Спосіб отримання ліпази, трансформована клітина дріжджів yarrowia lipolytica, здатна виробляти ліпазу, та її застосування

1. Спосіб отримання рекомбінантної ліпази, що містить: а) стадію, під час якої вирощуються клітини Yarrowia lipolytica, трансформовані вектором, що містить касету експресії кислотостійкої ліпази дріжджів, та б) стадію, протягом якої рекомбінантна ліпаза, утворена цими клітинами, відновлюється з супернатанта культури, який відрізняється тим, що стадію а) вирощування здійснюють у культуральному середовищі, яке не містить продуктів тваринного походження або неохарактеризованих сумішей, що складаються з білкових речовин тваринного походження чи продуктів їх ферментативного перетравлювання, та тим, що назване культуральне середовище містить: − як джерело азоту − неорганічний азот, бажано сульфат амонію; − джерело вуглецю, вибране з джерел вуглецю вуглеводного походження, поліспиртів, таких як гліцерин, та джерело вуглецю ліпідного походження, таке як жирні кислоти та ацилгліцерини; та − неорганічні солі, мікроелементи та вітаміни. 2. Спосіб отримання ліпази за п. 1, який відрізняється тим, що на стадії а) є: 2 (19) 1 3 97246 4 8. Спосіб отримання ліпази за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що під час стадії а) вирощують клон YL-LIP2-6C, поміщений до Національної Колекції Культур Мікроорганізмів (C.N.C.M.) під номером І-3542. 9. Препарат кислотостійкої рекомбінантної ліпази на основі дріжджів, який відрізняється тим, що його отримують способом відповідно до будь-якого з пунктів 1-8, де клітини Yarrowia lipolytica, трансформовані вектором, що містить касету експресії кислотостійкої ліпази дріжджів, вирощуються у культуральному середовищі, яке не містить продуктів трансгенного походження або неохарактеризованих сумішей, що складаються з білкових речовин тваринного походження чи продуктів їх ферментативного перетравлювання, причому назване культуральне середовище містить: − як джерело азоту − неорганічний азот, бажано сульфат амонію; − джерело вуглецю, вибране з джерел вуглецю вуглеводного походження, поліспиртів, таких як гліцерин, та джерело вуглецю ліпідного походження, вибране з жирних кислот та ацилгліцеринів; та − неорганічні солі, мікроелементи та вітаміни; та тим, що має каталітичну активність при рівні рН 6 щонайменше 15000 одиниць на мл супернатанту культури, у більш досконалому варіанті - більше 20000 одиниць на мл супернатанту культури, причому одна одиниця відповідає кількості ферменту, здатній каталізувати вивільнення 1 мкмоля жирної кислоти за хвилину, коли використовуваним субстратом є триоктаноїн, та тим, що концентрація ліпази у такому препараті вище 1 г ліпази на літр. 10. Застосування препарату ліпази за п. 9 для виробництва лікарського засобу, призначеного для лікування синдрому порушеної абсорбції жиру, пов’язаного з недостатністю підшлункової залози. 11. Клітина Yarrowia lipolytica, трансформована вектором, що містить касету експресії кислотостійкої позаклітинної ліпази на основі дріжджів, яка характеризується тим, що є клоном YL-LIP2-6C, поміщеним до Національної Колекції Культур Мікроорганізмів (C.N.C.M.) під номером І-3542. 12. Застосування клітини за п. 11 для отримання кислотостійкої ліпази на основі дріжджів. 13. Лікарський засіб, який відрізняється тим, що містить препарат ліпази за п. 9. Цей винахід належить до способу отримання ліпази з використанням клітин дріжджів Yarrowia lipolytica, що утворюють кислотостійку рекомбінантну ліпазу, за допомогою якого можна отримувати ліпазу, придатну для застосування у медицині; цей винахід також належить до штаму Yarrowia lipolytica, який виробляє надлишок кислотостійкої рекомбінантної ліпази, та до варіантів його застосування. Їжа, яку щодня споживає людина, складається головним чином з жирів, білків та цукрів. Усі ці складові частини перед всмоктуванням зазнають гідролізу, каталізованого ферментами травного тракту. Тому нестача будь-якого з цих ферментів може викликати порушення травлення та призвести до значною мірою недостатнього живлення. Так відбувається, наприклад, у випадках деяких патологій, таких як кістозний фіброз, або екзокринна недостатність підшлункової залози, пов'язаних з недостатністю панкреатичної ліпази. Для усунення цієї недостатності звичайно пропонують пероральний прийом екстрактів підшлункової залози. Однак ефективність такого лікування обмежена тим, що ферменти, які містяться у цих екстрактах (ліпази, амілази та протеази), швидко інактивуються кислотністю середовища шлунку. Тому було запропоновано застосовувати препарати ліпази, стійкі до умов шлунку, такі як, наприклад, препарати шлункової ліпази ссавців, отримані із застосуванням генних технологій, такі як описані у французькій заявці на патент, опублікованій під номером 2699179, від імені INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA, або препарати мікробної ліпази, що мають достатню активність у кислотному середовищі [ZENTLER-MONRO et al., Pancreas, 7, 311-319 (1992)]. Серед мікробних ліпаз, активних у кислотному середовищі, можна відзначити, зокрема, грибкові ліпази, такі як ліпази, отримані з грибків Candida ernobii [YOSHIDA et al., Biochim. Biophys. Acta.; 154, 586-588 (1968)], Trichosporon asteroid [DHARMSTHITI et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 111-116 (1997)], Rhizopus javanicus [UYTTENBROECK et al., Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)], або Yarrowia lipolytica [HADEBALL, Acta Biotechnol., 2, 159-167 (1991); NOVOTNY et al., J. Basic Microbiol. 