрифенілметану та метанолу. До одержаного розчину додають 3,6мл 0,5г диметиламінопіридину і суміш перемішують водного розчину сірчаної кислоти (0,4N) і суміш при температурі 50°С впродовж 6 год. Після завенагрівають у колбі зі зворотним холодильником ршення реакції розчинник випарюють, залишок при температурі перегонки впродовж 3год. Після розчиняють у 500мл дихлорметану, розчин промизакінчення реакції реакційну суміш нейтралізують вають водою (1л), сушать та випарюють. Залишок бікарбонатом натрію, одержані солі відфільтровусушать під вакуумом впродовж 3 год. ють, розчин випарюють. Залишок екстрагують Бензилування. Сироп із попередньої реакції етилацетатом, сушать та випарюють. Продукт сурозчиняють у 300мл диметилформаміду і одержашать під вакуумом впродовж як мінімум 2год. ний розчин охолоджують до температури 5°С. ПоБензилування. Одержаний продукт розчинявільно додають гідрид натрію (25г), після чого сують у 450мл диметилформаміду. Одержаний розміш перемішують впродовж 30хв. Після цього чин охолоджують до температури 0°С і повільно повільно додають бензилхлорид (40мл) і перемідодають 50г гідриду натрію. Суміш перемішують шування продовжують на протязі 1год. Після завевпродовж 30хв, після чого додають краплями бенршення реакції реакційну суміш знову охолоджузилхлорид (150мл). Після 2год перемішування до ють і повільно додають 10мл метанолу для реакційної суміші додають краплями 20мл метавидалення надлишку реактивів. Розчинники випанолу. Одержану суспензію випарюють під вакуурюють, залишок розчиняють у 500мл дихлорметамом, знову розчиняють у дихлорметані та промину, промивають 1л води. Органічну фазу сушать вають водою. Органічну фазу сушать сульфатом сульфатом натрію та випарюють. натрію та випарюють. Гідроліз. Залишок розчиняють у оцтовій кисло 19 75579 20 ті (1л) та 110мл води і реакційну суміш перемішуник заміняють на хлороформ для екстрагування ють при температурі 80°С впродовж 1,5год. Розпродукту з одержанням сиропу блідо-жовтого кочинник видаляють випарюванням і залишок розльору. Вихід 238г. ЯМР 1Η δ 5,85 (m, 1Н, СН=), чиняють у 500мл циклогексану. Органічну фазу 5,20 (m, 2Н, СН2),4,85 (s, 1Н, Н-1'), 13С δ 62,8 (С-5'), охолоджують при температурі 0-5°С впродовж 77,7, 77,9, 78,2 (С 2,3,4), 84,0 (С-4'), 107,2 (С-1’). 4год, після чого фільтрують, промивають водою, Приклад 6: Синтез 5-О-аліл-2,3,4-три-Осушать сульфатом натрію та випарюють. Чистий бензил-1-О-(р-О-2’,5’ -ді-О-бензилпродукт одержують шляхом дистилювання при рибофуранозил)-0-рибітолу 5 температурі 200-220°С і під тиском 0,1мм. Вихід Бензилування. Сполуки (200г), які було одер80-90г, виходячи зі 100г рибози. ЯМР13С δ 61,2 (Сжано у попередньому прикладі, розчиняють у то1), 69,6, 71,8, 72,1, 72,3, 73,9 (PhCH2C-5, луолі (2л). До цього розчину додають Bu2SnO (80г) ОСН2СН=), 78,0, 78,8, 78,9 (С-2,3,4), 116,8 (СН2), і суміш нагрівають у колбі зі зворотним холодиль127,5-128,2 (Ph), 134,7 (СН=), 138,0, 138,1, 138,2 ником при температурі перегонки впродовж 4 год. (Cipso). Невеликими порціями при кімнатній температурі Приклад 4: Синтез 5-О-аліл-2,3,4-три-Ододають 50% NaH (56г), і суміш перемішують при бензил-1-О-(р-Б-рибофуранозил)-0-рибітолу 4 температурі 80°С впродовж 30хв. Додають тетраГлікозилування. Продукт із попереднього прибутиламонію йодид (62г) і суміш знову перемішукладу (370г) розчиняють у 2,7л сухого дихлоретану ють впродовж 1 год. Після цього додають бензилта переносять до реакційної судини. Розчин охохлорид (148мл) і реакцію продовжують із лоджують до температури 0-25°С, додають пороперемішуванням при температурі 80°С впродовж шкоподібні молекулярні сита 4 А (207г) і через декількох годин. Додання бензилхлориду повто15хв повільно додають ефірат