Cd33-зв’язувальний агент
Номер патенту: 112062
Опубліковано: 25.07.2016
Автори: Хайдер Карл-Хайнц, Адам Пол, Боргес Ерік, Конопіцкі Ренате
Формула / Реферат
1. CD33-зв′язувальний агент, який специфічно зв´язується із епітопом, який має амінокислотну послідовність FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID NO: 141) людського CD33, і який вибирають із:
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 1, CDR2, що має SEQ ID NO: 15, CDR3, що має SEQ ID NO: 29, CDR4, що має SEQ ID NO: 43, CDR5, що має SEQ ID NO: 57 і CDR6, що має SEQ ID NO: 71,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 2, CDR2, що має SEQ ID NO: 16, CDR3, що має SEQ ID NO: 30, CDR4, що має SEQ ID NO: 44, CDR5, що має SEQ ID NO: 58 і CDR6, що має SEQ ID NO: 72,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 3, CDR2, що має SEQ ID NO: 17, CDR3, що має SEQ ID NO: 31, CDR4, що має SEQ ID NO: 45, CDR5, що має SEQ ID NO: 59 і CDR6, що має SEQ ID NO: 73,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 4, CDR2, що має SEQ ID NO: 18, CDR3, що має SEQ ID NO: 32, CDR4, що має SEQ ID NO: 46, CDR5, що має SEQ ID NO: 60 і CDR6, що має SEQ ID NO: 74,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 5, CDR2, що має SEQ ID NO: 19, CDR3, що має SEQ ID NO: 33, CDR4, що має SEQ ID NO: 47, CDR5, що має SEQ ID NO: 61 і CDR6, що має SEQ ID NO: 75,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 6, CDR2, що має SEQ ID NO: 20, CDR3, що має SEQ ID NO: 34, CDR4, що має SEQ ID NO: 48, CDR5, що має SEQ ID NO: 62 і CDR6, що має SEQ ID NO: 76,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 7, CDR2, що має SEQ ID NO: 21, CDR3, що має SEQ ID NO: 35, CDR4, що має SEQ ID NO: 49, CDR5, що має SEQ ID NO: 63 і CDR6, що має SEQ ID NO: 77,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 8, CDR2, що має SEQ ID NO: 22, CDR3, що має SEQ ID NO: 36, CDR4, що має SEQ ID NO: 50, CDR5, що має SEQ ID NO: 64 і CDR6, що має SEQ ID NO: 78,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 9, CDR2, що має SEQ ID NO: 23, CDR3, що має SEQ ID NO: 37, CDR4, що має SEQ ID NO: 51, CDR5, що має SEQ ID NO: 65 і CDR6, що має SEQ ID NO: 79,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 10, CDR2, що має SEQ ID NO: 24, CDR3, що має SEQ ID NO: 38, CDR4, що має SEQ ID NO: 52, CDR5, що має SEQ ID NO: 66 і CDR6, що має SEQ ID NO: 80,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 11, CDR2, що має SEQ ID NO: 25, CDR3, що має SEQ ID NO: 39, CDR4, що має SEQ ID NO: 53, CDR5, що має SEQ ID NO: 67 і CDR6, що має SEQ ID NO: 81,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 12, CDR2, що має SEQ ID NO: 26, CDR3, що має SEQ ID NO: 40, CDR4, що має SEQ ID NO: 54, CDR5, що має SEQ ID NO: 68 і CDR6, що має SEQ ID NO: 82,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 13, CDR2, що має SEQ ID NO: 27, CDR3, що має SEQ ID NO: 41, CDR4, що має SEQ ID NO: 55, CDR5, що має SEQ ID NO: 69 і CDR6, що має SEQ ID NO: 83,
антитіла, яке містить CDR1, що має SEQ ID NO: 14, CDR2, що має SEQ ID NO: 28, CDR3, що має SEQ ID NO: 42, CDR4, що має SEQ ID NO: 56, CDR5, що має SEQ ID NO: 70 і CDR6, що має SEQ ID NO: 84.
2. CD33-зв′язувальний агент, який специфічно зв´язується із епітопом, який має амінокислотну послідовність FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID NO: 141) людського CD33, і який вибирають із:
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 85, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 99,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 86, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 100,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 87, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 101,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 88, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 102,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 89, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 103,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 90, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 104,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 91, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 105,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 92, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 106,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 93, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 107,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 94, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 108,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 95, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 109,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 96, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 110,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 97, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 111,
антитіла, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 98, і варіабельну область легкого ланцюга, що має SEQ ID NO: 112,
3. CD33-зв′язувальний агент, який специфічно зв´язується із епітопом, який має амінокислотну послідовність FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQ ID NO: 141) людського CD33, і який вибирають із:
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 113, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 127,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 114, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 128,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 115, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 129,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 116, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 130,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 117, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 131,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 118, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 132,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 119, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 133,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 120, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 134,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 121, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 135,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 122, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 136,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 123, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 137,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 124, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 138,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 125, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 139,
антитіла, яке містить важкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 126, і легкий ланцюг, що має SEQ ID NO: 140.
4. CD33-зв′язувальний агент за одним з попередніх пунктів, де кінетика інтерналізації CD33-зв′язувального агента є такою, що щонайменше 30 % початкової кількості CD33-зв′язувального агента зберігається на клітинній поверхні HL60 клітин через 4 години після інкубації.
5. CD33-зв′язувальний агент за одним з попередніх пунктів, де кінетика інтерналізації CD33-зв′язувальних агентів є такою, що щонайменше 40 % початкової кількості CD33-зв′язувальних агентів зберігається на клітинній поверхні через 4 години після інкубації.
6. CD33-зв′язувальний агент за одним з попередніх пунктів, де CD33-зв′язувальний агент має афінність як до людського CD33, так і до CD33 мавп-ціномолгус, при цьому величина KD дорівнює або нижче ніж 10 нМ.
7. CD33-зв′язувальний агент за одним з попередніх пунктів, де CD33-зв′язувальний агент є гуманізованим.
8. CD33-зв′язувальний агент за одним з попередніх пунктів, де CD33-зв′язувальний агент є повністю людським.
9. CD33-зв′язувальний агент за одним з попередніх пунктів, де CD33-зв′язувальний агент додатково має ефекторну функцію.
10. CD33-зв′язувальний агент за п. 9, де ефекторна функція опосередковується Fc-доменом.
11. CD33-зв′язувальний агент за п. 9 або п. 10, де CD33-зв′язувальний агент містить одну або декілька мутацій в Fc-домені, яка модулює (ють) функцію Fc домену.
12. CD33-зв′язувальний агент за п. 11, де модуляція функції Fc-домену являє собою підвищення ADCC щонайменше на 10 %.
13. CD33-зв′язувальний агент за одним з пп. 11-12, де мутації в Fc домені локалізовані в одному або декількох положеннях, вибраних з амінокислот у положеннях 332 і/або 239 і/або 236 згідно із EU-нумерацією за Кеботом.
14. CD33-зв′язувальний агент за одним з пп. 11-13, де мутації в Fc домені являють собою комбінацію замін в положеннях 239 і 332.
15. CD33-зв′язувальний агент за п. 14, де вказана мутація в Fc домені являє собою комбінацію мутацій S239D і I332E.
16. Молекула ДНК, що містить область, що кодує варіабельну область важкого ланцюга CD33-зв′язувального агента за одним з попередніх пунктів.
17. Молекула ДНК, що містить область, що кодує варіабельну область легкого ланцюга CD33-зв′язувального агента за одним з пп. 1-15.
18. Експресійний вектор, що містить молекулу ДНК за п. 16 або п. 17.
19. Клітина-хазяїн, яке несе молекулу ДНК за п. 16 і молекулу за п. 17.
20. Спосіб одержання CD33-зв′язувального агента за одним з пп. 1-15, що включає трансфекцію клітини-хазяїна одним або більше векторами за п. 18, культивування клітини-хазяїна і виділення та очистку молекули антитіла.
21. Фармацевтична композиція, що містить як діючу речовину один або декілька CD33 зв′язувальних агентів за одним з пп. 1-15, і щонайменше фізіологічно прийнятний носій.
22. Фармацевтична композиція за п. 21, що містить також один або більше додаткових терапевтичних засобів.
23. Фармацевтична композиція за одним з пп. 21 і 22, призначена для виснаження клітин, які експресують CD33 на їх поверхні.
24. Фармацевтична композиція за одним з пп. 21 і 22 , призначена для лікування злоякісних захворювань, пов'язаних з мієлоїдними клітинами, і мієлодиспластичного синдрому (МДС).
25. Фармацевтична композиція за п. 24, де вказане злоякісне захворювання, пов'язане з мієлоїдними клітинами, вибрано з гострого мієлоїдного лейкозу і хронічного мієлоїдного лейкозу.
26. Фармацевтична композиція за одним з пп. 21 і 22, призначена для лікування аутоімунних і запальних захворювань, в патології яких беруть участь мієлоїдні клітини.
27. Спосіб виснаження експресуючих CD33 мієлоїдних клітин у пацієнта, що включає введення вказаному пацієнтові одного або більше CD33-зв′язувальних агентів за одним з пп. 1-15 або фармацевтичної композиції за одним з пп. 21 і 22.
Текст
Реферат: Винахід належить до CD33-зв′язувального агента, який специфічно зв´язується із епітопом, який має амінокислотну послідовність FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SEQID NO: 141) людського CD33, фармацевтичної композиції та способу о держання та застосування CD-33-зв′язувального агента. UA 112062 C2 (12) UA 112062 C2 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до імунотерапій, заснованих на виснаженні мієлоїдних клітин. Зокрема, даний винахід належить до CD33-зв'язуючим агентам, призначеним для застосування в зазначених терапіях, наприклад, для лікування пов'язаних з мієлоїдними клітинами злоякісних захворювань і мієлодиспластичного синдрому (МДС). Передумови створення винаходу На початку 1980-их років CD33 був ідентифікований в якості маркера мієлоїдних лейкозів (Andrews та ін., Blood 62, 1983, сс. 24-132). CD33 являє собою присутній на клітинній поверхні антиген, специфічно експресуємий на мієлоїдних клітинах, включаючи мієлоїдні лейкозні клітини. Він є найменшим представником сімейства сіглеків (що зв'язують сіалову кислоту родинні Ig лектини). CD33 експресується на ранніх мультилінійних гематопоетичних клітинахпопередниках і мієломоноцитарних клітинах-попередниках. Він відсутній на плюріпотентих гематопоетичних стволових клітинах (Andrews і ін., Journal of Experimental Medicine 169, 1989, сс. 1721-1731, 1989). Встановлено, що він піддається понижувальній регуляції на зрілих гранулоцитах, але зберігається на макрофагах, моноцитах і дендритних клітинах (Andrews та ін., Blood 62, 1083, сс. 24-132). Встановлено, що CD33 експресується крім мієломоноцитарних клітин також і на людських тучних клітинах і базофілів крові (Valent та ін., Blood 15; 73 (7), 1989, сс. 1778-1785). Моноклональні антитіла до CD33 застосовують для діагностування лейкозу, а також для цілеспрямованої терапії та in vitro для очищення кісткового мозку при аутологічній трансплантації при гострому мієлоїдному лейкозі (ГМЛ) (Duzkale та ін., Biol Blood Marrow Transplant. 9 (6), 2003, сс. 364-372). Перші спроби при створенні цілеспрямованої терапії були сфокусовані на розробці імунотоксинів з використанням антитіла до CD33, кон'югованого з токсином рицину. Підхід, заснований на застосуванні імунотоксинів, був очевидний у зв'язку з швидкою інтерналізацією CD33 при зв'язуванні з антитілом (Audran та ін., J Immunol Methods. 