28, 221-227 (1988)]. Окрім активності у кислотному середовищі, ці ліпази мають спільні властивості стійкості до розщеплення протеазами (трипсин, хімотрипсин, та пепсин) у присутності їх субстрату, та стійкості до дії солей жовчної кислоти (їх активність зберігається у присутності 10 мМ таурохолату натрію). Використання Yarrowia lipolytica для отримання цільового гена вже описувалося раніше. Так, заявка ЕР 1108043, від INRA (Національний Інститут сільськогосподарських досліджень) та CNRS (Національний центр наукових досліджень), описує використання інтегративного вектора, що містить касету експресії цільового гена та zetaпослідовностей, відповідних до LTRпослідовностей ретротранспозону дріжджів Yarrowia lipolytica. Такий вектор експресії дозволяє здійснити негомологічну та розосереджену інтеграцію декількох копій цільових вставок у геномну ДНК штаму Yarrowia lipolytica, яка не має zetaпослідовності. Цю систему, зокрема, було застосовано для інтеграції гена LIP2, що кодує ліпазу, у ДНК Yarrowia lipolytica, та вона дозволила здійснити в умовах культивування, які не були описані детально, секрецію ліпази, що у 10-15 разів пере 5 вищує цей показник для нетрансформованих штамів. Інші дослідження описують застосування вектору експресії, описаного у заявці на патент ЕР 1108043, для отримання рекомбінантної ліпази з Yarrowia lipolytica [міжнародна заявка WO 01/83773; PIGNEDE et al., Journal of Bacteriology, vol. 182, No. 10, p. 2802-2810 (2000) та PIGNEDE et al., Applied and Environmental Microbiology, vol. 66, No. 8, p. -3289 (2000)]. Таким чином: Міжнародна заявка WO 01/83773 від Laboratoires MAYOLY SPINDLER описує отримання клону Yarrowia lipolytica MS4 (CNCM (Національна колекція культур мікроорганізмів) I-2294), що містить 10 копій касети експресії гена LIP2, інтегрованих у його ДНК, та його застосування для отримання виходу ліпази 0,5 г на літр супернатанта (надосадової рідини) культури, та каталітичну активність 12000 ОД/мл, виміряну з використанням оливкової олії як субстрату, одна одиниця відповідає кількості ферменту, здатній каталізувати вивільнення 1 мкмоля жирної кислоти за хвилину, тобто у 200 разів більше, ніж початковий штам. Однак спосіб отримання ліпази, описаний у цій заявці, має важливий недолік, оскільки він використовує живильне середовище, що містить бактопептон або бактотриптон. Ці продукти, неохарактеризовані та такі, що містять різні гідролізати білків, зазвичай використовуються як джерела азоту та вуглецю. Отже, спосіб, описаний у цій заявці, не дозволяє отримувати ліпазу, яку б можна було безпосередньо застосовувати як лікарський засіб. - PIGNEDE et al. (Journal of Bacteriology, 2000) більш конкретно охарактеризували позаклітинну ліпазу, кодовану геном LIP2 Yarrowia lipolytica (штам PO1d). Таким чином, ця стаття була присвячена вивченню: Секреції ліпази з різних штамів дикого типу (PO1d, у якому Ylt1 відсутній, та Е150, у якому Ylt1 присутній), та з різних рекомбінантних штамів, у тому числі JMY184 (PO1d-6-15) та JMY279 (PO1d6-17), та Надлишкового утворення ліпази, зокрема, трансформантом JMY184. Ця стаття PIGNEDE et al. порівнює отримання ліпази штамами дикого типу, мутантними штамами та рекомбінантними штамами, отриманими відповідно до способу, описаного вище (Міжнародна заявка WO 01/83773). Штами дикого типу секретують від 30 до 50 одиниць ліпази/мл, тоді як мутантні штами, отримані під дією N-метил-N'-нітро-Nнітрозогунідину (NNNG) виробляють ліпази у 25 разів більше, тобто 1200 ОД/мл за оптимізованих умов культивування, із застосуванням середовища, що містить пептон (середовище прекультивування) та середовища, що містить молочну сироватку (ферментаційне середовище) (див. також DESTAIN et al., 1997). Рекомбінантні штами отримують за допомогою конструкції, що містить ген LIP2, регульований промотором РОХ2, та за допомогою негомологічної розосередженої інтеграції декількох копій касети експресії. PIGNEDE et al. отримали стабільні трансформанти (наприклад, штам JMY184), що виробляють 2000 ОД/мл за неоптимізованих умов, тобто, у середовищі 97246 6 YPDH(що містить 10 г/л екстракту дріжджів, 10 г/л бактопептону, 10 г/л глюкози та 10 г/л оливкової олії), що відповідає приблизно 0.5 г ліпази/л супернатанту. Аналогічно до вищенаведеного способу, препарати ліпази, описані PIGNEDE et al. та DESTAIN et al., непридатні, як такі, для застосування у медицині, та, конкретніше, для приготування клінічних партій, оскільки це вимагає застосування живильних середовищ, що містять пептони або молочну сироватку. - у процесі своєї роботи група PIGNEDE (Applied and Environmental Microbiology, 2000) вивчала штами Yarrowia lipolytica, трансформовані за допомогою вектора, що містить касету експресії гена LIP2. Автори визначили, що для 8 з цих трансформантів кількість копій касети експресії гена LIP2 становить від 6 до 16 (в середньому 10 копій), результатом чого є від 2 до 15 подій для інтеграції такої касети у різних локусах. Таким чином, штам JMY184 містить 12 копій касет експресії гена LIP2, інтегрованих у 4 різних локусах. Крім того, автори більш детально дослідили трансформант JMY184. Вони підтверджують, що штам JMY184 виробляє 0.5 г ліпази/л супернатанта з активністю 1500 ОД/мл на багатому YPDH-середовищі (що містить бактопептон) (у порівнянні з 50 ОД/мл для штаму дикого типу PO1d), виміряною з використанням у якості субстрату оливкової олії. Ці значення дають змогу зробити висновок про питому активність ліпази, що становить приблизно 3000 ОД/мл. Автори також стверджують, що оптимізоване утворення ліпази у ферментері JMY184 уможливлює отримання препаратів з активністю до 10000 ОД/мл. Однак умови культивування, за яких можливе отримання таких результатів, не розкриваються. У цій статті автори також дослідили стабільність цих трансформантів, зокрема, клону JMY184, у культурі, та продемонстрували їх стабільність для 120 поколінь. PIGNEDE et al. вважали, що для оптимізації утворення ліпази необхідно прийняти врахувати такі фактори як стабільність трансформантів та умови культивування. Крім того, вони показали, що існує тісна залежність між кількістю інтегрованих копій гена LIP2 та надлишковим утворенням ліпази. Однак для отримання ліпази єдиними культуральними середовищами, передбаченими у цій статті, є середовища, що містять пептони, такі як багате YPDH-середовище. Відомі способи отримання ліпази, навіть якщо вони дають змогу отримувати підвищений вихід ліпази, не можуть використовуватися