трифториду бору рюють з 30-хвилинними інтервалами доти, доки (407мл) зі швидкістю 15мл/хв. Нарешті, повільно тонкошарова хроматографія (гексани/етилацетат, (впродовж 20хв) додають розчин перацетату D2/1) не продемонструє, що головним продуктом у рибофуранози 15 (370г) у сухому дихлоретані (1л). реакційній суміші є дибензилований дисахарид. Реакційну суміш перемішують впродовж 3год і Реакційну суміш охолоджують та нейтралізують проходження реакції контролюють засобами тон1% розчином НСl у метанолі. Після цього реакційкошарового хроматографування (гексану суміш фільтрують через целіт та випарюють під ни/етилацетат, 2/1). Пластинки проявляють 5% зниженим тиском. Одержаний продукт, до складу розчином H2SO4(C) у етанолі. Після закінчення реаякого входять деякі солі, розчиняють у етилацетакції реакційну суміш нейтралізують триетиламіном ті, фільтрують під зниженим тиском та концентру(222мл) до рН7, потім додають насичений розчин ють. Неочищений сироп очищають шляхом хромабікарбонату натрію (800мл) і перемішування протографування на колонках у системі розчинників довжують на протязі 30хв. Необхідно утримувати толуол-ацетон, 60/1. Чистий продукт 5 одержують на нейтральному рівні рН реакційної суміші. Вміст у формі сиропу (100г). ЯМР 1H δ 5,96 (m, 1Н, реакційної судини фільтрують під вакуумом. ТверСН=), 5,18 (m, 2Н, СН2=), 5,02 (s, 1H, Н-1). ду речовину двічі промивають дихлоретаном Приклад 7: Синтез 2,3,4-три-О-бензил-1-О-(β(200мл) із метою екстрагування будь-якого залишD-2’,5’-ді-О-бензил-3’-О-триетиламонійфосфонаткового продукту у твердій речовині. Тверду фазу рибофуранозил)-0-рибітолу (19) видаляють, органічну фазу двічі екстрагують воІзомеризація алільної групи. 20г сиропу, який дою (600мл), сушать сульфатом натрію та випабуло одержано у попередньому прикладі, сушать рюють під вакуумом. під високим вакуумом впродовж 2год. Сироп розДеацетилювання. До одержаного у попередній чиняють у сухому диметилсульфоксиді (100мл) і реакції сиропу, який було розчинено у метанолі додають ί-бутоксид калію (6,4г). Реакційну суміш (2л), додають розчин метоксиду натрію (1%) у меперемішують при температурі 100°С впродовж 1 танолі до рН9. Реакція триває впродовж майже год, після чого додають до 250мл суміші льоду з 2год. Після завершення реакційну суміш нейтраліводою. Додають крапля за краплею концентровану зують смолою кислотного ствердження, доки рН хлористоводневу кислоту до досягнення рН7. Суне досягне рівня 6-7. Смолу відфільтровують під міш тричі екстрагують 80мл діетилового ефіру. вакуумом. До складу сиропу (427г) входить необОрганічні фази змішують, сушать сульфатом нахідний продукт разом із 5-О-аліл-2,3,4-три-Отрію та випарюють. бензил-О-рибітолом, D-рибозою та іншими невиФосфонілування. Розчин імідазолу (1,5г) у сузначеними домішками. хому ацетонітрилі (34мл) охолоджують до темпеПриклад 5: Очищення 5-О-аліл-2,3,4-три-Оратури 0°С. Додають трихлорид фосфору (0,56мл) бензил-1-О-(р-О-рибофуранозил)-0-рибітолу 4 та триетиламін (3,1мл). Одержаний розчин переСироп із попереднього прикладу розчиняють у мішують впродовж 15 хв. До цієї суміші додають дихлорметані (1л). До розчину додають силікагель дисахарид із попередньої реакції, який було роз(1кг) і суміш вручну перемішують до адсорбування чинено у сухому ацетонітрилі (3мл). Одержану продукту твердою фазою. Суспензію випарюють суміш перемішують впродовж 15 хв при кімнатній під вакуумом для видалення дихлорметану. Одетемпературі, реакцію припиняють шляхом додання ржану тверду речовину сушать під вакуумом впро1М розчину триетиламонійброміду. Перемішувандовж 2год для видалення будь-яких слідових кільня продовжують протягом 10 хв, додають дихлоркостей дихлорметану. Силікагель, який включає в метан