188(1), 1995, сс. 147-154). CD33 являє собою трансмембранний глікопротеїн з молекулярною масою 67 кДа. Зв'язуючий сіалову кислоту позаклітинний домен CD33 бере участь у адгезії за типом клітинаклітина. Внутрішньоклітинні імунорецепторні тирозинзалежні інгібіторні мотиви (ITIM) передають інгібіторні сигнали клітині, впливаючи на проліферацію і виживання клітини. Фактичні шляхи передачі сигналів CD33 мало вивчені, але ймовірно, вони включають ITIM і ITIM-подібні мотиви і рекрутмент тірозінфосфатаз (von Gunten та ін, Ann. NY Acad. Sci. 1143, 2008, сс. 61-82). Ідентифікований мишачий Ортолог CD33, але його функціональна сумісність з людським CD33 є спірною (Brinkman-Van der Linden та ін, Mol Cell Biol., 23 (12), 2003, сс. 4199-4206). Функціональна роль людського CD33 на здорових і злоякісних лейкоцитах залишається невідомою. У кількох публікаціях CD33 описаний в якості стабільного маркера клітинної поверхні на первинних ГМЛ-і ХМЛ-клітинах, що експресується у 70-100 % тестованих пацієнтів (Plesa та ін, Cancer 112 (3), 2007, сс. 572-580; Hauswirt та ін, Eur J Clin Invest., январь 2007, сс. 73-82; Scheinberg та ін, Leukemia, т. 3, 1989, сс. 440-445). CD33 експресується на злоякісних мієлоїдних бластних клітинах, які являють собою основні злоякісні клітини в периферичній крові та кістковому мозку пацієнтів які страждають на лейкоз, і на лейкозних стволових клітинах, відносно невеликий групі менш диференційованих клітин у кістковому мозку, які відрізняються притаманною їм здатністю до самовідновлення і підтримці лейкозної клональної ієрархії. Виснаження лейкозних стволових клітин вважається ключовим механізмом забезпечення тривалого вільного від пухлини виживання. Імунотоксин, що надає спрямований вплив на CD33 ® Mylotarg , гуманізоване антитіло ізотипу IgG4, кон'югованого з токсином халіцеаміціном, застосовують для лікування страждаючих ГМЛ пацієнтів шляхом доставки цього токсичного "корисного вантажу" до CD33-позитивним ГМЛ-клітинам (Amadori та ін, Cancer Treat Rev. 34 (1), 2008, сс. 49-60). Лінтузумаб (SGN-33, HuM195), "голе" CD33-специфічне гуманізоване моноклональне антитіло, оцінювали на фазі II клінічних випробувань для лікування ГМЛ і МДС, з урахуванням опублікованих початкових даних про клінічних ознаках ефективності, встановлених на фазі I в досліді з зростаючими дозами, і наявності переносимих небажаних явищ (Raza та ін, реферат № 983, 14-ий конгрес EHA, 4-7 червня 2009). Спрямований вплив на клітинні лінії ГМЛ CD33-специфічного HuM195 in vitro призводило до зниження індукованої TNF-α секреції запальних цитокінів типу IL-8, MCP-1 і RANTES (Sutherland та ін, Mabs 1:5, 2009, сс. 481-490). Придатність цього явища для терапії ГМЛ залишається невідомим, але модуляція цитокінового середовища в мікрооточенні пухлини може впливати на терапевтичну ефективність антитіла. Крім того, антитіло індукує антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC) і антитіло-обумовлений клітинозалежний фагоцитоз (ADCP) клітинних ліній ГМЛ in vitro (Sutherland та ін, Mabs 1,5, 2009, сс. 481-490). Вважається, 1 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що ADCC є таким, що має вирішальне значення механізмом протипухлинної активності антитіл при гематологічних злоякісних захворюваннях. Дані, отримані при клінічних випробуваннях CD20-специфічного моноклонального антитіла ритуксимабу, продемонстрували важливість опосередковуваних ефекторними клітинами механізмів дії для лікування B-клітинних злоякісних захворювань щодо відповіді на лікування антитілом (Weng і Levy, J Clin Oncol. 21 (21), 2003, сс. 3940-3947). Таким чином, було встановлено, що антиген CD33 експресується на здорових клітинах мієломоноцитарної клітинної лінії і часто експресується на пухлинних клітинах при мієлоїдних лейкозах. При проведенні фази I випробувань антитіла до CD33 (Лінтузумаба) виявлені перші свідчення ефективності без серйозних небажаних явищ. Проте вивчення в клінічних умовах лінтузумаба було припинено після того, як на фазі II випробувань було встановлено, що при застосуванні лінтузумаба у поєднанні з хіміотерапією не вдалося досягти очікуваного підвищення ефективності. Таким чином, очевидно, що існує потреба в розробці вдосконалених шляхів лікування, мішенню якого є CD33. З існуючого рівня техніки випливає, що існує потреба в розробці більш ефективної терапії злоякісних захворювань, пов'язаних з мієлоїдними клітинами, і МДС, насамперед гострого мієлоїдного лейкозу. Зокрема, існує потреба у створенні більш ефективних антагоністичних зв'язуючих CD33 агентів, призначених для лікування раку, насамперед ГМЛ. Короткий виклад суті винаходу У даному винаході запропоновані нові CD33-зв'язуючі агенти, які зв'язуються з людським CD33 і які відрізняються тим, що вони: a) несуть варіабельну область важкого ланцюга, що містить CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить CDR4, CDR5 і CDR6, де CDR1 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 1-14, CDR2 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 14-28, CDR3 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 29-42, CDR4 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 43-56, CDR5 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 57-70, CDR6 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 71-84, або б) розпізнають епітоп, розташований усередині амінокислотної послідовності FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SeqID No: 141) людського CD33. Даний винахід належить і до CD33-зв'язуючих агентів, де кінетика інтерналізації CD33зв'язуючих агентів є такою, що щонайменше 30 %, переважно щонайменше 40 % початкової кількості антитіла залишається на клітинній поверхні HL60-клітин через 4 години після інкубації. Даний винахід належить і до CD33-зв'язуючих агентів, варіабельна область важкого ланцюга яких містить амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 85-98, і варіабельна область легкого ланцюга яких містить амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 99-112. Даний винахід належить і до CD33-зв'язуючих агентів, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 113-126, і легкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 127-140. Даний винахід належить і до CD33-зв'язуючих агентів, які мають мутації в Fc-області, що підвищують ADCC. Інші переважні варіанти здійснення викладені нижче в описі і формулі винаходу. Встановлено, що CD33-зв'язуючі агенти, запропоновані в даному винаході, мають високу афінність до людського CD33 і також мають кращу кінетику інтерналізації, що відрізняється тривалою присутністю CD33-зв'язуючих агентів, коли вони пов'язані з CD33 на поверхні клітинмішеней, що призводить до кращої ADCC-активності. При створенні винаходу було встановлено також, що CD33-зв'язуючі агенти, запропоновані в даному винаході, зв'язуються з епітопом позаклітинного домену CD33, відмінним від епітопу, з яким зв'язується лінтузумаб. Не вдаючись в яку-небудь конкретну теорію, можна припустити, що це є причиною відмінності кінетики інтерналізації CD33-зв'язуючих агентів, пропонованих в даному винаході, і лінтузумаба. Опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1-3 - дані про інтерналізацію наведених як приклади CD33-зв'язуючих агентів, запропонованих у винаході, в порівнянні з лінтузумабом на HL60-клітинах; на фіг. 4 - дані про швидкість інтерналізації на HL60-клітинах двох наведених як приклад антитіл, запропонованих у винаході, в порівнянні з лінтузумабом; на фіг. 5 - дані про ефективність ADCC щодо HL60-клітин двох наведених як приклад антитіл, запропонованих у винаході, в порівнянні з лінтузумабом. 2 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Детальний опис винаходу CD33-зв'язуючі агенти Поняття "зв'язуючий агент" в контексті даного опису належить до білка або пептиду, який специфічно зв'язується з антигеном-мішенню. Зв'язуючий агент може представляти собою, наприклад, антитіло, похідне зазначеного антитіла або інший агент, який специфічно зв'язується з антигеном-мішенню. Зв'язуючий агент може представляти собою також білок, що містить Fvобласть або її частина (наприклад, VH або VL або CDR антитіла, яке специфічно зв'язується з антигеном-мішенню). У переважному варіанті здійснення винаходу зв'язує агент являє собою антитіло. Поняття "CD33-зв'язуючий агент" в контексті даного опису відноситься до зв'язуючого агенту, який специфічно зв'язується з CD33, як правило, фрагментом позаклітинного домену людського CD33. Поняття "антитіло" у контексті даного опису відноситься до (a) імуноглобулінових поліпептидів і імунологічно активним фрагментів імуноглобулінових поліпептидів (тобто поліпептидів сімейства імуноглобулінів або їх фрагментів, які містять антигензв'язуючий центр, імуноспецифічно зв'язується зі специфічним антигеном-мішенню), або (б) консервативно зміщенням похідним зазначених імуноглобулінових поліпептидів або їх фрагментів, які імуноспецифічно зв'язуються з антигеном-мішенню. Антитіла описані в цілому, наприклад, у Harlow і Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Поняття "антитіло" належить до інтактних моноклональних антитіл, поліклональних антитіл, моноспецифічних антитіл, мультиспецифічних (наприклад, біспеціфічних) антитіл і фрагментів антитіл, які мають необхідну біологічну активність (наприклад, здатність зв'язуватися з антигеном). Антитіло може належати до будь-якого типу або класу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD та IgA) або підкласу (наприклад, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl і IgA2), переважно IgG-класу, більш переважно IgG1. "Інтактне" антитіло являє собою антитіло, яке містить антигензв'язуючу варіабельну область, а також константний домен легкого ланцюга і константні домени важкого ланцюга антитіла відповідного класу. Константні домени можуть мати нативну послідовність константних доменів (наприклад, константні домени, які мають людську нативну послідовність) або її амінокислотні варіанти. "Фрагмент антитіла" містить частину антитіла, включаючи антигензв'язуючу або варіабельну область або її частину. Прикладами фрагментів антитіла є Fab-, Fab'-, F (ab') 2 - і Fv-фрагменти, антигензв'язуючі фрагменти VH і VL, димерні антитіла (діабоді), тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, одноланцюгове антитіло, scFv, scFv-Fc, SMIP ("Small Modular Immunopharmaceuticals", малі модульні імунофармацевтичні засоби) і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагмента (ів) антитіл. "Варіабельна область важкого ланцюга" або "VH" означає частину важкого ланцюга, яка містить CDR1, CDR2 і CDR3 й оточуючі їх каркасні ділянки. "Варіабельна область легкого ланцюга" або "VL" означає частину легкого ланцюга, яка містить CDR4, CDR5 і CDR6 й оточуючі їх каркасні ділянки. "CDR" означає гіперваріабельні ділянки важкого і легкого ланцюга, які визначають компліментарність / специфічність зв'язування антитіла або фрагмента антитіла. Порядок розташування CDR, зазначений в цьому описі, повністю відповідає їх числовій нумерації. "Епітоп" у контексті даного опису означає ділянку антигену, який розпізнається антитілом або фрагментом антитіла. Зокрема, це поняття відноситься до фрагментів CD33, які можуть розпізнаватися антитілом. "МАт" у контексті даного опису означає моноклональні антитіла. Антитіло може мати одну або кілька "ефекторних функцій", які означають види біологічної активності, властиві Fc-області (Fc-області, що має нативну послідовність, або варіанту амінокислотної послідовності Fc-області) антитіла. Прикладами ефекторних функцій антитіл є зв'язування C1q; комплементзалежна цитотоксичність (CDC); зв'язування Fc-рецептора; антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; понижуюча регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, B-клітинного рецептора, BCR) і т.д. "Одноланцюгові Fv" або "scFv"-фрагменти антитіла представляють собою фрагменти, що містять VH- і VL- області антитіла, при цьому області присутні в одного поліпептидного ланцюга. Поліпептид scFv, як правило, додатково містить поліпептидний лінкер, розташований між V H- і VL- областями для полегшення утворення структури, необхідної scFv для зв'язування з антигеном (див., наприклад, Pluckthun, в: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, т. 113, під ред. Rosenburg і Moore, вид-во Springer-Verlag, New York, 1991, сс. 269-315). 