для отримання ліпази, придатної для застосування у медицині. Дійсно, усі використовувані зазвичай культуральні середовища містять неохарактеризовані суміші та/або продукти тваринного походження, такі як пептони, триптони, або молочну сироватку. Тому існує потреба у розробці системи, яка б уможливила отримання препаратів рекомбінантної ліпази, придатної для медичного застосування. Для вирішення цієї проблеми автори винаходу розробили спосіб утворення ліпази, який відповідає цим потребам краще, ніж відомі способи. Конкретніше, винахідники розробили спосіб отриман 7 ня ліпази, згідно якому використовуване культурне середовище не містить вищезазначених продуктів, тобто, воно не містить продуктів тваринного походження та неохарактеризованих сумішей, таких як пептон, триптон чи молочна сироватка. Винахідники також селекціонували новий рекомбінантний штам Yarrowia lipolytica, що продукує ліпазу Lip2, який, у поєднанні з вищезгаданим способом, також уможливлює суттєве збільшення виходу отриманої ліпази. Отже, предметом цього винаходу є спосіб отримання ліпази із застосуванням штаму Yarrowia lipolytica, трансформованого вектором, що містить касету експресії кислотостійкої ліпази дріжджів, яка характеризується тим, що використовуване культуральне середовище не містить продуктів тваринного походження чи неохарактеризованих сумішей, таких як пептон, триптон чи молочна сироватка. Конкретніше, предметом цього винаходу є спосіб утворення ліпази, який складається з: а) стадії культивування клітин Yarrowia lipolytica, трансформованих вектором експресії, що містить касету експресії кислотостійкої ліпази дріжджів, в умовах, що уможливлюють утворення ліпази; б) стадії відновлення ліпази, утвореної таким чином, з супернатанту такої культури; та характеризується тим, що стадія а) культивування здійснюється у живильному середовищі, що не містить продуктів тваринного походження чи неохарактеризованих сумішей, які складаються з білкових речовин тваринного походження (наприклад, молочної сироватки), чи продуктів їх ферментативного перетравлення (наприклад, криптону чи пептону). У більш досконалому варіанті здійснення названого способу, живильне середовище стадії а) містить: - у якості джерела азоту - неорганічний азот, краще - сульфат амонію; - джерело вуглецю, вибране з-поміж джерел вуглецю вуглеводного походження, поліспирти, такі як гліцерин, та джерела вуглецю ліпідного походження, такі як жирні кислоти та ацилгліцерини; та - неорганічні солі, мікроелементи та вітаміни. Ще у одному більш досконалому варіанті здійснення способу стадія а) складається з: а1) етапу прекультивування трансформованих клітин Yarrowia lipolytica, згідно з вищенаведеним визначенням, у середовищі, що містить джерело вуглецю вуглеводного походження; та а2) етапу ферментизації такими клітинами, що складається з фази росту клітини у середовищі, що містить джерело вуглецю вуглеводного походження, та фази синтезу ліпази у середовищі, що містить як єдине джерело вуглецю жирну кислоту, вибрану з-поміж коротко-, середньо- або довголанцюгових тригліцеридів. Отже, ферментація здійснюється, по-перше, таким чином, щоб уможливити ріст клітини, наприклад, у присутності джерела вуглецю вуглеводного походження, та, по-друге, за умов, що уможливлюють біосинтез ліпази, наприклад, у присутності у якості єдиного джерела 97246 8 вуглецю хімічного індуктора типу жирної кислоти, такого як коротколанцюговий тригліцерид (напр., трибутирин), середньоланцюговий тригліцерид (напр., триоктаноїн або триоктаноілгліцерин), або довголанцюговий тригліцерид (напр., оливкова олія або триолеїн). Ферментацію краще здійснювати при постійному рівні рО2 від 15 % до 25 % та рН, бажано нижчому за 6.5. Ферментація, наприклад, може здійснюватися при швидкості повітряного потоку близько 1 Об.Об./хв, одна одиниця Об.Об./хв дорівнює 1 об'єм повітря на об'єм рідини за хвилину(наприклад, для 30-літрового ферментера, 1 Об.Об./хв дорівнює 30 л/хв., а для 5-літрового ферментера 1 Об.Об./хв дорівнює 5 л/хв). Відповідно до одного з найбільш досконалих варіантів винаходу, етап а1) прекультивування здійснюється до досягнення значення оптичної щільності ОЩ600нм від 3 до 10 на 1 мл, а на етапі а2) ферментації фаза синтезу ліпази починається, коли ОЩ600нм культури досягає значення від 60 до 70 на 1 мл. Відповідно до іншого більш досконалого варіанту винаходу, стадія б) починається, коли ОЩ600нм досягає значення від 300 до 350 на мл. Стадія б) може додатково містити: б1) відокремлення ліпази від супернатанту культури; б2) очищення ліпази, отриманої у б1). Ці два етапи здійснюються загальноприйнятними способами, відомими як: фізичне відокремлення (фільтрація, хроматографія, центрифугування), або фізико-хімічне відокремлення (утворення осаду). Відокремлення ліпази від супернатанту може виконати спеціаліст, наприклад, способом, вибраним з-поміж порожньоволоконної тангенціальної фільтрації, фронтальної фільтрації, та безперервного або періодичного центрифугування. Очищення ліпази полягає, зокрема, у зниженні біонавантаження, тобто, наявності мікроорганізмів, та може здійснюватися будь-яким придатним способом очищення, відомим спеціалісту, наприклад, способом, вибраним з-поміж фільтрації, фракційного осадження, іонообмінної хроматографії, хроматографії гідрофобної взаємодії та гельхроматографії. Додатково, пропонований спосіб отримання ліпази може також мати етап концентрування або збагачення, що полягає у підвищенні концентрації ліпази у препараті. Такий етап може виконуватися, наприклад, після етапу очищення. Він також може виконуватися одночасно з етапом очищення. Пропонований спосіб уможливлює, зокрема, отримання рекомбінантної ліпази у кількостях від близько 1 до 3 г очищеної ліпази на літр супернатанту культури. У більш досконалому варіанті запропонований спосіб дозволяє отримувати препарат рекомбінантної ліпази з каталітичною активністю, вищою за 15000 ОД/мл супернатанту культури. У найдосконалішому варіанті здійснення винаходу такий препарат