і фази відокремлюють. Органічну фазу просебе продукт, вносять до фільтру-перколятору. мивають холодним розчином триетиламонію Домішки видаляють шляхом екстрагування циклобікарбонату, сушать та випарюють. гексаном впродовж 48 год. Екстракційний розчинГідроліз пропенілової групи. Продукт розчиня 21 75579 22 ють у оцтовій кислоті (60%) і перемішують при теводи-оцтової кислоти (1-2-2-0,1) з паладієм на демпературі 70°С впродовж 30 хв. Розчинник видаревному вугіллі (10%). Після закінчення продукт ляють випарюванням і продукт розчиняють у дихочищали шляхом іонообмінного хроматографулорметані, промивають триетиламонію вання на Sephadex C-25 Na. Визначення характебікарбонатом, сушать та випарюють. Шляхом хрористик ліофілізованого продукту за допомогою матографування одержаного продукту на колонках ЯМР показало присутність основної повторюваної одержують чисту сполуку з виходом у межах 70одиниці Rib-Rib-фосфат та спейсера. Активні фра85%. ЯМР 1H δ 6,85 (d, H-P), 4,95 (s, H-1), 4,60 (m, кції одержали після ультрафільтрації продукту Н-3), 2,93 (q, NCH2CH3) 1,20 (t, NCH2CH3). 13C δ спочатку на мембранному фільтрі зі смугою пропу105,9 (C-1). скання 1000, потім фільтрату на мембранному Приклад 8: Реакція поліконденсації між 19 та фільтрі зі смугою пропускання 10000. Розчин, 26 (співвідношення 10-1) профільтрований через мембранний фільтр зі смуДо розчину сполуки 19 (1г) у піридинігою пропускання 10000, збирали і ліофілізували з триетиламіні (10-1, 1мл) додають триметилацетиодержанням кінцевого продукту 28 з загальним лхлорид (0,14мл) і реакційну суміш перемішують виходом, який залежав від реакційних умов і дорівпродовж 20 хв. Додають спейсер 26 (29,2мг) та внював 20-80%, виходячи з дисахариду. ЯМР 1H δ нову кількість триметилацетилхлориду (0,9мл) і 5,12 (Н-1), 4,60 (Н-3), 3,29 (CH2NH2). 31Р δ 2,14 реакційну суміш перемішують впродовж 1 год. До(спейсер-P-Rib) 0,74 (рибітол-P-Rib). дають розчин І2 (1,1г) у піридині-воді (7,3мл; 20-1) і Приклад 14. Синтез похідної 5-(3реакційну суміш перемішують впродовж 30 хв. малеімідопропіонамідо)-3Суміш розбавляють дихлорметаном, промивають оксапентилолігорибозилрибітолфосфату 30 розчином тіосульфату натрію (ЇМ) та холодним До розчину попереднього прикладу (3,34мг, розчином триетиламонію броміду (0,5М), після 1,73мкмоль) у бідистиляті (0,1мл) додають 0,7мг чого сушать сульфатом натрію та випарюють. (2,62мкмоль) розчину N-гідроксисукцинімідил βОдержаний продукт розчиняють у метанолі та малеімідопропіонату 27 у Ν,Ν-диметилформаміді хроматографують на колонці Sephadex LH-20 з (0,4мл). Після 4-годинної реакції розчин випарютим же самим розчинником. Фракції, які вміщують ють під вакуумом, ресуспендують у дистильованій олігомери, змішують та випарюють. Вихід 80%. воді (0,5мл) та центрифугують (10 хв, 3500об/хв Приклад 9: Реакція поліконденсації між 19 та (366,3 рад∙c-1)). Супернатант розбавляють водою 26 (співвідношення 10-1) та ультрафільтрують на обладнанні компанії AmiДо розчину сполуки 19 (1г) та спейсера 26 con з мембранним фільтром зі смугою пропускан(14,6мг) у піридині-триетиламіні (10-1, 1мл) доданя 1000. Фільтрат ліофілізують. Вихід становить 1 ють триметилацетилхлорид (0,23мл) і реакційну від 85 до 95%. ЯМР Н δ 6,95 (s, 2H, СН=СН), 5,01 суміш перемішують впродовж 2 год. Додають роз(s, H-1), 3,41 (t, 2H, CH2NH), 2,56 (t, 2H, СН2а). чин І2 (1,1г) у піридині-воді (7,3мл; 20-1) і продукт Приклад 15: Аналіз продуктів, які було одеробробляють таким же самим чином, що і у приклажано у прикладі 13, за допомогою іонообмінного ді 8. хроматографування Приклад 10: Реакція поліконденсації між 19 та Продукти прикладів 8-12 гідрогенізували та у 26 (співвідношення 5-1) вигляді натрієвих солей аналізували за