3 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зв'язуючий агент, такий як антитіло, який "спрямований до", "який зв'язується з" або "специфічно зв'язується" з що становить інтерес антигеном (тобто антигеном-мішенню), являє собою агент, який має здатність зв'язуватися з зазначеним антигеном з достатньою афінністю, такий, щоб зв'язуючий агент можна було застосовувати для спрямованого впливу на клітину, що експресує антиген. Як правило, зв'язування зв'язує агента характеризується афінністю, 7 -1 становить щонайменше приблизно 1×10 M , та його зв'язування з попередньо визначеним антигеном характеризується афінністю, яка щонайменше в два рази перевищує його афінність зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, БСА, казеїном), відмінним від попередньо визначеного антигену або близькоспорідненого антигену. "Похідне антитіла" у контексті даного опису належить до антитіла, як воно визначено вище, модифікованому шляхом ковалентного приєднання гетерологічної молекули, наприклад, шляхом приєднання гетерологічного поліпептиду, або шляхом глікозилювання, деглікозилювання, ацетилювання або фосфорилювання або іншої модифікації, яка в нормі не асоційована з антитілом. У деяких варіантах здійснення винаходу гетерологічние молекула не представляє собою терапевтичний засіб. У деяких варіантах здійснення винаходу гетерологічна молекула сама по собі не має цитостатичну або цитотоксичну дію. В якості ще одного вичерпного посилання, де описані всі поняття і процедури, згадані в цьому описі, слід вказати Sambrook та ін, Molecular Cloning, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3-е вид., 1 січня 2001 р. CD33-зв'язуючі агенти специфічно зв'язуються з рецептором CD33, який асоційований з даною популяцією клітин-мішеней. CD33 є представником сімейства, володіє здатністю до адгезії сіалової кислоти (сіалоадгезія), який експресується на клітинах гематопоетичної лінії диференціювання, включаючи мієлоїдні клітини-попередники, моноцити, макрофаги, дендритні клітини і тучні клітини. CD33 експресується також на пухлинних клітинах, асоційованих з мієлопроліферативними або тучноклітиними проліферативними захворюваннями, включаючи гострий мієлоїдний лейкоз і мієлопластичні синдроми, і на лейкозних стволових клітинах. Антитіла, мішенню яких є CD33, і їх застосування, в цілому, описані (див., наприклад, Pierelli та ін, Br. J. Haematol. 84, 1993, сс. 24-30; Matutes та ін, Hemaiol. Oncol. 3, 1985, сс. 179-186; Taussig та ін, Blood 106, 2005, сс. 4086-4092; Florian і др., Leuk. & Lymph. 47, 2006, сс. 207-222). У деяких варіантах здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент являє собою антитіло (наприклад, моноклональне антитіло). Придатні моноклональні антитіла можуть являти собою гомогенні популяції антитіл до CD33 (наприклад, позаклітинного домену людського CD33). Моноклональних антитіл (МАт) можна отримувати за допомогою будь-якого методу, відомого в даній області. Вони включають (але, не обмежуючись лише ними) метод на основі гібридом, вперше описаний Köhler і Milstein (Nature 256, 1957, сс. 495-497), метод на основі людської Вклітинної гібридоми (Kozbor та ін, Immunology Today 4, 1983, с. 72) і метод на основі EBV гібридом (Cole та ін, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, під ред. Alan R., вид-во Liss, Inc., 1985, сс. 77-96). Зазначені антитіла можуть ставитися до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи IgG, IgM, IgE, IgA і IgD, і будь-якому їх підкласу. Гібридому, що продукує моноклональне антитіло можна культивувати in vitro або in vivo. Прийнятними моноклональними антитілами є (але, не обмежуючись лише ними) людські моноклональні антитіла, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла і функціонально активні фрагменти будь-якого із зазначених антитіл. Придатними антитілами до CD33 є антитіла, які можуть надавати терапевтичну дію за допомогою різних механізмів, відомих в даній області, таких як антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC), антитіло-обумовлений клітинозалежний фагоцитоз (ADCP) та / або комплементзалежна цитотоксичність (CDC). Наприклад, антитіло може опосередковувати ADCC шляхом взаємодії з імунними ефекторними клітинами, такими як NKклітини, моноцити і макрофаги. Рекомбінантні антитіла, такі як химерні і гуманізовані моноклональні антитіла, містять як людські, так і нелюдські ділянки, їх можна створювати з використанням стандартних методів рекомбінантної ДНК (див., наприклад, Cabilly та ін, US 481567; і Boss тощо, US 4816397; зміст обох документів повністю включено в даний опис як посилання). "гуманізовані антитіла" представляють собою молекули антитіл з видів крім людини, які містять один або кілька гіперваріабельних ділянок (CDR) з видів крім людини і каркасну область з молекули людського імуноглобуліну (див., наприклад, Queen, US 5585089, зміст якого повністю включено в даний опис як посилання). Зазначені химерні і гуманізовані моноклональні антитіла можна отримувати за допомогою методів рекомбінантної ДНК, відомих в даній області, наприклад, з використанням методів, описаних у публікації міжнародної заявки на патент WO 87/02671; публікації європейського патенту 0184187; публікації європейського патенту 0171496; публікації 4 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 європейського патенту 0173494; публікації міжнародної заявки на патент WO 86/01533; US 4816567; публікації європейського патенту 012023; у Berter та ін, Science 240, 1988, сс. 10411043; Liu та ін, Proc. Natl. Acad Set. USA 84, 1987, сс. 3439-3443; Liu та ін, J. Immunol. 139, 1987, сс. 3521-3526; Sun і ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, сс. 214-218; Nishimura та ін, Cancer. Res. 47, 1987, сс. 999-1005; Wood та ін, Nature 314, 1985, сс. 446-449; Shaw та ін, J. Natl. Cancer Inst. 80, 1988, сс. 1553-1559; Morrison, Science 229, 1985, сс. 1202-1207; Oi та ін, BioTechniques 4, 1986, с. 214; US 5225539; Jones і ін, Nature 321, 1986, сс. 552-525; Verhoeyan та ін, Science 239, 1988, с. 1534; та Beidler та ін, J. Immunol. 141, 1988, сс. 4053-4060 (зміст кожного документа повністю включено в даний опис як посилання) Людські моноклональні антитіла можна створювати за допомогою будь-якого з численних методів, відомих у цій галузі (див., наприклад, Teng та ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1983, сс. 7308 7312; Kozbor та ін, Immunology Today 4, 1983, сс. 72-79; Olsson та ін, Meth. Enzymol. 92, 1982, сс. 3-16; і US 5939598 та 5770429). Повністю людські антитіла можна отримувати з використанням трансгенних мишей, які не можуть експресувати ендогенні гени важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, але можуть експресувати гени людських важких і легких ланцюгів. Трансгенних мишей імунізують загальноприйнятим чином за допомогою вибраного антигену, наприклад, з використанням повного поліпептиду CD33 або частини. Моноклональні антитіла до антигену можна отримувати з використанням загальноприйнятого методу на основі гібридом. Трансгени людського імуноглобуліну, присутні в організмі трансгенних мишей, піддаються перегрупування в процесі В-клітинної диференціювання і в результаті піддаються переключенню класу і соматичної мутації. Таким чином, з використанням зазначеного методу можна отримувати терапевтично прийнятні антитіла типу IgG, IgA, IgM та IgE. Загальні відомості про застосування зазначеного методу для отримання людських антитіл див., наприклад, у Lonberg і Huszar, Int. Rev. Immunol. 13, 1995, сс. 65-93. Детальний обговорення цього методу для отримання людських антитіл і людських моноклональних антитіл і протоколи отримання зазначених антитіл представлені, наприклад, у US 5625126; 5633425; 5569825; 5661016 і 5545806. Інші людські антитіла, які отримують шляхом імунізації мишей, надходять у продаж, наприклад, від фірми Medarex (Прінстон, шт. Нью-Джерсі). Повністю людські антитіла, які розпізнають вибраний епітоп, можна створювати також за допомогою методу, позначеного як "спрямована селекція". У цьому підході відібране нелюдське моноклональне антитіло, наприклад, мишаче антитіло, застосовують для спрямованої селекції повністю людського антитіла, що розпізнає той же самий епітоп (див., наприклад, Jespers та ін, Biotechnology 12, 1994, сс. 899-903). Людські антитіла можна отримувати також за допомогою різних методів, відомих в даній області, включаючи застосування фагових дисплейних бібліотек (див., наприклад, Hoogenboom і Winter, J. MoI. Biol 227, 1991, с.381; Marks та ін, J MoI Biol 222, 1991, с. 581; Quan і Carter, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, в: Anti-IgE and Allergic Disease, під ред. Jardieu і Fick Jr., вид-во Marcel Dekker, New York, NY, глава 20, 2002, сс. 427-469). Придатні фрагменти антитіл являють собою (але, не обмежуючись лише ними) F (ab') 2фрагменти, Fab'-фрагменти, Fab-фрагменти, Fv, одноланцюгові антитіла (SCA) (наприклад, описані в US 4946778; у Bird, Science 242, 1988, сс. 423-442; Huston та ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, сс. 5879-5883 і Ward та ін, Nature 334, 1989, сс. 544-554), scFv, scFv-Fc, FvdsFv, Мінітель, димерні антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, SMIP (див., наприклад, опубліковану заявку на патент США № 2005-0238646) і будь-яку іншу молекулу, яка містить один або кілька CDR, і які володіють такою ж специфічністю, що і антитіло. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло являє собою злитий білок, що містить антитіло або його функціонально активний фрагмент, зчеплений з іншим білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент можна зливати за допомогою ковалентного зв'язку (наприклад, пептидного зв'язку) або на N-кінці, або на C-кінці з амінокислотною послідовністю іншого білка (або його ділянкою, як правило, що містить щонайменше 10, 20 або 50 амінокислот білка), який не являє собою антитіло або фрагмент антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло або його фрагмент можна ковалентно пов'язувати з іншим білком на C-кінці варіабельної області або константної області. Антитіла можна модифікувати, наприклад, шляхом ковалентного приєднання молекули будь-якого типу, якщо зазначене ковалентне приєднання дозволяє зберігати антитілу його специфічність щодо зв'язування антигену. Наприклад, похідне антитіла може являти собою антитіло, додатково модифіковане, наприклад, шляхом глікозилювання, деглікозилювання, ацетилювання, пегілірування, фосфорилювання, амідування, захисту за допомогою відомих захисних / блокуючих груп, протеолітичного розщеплення, зв'язування з іншим білком і т.д. 5 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Можна здійснювати будь-яку з численних хімічних модифікацій з використанням відомих методів, таких як (але, не обмежуючись лише ними) специфічне хімічне розщеплення, ацетилювання, формілювання, метаболічний синтез у присутності тунікаміцина або т.п. Крім того, похідне може містити одну або кілька не зустрічаються в природних умовах амінокислот. У конкретних варіантах здійснення винаходу може виявитися бажаним покращувати афінність зв'язування і / або інші біологічні властивості антитіла (див., наприклад, публікації заявок на патент США № № 2006-0003412 і 2006-0008882). Варіанти амінокислотних послідовностей антитіл отримують шляхом інтродукції відповідних нуклеотидних замін у нуклеїнову кислоту антитіла або шляхом пептидного синтезу. Зазначені модифікації включають, наприклад, делеції і / або інсерції, та / або заміни залишків у амінокислотних послідовностях антитіла. Будь-яку комбінацію делецій, інсерцій і / або замін здійснюють для отримання кінцевої конструкції, за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики. Амінокислотні заміни можуть також змінювати пост-трансляційні процеси антитіла, наприклад, змінювати кількість або розташування сайтів глікозилювання. Придатним методом ідентифікації конкретних залишків або областей у антитілі, які представляють собою переважні сайти для мутагенезу, є так званий "аланін-скануючий мутагенез", описаний у Cunningham і Wells, Science, 244, 1989, сс. 1081-1085. З його допомогою ідентифікують залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, his, lys і glu) і замінюють на нейтральну чи негативно заряджену амінокислоту (як правило, на аланін або поліаланін) для впливу на взаємодію амінокислот з антигеном. Ті положення амінокислот, для яких продемонстрована функціональна чутливість до замін, потім уточнюють шляхом інтродукції додаткових або інших варіантів в сайти заміни або для сайтів заміни. При цьому, хоча сайт для інтродукції варіації амінокислотної послідовності є наперед визначеним, не є необхідним, щоб природа самої мутації була зумовленою. Наприклад, для аналізу ефективності мутації в розглянутому сайті здійснюють сканування аланіном або неспецифічний мутагенез кодону-мішені або області-мішені і отримані в результаті експресії варіанти антитіла піддають скринінгу щодо необхідної активності. Інсерції в амінокислотну послідовність можуть включати аміно- та / або карбоксикінцеві злиття різної довжини від одного залишку до поліпептидів, які містять сто або більшу кількість залишків, а також інсерції всередину послідовності одного або декількох амінокислотних залишків. Прикладами кінцевих інсерцій є антитіло з N-кінцевим метіонільним залишком або антитіло, злите з цитотоксичним поліпептидом. Іншим типом варіанту антитіла є варіант, що включає амінокислотну заміну. У цих варіантах щонайменше один амінокислотний залишок в молекулі антитіла замінений на інший залишок. Представляють найбільший інтерес сайтами для мутагенезу шляхом замін є гіперваріабельні ділянки, але можна здійснювати також зміни в каркасній області. Для досягнення істотних модифікацій біологічних властивостей антитіла можна відбирати заміни, які суттєво відрізняються за їх впливом на підтримання (a) структури поліпептидного каркаса в області заміни, наприклад, складчастої або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобності молекули в сайті-мішені або (у) розміру бічних ланцюгів. Такі, що зустрічаються в природних умовах залишки розділяють на групи на основі загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; (3) кислі: asp, glu; (4) оснóвні: asn, gin, his, lys, arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; і (6) ароматичні: trp, tyr, phe. Неконсервативні заміни передбачають заміну представника одного з цих класів на представника іншого класу. Може виявитися бажаним модифікувати антитіла щодо його ефекторної функції, наприклад, для підвищення антитіло-обумовленої клітинозалежної цитотоксичності (ADCC), антитілообумовленого клітинозалежного фагоцитозу (ADCP) та / або комплементзалежної цитотоксичності. Зокрема, ADCC-активність можна підвищувати шляхом інтродукції амінокислотних мутацій в константну область антитіла (Lazar та ін, PNAS 103, 11, 2006, сс. 4005-4010). Для цієї мети можна застосовувати інтродукцію однієї або декількох амінокислотних замін в Fc-область антитіла (див. опубліковану заявку на патент США № 2006-0160996). В альтернативному або додатковому варіанті залишок (і) цистеїну можна інтродуціювати в Fcобласть антитіла, що призводить до утворення в цій області дисульфідного зв'язку між ланцюгами. Отримане таким шляхом гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність до 6 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтерналізації та / або підвищену CDC або ADCC (див. Caron та ін, J. Exp. Med., 176, 1992, сс. 1191-1195 і Shopes, J. Immunol., 148, 1992, сс. 2918-2922). Гомодимерні антитіла з підвищеною протипухлинною активністю можна отримувати також з використанням гетеробіфункціональних перехреснозшиваючих лінкерів, згідно з методикою, описаною у Wolff та ін, Cancer Research, 53, 1993, сс. 2560-2565. В іншому варіанті можна сконструювати антитіло, що має подвійну кількість Fc-областей, завдяки чому воно може мати підвищену здатність до залежного від комплементу лізису і ADCC (див. Stevenson та ін, Anti-Cancer Drug Design, 3, 1989, сс. 219-230). У даній області, як в наукових публікаціях, так і в патентних документах, описано широке розмаїття модифікацій Fc-області, див., наприклад, EP 0307434, WO 93/04173, WO 97/34631, WO 97/44362, WO 98/05787, WO 99/43713, WO 99/51642, WO 99/58572, WO 02/060919, WO 03/074679, WO 2004/016750, WO 2004/029207, WO 2004/063351, WO 2004/074455, WO 2004/035752, WO 2004/099249, WO 2005/077981, WO 2005/092925, WO 2006/019447, WO 2006/031994, WO 2006/047350, WO 2006/053301, WO 2006/088494 і WO 2007/041635. У кращих варіантах здійснення винаходу антитіла, пропоновані у винаході, несуть варіанти Fc з амінокислотними замінами в положеннях 332 і / або 239, та / або 236. У кращих варіантах здійснення винаходу антитіла, пропоновані у винаході, мають мутації в Fc-домені, вибрані з групи, що включає I) одну заміну в положенні 332, бажано I332E; II) комбінацію замін в положеннях 239 і 332, бажано S239D/I332E; III) комбінацію замін в положеннях 236 і 332, бажано G236A/I332E; IV) комбінацію замін в положеннях 236, 239 і 332, бажано G236A/S239D/I332E. У цьому контексті найбільш переважно інтродуціювати мутації в одне або кілька положень у Fc-домені, вибраному (их) з амінокислот у положеннях 332 і / або 239, та / або 236 згідно нумерації EU за Кеботом. Найбільш бажаними є заміни в положеннях 239 і 332, насамперед S239D/I332E. Варіанти Fc в антитілах, пропонованих в даному винаході, визначають по вхідних в них амінокислотних модифікаціях. Так, наприклад, I332E являє собою варіант Fc із заміною I332E щодо батьківського поліпептиду Fc. Аналогічно цьому S239D/I332E позначає варіант Fc із замінами S239D і I332E, а S239D/I332E/G236A позначає варіант Fc із замінами S239D, I332E і G236A щодо батьківського поліпептиду Fc. Для подовження часу напівжиття антитіла в сироватці можна включати епітоп, що зв'язується з рецептором порятунку, в антитіло (насамперед у фрагмент антитіла), наприклад, згідно методу, описаного в US 5739277.У контексті даного опису поняття "епітоп, що зв'язується з рецептором порятунку" відноситься до епітопу в Fc-області молекули IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), відповідальному за подовження часу напівжиття молекули IgG в сироватці in vivo. Антитіла можна глікозилювати в консервативних положеннях в константних областях (див., наприклад, Jefferis і Lund, Chem. Immunol. 65, 1997, сс. 111-128; Wright і Morrison, TibTECH 15, 1997, сс. 26-32). Олігосахаридні бічні ланцюги імуноглобулінів можуть впливати на функцію білка (див., наприклад, Boyd та ін, MoI. Immunol. 32, 1996, сс. 1311-1318; Wittwe і Howard, Biochem. 29, 1990, сс. 4175 4180) і внутрішньомолекулярна взаємодія між ділянками глікопротеїну, що може впливати на конформацію і презентовану тривимірну поверхню глікопротеїну (див., наприклад, Jefferis і Lund, вище; Wyss і Wagner, Current Opin. Biotech. 7, 1996, сс. 409-416). Олігосахариди можуть служити також для заснованого на специфічних розпізнаваних структурах напрямки даного глікопротеїну до певних молекул. Наприклад, встановлено, що в галактозильованному IgG олігосахаридний залишок "виступає" з інтер-CH2простору і кінцеві залишки N ацетилглюкозаміну стають доступними для зв'язування зі зв'язуючим манозу білком (див., наприклад, Malhotra та ін, Nature Med. 1, 1995, сс. 237-243). Видалення за допомогою глікопептидаз олігосахаридів з CAMPATH-1H (рекомбінантне гуманізоване мишаче моноклональне антитіло типу IgG1, яке розпізнає антиген CDw52 людських лімфоцитів), яке отримано в клітинах яєчника китайського хом'ячка (CHO), призводить до повної елімінації опосередковуваного комплементом лізису (CMCL або CDC) (Boyd та ін, MoI. Immunol. 32, 131, 1996, сс. січня 1318), в той час як вибіркове видалення залишків сіалової кислоти за допомогою нейрамінідази не приводить до втрати CMCL. Встановлено також, що глікозилювання антитіл впливає на ADCC. Зокрема, встановлено, що CHO-клітини з регульованою тетрацикліном експресією β (1.4)-N-ацетилглюкозаминілтрансферази III (GnTIII), глікозілтрансферази, каталізує утворення двурозсікаючого GlcNAc, мають поліпшену ADCCактивність (див., наприклад, Umana та ін., Nature Biotech. 17, 1999, сс. 176-180). Глікозилювання антитіл зазвичай відбувається за допомогою або N-зв'язування, або Озв'язування. N-зв'язування передбачає приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга 7 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 залишку аспарагіну. Тріпептідні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де X означає будь-яку амінокислоту крім проліну, являють собою розпізнавані послідовності, призначені для ферментативного приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Так, присутність будь-якої їх цих тріпептидних послідовностей в поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. О-пов'язане глікозилювання передбачає приєднання одного з цукрів, таких як N-ацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза, до гідроксиамінокислота, найбільш часто до серину або треоніну, хоча можна застосовувати також 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Варіанти глікозилювання антитіл являють собою варіанти, в яких змінено схему глікозилювання антитіла. Під зміною увазі делецію одного або декількох вуглеводних фрагментів, присутніх у антитілі, додавання одного або декількох вуглеводних фрагментів до антитіла, зміна складу (композиції) глікозилювання (т.e., схеми глікозилювання), ступеня глікозилювання або т.п. Додавання сайтів глікозилювання в антитіло, як правило, здійснюють шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, що вона містить одну або декілька зазначених вище тріпептідних послідовностей (для сайтів N-зв'язаного глікозилювання). Зміна можна здійснювати також шляхом додавання або заміни одного чи декількох залишків серину або треоніну в послідовності вихідного антитіла (для сайтів O-пов'язаного глікозилювання). Аналогічно цьому, видалення сайтів глікозилювання можна здійснювати шляхом зміни амінокислот в нативних сайтах глікозилювання антитіла. Амінокислотну послідовність, як правило, модифікують шляхом зміни що кодує її нуклеотидної послідовності. Ці методи включають (але, не обмежуючись лише ними) виділення з природного джерела (у разі зустрічаються в природних умовах варіантів амінокислотних послідовностей) або одержання за допомогою мутагенезу з використанням олігонуклеотидів (або сайтнаправленного мутагенезу), ПЛР-мутагенезу або касетного мутагенезу отриманого раніше варіанту або неваріантної версії антитіла. Глікозилювання (включаючи схему глікозилювання) антитіл можна змінювати також без зміни амінокислотної послідовності або що кодує її нуклеотидної послідовності. Глікозилювання залежить головним чином від клітини-хазяїна, застосовуваної для експресії антитіла. Оскільки тип клітини, застосовуваної для експресії рекомбінантних глікопротеїнів, наприклад, антитіл, в якості потенційних терапевтичних засобів, рідко являє собою нативну клітку, то можна очікувати суттєві варіації в схемі глікозилювання антитіл (див., наприклад, Hse та ін, Biol. Chem. 272, 1997, сс. 9062-9070.). Крім вибору клітин-господарів, фактори, які впливають на глікозилювання в процесі рекомбінантного отримання антитіл, включають схему вирощування, склад середовища, щільність культури, оксигенацію, pH, схеми очищення і т.п. Різні методи, запропоновані для зміни схеми глікозилювання в конкретному організмі-хазяїні, включають інтродукцію або надекспресію певних ферментів, що беруть участь у виробництві олігосахаридів (див., наприклад, US 5047335; 5510261 і 5278299). Глікозилювання або певні типи глікозилювання можна ферментативно усувати в глікопротеїн, наприклад, з використанням ендоглікозідази H (Endo H). Крім того, рекомбіновану клітину-хазяїна можна створювати за допомогою методів генетичної інженерії, наприклад, створюючи в ній порушення процесингу певних типів полісахаридів. Ці та аналогічні методи добре відомі в даній галузі. Структуру глікозилювання антитіл легко можна аналізувати за допомогою загальноприйнятих методів аналізу вуглеводів, включаючи лектиновухроматографію, ЯМР, мас-спектрометрію, РХВР, гельпроникну хроматографію (GPC), аналіз складу моносахаридів, послідовне ферментативне розщеплення, HPAEC-PAD (аніонообмінна хроматографія високого тиску з імпульсним амперометричним виявленням), в якій застосовують аніонообмінну хроматографію при високому значенні рН для розділення олігосахаридів на основі заряду. Відомі також методи вивільнення олігосахаридів для аналітичних цілей, і вони включають (але, не обмежуючись лише ними) ферментативну обробку (яку, як правило, здійснюють з використанням пептид-N-глікозідази F / ендо-β-галактозидази), елімінацію з використанням жорсткого лужного оточення для вивільнення переважно O-пов'язаних структур і хімічні методи, засновані на застосуванні безводного гідразину для вивільнення як N-, так і O-пов'язаних олігосахаридів. Антитіла можуть також мати модифікації (наприклад, заміни, делеції або додавання) амінокислотних залишків, які взаємодіють з Fc-рецепторами. Зокрема, антитіла можуть мати модифікації амінокислотних залишків, для яких встановлена здатність брати участь у взаємодії між анти-Fc-доменом і FcRn-рецептором (див., наприклад, публікацію міжнародної заявки на патент WO 97/34631). 8 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Найбільш широким об'єктом даного винаходу є CD33-зв'язуючі агенти, які зв'язуються з людським CD33 і які відрізняються тим, що a) мають варіабельну область важкого ланцюга, яка містить CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить CDR4, CDR5 і CDR6, де CDR1 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 1-14, CDR2 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 15-28, CDR3 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 29-42, CDR4 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 43-56, CDR5 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 57-70, CDR6 має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 71-84, або б) розпізнають епітоп, розташований усередині амінокислотної послідовності FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SeqID No: 141) людського CD33. Даний винахід належить і до CD33-зв'язуючих агентів, що відрізняється тим, що кінетика інтерналізації CD33-зв'язуючих агентів є такою, що щонайменше 30 %, переважно щонайменше 40 % початкової кількості антитіла залишається на клітинній поверхні HL60-клітин через 4 год. після інкубації. При створенні винаходу було встановлено, що CD33-зв'язуючі агенти, запропоновані в даному винаході, зв'язуються з епітопом, відмінним від епітопу лінтузумаба, див. приклад 4 в даному описі. Обидва епітопу (SeqID No: 141 і SeqID No: 142) не перекриваються. Ймовірно, присутність різних епітопів позаклітинного домену CD33, які розпізнаються CD33-зв'язуючими агентами, запропонованими в даному винаході, і лінтузумабом, є причиною різної кінетики інтерналізації і ADCC-ефективності CD33-зв'язуючих агентів, пропонованих в даному винаході, і лінтузумаба (пор. приклади 2 і 3 в даному описі). Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу щонайменше 40 % від початкової кількості CD33-зв'язуючих агентів залишається на клітинній поверхні через 4 години після інкубації. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 85-98, і варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 99-112. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент містить важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 113-126, і легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, вибрану з SeqID No: 127-140. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу афінність CD33-зв'язуючого агента як до людського CD33, так і до CD33 мавп ціномолгус (яванський макак-крабоїд), характеризується величиною KD, що дорівнює або є нижчою ніж 10нМ. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент є гуманізованим. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент є повністю людським. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент додатково має ефекторну функцію. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу ефекторна функція опосередковується Fc-доменом. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент містить одну або декілька мутацій в Fc-області, яка (і) модулюють функцію Fc-доменом. Згідно з переважним варіантом здійснення винаходу модуляція функції Fc-домену представляє собою підвищення ADCC щонайменше на 10 %, переважно на 50 % або 100 %. Найбільш переважні CD33-зв'язуючі агенти, запропоновані в даному винаході, перераховані в таблиці 1: Таблиця 1 № 1 2 3 4 5 Клон/ ID № 280-03-08 280-21-09 280-29-12 280-31-01 280-31-01 (mut) SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID важкий CDR1 CDR2 CDR3 CDR4 CDR5 CDR6 VH VL ланцюг 1 15 29 43 57 71 85 99 113 2 16 30 44 58 72 86 100 114 3 17 31 45 59 73 87 101 115 4 18 32 46 60 74 88 102 116 5 19 33 47 61 9 75 89 103 117 SeqID легкий ланцюг 127 128 129 130 131 UA 112062 C2 Продовження таблиці 1 № 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID SeqID важкий CDR1 CDR2 CDR3 CDR4 CDR5 CDR6 VH VL ланцюг 280-34-02 6 20 34 48 62 76 90 104 118 280-50-01 7 21 35 49 63 77 91 105 119 280-50-01 8 22 36 50 64 78 92 106 120 (mut) 280-61-07 9 23 37 51 65 79 93 107 121 283-03-03 10 24 38 52 66 80 94 108 122 283-05-01 11 25 39 53 67 81 95 109 123 283-07-03 12 26 40 54 68 82 96 110 124 283-11-03 13 27 41 55 69 83 97 111 125 283-14-01 14 28 42 56 70 84 98 112 126 Клон/ ID № SeqID легкий ланцюг 132 133 134 135 136 137 138 139 140 Лікування раку У кількох публікаціях CD33 описаний в якості маркера клітинної поверхні первинних ГМЛ-і ХМЛ-клітин, що експресується на клітинах у 70-100 % пацієнтів (Scheinberg та ін, 1989; Hauswirt та ін, 2007; Plesa та ін, 2007; Webber та ін, 2008). CD33 експресується на злоякісних мієлоїдних бластних клітинах, які представляють собою основну частину злоякісних клітин у периферичній крові та кістковому мозку які страждають на лейкоз пацієнтів, і на лейкозних стволових клітинах, відносно невеликий групі менш диференційованих клітин у кістковому мозку, які відрізняються притаманною їм здатністю до самовідновлення і підтримці лейкозної клональної ієрархії. Можливість в клінічних умовах здійснювати спрямований вплив на CD33 із застосуванням антитіл продемонстрована при використанні Mylotarg ® (гемтузумаба озогаміцін), кон'югату антитіло-каліхеаміцином, який дозволений для лікування пацієнтів з рецидивуючим ГМЛ, що не піддаються лікуванню з використанням інших засобів. Альтернативний підхід спрямованого впливу на CD33 пов'язаний із створенням лінтузумаба (SGN-33, HuM195), гуманізованого моноклонального антитіла типу IgG1, для якого отримані початкові дані про клінічних ознаках ефективності, встановлених на фазі I випробувань (Raza та ін, 2009). У цілому, як у доклінічних, так і в клінічних умовах отримані великі дані, які підкреслюють придатність і можливість застосування спрямованого впливу на CD33 при лікуванні ГМЛ та інших CD33-позитивних злоякісних захворювань. Гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ) являє собою злоякісний стан мієлоїдної лінії диференціювання лейкоцитів. Ця гематологічна неоплазія являє собою захворювання крові і кісткового мозку, яке без лікування, як правило, призводить до смерті протягом періоду часу, що складає від декількох тижнів до місяців. Встановлено, що поширеність ГМЛ складає 30000 випадків у США і 47000 випадків у країнах Європейського союзу (дані про поширеність захворювання протягом 10-річного періоду підтверджені Mattson-Jack, 2010). ГМЛ є найбільш поширену форму гострого лейкозу у дорослих (приблизно 90 %), що становить приблизно 33 % від нових випадків лейкозу. Медіанний вік пацієнтів, у яких діагностовано ГМЛ, становить 67 років. На частку ГМЛ припадає приблизно 1,2 % випадків смерті від раку в США. ГМЛ характеризується неспецифічними симптомами, такими як втрата ваги, втома, лихоманка і нічна пітливість. ГМЛ діагностується за результатами аналізу крові, обстеження кісткового мозку і за допомогою лабораторних аналізів, які дозволяють визначати підтип ГМЛ і приймати рішення про шляхи лікування. Терапія при ГМЛ насамперед залежить від віку та характеристики працездатності пацієнта. Пацієнтів, які можуть переносити інтенсивну індуктивну (а потім консолідуючу і підтримуючу) хіміотерапію, можна лікувати інтенсивно з використанням комбінації цитотоксичних лікарських засобів. Такі пацієнти мають ймовірність досягнення повної відповіді, що становить приблизно 75 %. Для цієї популяції пацієнтів завданням терапевтичного лікування є лікування. При цьому протягом 1 року після досягнення повної відповіді приблизно у половини пацієнтів має місце рецидив ГМЛ. Довготривалі показники лікування становлять близько 30 %. Однак більш старший вік у момент діагностування або наявність супутніх хвороб не дозволяє застосовувати інтенсивну індуктивну терапію, тому завданням є паліативне лікування. Таким чином, рівні ремісії різко знижуються у людей похилого віку, які страждають ГМЛ. Медіанний показник виживаності для людей похилого віку з ГМЛ складає менше 6 місяців. Відповідно до одного з об'єктів винаходу CD33-зв'язуючі агенти можна застосовувати для лікування раку, наприклад, для уповільнення прогресування раку та / або зменшення 10 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 асоційованої з раком кахексії, або попередження або уповільнення рецидиву гематологічного злоякісного захворювання (наприклад, лейкозу) у ссавця, переважно у хворої людини. CD33зв'язуючий агент можна вводити індивідуально або спільно з іншим терапевтичним засобом. У деяких варіантах здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент вводять спільно зі стандартним лікувальним хіміотерапевтичних засобом. CD33-зв'язуючий агент можна застосовувати в некон'югованій формі (тобто у формі, некон'югованій з цитотоксин) або у вигляді кон'югату. У цьому підрозділі під поняттям "пацієнт" мається на увазі людина або інший ссавець, якого / яку піддають лікуванню або у якого діагностовано рак. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу CD33-зв'язуючі агенти можна застосовувати для уповільнення прогресування раку та / або зменшення асоційованої з раком кахексії у пацієнта шляхом введення пацієнтові, який потребує цього, CD33-зв'язуючого агента в ефективній дозі. Не вдаючись у будь-який конкретний механізм, прийнято, що CD33-зв'язуючий агент зв'язується з ефекторними або А-клітинами (клітини, що здійснюють кооперативну взаємодію з Т-і В-лімфоцитами) мієлоїдної або моноцитарній лінії диференціювання (наприклад, моноцити, макрофаги, дендритні клітини і нейтрофіли), інгібуючи тим самим або знижуючи виробництво різних цитокінів, хемокінів і факторів росту ефекторними або Аклітинами і / або пухлинними клітинами. Зазначені цитокіни, хемокіни і фактори росту, які можуть прискорювати ріст і проліферацію пухлинних клітин і / або беруть участь у розвитку асоційованої раком кахексії, включають (але, не обмежуючись лише ними) інтерлейкін-1β (IL1β), фактор некрозу пухлини-α (TNF-α), інтерлейкін-6 (IL-6), інтерлейкін-8 (IL-8), інтерферон-γ (IFN-γ), судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF), фактор, що інгібує лейкоз (LlF), моноцитарний хемоаттрактантний білок-1 (MCP-1), RANTES, інтерлейкін-10 (IL-10), інтерлейкін12 (IL-12), матричну металлопротеіназу 2 (MMP2), IP-10 і / або запальний білок макрофагів-1α (MIP1α). CD33-зв'язуючі агенти можуть також знижувати міграцію макрофагів в область ракових клітин. У деяких варіантах здійснення винаходу введення пацієнтові в ефективній дозі CD33зв'язуючого агента знижує рівень щонайменше одного цитокіну, Хемокіни або фактора росту, де цитокін, хемокіни або фактор росту може прискорювати зростання і проліферацію пухлинних клітин, прискорювати міграцію незлоякісних ефекторних клітин, таких як асоційовані з пухлиною макрофаги (TAMS), в околицю області пухлини та / або брати участь у розвитку асоційованої раком кахексії. У конкретних варіантах здійснення винаходу цитокін, хемокін або фактор зростання являє собою, наприклад, інтерлейкін-1β (IL-1β), фактор росту пухлини-α (TNF-α), інтерлейкін-6 (IL-6), інтерлейкін-8 (IL-8), інтерферон-γ (IFN-γ), судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF), фактор, що інгібує лейкоз (LlF), моноцитарний хемоаттрактантний білок -1 (MCP1), RANTES, інтерлейкін-10 (IL-10), інтерлейкін-12 (IL-12), матричну металлопротеіназу 2 (MMP2), IP-10 і / або запальний білок макрофагів-1α (MIP1α). Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб уповільнення прогресування раку, що полягає в тому, що вводять пацієнтові в ефективному режимі CD33-зв'язуючий агент, який має здатність специфічно зв'язуватися з CD33. У результаті введення CD33-зв'язуючого агента сповільнюється прогресування раку, наприклад, сповільнюється зростання або проліферація пухлинних клітин, зменшуються метастази, знижується рівень щонайменше одного цитокіну, хемокіну або фактора росту, знижується рівень незлоякісних ефекторних клітин біля пухлинних клітин або т.п. Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб зменшення пухлинного навантаження у пацієнта, що полягає в тому, що вводять пацієнтові в ефективному режимі CD33-зв'язуючий агент, який має здатність специфічно зв'язуватися з CD33. У результаті введення CD33зв'язуючого агента пухлинне навантаження в організмі пацієнта залишається на тому ж рівні або знижується, наприклад, в результаті зменшення розміру або маси пухлини, зниження рівня щонайменше одного цитокіну, хемокіну або фактора росту, зниження рівня незлоякісних ефекторних клітин в околиці пухлинних клітин, інгібування міграції макрофагів в околицю пухлинних клітин, зменшення кількості незлоякісних ефекторних клітин (наприклад, TAMS або макрофагів) у пухлини або т.п. Іншим варіантом здійснення винаходу є спосіб зменшення пухлинного навантаження або сповільнення прогресування раку у пацієнта, що полягає в тому, що вводять пацієнтові в ефективному режимі CD33-зв'язуючий агент, який має здатність специфічно зв'язуватися з CD33. У результаті введення CD33-зв'язуючого агента пухлинне навантаження в організмі пацієнта залишається на тому ж рівні або знижується, наприклад, в результаті рекрутменту імунних ефекторних клітин типу NK-клітин або макрофагів, або моноцитів, які можуть руйнуватипухлинні клітини за допомогою опосередковуваних імунною системою механізмів. 11 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC) являє собою опосередковуваний імунними ефекторними клітинами механізм, який може приймати участь у протипухлинній активності моноклональних антитіл (Weiner GJ, Monoclonal antibody mechanisms of action in cancer. Immunol Res., 39 (1-3), 2007, сс. 271-278). Роль ADCC в протипухлинній ефективності була продемонстрована на моделях в доклінічних дослідженнях, наприклад, на мишачих моделях пухлин (див., наприклад, Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV, Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med., 6 (4), квітень 2000 р., сс. 443-446). Дані клінічних випробувань підтверджують роль ADCC в прояві ефективності терапевтичних антитіл в клінічних умовах (див., наприклад, Weng WK, Levy R., Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol., 1, 21 (21), листопад 2003 р., сс. 3940-3947. Електронна публікація від 15 вересня 2003). Взаємодія моноклональних антитіл з Fcрецептором на імунних клітинах бере участь у ADCC. Fc-область антитіл можна модифікувати для того, щоб отримувати підвищену афінність до Fc-рецепторів (див., наприклад, Presta LG, Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function. Adv Drug Deliv Rev., 7, 58 (5-6), серпень 2006 р., сс. 640-656. Електронна публікація від 23 травня 2006 р.). Зазначена підвищена афінність до Fc-рецепторів призводить до підвищеної ADCCактивності, що може призводити до підвищеної протипухлинної ефективності для пацієнтів. У різних варіантах здійснення винаходу, описаних у цьому розділі, CD33-зв'язуючий агент можна застосовувати для лікування CD33-позитивного раку (тобто раку, що включає ракові клітини, на поверхні яких відбувається надекспресія CD33, або в яких відбувається експресія CD33 в кількостях, які вважаються прийнятними для терапії з використанням антитіл до CD33). CD33-зв'язуючий агент можна застосовувати також для лікування раку, при якому не відбувається надекспресія CD33 на незлоякісних ефекторних клітинах порівняно зі здоровою тканиною такого ж типу. Рак може являти собою, наприклад, негематологічне