має активність, вищу за 20000 ОД/мл супернатанту культури. Ці величини визначаються при рН 6 з використанням триоктаноїну як субстрату. Ця величина активності препа 9 рату ліпази становить найбільший інтерес у контексті розвитку фармацевтичної продукції. Зараз дійсно доцільно вводити зменшені дози ліпази, отриманої пропонованим способом, одночасно зберігаючи достатню ефективність для досягнення потрібного терапевтичного ефекту, яким може бути, наприклад, усунення порушення абсорбції жиру, пов'язаного з недостатністю підшлункової залози, зумовленою нестачею ліпази. Той факт, що ліпазу Lip2 зараз можна отримувати за допомогою рекомбінантних штамів Yarrowia lipolytica без потреби у продуктах тваринного походження, як у випадку з пропонованим способом, складає суттєву перевагу та значно полегшує застосування ліпази для медичних цілей. Вектор експресії, використовуваний для отримання рекомбінантних клітин Yarrowia lipolytica, застосовуваних у пропонованому способі, є інтегративним вектором, що має щонайменше одну копію гена LIP2 та елементи для регулювання експресії. Цей вектор може потім бути інтегрований у плазмідну або геномну ДНК дріжджів. Одним прикладом інтегративного вектора, якому надається особлива перевага, є вектор JMP6 або вектору JMP10, як це описано у міжнародній заявці на патент W0 01/83773. Вектор JMP6 містить касету експресії гена LIP2, який кодує прекурсор Lip2p ліпази Yarrowia lipolytica Lip2, вище від якої міститься промотор Yarrowia lipolytica для ацил СоА оксидази АСО2 під назвою РОХ2. Вектор JMP10 також містить ген LIP2, вище від якого міститься промотор Yarrowia lipolytica для ліпази Lip2. Ці два промотори індукуються тригліцеридами та жирними кислотами. У кожному з цих векторів касета експресії та промотор розташовані між zetaпослідовностями, як це описано вище. Інтеграція може бути цільовою, тобто, спрямованою на конкретні ділянки, або довільною. Таким чином, коли трансформований штам Yarrowia lipolytica не має zeta-послідовності (як, наприклад, у випадку зі штамом PO1d), інтеграція касети експресії розосереджена у геномній ДНК цього штаму. З іншого боку, коли штам Yarrowia lipolytica містить zetaпослідовності (як, наприклад, у випадку зі штамом Е150), інтеграція головним чином спрямована на рівень цих послідовностей. У іншому більш досконалому варіанті способу штам Yarrowia lipolytica бажано є штамом під назвою YL-LIP2-6C, поміщеним до Національної Колекції Культур Мікроорганізмів (C.N.C.M.), за адресою 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 15 грудня 2005 року, під номером 1-3542. Цей штам YL-LIP2-6C є генетично стабільним. З метою цього винаходу, вирази "стабільний", "генетично стабільний", "генетична стабільність", та їх варіанти вживаються стосовно збереження однакової кількості локусів для інтеграції цільової нуклеїнової кислоти у ДНК клону, що розглядається, протягом щонайменше 30 поколінь. Це число 30 поколінь - вибране за основу для обчислення генетичної стабільності, оскільки автори винаходу визначили, що воно відповідає кількості подвоєнь клітинних популяцій, достатній для уможливлення утворення ліпази за допомогою способу, що міс 97246 10 тить щонайменше один етап прекультивування рекомбінантних клітин Yarrowia lipolytica та один етап власне утворення ліпази в умовах ферментації. З метою цього винаходу, покоління визначається подвоєнням клітинної популяції та може обg числюватися за формулою Y = Х*2 , де Y клітинна популяція на момент часу t (наприклад, виражена як щільність клітин), X - початкова клітинна популяція на момент часу t0, та g - кількість поколінь, необхідна для того, щоб клітинна популяція перейшла від значення X до значення Y. У варіанті, якому надається перевага, клон вважається генетично стабільним, коли проаналізовано щонайменше 90 % колоній після щонайменше 30 поколінь, та він містить таку ж кількість локусів цільового гена, як і початковий клон. Таким чином, як виявляється з прикладів, клон YL-LIP2-6C вважається стабільним, оскільки близько 100 % колоній, проаналізованих після 100 поколінь, містять 6 локусів гена LIP2 (один локус відповідає ендогенному гену LIP2+5 локусів для інтеграції касети експресії гена LIP2). Як не дивно, коли у пропонованому способі використовувався саме цей штам, авторам винаходу вдалося отримати рекомбінантну ліпазу у великій кількості та краще контролювати процес її продукування. Автори винаходу дійсно змогли збільшити вихід утвореної ліпази та, зокрема, досягти отримання порядку від 1 до 3 г чистої ліпази на літр супернатанту культури. Їм також вдалося отримати препарати ліпази з активністю близько 20000 ОД/мл. У межах сутності цього винаходу, активність ліпази відповідає її ферментативній активності. Каталітична активність розчину ліпази виражається в одиницях (ОД) на мл аналізованого розчину. Питома активність виражена в одиницях (ОД) на мг очищеного білка (ліпази). Одна одиниця відповідає кількості ферменту, здатній каталізувати вивільнення 1 мкмоля жирної кислоти за хвилину. Питома активність ліпази змінюється в залежності від властивостей тригліцерида, використаного як субстрат. Крім збільшення виходу утвореної ліпази, авторам винаходу також вдалося забезпечити кращу відтворюваність способу вироблення, покращити гомогенність кінцевого продукту та поліпшити умови для очищення ліпази. Таким чином, ці різноманітні модифікації уможливлюють отримання ліпази, що задовольняє вимогам для медичного застосування. Дійсно, у контексті їх дослідження автори винаходу виявили, що ліпаза Lip2 активна при значеннях рН, вищих за 3, та до досягнення значення рН близько 8, причому оптимальна активність відзначалася при значеннях рН від 5 до 6. З іншого боку, вона безповоротно інактивувалася протягом 2-годинної інкубації при рН 3 чи рН 8.5. Питому активність ліпази Lip2 також було проаналізовано як залежну від різних субстратів, і автори винаходу таким чином визначили при рН 4 значення близько 10760 ОД/мг, близько 16920 ОД/мл та близько 12260 ОД/мл