допомогою До розчину сполуки 19 (1г) та спейсера 24 іонообмінного хроматографування на колонці (29,2мг) у піридині-триетиламіні (10-1, 1мл) додаHR5/5 mono Q з лінійним градієнтом хлориду нають триметилацетилхлорид (0,23мл) і реакційну трію (П. Константіно (P. Constantino) та інші, Vacсуміш перемішують впродовж 2 год. Додають розcine, 1999, 17, 1251-1263). Профіль хроматографічин І2 (1,1г) у піридині-воді (7,3мл; 20-1) і продукт чного елюювання прикладу 8 представлено на обробляють таким же самим чином, що і у приклаФіг.1В; показано фрагменти різних розмірів. У разі ді 8. їх порівняння з результатами, які наведено у літеПриклад 11: Реакція поліконденсації між 23 та ратурі, та на Фіг.1А, яка представляє хроматогра26 (співвідношення 5-1, розчинник піридин) му пентамеру, можна дійти висновку, що у суміші До розчину сполуки 23 (1г) та спейсера 26 знаходяться фрагменти розміром від 4-5 до більш (29,2мг) у піридині (1мл) додають триметилацетиніж 20 повторюваних одиниць. лхлорид (0,23мл) і реакційну суміш перемішують Приклад 16: Кон'югація з зовнішнім білком впродовж 2 год. Додають розчин І2 (1,1г) у піридимембрани Neiseria meningitidis ні-воді (7,3мл; 20-1) і продукт обробляють таким Комплекс зовнішніх білків мембрани Neiseria же самим чином, що і у прикладі 8. meningitidis (OMPC) (400мг) розчиняли у 80мл заПриклад 12: Реакція поліконденсації між 19 та буференого фосфатом фізіологічного розчину (рН 24 (співвідношення 5-1, розчинник піридин) 8), який попередньо продували N2(g). Розчин проДо розчину сполуки 19 (1г) та спейсера 24 дували N2(g) впродовж 5 хв з перемішуванням на (29,2мг) у піридині (1мл) додають триметилацетильодо-водяній бані. Додавали 1,6мл розчину диналхлорид (0,23мл) і реакційну суміш перемішують трійфосфату у диметилформаміді і суміш обережвпродовж 2 год. Додають розчин І2 (1,1г) у піридино перемішували при температурі 4°С впродовж 2 ні-воді (7,3мл; 20-1) і продукт обробляють таким год. Додавали 1,6мл розчину дитіотреїтолу у заже самим чином, що і у прикладі 8. буференому фосфатом фізіологічному розчині і Приклад 13: Реакція гідрогенізації продуктів перемішування при температурі 4°С продовжуваПрикладів 8-12 ли протягом 1 год. Одержану суспензію переносиНеочищений продукт попередніх прикладів 8ли до центрифугальної склянки, яка вміщувала 2012 гідрогенізували у суміші етилацетату-етанолу400мл холодного етанолу. Склянку центрифугува 23 75579 24 ли при 1800об/хв (188,4 рад∙с-1) при температурі загальних білків; вона може регулюватись шляхом 4°С впродовж 30хв і супернатант видаляли. До додання більшої кількості буферного розчину до твердої речовини додавали нову порцію етанолу і одержання кінцевої концентрації Hib антигену процес центрифугування знову повторювали після 20мг/мл. Додавали тіомерсал до кінцевої концентдодання 200-400мл етанолу. Осад ресуспендуварації 0,1-0,001%. Одержана суспензія представляє ли у 80мл забуференого фосфатом фізіологічного собою кінцевий об'єм анти-Hib кон'югатної вакцини розчину (рН7-9). До одержаного розчину додавали без ад'юванту. синтетичний олігосахарид 30 і перемішування Приклад 20: Одержання анти-Hib вакцини з продовжували протягом 1-48 год. Після завершеноксидом алюмінію як ад'ювантом ня процесу операції осадження етанолом та Імуноген прикладу 16, розчинений у фосфатцентрифугування повторювали з ультрафільтраціному буфері з концентрацією 40мкг/мл, змішували єю на мембранному фільтрі зі смугою пропускання за асептичних умов при температурі 4-6°С із рів30000. Фільтрат відновлювали у забуференому ним об'ємом оксиду алюмінію (1-0,01мг/мл) у дисфосфатом фізіологічному розчині до концентрації тильованій воді. Перемішування продовжували Hib 40-80мкг/мл. ПРИКЛАД 17: Кон'югація з