або гематологічне злоякісне захворювання. У конкретних прикладах гематологічне злоякісне захворювання може являти собою CD33-позитивне захворювання і може являти собою, наприклад, гострий лімфоїдний лейкоз, гострий мієлоїдний лейкоз, хронічний мієломоноцитарний лейкоз і еритроцитарний лейкоз, гострий мегакаріобластний лейкоз, гістоцитарну лімфому, мієлоїдну саркому, проліферативне порушення тучних клітин або мієлодиспластичний синдром (МДС). У деяких варіантах здійснення винаходу гематологічне злоякісне захворювання являє собою CD33-позитивне злоякісне захворювання, таке як гострий мієлоїдний лейкоз або мієлодиспластичний синдром (МДС). У різних варіантах здійснення винаходу, описаних у цьому розділі, CD33-зв'язуючий агент може представляти собою некон'юговане антитіло до CD33. Наприклад, антитіло може являти собою повністю людське, гуманізоване або химерне антитіло, таке як химерне або гуманізоване антитіло M 195. Антитіло може являти собою також інше антитіло, яке конкурує з антитілом M 195 за специфічне зв'язування з CD33. Антитіло може також зв'язуватися з тим же епітопом, що й антитіло M 195, або з іншим епітопом. В інших варіантах здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент може бути пов'язаний (тобто кон'югований) з цитотоксином. Цитотоксин може являти собою, наприклад, пептидний токсин, такий як сапорін, рицин, хлоротоксин, екзотоксин Рseudomonas, ендотоксин Рseudomonas або дифтерійний токсин. Цитотоксин може являти собою також хімічний (тобто який не має пептидну основу) токсин, такий як каліхеаміцин, доксорубіцин, камптотецин, даунорубіцин або інші ДНК-зв'язуючі агенти. Цитотоксин може являти собою також аурістатін, майтансіноід, доластатін або інші блокуючі мікротрубочки агенти. CD33-зв'язуючий агент, який представляє собою антитіло до CD33, можна вводити пацієнту внутрішньовенно або підшкірно в дозі від 0,1-менш до приблизно 25 мг / кг, переважно від 1,0 до приблизно 10 мг / кг. CD33-зв'язуючий агент, який представляє собою фрагмент антитіла до CD33 або інший CD33-зв'язуючий білок, можна вводити в дозі, еквівалентній дозі від 0,1 до приблизно 25 мг / кг, від 1,0 до приблизно 10 мг / кг інтактного антитіла. CD33-зв'язуючий агент можна вводити пацієнту внутрішньовенно або підшкірно згідно, наприклад, такою схемою: щодня, щотижня, через два тижні, через три тижні (тобто кожні три тижні) або щомісяця, або застосовувати комбінацію зазначених схем введення. CD33-зв'язуючий агент можна вводити протягом періоду, що становить щонайменше один місяць, щонайменше два місяці, щонайменше три місяці, щонайменше чотири місяці, щонайменше п'ять місяців, щонайменше шість місяців або при необхідності протягом більш тривалого терміну. У деяких варіантах здійснення винаходу за фазою лікування (див. вище) за допомогою CD33-зв'язуючого агента слідує підтримуюча фаза, під час якої дози CD33-зв'язуючого агента вводять рідше, ніж під час фази лікування. Наприклад, підтримуючі дози можна вводити щотижня, через два тижні, через 12 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 три тижні або щомісяця протягом 1-6 місяців. Під час підтримуючої фази можна застосовувати такі ж дози, що і при здійсненні фази лікування. Лікування гематологічного злоякісного захворювання на стадії ремісії Іншим об'єктом винаходу є способи попередження або уповільнення виникнення рецидиву гематологічного злоякісного захворювання (наприклад, лейкозу) у пацієнта, які полягають в тому, що пацієнтові на стадії ремісії гематологічного злоякісного захворювання вводять в ефективній дозі CD33-зв'язуючий агент, що призводить до попередження або уповільнення виникнення рецидиву зазначеного гематологічного злоякісного захворювання. CD33-зв'язуючий агент специфічно зв'язується з CD33 на поверхні гематологічних злоякісних (тобто лейкозних) клітин і / або незлоякісних ефекторних клітин. У контексті даного опису поняття "пацієнт", як правило, належить до людини, яку піддають лікуванню з приводу гематологічного злоякісного захворювання або у якої діагностовано зазначене захворювання. У деяких варіантах здійснення винаходу гематологічне злоякісне захворювання являє собою CD33-позитивне гематологічне злоякісне захворювання. Гематологічні злоякісні захворювання включають (але не обмежуючись лише ними) лейкози (наприклад, гострий лімфобластний лейкоз (ГЛЛ), гострий мієлоїдний (мієлогенний) лейкоз (ГМЛ), хронічний мієлоїдний (мієлогенний) лейкоз (ХМЛ), хронічний мієломоноцитарний лейкоз, волосковоклітинний лейкоз). Споріднені хвороби крові включають (але, не обмежуючись лише ними) мієлодиспластичний синдром (МДС), мієлофіброзу, мієлпроліферативне захворювання (наприклад, поліцитемія справжня (PV, PCV або PRV), ідіопатичний тромбоцитоз (есенціальна тромбоцитемія) (ET)) і амілоїд, пов'язаний з хворобою легких ланцюгів. Поняття "CD33-позитивне гематологічне злоякісне захворювання" відноситься до гематологічного злоякісного захворювання, що відрізняється експресією CD33 на поверхні злоякісної клітини. CD33-позитивні гематологічні злоякісні захворювання включають (але не обмежуючись лише ними) гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ), хронічний мієлоїдний лейкоз (ХМЛ), хронічний мієломоноцитарний лейкоз, тромбоцитарний лейкоз, мієлодиспластичний синдром, мієлопроліферативне порушення, рефрактерну анемію, передлейкозний синдром, лімфоїдний лейкоз або недиференційований лейкоз. У деяких варіантах здійснення винаходу способи полягають у тому, що пацієнтові на стадії ремісії CD33-позитивного гематологічного злоякісного захворювання вводять в ефективному режимі CD33-зв'язуючий агент, завдяки чому рецидив гематологічного злоякісного захворювання попереджається або його виникнення сповільнюється. У деяких варіантах здійснення винаходу у пацієнта відсутні здатні до виявлення клітини, характерні для гематологічного злоякісного захворювання. У контексті даного опису "відсутність здатних до виявлення клітин" визначають за допомогою стандартних діагностичних або прогностичних методів. Для пацієнта на стадії ремісії ГМЛ, як правило, характерно усунення аномальних клінічних ознак, повернення в норму гемограми і наявність нормального гематопоезу в кістковому мозку з формуванням 1000-1500, тромбоцитів у кількості> 100000, і зникненням лейкемічного клона (див., наприклад, The Merck Manual, розділ 11, гл. 138 (17-е вид., 1997): Estey, Cancer 92(5), 2001, сс. 1059-1073). CD33-зв'язуючий агент може представляти собою, наприклад, антитіло, яке специфічно зв'язується з CD33, а гематологічне злоякісне порушення може представляти собою гострий мієлоїдний лейкоз (ГМЛ), хронічний мієлоїдний лейкоз (ХМЛ), хронічний мієломоноцитарний лейкоз, пов'язаний з тімоідом (що нагадує тимус лімфо-епітеліальна структура) лейкоз, мієлодиспластичний синдром, мієлопроліферативне порушення, рефрактерну анемію, передлейкозний синдром, лімфоїдний лейкоз або недиференційований лейкоз. У деяких варіантах здійснення винаходу пацієнт на стадії ремісії гематологічного злоякісного захворювання піддавався трансплантації кісткового мозку. В інших варіантах здійснення винаходу пацієнт на стадії ремісії гематологічного злоякісного захворювання піддавався трансплантації кісткового мозку. Трансплантат може являти собою або аутотрансплантат, або алотрансплантат кісткового мозку. Наведені нижче типи раку найбільш придатні для лікування за допомогою антитіл, пропонованих в даному винаході: типи раку кроветворного походження, включаючи (але, не обмежуючись лише ними): гострий лімфобластний лейкоз ("ГЛЛ"), гострий лімфобластний B-клітинний лейкоз, гострий лімфобластний T-клітинний лейкоз, гострий мієлобластний лейкоз ("ГМЛ"), гострий лейкоз промієлоцитарний ("ГПЛ"), гострий монобластний лейкоз, гострий еритролейкозний лейкоз, гострий мегакаріобластний лейкоз, гострий мієломоноцитарний лейкоз, нелімфоцитарний лейкоз, гострий недиференційований лейкоз, хронічний мієлоцитарний лейкоз ("ХМЛ"), хронічний лімфоцитарний лейкоз "ХЛЛ"), волосковоклітинний лейкоз, множинну мієлому. 13 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Гострі та хронічні лейкози, які можна лікувати за допомогою CD33-зв'язуючих агентів, включають: лімфобластний, мієлогенний, лімфоцитарний, мієлоцитарний лейкози і тромбоцитарний лейкоз. Крім того, за допомогою CD33-зв'язуючих агентів можна лікувати мієлодиспластичний синдром, мієлопроліферативне порушення, рефрактерну анемію, передлейкозний синдром, лімфоїдний лейкоз або недиференційований лейкоз. Комбінації з іншими активними субстанціями Залежно від такого, що підлягає лікуванню порушення CD33-зв'язуючі агенти, пропоновані у винаході, можна застосовувати індивідуально або в поєднанні з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами, зокрема вибраними з числа викликаючих пошкодження ДНК, деметилювання ДНК або тубулінзв'язуючих агентів, або терапевтичними діючими речовинами, які інгібують ангіогенез, шляхи трансдукції сигналів або чекпойнту мітозу в ракових клітинах або що мають імуномодулюючу функцію (речовини класу IMIDs®). Додатковий терапевтичний засіб можна вводити одночасно, необов'язково у вигляді компонента одного і того ж фармацевтичного препарату, або до або після введення CD33зв'язуючого агента. У деяких варіантах здійснення винаходу додатковий терапевтичний засіб може являти собою (але, не обмежуючись лише ними) один або кілька інгібіторів, вибраних з групи інгібіторів сімейства EGFR, сімейства VEGFR, IGF-1R, рецепторів інсуліну, кіназ AuroraA, AuroraB, PLK і PI3, FGFR, PDGFR, Raf, KSP або PDK1. Іншими прикладами додаткових терапевтичних засобів є інгібітори CDK, Akt, Src, Bcr Abl, cKit, cMet / HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, антагоністи білка hedgehog, інгібітори JAK / STAT, Mek, mTor, NFkappaB, протеосоми, Rho, інгібітор шляхи передачі сигналу Wnt або шляхи передачі сигналу Notch або інгібітор шляху убіквітінізаціі. Іншими прикладами додаткових терапевтичних засобів є інгібітори ДНК-полімерази, топоізомерази II, мультитаргетні (багатоцільові) інгібітори тирозинкіназ, антагоністи CXCR4, інгібітори IL3RA, антагоністи RAR, інгібітори KIR, імунотерапевтичні вакцини, інгібітори TUB, індуктори Hsp70, інгібітори сімейства IAP, інгібітори ДНК-метилтрансферази, інгібітори TNF, інгібітори рецепторної тирозинкінази ErbB1, мультитаргетні інгібітори кіназ, інгібітори JAK2, інгібітори RR, індуктори апоптозу, інгібітори HGPRTази, антагоністи H2-рецепторів гістаміну і агоністи CD25-рецепторів. Прикладами інгібіторів Aurora-кінази є (але, не обмежуючись лише ними) PHA-739358, AZD1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-667, MLN-8045, PF-3814735, SNS 314, VX 689, GSK 1070916, TTP-607, PHA-680626, MLN-8237, BI847325 і ENMD-2076. Прикладами інгібіторів PLK є GSK-461364, BI2536 і BI6727. Прикладами інгібіторів raf є BAY-73-4506 (є також інгібітором VEGFR), PLX 4032, RAF-265 (є також інгібітором VEGFR), сорафеніб (є також інгібітором VEGFR), XL 281 і невавар (Nevavar) (є також інгібітором VEGFR) і PLX4032. Прикладами інгібіторів KSP є іспінесіб, ARRY-520, AZD-4877, CK 1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, SB-743921, LY 2523355 і EMD-534085. Прикладами інгібіторів src і / або bcr-abl є дасатініб, AZD-0530, босутініб, XL 228 (є також інгібітором IGF-1R), нілотініб (є також інгібітором PDGFR і cKit), іматиніб (є також інгібітором cKit), NS-187, KX2-391, AP-24534 (є також інгібітором EGFR, FGFR, Tie2, Flt3), KM-80 і LS-104 (є також інгібітором Flt3, Jak2). Прикладом інгібітору PDK1 є AR-12. Прикладом інгібітору Rho є BA-210. Прикладами інгібіторів PI3-кинази є PX-866, PX-867, BEZ-235 (є також інгібітором mTor), XL147 і XL-765 (є також інгібітором mTor), BGT-226, CDC-0941. Прикладами інгібіторів cMet або HGF є XL-184 (є також інгібітором VEGFR, cKit, Flt3), PF2341066, MK-2461, XL-880 (є також інгібітором VEGFR), MGCD-265 (є також інгібітором VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, AV-299, ARQ-197, MetMAb, CGEN-241, BMS777607, JNJ 38877605, PF-4217903, SGX-126, CEP-17940, AMG-458, INCB 028060 і E-7050. Прикладом інгібітору c-Myc є CX-3543. Прикладами інгібіторів Flt3 є AC-220 (є також інгібітором cKit і PDGFR), KW 2449, LS-104 (є також інгібітором bcr-abl і Jak2), MC-2002, SB-1317, лестауртініб (є також інгібітором VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (є також інгібітором JAK2), XL 999 (є також інгібітором cKit, FGFR, PDGFR і VEGFR), сунітініб (є також інгібітором PDGFR, VEGFR і cKit) і тандутініб (є також інгібітором PDGFR і cKit). Прикладами інгібіторів HSP90 є танеспіміцін, алвеспіміцін, IPI 504, STA 9090, MEDI-561, AUY-922, CNF 2024 і SNX-5422. 