очищеної ліпази, з коротколанцюговими тригліцеридами (трибутирин), середньоланцюговими тригліцеридами (триоктаноїн), та довго 11 ланцюговими тригліцеридами (оливкова олія), відповідно. Нарешті, автори винаходу були здивовані, відзначивши, що ліпаза Lip2 активна у присутності солей жовчної кислоти, та що ця активність підвищується з концентрацією солей жовчної кислоти. Така активність у присутності солей жовчної кислоти до цього часу спостерігалася лише стосовно шлункової ліпази та панкреатичної ліпази у поєднанні з коліпазою. Отже, застосування ліпази Lip2 з високою питомою активністю не вимагає присутності коліпази. Клон YL-LIP2-6C містить декілька копій касет для експресії цієї ліпази Lip2, результатом чого є 5 подій для інтеграції гена LIP2 у різних локусах. У різних умовах, придатних для утворення ліпази, клон YL-LIP2-6C продукує більше ліпази, і ніж відомі трансформовані штами Yarrowia lipolytica. Ліпаза утворюється у кількості, більшій за 1 г/л супернатанту культури, тобто, більшій, ніж вихід ліпази у раніше відомих клонів, описаних вище. Предметом цього винаходу також є препарат ліпази, котрий можна отримати пропонованим способом. У більш досконалому варіанті отримання такого препарату ліпази вона має активність, яка щонайменше дорівнює 15000 ОД/мл, бажано вище 20000 ОД/мл, коли вона визначається способом, наведеним вище. Предметом винаходу є також використання пропонованого препарату ліпази для виготовлення лікарського засобу, призначеного для лікування патологій, пов'язаних з припиненням абсорбції жиру (наприклад, коротко-, середньо-чи довго ланцюгові жирні кислоти), зокрема, пов'язаних з недостатністю підшлункової залози, особливо екзокринної недостатності підшлункової залози. Предметом винаходу є також лікарський засіб, що характеризується тим, що містить препарат ліпази, згідно з вищенаведеним визначенням. Предметом цього винаходу є також клітина Yarrowia lipolytica, трансформована вектором експресії кислотостійкої ліпази дріжджів, яка характеризується тим, що є клоном під назвою YL-LIP26C, поміщеним до Національної Колекції Культур Мікроорганізмів (C.N.C.M.), за адресою 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 15 грудня 2005 року під номером I-3542. Предметом цього винаходу є також використання клітини згідно з вищенаведеним визначенням для виробництва кислотостійкої ліпази дріжджів. Окрім попередніх властивостей, винахід також має інші властивості, які будуть випливати з подальшого опису, що стосується прикладів здійснення способу, що є предметом цього винаходу, та прикладених креслень, де: - Фіг.1 представляє загальний підхід до регулювання генетичної стабільності клону YL-LIP2-6C під час здійснення способу отримання ліпази. - Фіг.2 ілюструє змінення оптичної щільності при 600 нм (ОЩ600нм зліва по осі у) (-♦-), та змінен-1 ня темпу росту (h , справа по осі у) (- -) як функції часу (години, вісь х) під час процесу ферментації. Стрілкою позначено індукцію утворення ліпази. 97246 12 - Фіг.3 зображує аналіз методом Саузернблоттингу кількості подій для інтеграції гена LIP2 у різних локусах у геном 23 колоній (рядки з 24 по 43) отриманий на момент часу ТЗЗ, що відповідає завершенню ферментації, приблизно через 100 годин після початку ферментації. Копії 1-6: 6 локусів гена LIP2 (5 локусів для інтеграції касети експресії гена LIP2 + один локус для ендогенного гена LIP2). М: маркер розміру. - Фіг.4 зображує моніторинг із застосуванням методу SDS-PAGE (електрофорез гелю поліакриламіду додецилсульфата натрію) продукування рекомбінантної ліпази клоном YL-LIP2-6C під час використання пропонованого способу вироблення ліпази, від моменту часу Т16 до Т33. Стрілка позначає індукцію продукування ліпази (час Т17, 48 години ферментації). М: драбина молекулярної ваги; п'ять рядків правої частини гелю відповідають відомим кількостям (2.5 мкг - 20 мкг) очищеної ліпази Lip2. - Фіг.5 ілюструє аналіз із застосуванням методу SDS-PAGE чистоти ліпази у супернатанті у момент часу ТЗЗ (завершення процесу ферментації). MW: драбина молекулярної ваги; Ref. Lip2 F5: ліпаза Lip2 у проміжку від 1 до 10 мкг; супернатант YL-LIP2-6C: об'єм аналізованого супернатанта у мкл. - На Фіг.6 представлений спектр мас рекомбінантної ліпази, утвореної клоном YL-LIP2-6C, визначений за допомогою MALDI-TOF масспектрометріїї. ПРИКЛАД 1. - МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ 1) Використані середовища Зазначені кінцеві концентрації є концентраціями у вихідних розчинах. Незбагачене базальне середовище (основне живильне середовище) 02130S Інгредієнти Глюкоза КН2РО4 Na2HPO4 Н3ВО3 (NH4)2SO4 C5H8O4NNa (глутамат) MgSO4 СаСl2 MnSO4 ZnSO4 Кінцева концентрація 10 г/л 3 г/л 3 г/л 0.34 г/л 3 г/л 1 г/л 0.5 г/л 0.023 г/л 0.038 г/л 0.04 г/л Збагачене живильне середовище 02130S додатково містить такі добавки: Добавки Розчин мікроелементів Розчин вітамінів Кінцева концентрація 1 мл/л 1 мл/л Склад розчину мікроелементів Інгредієнти СоСl2 Na2MoO4 CuSO4 Кінцева концентрація 0.5 г/л 0.06 г/л 0.9 г/л 13 97246 Склад розчину вітамінів Інгредієнти D-біотин Пантотенат кальцію Нікотинова кислота Міоінозитол Тіамін НСl Піридоксол НСl р-амінобензойна кислота Кінцева концентрація 0.05 г/л 1 г/л 1 г/л 25 г/л 0.25 г/л 0.25 г/л 0.05 г/л Склад розчину неорганічних солей Інгредієнти MgSO4 СаСl2 FeSO4 СоСl2 ZnSO4 Na2MoO4 Н3ВО3 МnСІ2 CuSO4 Кінцева концентрація 26.76 г/л 6.40 г/л 5.61 г/л 0.29 г/л 7.72 г/л 0.09 г/л 0.34 г/л 0.47 г/л 0.61 г/л Склад розчину FeSO4 Інгредієнти FeSO4 Кінцева концентрація 0.9 г/л Розчин аміаку, 14 % Протипінний розчин: Struktol (страктол) J673, розчинений у співвідношенні 1/10 (Schill+Seilacher AG, Moorfleeter Str. 28, 22113, Гамбург, Германія) 2) Виділення геномної ДНК та аналіз методом Саузерн-блоттинг а) Виділення геномної ДНК Осад клітин, отриманий з 4 мл культури, суспендують у 0.5 мл буферної суміші сорбіту (0.9 М сорбіту; 0.1 М трис-НСІ, рН = 8.0; 0.1 М ЕДТА (етилендіамінотетраацетат). Додають 50 мкл Zymolase® (зимолаза) 20Т (6 мг/мл) (Euromedex, 