протипротягом 20 хв при температурі 4-8°С. Кінцеву правцевою сироваткою концентрацію Hib антигену визначали шляхом виРозчин протиправцевої сироватки з концентзначення вмісту рибози та загальних білків; вона рацією 5мг/мл у забуференому фосфатом фізіоломоже регулюватись шляхом додання більшої кільгічному розчині (рН8) барботували N2(g) впродовж кості буферного розчину до одержання кінцевої 5 хв. Не припиняючи перемішування на льодоконцентрації Hib антигену 20мг/мл. Додавали тіоводяній бані, додавали 1,6мл розчину динатрійфомерсал до кінцевої концентрації 0,1-0,001%. Одесфату у диметилформаміді і суміш обережно пержана суспензія представляє собою кінцевий ремішували при температурі 4°С впродовж 2 год. об'єм анти-Hib кон'югатної вакцини у оксиді алюміДодавали 1,6мл розчину дитіотреїтолу у забуфенію. реному фосфатом фізіологічному розчині і переПриклад 21: Одержання комбінованої вакцини мішування при температурі 4°С продовжували проти Hib та менінгококу В протягом 1 год. Одержаний розчин переносили до Імуноген прикладу 16, розчинений у фосфатультрафільтраційного обладнання з мембранним ному буфері з концентрацією 80 мкг/мл, змішували фільтром зі смугою пропускання 10000. Розчин за асептичних умов при температурі 4-6°С з оснодекілька разів піддавали ультрафільтрації шляхом вним об'ємом комплексу зовнішніх білків мембрадодання свіжого буферу, який перед тим барботуни (ОМРС) Neisseria meningitidis типу В, який зараз вали N2(g), доки розчин, який проходив через мемвикористовується у вакцині VAMEMGOC ВС, із бранний фільтр, не давав негативних результатів концентрацією у забуференому фосфатом фізіона пробу Елмана. До одержаного розчину додавалогічному розчині 100-200 мг/мл. Через 20 хв гомоли синтетичний олігосахарид 30 і перемішування генізації шляхом обережного перемішування за продовжували протягом 1-48 год. Після завершендопомогою магнітної мішалки реакційну суміш у ня процесу розчин знову піддавали ультрафільтповному об'ємі змішували з рівним об'ємом оксиду рації, доки розчин, який проходив через мембраналюмінію (1-0,01 мг/мл) у дистильованій воді. Пений фільтр, не давав негативних результатів на ремішування продовжували на протязі 20 хв при феноло-сірчану пробу на цукри. Розчин відновлютемпературі 4-6°С. Кінцеву концентрацію Hib антивали у забуференому фосфатом фізіологічному гену визначали шляхом визначення вмісту рибози розчині до концентрації Hib 40-80мкг/мл. та загальних білків за Лоурі; вона може регулюваПриклад 18: Кон'югація з напівсукцинатом діотись шляхом додання більшої кількості буферного ктадецилгліцерину розчину до одержання кінцевої концентрації Hib Продукт прикладу 8 (10мг) розчиняли у 1мл антигену 20 мг/мл. Додавали тіомерсал до кінцевої диметилформаміду та додавали до розчину напівконцентрації 0,1-0,001%. Одержана суспензія сукцинату діоктадецилгліцерину у вигляді Nпредставляє собою кінцевий об'єм комбінованої гідроксисукцинімідного складного ефіру 31. До вакцини проти Hib та менінгококу В у оксиді алюрозчину додавали етилдіамінопропілкарбодіімід мінію. (5мг) і реакційну суміш перемішували впродовж 6 Приклад 22: Одержання комбінованої вакцини год. Додавали нову порцію карбодііміду і переміпроти Hib, коклюшу, дифтерії та правця шування продовжували на протязі 6 год. РозчинІмуноген прикладу 16, розчинений у фосфатник випарювали і суміш переносили на силікагеному буфері з концентрацією 80 мкг/мл, змішували леву колонку С18 (1г). Олігосахарид видаляли за асептичних умов при температурі 4-6°С з осношляхом елюювання водою. Продукт елюювали вним об'ємом DTP у концентрації, яка у 4 рази градієнтною концентрацією суміші метанолу-води. перевищує звичайну концентрацію для кінцевої Вихід 85%. ЯМР 1H δ 5,12 (Н-1), 4,60 (Н-3), 