14 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Прикладами інгібіторів JAK / STAT є CYT-997 (взаємодіє також з тубуліну), TG 101 348 (є також інгібітором Flt3) і XL-019. Прикладами інгібіторів Mek є ARRY-142886, AS-703 026, PD-325901, AZD 8330, ARRY-704, RDEA-119 і XL-518. Прикладами інгібіторів mTor є темсіролімус, дефоролімус (є також інгібітором VEGFr), еверолімус (є також інгібітором VEGF), XL-765 (є також інгібітором PI3-кінази) і BEZ-235 (є також інгібітором PI3-кінази). Прикладами інгібіторів Akt є періфозін, GSK-690693, RX-0201 і трицірибін. Прикладами інгібіторів cKit є масітініб, OSI-930 (є також інгібітором VEGFR), AC-220 (є також інгібітором Flt3 і PDGFR), тандутиніб (є також інгібітором Flt3 і PDGFR), аксітиніб (є також інгібітором VEGFR і PDGFR), сунітініб (є також інгібітором Flt3, PDGFR, VEGFR) і XL-820 (є також інгібітором VEGFR і PDGFR), іматиніб (є також інгібітором bcr-abl), нілотиніб (є також інгібітором bcr-abl і PDGFR). Прикладами антагоністів білка hedgehog є IPI-609, CUR-61414, GDC-0449, IPI 926 і XL-139. Прикладами інгібіторів CDK є селіцікліб, AT-7519, P-276, ZK-CDK (є також інгібітором VEGFR2 і PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, PHA-848125 і SCH-727965. Прикладами інгібіторів протеосоми є бортезоміб, карфілзоміб і NPI-0052 (є також інгібітором NFkappaB). Прикладами інгібіторів протеосоми / інгібіторів шляху NFkappaB є бортезоміб, карфілзоміб, NPI-0052, CEP-18770, MLN 2238, PR-047, PR-957, AVE-8680 і SPC-839. Прикладом інгібітора шляху убіквітінізаціі є HBX-41108. Прикладами агентів що деметилюється є 5-азацітідін і децітабін. Прикладами антиангіогенних засобів є інгібітори FGFR, PDGFR і VEGF (R) і талідомід, вказані засоби вибирають з групи включає (але, не обмежуючись лише ними) бевацизумаб, мотесаніб, CDP-791, SU-14813, телатініб, KRN-951, ZK-CDK (є також інгібітором CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs, талідомід, CC-4047, леналідомід, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, бріваніб, цедіраніб, 1B3, CP 868 596, IMC 3G3, R-1530 (є також інгібітором Flt3), сунітініб (є також інгібітором cKit і Flt3), аксітініб (є також інгібітором cKit), лестауртініб (є також інгібітором Flt3 і PKC), ваталаніб, тандутініб (є також інгібітором Flt3 і cKit), пазопаніб, PF-337210, афліберцепт, E-7080, CHIR 258, сорафеніба тозілат (є також інгібітором Raf), вандетаніб, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (є також інгібітором EGFR і Her2), BAY-57-9352 (є також інгібітором Raf), BAY-73-4506 (є також інгібітором Raf), XL 880 (є також інгібітором cMet), XL 647 (є також інгібітором EGFR і EphB4), XL 820 (є також інгібітором cKit), нілотініб (є також інгібітором cKit і brc-abl), CYT-116, PTC-299, BMS 584622, CEP-11981, довітиніб, CY2401401, ENMD-2976 і BIBF1120. Додатковий терапевтичний агент можна вибирати також з інгібіторів EGFR, він може представляти собою низькомолекулярний інгібітор EGFR або антитіло до EGFR. Прикладами антитіл до EGFR є (але не обмежуючись лише ними) цетуксимаб, панітумумаб, німотузумаб, залутумумаб; прикладами низькомолекулярних інгібіторів EGFR є гефітиніб, ерлотиніб, вандетаніб (є також інгібітором VEGFR) і афатініб (є також інгібітором Her2). Іншим прикладом модулятора EGFR є злитий з токсином EGF. Іншими інгібіторами EGFR і / або Her2, які можна застосовувати в поєднанні з CD33зв'язуючим агентом, запропонованим у винаході, є лапатініб, трастузумаб, пертузумаб, XL 647, нератініб, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, МАт B-806, BMS 690514, JNJ-26483327, AEE-788 (є також інгібітором VEGFR), AZD-8931, ARRY-380 ARRY-333786, IMC-11F8, земаб, TAK-285, AZD-4769 і афатініб (подвійний інгібітор Her2 і EGFR). Інгібітори ДНК-полімерази, які можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являють собою Ara-C/цітарабін, клолар (Clolar) / клофарабін. Інгібітор ДНК-метилтрансферази, який можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являє собою вайдазу (Vidaza) / азацитидін. Індуктор апоптозу, який можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являє собою трісенокс (Trisenox) / триоксид миш'яку. Інгібітори топоізомерази II, які можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являють собою ідарубіцин, даунорубіцин і мітоксантрон. Антагоніст RAR, який можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являє собою Весаноїд (Vesanoid) / третиноїн. Інгібітор HGPRTази, який можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являє собою Mercapto / меркаптопурин. 15 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антагоніст H2-рецептора гістаміну, який можна застосовувати в поєднанні з CD33зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являє собою цеплен (Ceplene) / гістаміну дигідрохлорид. Агоніст CD25-рецептора, який можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом, що пропонується у винаході, являє собою IL-2. Додатковий лікарський засіб можна вибирати також з агентів, мішенню яких є IGF 1R та шляхи інсулінового рецептора. До таких агентів відносяться антитіла, які зв'язуються з IGF 1R (наприклад, CP-751871, AMG-479, IMC-A12, MK 0646, AVE 1642, R 1507, BIIB 022, SCH 717454, rhu Мат IGFR і нові хімічні субстанції, мішенню яких є кіназного домен IGF1-R (наприклад, OSI906 або BMS-554417, XL-228, BMS-754807). Інші агенти, які доцільно об'єднувати з терапією CD33-зв'язуючим агентом, запропонованим у винаході, є молекули, мішенню яких є CD20, в тому числі специфічні для CD20 антитіла, такі як ритуксимаб, LY-2469298, окрелізумаб, MEDI-552, IMMU-106, GA-101 (тобто R7159), XmAb0367, офатумумаб, мічені радіоактивним ізотопом антитіла до CD20 типу тосітумумабу і ібрітумомабу тіуксетана або інші білки, мішенню яких є CD20, типу SMIP Tru015, PRO-131921, FBT A05, велтузумаба, R-7159. CD33-зв'язуючі агенти можна об'єднувати з інгібіторами інших розташованих на поверхні антигенів, які експресуються на лейкоцитах, зокрема антитілами або що нагадують антитіла молекулами, наприклад, з антитілом до CD2 (сіплізумаб), антитілом до CD4 (занолімумаб), антитілом до CD19 (MT 103, MDX 1342, SAR-3419, XmAb-5574), антитілом до CD22 (епратузумаб), антитілом до CD23 (луміліксімаб), антитілом до CD30 (іратумумаб), антитілом до CD32B (MGA-321), антитілом до CD38 (HuMax-CD38), антитілом до CD40 (SGN40), антитілом до CD52 (алемтузумаб), антитілом до CD80 (галіксімаб). Інші агенти, які можна об'єднувати з CD33-зв'язуючими агентами, являють собою імунотоксинів, такі як BL 22 (імунотоксин до CD22), інотузумабу озогаміцин (кон'югат антитіло до CD23 - каліхеаміцин), RFT5.dgA (кон'югат А ланцюг токсину рицину - антитіло до CD25), SGN-35 (кон'югат антитіло до CD30 - аурістатін E) і гемтузумаба озогаміцін (кон'югат антитіло до CD33 каліхеаміцин), MDX-1411 (кон'югат антитіла до CD70) або мічені радіоактивним ізотопом антитіла типу 90Y-епратузумаб (радіоімунокон'югат антитіла до CD22). Крім того, CD33-зв'язуючі агенти можна об'єднувати з імуномодуляторами, агентами, наприклад, антитілами, що індукують апоптоз або модифікують шляхи трансдукції сигналів, такими як модулятори TRAIL-рецептора, наприклад, мапатумумаб (агоніст TRAIL-1-рецептора), лексатумумаб (агоніст TRAIL-2-рецептора), тігатузумаб, апомаб, AMG-951 і AMG-655; антитіло до HLA-DR (типу 1D09C3), антитіло до CD74, інгібітор ліганда фактора диференціювання остеокластів (типу деносумаба), антагоніст BAFF (типу AMG-623a) або агоніст Toll-подібного рецептора (наприклад, TLR 4 або TLR-9). Інші лікарські засоби, які можна застосовувати в поєднанні з CD33-зв'язуючими агентами, запропонованими в даному винаході, вибирають з групи, що включає (але не обмежуючись лише ними) гормони, аналоги гормонів і антигормональні засоби (наприклад, тамоксифен, тореміфен, ралоксіфен, фулвестрант, мегестрола ацетат, флутамід, нілутамід, бікалутамід, ципротерону ацетат, фінастерід, бусереліну ацетат, флудрокортизон, флуоксиместерон, медроксипрогестерон, гідроксипрогестерону капроат, діетілстілбестрол, тестостерону пропіонат, флуоксиместерон / його еквіваленти, остреотід, арзоксіфен, пасіреотід, вапреотід, адренокортикостероїдами / їх антагоністи, преднізон, дексаметазон, аміноглутетимід), інгібітори ароматази (наприклад, анастрозол, летрозол, ліарозол, ексеместан, атаместан, форместан), агоністи і антагоністи LHRH (наприклад, госерелін ацетат, леупролід, абарелікс, церторелікс, деслорелін, гістрелін, трипторелін), антіметаболіти (наприклад, антифолатів типу метотрексату, триметрексату, пеметрекседу, аналоги піримідину типу 5 фторурацилу, флуородезоксіурідіна, капецитабіну, децітабіна, неларабіну, 5-азацітідіна і гемцитабіну, аналоги пурину і аденозину, такі як меркаптопурин, тіогуанін, азатіоприн, кладрибін і пентостатином, цитарабін, флударабін, клофарабін); протипухлинні антибіотики (наприклад, антрацикліни, такі як доксорубіцин, даунорубіцин, епірубіцин та ідарубіцин, мітоміцин-C, блеоміцину дактіноміцін, плікаміцін, актиноміцин D, мітоксантрон, мітоксантронідарубіцін, піксантрон, стрептозоцином, афідіколін); похідні платини (наприклад, цисплатин, оксаліплатин, карбоплатин, лобаплатін, сатраплатін); алкілуючі засоби (наприклад, естрамустин, семустин, мехлоретамін, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазін, циклофосфамід, іфосфамід, гідроксисечовина, темозоломід, нітрозосечовини, такі як кармустин і ломустін, тіотепа); антімітотичні засоби (наприклад, алкалоїди барвінку типу вінбластину, віндесіна, винорелбина, вінфлуніна і вінкристину; і таксани, такі як паклітаксел, доцетаксел і їх препаративні форми, ларотаксел; сімотаксел і епотілони типу іксабепілона, патупілона, ZK-EPO); інгібітори топоізомерази (наприклад, 16 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епіподофіллотоксіни, такі як етопосід і етопофос, теніпосід, амсакрин, топотекан, іринотекан, баноксантрон, камптотецин) і хіміотерапевтичні агенти різного типу, такі як похідні ретиноєвої кислоти, аміфостин, анагрелід, інтерферон альфа, інтерферон бета, інтерферон гамма, інтерлейкін-2, прокарбазін, N-метилгідразін, мітотан і порфімер, бексаротен, целекоксиб, етиленимін / метілмеламін, тріетіленмеламін, тріетілентіофосфорамід, гексаметілмеламін, і ферменти, такі як L аспарагіназа, L-аргіназа, і метронідазол, місонідазол, десметілмісонідазол, пімонідазол, етанідазол, німоразол, RSU 1069, EO9, RB 6145, SR4233, нікотинамід, 5бромдезоксіурідіна, 5-йоддезоксіурідін, бромдезоксіцітідін, ерітрогідроксіноніладенін, антраценедіон, GRN 163L (конкурентний антагоніст матриці теломерази), SDX-101 (агоніст PPAR), талабостат (інгібітор DPP), фородезін (інгібітор PNP), атаціцепт (розчинний рецептор представників сімейства TNF BLyS і APRIL), агенти, нейтралізуючі TNF-альфа (енбрел, хуміра, ремікад), XL-844 (інгібітор CHK1 / 2), VNP-40101M (ДНК-алкілуючий агент), SPC-2996 (антисмисловий інгібітор bcl2), обатоклакс (інгібітор bcl2), ензастаурін (модулятор PKC-бета), воріністат (інгібітор HDAC), ромідепсін (інгібітор HDAC), AT-101 (інгібітор Bcl-2/Bcl-xL), плітидепсин (багатофункціональний депсіпептід), SL-11047 (модулятори метаболізму поліамінів). CD33-зв'язуючі агенти, пропоновані у винаході, можна застосовувати також у поєднанні з іншими шляхами лікування, включаючи хірургію, трансплантацію стволових клітин, променеву терапію, ендокринну терапію, лікування за допомогою модифікаторів біологічної відповіді, гіпертермію і кріотерапію, і з лікуванням за допомогою таких засобів, призначених для зниження яких побічних дій (наприклад, нудоти кошти), G-CSF, GM-CSF, фотосенсибілізуючі засоби, такі як похідні гематопорфірину, протофрін (Photofrin), похідні бензопорфіріну, Npe6, етіопорфірін олова, феоборід-a, бактеріохлорофіл-a, нафталоціаніни, фталоціанін, фталоціанін цинку. Фармацевтичні композиції і методи введення CD33-зв'язуючі агенти можуть перебувати у будь-якій формі, що забезпечує введення композиції пацієнтові. Наприклад, композиція може знаходитися у твердій або рідкій формі. Переважним шляхом введення є парентеральний, здійснюваний за допомогою інфузії або ін'єкції (внутрішньовенної, внутрішньом'язової, підшкірної, внутрішньоочеревинної, внутрішньошкірної), однак можна застосовувати також інші шляхи введення, наприклад, за допомогою інгаляції, трансдермальний, інтраназальний, транбуккальний, оральний шлях введення та введення в пухлину. Парентеральне введення включає підшкірні ін'єкції, методи внутрішньовенної, внутрішньом'язової, надчеревній ін'єкції або інфузії. Відповідно до одного з об'єктів винаходу композиції вводять парентерально. Згідно іншому об'єкту винаходу композиції вводять внутрішньовенно. Фармацевтичні композиції можна готувати у вигляді таких форм, які забезпечують біодоступність сполуки при введенні композиції пацієнтові. Композиції можуть мати форму однієї або декількох стандартних доз, як, наприклад, в тому випадку, коли сполука в аерозольній формі знаходиться в контейнері, який може містити велику кількість стандартних доз. Продукти, вживані для приготування фармацевтичної композиції, можуть бути нетоксичними в застосовуваних кількостях. Як має бути очевидно звичайному фахівцеві в даній галузі, оптимальна доза діючої речовини / діючих речовин у фармацевтичній композиції повинна залежати від ряду факторів. Відповідні чинники включають (але не обмежуючись лише ними) тип пацієнта (наприклад, чоловік), конкретну форму сполуки, шлях введення і застосовувану композицію. Фармацевтично прийнятний носій або наповнювач може складатися з (мікро) часток, в результаті чого композиції знаходяться, наприклад, у порошкоподібній формі. Носій (ї) може (уть) бути рідким (и), в результаті чого композиції являють собою, наприклад, призначену для ін'єкції рідину. Композиція