67458 Mundolsheim Cedex, France), 50 мкл 2меркаптоетанол при 0.28 М, та інкубують розчин протягом 1 години при температурі 37 °C з перемішуванням (180 об./хв.). Розчин центрифугують, і осад клітин суспендують у 0.5 мл буфера ТЕ (50 мМ трис-НСІ, рН = 8; 20 мМ ЕДТА). Додають 50 мкл 10 % SDS (додецилсульфат натрію), і розчин перемішують перевертанням та інкубують протягом 20 хв при температурі 65 °C. Додають 0.2 мл 5 М ацетату калію, потім розчин перемішують та витримують у льоду протягом 30 хв, після чого центрифугують протягом 5 хв. Супернатант переносять у пробірку ємністю 1.5 мл, потім додають 0.8 мл 100 % етанолу, попередньо охолодженого у льоду. Розчин перемішують, перевертаючи, потім центрифугують. Після видалення супернатанта додають 0.4 мл буфера ТЕ, що містить 100 мкг/мл РНКази A (Invitrogen, USA), та розчин інкубують протягом 1 години при температурі 37 °C. Після додавання 1 мл 100 % етанолу, попередньо охолодженого у льоду, розчин обережно перемішують до осадження ДНК, після чого центрифугують. Супернатант видаля 14 ють, потім масу ДНК висушують на відкритому повітрі, після чого суспендують у 100 мкл стерильної води, та інкубують протягом ночі при температурі 4 °C. б) Розщеплення ферментом HindIII Концентрацію геномної ДНК вимірюють шляхом визначення абсорбції при 260 нм (А260) та при 280 нм (А280). 1 мкг геномної ДНК змішують з стерильною водою до отримання кінцевого об'єму 42.5 мкл. Додають 5 мкл буфера (5Х) та 2.5 мкл Hindlll (50 ОД/мкл) (Invitrogen, USA), розчин інкубують при температурі 37 °C протягом 4 годин. в) Аналіз методом Саузерн-блоттингу Переноси під час аналізу методом Саузернблоттингу виконуються згідно з методиками до набору для мічення ДНК дигоксигеніном "DIG High Prime DNA Labeling and Detection" від компанії Roche Diagnostic. г) Методика мічення зразка Зразок, що відповідає цілому гену, який кодує ліпазу Lip2, отримують шляхом ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), що здійснюється на геномній ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази Phusion (Finzyme) та після двох праймерів: Сенспраймер: 5'-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3' (Поточний ід. № 1) Антисенс-праймер: 5'TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3' (Поточний ід. № 2) Після реакції ПЛР зразок очищали від гелю за допомогою набору "Nucleospin Extract II" (Macherey Nagel). Очищений зразок потім піддали холодному міченню (дигоксигенін) за допомогою набору "DIG high prime DNA labeling" від компанії Roche. д) Відокремлення від гелю, перенос ДНК та детектування сигналу 2 мкг розщепленого HindIII ДНК змішали із навантажувальним буфером та помістили на 0.8 % агарозний гель. Міграція здійснювалася при 50 V протягом 2 годин 30 хвилин, після чого ДНК перенесли на мембрану Hybond+ (Amersham Bioscience). Кількість локусів гена Lip2 у геномній ДНК визначили шляхом гібридизації міченого зразка на мембранах, з подальшою візуалізацією під дією рентгенівського випромінювання. 3) Визначення концентрації білка Концентрацію білка визначають методом Бредфорда. Кількість білків визначається за допомогою методу Бредфорда безпосередньо на супернатанті ферментуючої культури. Кількість білків, визначена таким чином, порівнюється з відомими кількостями очищеної ліпази Lip2. 20 мкл зразків стандартів при відповідному розбавленні змішують у пробірках з 1 мл розбавленого (5-кратно) реагенту, що містить барвник. Потім визначають оптичну щільність ОЩ595 відносно ОЩ595, отриманої для контролю (розбавляють тільки барвник). 4) Вимірювання питомої активності рекомбінантної ліпази Активність ліпази вимірюється потенціометрично при температурі 37 °C за допомогою рНстатного приладу (РАДІОМЕТР). Використовуваний субстрат - триоктаноїн. 10 мМ субстрату піддають емульсифікації у 15 мл реакційного буферу, що містить 1 мМ трис-НСІ (рН 5.5), 150 мМ NaCl, 15 5 мМ СаСl2 та 4 мМ тауродезоксихолату натрію (SIGMA). Одиниця питомої активності визначається як 1 мкмоль жирної кислоти, що вивільняється за хвилину, на мг білка. 5) Електрофорез у поліакриламідному гелі в умовах денатурування (SDS-PAGE) 12 мкл зразка, що містить 25 % суміші, яка містить додецилсульфат натрію та відновлювальні реагенти, поміщають на 4-12 % гелю bistris (Biorad). Міграція здійснюється протягом 45 хв при 160 V. Потім гель аналізують шляхом його фарбування кумасі блакитним. 6) Визначення молекулярної маси ліпази Lip2, продукованої клоном YL-LIP2-6C, за допомогою часопрольотної мас-спектрометрії з лазерною іонізацією та десорбцією з рідкої матриці (MALDITOF). Аналіз за допомогою мас-спектрометрії з лазерною іонізацією та десорбцією використовує мас-спектрометр "Voyager Elite XL time of flight" від компанії Perseptive Biosystems (Framingham, MA) та здійснюється азотним лазером, що випромінює при 337 нм. Спектр мас у позитивному режимі отримують з застосуванням лінійного режиму та режиму уповільненого виділення при напрузі прискорення 25 кВ, струмі сітки 0.3 %, струмі іонопроводу 0.3 %, та чистій затримці 1000 не для білка Lip2. Кожний спектр є результатом в середньому 100 лазерних імпульсів. Аналізовану речовину змішують з таким же об'ємом насиченого розчину синапінової кислоти (Fluka), приготованого у вигляді розчину, що містить 50 % (об./об.) ацетонітрил /водну трифтороцтову кислоту. 