3,40 лікарської форми. Через 20 хв гомогенізації шля(CH2NH), 1,30 (СН2), 0,90 (СН3). хом обережного перемішування за допомогою Приклад 19: Одержання вакцини без ад'юванмагнітної мішалки реакційну суміш у повному об'єту мі змішували з рівним об'ємом оксиду алюмінію (1Імуноген прикладу 16, розчинений у фосфат0,01мг/мл) у бідистиляті. Перемішування продовному буфері з концентрацією 40мкг/мл, розбавляжували на протязі 20 хв при температурі 4-6°С. ли за асептичних умов при температурі 4-8°С розКінцеву концентрацію Hib антигену визначали чином бідистиляту. Суспензію перемішували шляхом визначення вмісту рибози та загальних впродовж 10 хв. Кінцеву концентрацію Hib антигебілків за Лоурі; вона може регулюватись шляхом ну визначали шляхом визначення вмісту рибози та додання більшої кількості буферного розчину до 25 75579 26 одержання кінцевої концентрації Hib антигену рилу-води. Фракції, позитивні за орсиновою про20мг/мл. Додавали тіомерсал до кінцевої концентбою на рибозу, змішували та ліофілізували. Вихід, рації 0,1-0,001%. Одержана суспензія представляє як правило, перевищував 80%. собою кінцевий об'єм комбінованої вакцини проти Приклад 25: Здатність кон'югату синтетичних Hib, коклюшу, дифтерії та правця у оксиді алюміолігосахаридів до виявлення анти-Hib антитіл нію. Розчин продукту з попереднього прикладу у Приклад 23: імунологічний аналіз вакцин, які карбонатно-бікарбонатному буфері наносили з було одержано з суміші синтетичних олігосахариконцентрацією 1-100 мкг/мл на одну половину 96дів та зовнішнього білка мембрани ямкового планшету. На іншу половину планшету Вакцину прикладів 19 та 20 вводили у дозі 1 наносили антиген HbO-HSA у рекомендованій конмкг або 2 мкг антигенів. У цих експериментах були центрації. Аналіз за допомогою ELISA здійснили з використані кролі,пацюки та миші. 2 імунізації бувикористанням сироваток мишей, імунізованих ли здійснені з 4 тижневим інтервалом зі знекроввакциною, до складу якої входить природний каплюванням на 0 день, 28 день та 42 день. Кров сульний полісахарид, сполучений з протиправцезбирали та центрифугували при 3500 об/хв (366,3 вою сироваткою. Одержані результати представрад-с"1) впродовж 20 хв. Сироватку розбавляли у лені на Фіг.6. 10 разів та зберігали при температурі -40°С. Короткий опис фігур: Гуморальну імунну відповідь визначали за доФіг.1. Типова хроматограма олігомерних фрапомогою непрямого твердофазного імуноферменкцій, що були одержані у Прикладі 15, яку одержатного методу з використанням Hib-HSA як сенсибіли шляхом іонообмінного хроматографування на лізувального антигену. Результати показано на Mono Q HR 5/5 із лінійним градієнтом NaCl 0Фіг.2-5. 500 мМ, де А - пентамер; В -олігомер Прикладу 10. ПРИКЛАД 24: Кон'югат суміші синтетичних оліФіг.2. Гуморальна імунна відповідь кролів, імугосахаридів та /7-нітрофенілакрилату нізованих вакциною Прикладу 16. Суміш олігосахаридів з прикладу 13 (10 мг) роФіг.3. Гуморальна імунна відповідь кролів, імузчиняли у диметилформаміді і додавали до розчинізованих вакциною Прикладу 15. ну нітрофенілакрилату (10-30 мг) у диметилфорФіг.4. Гуморальна імунна відповідь пацюків, маміді (1 мл). Додавали 0,1-0,5 мл триетиламіну і імунізованих вакциною Прикладу 15. реакційну суміш перемішували впродовж 16 год. Фіг.5. Гуморальна імунна відповідь мишей лінії Додавали аміак (0,1-0,5 мл) і перемішування проBalb C, імунізованих вакциною Прикладу 15. довжували на протязі 24 год. Розчин переносили Фіг.6. Здатність кон'югату 26-РАА до виявленна колонку Sephadex LH-20 у ацетонітрилі. Елююня анти-Hib антитіл. вання здійснювали за допомогою суміші ацетоніт 27 Комп’ютерна верстка О. Присяжнюк 75579 Підписне 28 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601