2 мкл аліквот цієї суміші поміщують на пластинку з нержавіючої сталі та висушують на відкритому повітрі перш ніж провести аналіз. Зовнішнє калібрування виконують за допомогою альфа-химотрипсиногена A (Sigma). Виражені значення є середніми значеннями та + відповідають іону [М+Н] . ПРИКЛАД 2 - Конструювання вектора експресії та продукування клону YL-LIP2-6C Штам YL-LIP2-6C отримують трансформуванням штаму PO1d Yarrowia lipolytica, який не має zeta-послідовностей, за допомогою вектора експресії під назвою JMP6, описаного у заявці ЕР 1108043, та такого, що містить ген LIP2, кодуючого прекурсор ліпази Lip2p Yarrowia lipolytica, вище від якого знаходиться промотор АСО2. З боків від вищеназваної касети розташовані zetaпослідовності, як це описано вище. Конструювання вектора JMP6 та трансформація штаму PO1d виконуються відповідно до однієї методики, викладеної у заявці на патент ЕР1108043. Цей штам YLLIP2-6С, що містить 5 різних локусів для інтеграції касети експресії гена LIP2, був поміщений до Національної Колекції Культур Мікроорганізмів (C.N.C.M.), за адресою 28 rue du Docteur Roux, 97246 16 75724 Paris Cedex 15, 15 грудня 2005 року, під номером I-3542. ПРИКЛАД 3 - Вироблення ліпази штамом YLLIP2-6C та перевірка генетичної стабільності YLLIP2-6C Штам YL-LIP2-6C використовується у способі вироблення ліпази, що має стадію прекультивування та стадію ферментації, придатні для вироблення ліпази. Загальний підхід цього способу проілюстровано на Фіг.1. Отриману таким чином ліпазу було потім проаналізовано стосовно активності та якості. Крім того, генетичну стабільність YL-LIP26C аналізують шляхом визначення кількості локусів касети експресії гена LIP2. 1) Спосіб продукування Прекультури та ферментація Пробірку з вихідним розчином клону YL-LIP26C у гліцерині розморожують, та 5 мкл культивують у 25 мл збагаченого середовища 02130S, що містить 1 % (об./об.) розчину вітамінів та 1 % (об./об.) розчину мікроелементів, у 250 мл колбі Ерленмейера. Культуру інкубують при температурі 28 °C протягом 36 годин, перемішуючи (180 об/хв). Отримані 25 мл прекультури (прекультура 1) інокулюють у 200 мл збагаченого середовища 02130S у 2-літровій колбі Ерленмейера з 2 літрами культури та інкубують при температурі 28 °C протягом 36 годин при перемішуванні (180 об/хв). Отриману таким чином прекультуру 2 (225 мл) інокулюють у збагаченому середовищі 02130S у ферментері. У момент часу ТО процесу ферментації до культури додають 2 мл розчину FeSO4. Кожні 6-9 годин до ферментуючої культури додають 2-3 мл розчину вітамінів, та через 34 години ферментації (у час Т12), починають подачу глюкози. Подачу глюкози поступово збільшують протягом 14 годин, потім припиняють у момент часу Т17 (що відповідає 48 годинам ферментації), після чого починають індукцію олеїновою кислотою. Подачу олеїнової кислоти поступово збільшують протягом наступних 54 годин, потім у момент часу ТЗЗ (102 години ферментації) досягається оптична щільність ОЩ600нм що становить 340, і процес ферментації зупиняють. Кінцеву культуру у кількості 3 літри центрифугують (14000 об/хв). Супернатант відновлюють та зберігають при температурі -20 °C. Моніторинг культур Під час ферментації температуру, парціальний тиск кисню та рівень рН контролюють та підтримують відповідно на рівні 28 °C, 20 % та 6.2. Приблизно кожні 3 години відбирають зразок культури та вимірюють ОЩ600нм з метою контролю зміни темпів росту. Результати відображені на Фіг.2. Два 1 мл витяги цих зразків центрифугують протягом 5 хв із швидкістю 14000 об/хв., а осад та супернатанти зберігають при температурі -20 °C. Таблиця І ілюструє моніторинг процесу ферментації. 17 97246 18 Таблиця І Моніторинг процесу ферментації 0.28 0.3 0.32 0.34 0.4 Додавання ПеремішуТемп росту вітамінів: вання РО2 (%) (h-1) 2 мл кожні (об/х в) 12 год. 2 мл 300 98 0.02299762 300 98 0.02151284 300 98 0.02020821 300 98 0.05417298 2 мл 300 100 6.21 6.47 6.51 6.53 6.57 15.00 0.5 0.07438118 Т6 Т7 Т8 Т9 Т10 18.00 21.00 24.00 27.00 30.00 0.62 0.92 1.54 2.36 3.99 0.07170379 0.1315514 0.17172134 0.14229307 0.1750432 Т11 31.00 4.67 Т12 34.00 Т13 Т14 Т15 Т16 T Тривалість ферментації/ годин ОЩ 600 Т0 T1 Т2 Т3 Т4 0.00 3.00 6.00 9.00 12.00 Т5 рH 300 98 6.2 300 300 300 300 300 97 92.7 80.9 61.4 20 331 20 6.2 9.97 0.25280717 392 20.6 6.2 36.00 39.00 42.00 45.00 11.96 21.5 37.2 61 0.09099358 0.19549506 0.18275194 0.16485503 2 мл 378 401 424 445 17.6 19.7 18.9 20 48.00 70 0.04587379 2 мл 470 20 6.4 Т18 Т19 Т20 Т21 Т22 Т23 Т24 Т25 Т26 Т27 Т28 Т29 Т30 Т31 Т32 Т33 51.00 54.00 57.00 60.00 63.00 66.00 69.00 72.00 75.00 78.00 80.00 83.50 90.50 94.00 99.00 100 89 93.86 85 95 105 129 159 178 210 216 235 240 280 310 342 340 0.08004704 0.01772265 -0.03305102 0.03707521 0.03336115 0.06861735 0.06969727 0.03762645 0.05510799 0.09939029 0.04215355 0.00601526 0.02202153 0.02908077 0.01964769 -0.00586512 366 409 535 615 563 583 580 563 565 589 590 610 640 687 691 680 20 20.3 19.5 20.2 21.5 20.4 21.2 19 19.5 20 20 20 21 19.5 20 20 6.38 6.17 6.19 6.21 6.2 6.2 6.18 6.18 6.2 6.2 6.2 6.2 6.2 6.19 6.19 6.2 Регулювання рН ортофосфорною кислотою 6.2 6.23 6.2 6.2 Т17 2 мл FeSO4 6.2 6.19 6.2 6.19 6.19 0.15736784 Інші дії та при- Температура мітки (°С) 2 мл 2 мл 3 мл 3 мл 3 мл Очищення ліпази За бажанням здійснюється додатковий етап очищення ліпази. Ліпаза відокремлюється від культури за допомогою пристрою тангенціальної мікрофільтрації на керамічній мембрані (pilot Х6 від PALL), який дозволяє затримувати дріжджі, розміри яких перевищують критичні (0.1 мкм). Розчинена речовина, що містить ліпазу, спочатку відновлюється у режимі концентрації, а потім у режимі діафільтрації. Ці етапи виконуються згідно з рекомендаціями виробника з відповідними модифікаціями. Концен 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 Проблема з подачею глюкози Початок подачі глюкози 28 28 28 28 28 28 Індукція олеїновою кислотою 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 трація мікроорганізмів, які містяться у розчиненій речовині, потім знижується шляхом фільтрації (0.2 мкм) (Millipore), щоб отримати біонавантаження менше, ніж 10 КУО/мл. Використовуючи пристрій Profux М12 (Millipore), розчин ліпази концентрують до об'єму близько 5 літрів, та піддають тангенціальній ультрафільтрації за допомогою стандартної мембрани Pellicon Biomax 10 kDa для видалення домішок з низькою молекулярною вагою. Ультрафільтрат, що не містить ліпази, видаляється. Розчин ліпази потім знову очищують шляхом видалення мікроорганізмів, як показано 19 97246 вище, щоб отримати біонавантаження менше, ніж 5 КУО/мл. Очищена у такий спосіб ліпаза може бути додатково просушена виморожуванням. 3) Характеристика рекомбінантної ліпази, утвореної YL-LIP2-6C а) Моніторинг продукування ліпази штамом YL-LIP2-6C під час процесу ферментації У кожній точці вимірювання зразок культури піддають центрифугуванню, а супернатант аналізують із застосуванням SDS-PAGE. 75 мкл супернатанту змішують з 75 мкл води, потім 5 мкл поміщають на гель 26-well. Аналізують також зразки, що містять відомі кількості ліпази Lip2. Результати наведені на Фіг.4. Порівнюючи кількість ліпази, отриманої після завершення ферментації (ТЗЗ), з градієнтом відомих кількостей ліпази Lip2, можна визначити концентрацію ліпази, отриманої через 100 годин ферментації, як таку, що становить 1.5 г/л. Крім того, автори винаходу застосували пропонований спосіб вироблення ліпази для кінцевого об'єму близько 35 літрів, що дозволило отримати вихід ліпази від 1 до 3 г на літр супернатанту культури. 20 б) Визначення концентрації білка та розрахунок виходу отримання рекомбінантної ліпази Концентрація білка у супернатанті культури визначається у відповідності до прикладу 1 (метод Бредфорда). Виконують сім незалежних вимірювань, і концентрація білка у супернатанті становить 2.3 г/л. Чистота білка Lip2 у супернатанті обчислюється за допомогою методу SDS-PAGE. Результати представлені на Фіг.5. Ступінь чистоти оцінюють як такий, що приблизно дорівнює 70 %. Отже, результуючий вихід ліпази на етапі ферментації з клоном YL-LIP2-6C становить 1.6 г/л. в) Вимірювання питомої активності рекомбінантної ліпази, виробленої YL-LIP2-6C Питому активність рекомбінантної ліпази, продукованої клоном YL-LIP2-6C, вимірюють відповідно до прикладу 1. Зразок, що відповідає супернатанту ферментації, розводять 100-кратно у буфері, що містить 50 мМ Na2HPO4, 50 мМ КН2РО4, 150 мМ NaCl, рН 6.0. Каталітична активність, визначена при температурі 37 °C за допомогою триоктаноїну у 3 незалежних дослідах, становить 21 883.33 ОД/мл супернатанту (Таблиця II) Таблиця II Вимірювання активності зразків супернатанту ферментації Активність ліпази (ОД/мл) Зразок 20 800.00 Досліди 22 750.00 З обчисленої концентрації ліпази Lip2 у супернатанті (див. вище), питома активність ліпази становить 13 675 ОД/мл, що сумірно з питомою активністю ліпази, отриманою для клінічних досліджень. Питома активність ліпази, утвореної клоном YL-LIP2-6C, відповідає умовам вимог до клінічних партій. г) Молекулярна маса рекомбінантної ліпази Аналіз спектру мас (див. приклад 1) проводять на супернатанті ферментаційної культури після центрифугування без очищення. Результат показаний на Фіг.6. Максимальне отримане значення свідчить про молекулярну масу 37 648 Da. Ліпаза Lip2, продукована клоном YL-LIP2-6C, має прийнятну молекулярну масу, оскільки виміряне значення відповідає умовам вимог до клінічних партій, тобто 37 500 +/- 1000 Da. Цей приклад ілюструє вибір стабільного клону, YL-LIP2-6C (у цьому випадку 100 % клонів, проаналізованих після 30 поколінь, мають таку ж кількість локусів гена Lip2, що і початковий клон). Крім того, на генетичну стабільність цього клону не впливають умови культивування, застосовані для отримання ліпази (під час прекультивування; безпосередньо перед ферментацією; безпосередньо перед індукцією вироблення ліпази олеїновою кислотою; у кінці ферментації). 3) Генетична стабільність клону YL-LIP2-6C Генетичну стабільність клону YL-LIP2-6C під час застосування способу для виробництва ліпази, що складається із стадії прекультивування та стадії ферментації, аналізують шляхом визначення 22 100.00 Середній 21 883.33 СКВ 992.89 кількості подій для інтеграції касети експресії гена LIP2 у різних локусах ДНК Yarrowia lipolytica, у колоніях, відібраних у моменти часу Т0, Т17 та Т33. а) Вибір колоній Зразок прекультури 2 (час Т0, початок ферментації), зразки культур в умовах ферментації у моменти часу Т17 (безпосередньо перед індукцією) та Т33 (закінчення ферментації) розводять, перший раз до оптичної щільності ОЩ600 = 1, потім 1000-кратно. 10 мкл кожного з цих розведених розчинів наносять на 3 культуральних планшети на YPD-середовище (1 % дріжджового екстракту, 2 % пептону, 2 % глюкози). Потім планшети інкубують при температурі 28 °C протягом 48 годин та зберігають при температурі 4 °C до відбору колоній для аналізу кількості локусів. 20 колоній, взятих із зразка, відібраного у момент початку ферментації (Т0), 20 колоній, взятих із зразка, відібраного безпосередньо перед індукцією (T17), та 100 колоній, взятих із зразка, відібраного у кінці ферментації (Т33), інокулюють окремо у 4 мл збагаченого середовища 02130S, а потім вирощують протягом 72 годин. Потім вихідні культури (stocks) у 30 % гліцерину готують для екстракції ДНК та аналізу методом Саузерн-блоттингу (Матеріали та методи). б) Визначення кількості подій для інтеграції гена LIP2 у різних локусах для 140 колоній, взятих зі штаму YL-LIP2-6C Результати аналізу методом Саузернблоттингу кількості подій для інтеграції у різних локусах гена LIP2 на 20 колоніях, взятих у момент 21 часу Т0 (початок ферментації), 20 колоніях, взятих у момент часу Т17 (48 годин ферментації), та 100 колоніях, взятих у момент часу Т33 (100 годин ферментації), представлені на Фіг.3. Ці результати показують, що всі проаналізовані колонії мають 6 локусів гена LIP2. Оскільки штам дикого типу міс 97246 22 тить копію ендогенного гена LIP2, то, отже, штам YL-LIP2-6C має 5 локусів для інтеграції касети експресії гена LIP2. Отже, клон YL-LIP2-6C є 100 % стабільним протягом 100 годин процесу ферментації. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ЛАБОРАТУА МАЙОЛІ СПІНДЛЕ ЛЕБЛОН, Ів МУЗ, Ніколя Спосіб отримання ліпази, трансформована клітина дріжджів yarrowia lipolytica, здатна виробляти ліпазу, та їх застосування F269Cas39PCT 2 Patentin version 3.3 1 24 DNA штучна послідовність зворотній праймер 1 gtgtacacct ctaccgagac ctct 24 2 24 DNA штучна послідовність зворотній праймер 2 ttagatacca cagacaccct cggt 24 23 97246 24 25 97246 26 27 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 97246 Підписне 28 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601