може перебувати у формі рідини, наприклад, для парентеральної ін'єкції. У композицію, призначену для введення шляхом ін'єкції, можна включати також одну / один або кілька поверхнево-активних речовин, консервантів, змочувальних агентів, диспергуючих агентів, суспендуючих агентів, буферів, стабілізаторів і агентів що забезпечують ізотонічність. Рідкі композиції у вигляді розчинів, суспензій або інших подібних форм можуть включати також одну або декілька таких речовин: стерильні розріджувачі, такі як вода для ін'єкцій, соляний розчин, переважно фізіологічний соляний розчин, розчин Рінгера, ізотонічний хлорид натрію, нелеткі олії, такі як синтетичні моно-або дигліцериди, які можуть служити в якості розчинника або суспендуючого середовища, поліетиленгліколі, гліцерин, циклодекстрин, пропіленгліколь або інші розчинники; стабілізатори, такі як амінокислоти; поверхнево-активні речовини, такі як полісорбати; антибактеріальні агенти, такі як бензиловий спирт або 17 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метилпарабен; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або бісульфіт натрію; хелатуючі агенти, такі як етилендіамінтетраоцтова кислоти; буфери, такі як ацетати, цитрати або фосфати; та агенти для регулювання тонічності, такі як хлорид натрію або декстроза. Парентеральну композицію можна укладати в ампулу, одноразовий шприц або мультидозовий флакон зі скла, пластику або іншого матеріалу. Прикладом ад'юванта є фізіологічний соляний розчин. Призначена для ін'єкцій композиція переважно є стерильною. CD33-зв'язуючі агенти можуть перебувати також у висушеній формі (наприклад, отриманої за допомогою сушіння виморожуванням, сушіння розпиленням, комбінованого процесу сушіння розпиленням та сушіння виморожуванням, сушіння за допомогою околокритичних або суперкритичних газів, вакуумного сушіння, повітряної сушки), обложеної або кристалізованої або включеної в мікрокапсули формі, які отримують, наприклад, з використанням методів коацервації або міжфазної полімеризації з використанням, наприклад, гідроксиметилцелюлоза або желатину та полі (метилметакрилату) відповідно, в колоїдних системах для введення лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули), у формі макроемульсій або обложеної або іммобілізованій формі на носіях або поверхнях, наприклад, отриманої за допомогою pcmc-технології (покриті білком мікрокристали protein coated microcrystals). Зазначені методики описані в: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21-е вид., Під ред. Hendrickson R. Кількість композиції, що є ефективним щодо лікування конкретного порушення або стану, має залежати від природи порушення або стану, і його можна визначати за допомогою стандартних клінічних методик. Крім того, для полегшення визначення оптимальних діапазонів доз, необов'язково можна застосовувати аналізи in vitro або in vivo. Точна доза, в якій слід застосовувати композиції, повинна залежати також від шляху введення і серйозності захворювання або порушення, і рішення про її застосування повинно залежати від рекомендації практикуючого спеціаліста та обставин, пов'язаних з особливостями кожного пацієнта. Композиції містять в ефективній кількості лікарський (і) засіб (а) або агент (и), що дозволяють отримувати прийнятну дозу. Як правило, вказану кількість становить щонайменше приблизно 0,01 % лікарського засобу або агента в перерахунку на масу композиції. Коли композиція призначена для орального введення, то ця кількість може варіюватися в діапазоні від приблизно 0,1 % до приблизно 80 % у перерахунку на масу композиції. В одному з об'єктів винаходу оральні композиції можуть містити сполуку у кількості від приблизно 4 % до приблизно 50 % у перерахунку на масу композиції. Згідно іншому об'єкту винаходу композиції, запропоновані в даному винаході, готують таким чином, що парентеральна стандартна доза лікарського засобу містить сполуку у кількості від приблизно 0,01 до приблизно 2 мас. %. Призначена для внутрішньовенного введення композиція може містити від приблизно 1 до приблизно 50 мг лікарського засобу або агента на 1 кг ваги тіла пацієнта. В одному з об'єктів винаходу композиція може включати від приблизно 1, 1,5 або 2,5 до приблизно 50 мг лікарського засобу або агента на 1 кг ваги тіла пацієнта. У іншому об'єкті винаходу кількість, що вводиться, повинна знаходитися в діапазоні від приблизно 1, 1,5 або 2,5 до приблизно 25 мг лікарського засобу або агента / кг ваги тіла. У деяких варіантах здійснення винаходу доза, що вводиться пацієнтові, становить від менш ніж 0,1 мг / кг до приблизно 50 мг / кг ваги тіла пацієнта (для перетворення на мг/мм2 можна приймати, що BSA (область поверхні тіла) становить 1,8 м2 і вага тіла становить 80 кг). Як зазначено в даному описі, CD33-зв'язуючий агент можна вводити пацієнту внутрішньовенно або підшкірно згідно з графіком, який передбачає, наприклад, введення пацієнту щодня, щотижня, один раз на два тижні, один раз на три тижні або щомісяця. Наприклад, CD33-зв'язуючий агент можна вводити щотижня протягом 2-10 тижнів, як правило, 3-6 тижнів. У деяких варіантах здійснення винаходу схема застосування CD33-зв'язуючого агента забезпечує підтримання концентрації антитіла в сироватці крові, становить щонайменше 5 мкг / мл або щонайменше 10 мкг / мл протягом циклу введення доз. CD33-зв'язуючий агент можна вводити, наприклад, протягом 1-8 або більшої кількості циклів. У деяких варіантах здійснення винаходу CD33-зв'язуючий агент вводять індивідууму постійно. Наприклад, винахід включає спосіб лікування раку, такого як мієлоїдний лейкоз, що полягає в тому, що щотижня вводять в кількості від 0,1 до 50 мг / кг, наприклад, приблизно 1,5 8 або 2,58 мг / кг, антитіла до CD33, пропонованого у винаході. Таке лікування можна, як правило, можна продовжувати протягом приблизно 1-3 місяців, як правило, приблизно двох місяців. В одному з варіантів здійснення винаходу схему застосування лікарського засобу зберігають аж до виявлення зменшеного рівня бластних клітин. Наприклад, дозування можна продовжувати аж до приблизно 6 місяців. Після зазначеного лікування можна використовувати схему з менш частим дозуванням, яка включає, наприклад, введення один раз на 2 тижні (або двічі на місяць). 18 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таку схему застосування можна підтримувати протягом 1, 2, 3, 4, 5, 6 місяців або більше для підтримки зниження кількості бластних клітин і / або ремісії. У деяких варіантах здійснення винаходу для мінімізації інфузійних реакцій можна застосовувати профілактичний засіб у поєднанні з CD33-зв'язуючим агентом. Прийнятні профілактичні засоби включають, наприклад, метилпреднізолон, діфенілдрамін, ацетамінофен або інший прийнятний засіб. Профілактичний засіб можна вводити до або приблизно одночасно з CD33-зв'язуючим агентом. Лікарський (і) засіб (и) або агент (и), або композиції можна вводити будь-яким загальноприйнятим шляхом, наприклад, за допомогою інфузії або болюсної ін'єкції, за допомогою абсорбції через епітеліальні або слизово-шкірні вистилки (наприклад, через слизову порожнини рота, слизову прямої кишки і кишечника тощо). Введення може бути системним або місцевим. Відомі різні системи для введення, наприклад, капсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, капсули і т.д., і їх можна застосовувати для введення сполуки. У деяких варіантах здійснення винаходу пацієнту можна вводити більше одного лікарського засобу або агента або більше однієї композиції. Може виявитися бажаним застосовувати більше одного лікарського засобу або агента або більше однієї композиції місцево шляхом введення в область, що підлягає лікуванню, якщо це можливо для лікарського засобу або агента. Цієї мети можна досягати, наприклад (але не обмежуючись лише ними), за допомогою місцевої інфузії в процесі хірургічного втручання; місцевого нанесення, наприклад, у поєднанні з перев'язування рани після хірургічного втручання; шляхом ін'єкції; за допомогою катетера; за допомогою супозиторія; або з допомогою імплантату, при цьому імплантат може бути виготовлений з пористого, непористого або гелеподібного матеріалу, включаючи мембрани, такі як сіаластичні мембрани або волокна. В одному з варіантів здійснення винаходу введення можна здійснювати шляхом безпосередньої ін'єкції в область (або колишню область) раку, пухлини або в неопластичних або переднеопластичну тканину. Лікарський (і) засіб (и) або агент (и), або композиції можна вводити за допомогою системи з контрольованим вивільненням, такий як насос або різні полімерні матеріали. Згідно ще одному варіанту здійснення винаходу систему з контрольованим вивільненням можна поміщати в околиці мішені лікарського (их) засобу (ів) або агента (ів), або композицій, для чого потрібно використовувати тільки частина системної дози (див., наприклад, Goodson, в: Medical Applications of Controlled Release, т. 2, 1984, сс. 115138). Можна застосовувати інші системи з контрольованим вивільненням, обговорення яких представлено в огляді Langer (Science 249, 1990, сс. 1527-1533). Лікарські засоби або агенти включають в препаративні форми відповідно до загальноприйнятих процедур з отриманням фармацевтичної композиції, адаптованої для внутрішньовенного введення тваринам, перш за все людині, придатної для лікарського засобу або агента. Як правило, носії або наповнювачі для внутрішньовенного введення являють собою стерильні ізотонічні водні буферні розчини. При необхідності композиції можуть включати також солюбілізуючий агент. Композиції для внутрішньовенного введення можуть необов'язково містити місцевий анестетик, такий як лігнокаін, для зменшення болю в області ін'єкції. Як правило, інгредієнти застосовують або окремо, або їх змішують разом в стандартній лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого порошку або безводного концентрату в герметично закритому контейнері, такому як ампула або саше, вказуючи кількість діючої речовини. Коли лікарський засіб або агент підлягає введенню шляхом інфузії, його можна поміщати, наприклад, в інфузійний флакон, що містить стерильну воду або соляний розчин фармацевтичного ступеня чистоти. Коли лікарський засіб або агент вводять шляхом ін'єкції, то можна застосовувати ампулу зі стерильною водою для ін'єкцій або соляним розчином, з якими можна змішувати інгредієнти перед введенням. Композиції терапевтичних агентів можна застосовувати також у вигляді прийнятних лікарських форм, наприклад, у вигляді таблеток, коржиків, водних або масляних суспензій, гранул, порошків, емульсій, капсул, сиропів або еліксирів. Композиції, що підлягають оральному введенню можуть містити один або кілька необов'язкових агентів, наприклад, підсолоджувальних речовин, таких як фруктоза, аспартам або сахарин; коргіентів, таких як олія м'яти перцевої, олія грушанки або вишневу отдушку; барвників та консервантів для отримання фармацевтичного препарату, що має приємний смак. Крім того, на композицію, якщо вона має форму таблетки або пігулки, можна наносити покриття для уповільнення руйнування і абсорбції в шлунково-кишковому тракті, що забезпечує тривалу дію протягом подовженого періоду часу. Для впроваджуваних оральним шляхом лікарських засобів або агентів можна застосовувати також такі, що володіють виборчою проникністю мембрани, що оточують осмотично активну 19 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 таку, що забезпечує введення, сполуку. У цих зазначених останніх платформах рідина з середовища, що оточує капсулу, всмоктується сполукою, що забезпечує введення, що набухає, витісняючи агент або включає агент композицію з отвору. Ці платформи для введення можуть забезпечувати практично нульовий профіль введення на відміну від гострих профілів, характерних для препаративних форм, з яких відбувається негайне вивільнення. Можна застосовувати також уповільнюючий вивільнення матеріал, такий як гліцеролмоностеарат або гліцеролстеарат. Композиція може включати різні матеріали, які модифікують фізичну форму твердої або рідкої стандартної дози. Наприклад, композиція може включати матеріали, які формують покриваючу оболонку навколо діючих речовин. Матеріали, які утворюють покриваючу оболонку, як правило, є інертними і їх можна вибирати, наприклад, з цукру, шелаку та інших агентів для ентеросолюбільних покриттів. В альтернативному варіанті діючі речовини можна включати в желатинову капсулу. Композиції можна вводити пацієнту, який потребує цього, з частотою або протягом періоду часу, який визначається лікуючим лікарем. Композиції можна вводити протягом періоду, що становить 1 день, 2 дні, 3 дні, 5 днів, 7 днів, 10 днів, 14 днів, 21 день, 28 днів, один місяць, два місяці або протягом більш тривалих періодів часу. Повинно бути очевидно, що композиції можна вводити протягом будь-якого періоду часу, тривалістю від 1 дня і до двох або більше місяців. Отримання антитіл Антитіла можна отримувати за допомогою будь-якого методу, придатного для синтезу антитіл, такого, зокрема, як рекомбінантна експресія або хімічний синтез. Рекомбінантна експресія антитіл або їх фрагментів або похідних, як правило, включає конструювання нуклеїнових кислот, які кодують антитіло. Якщо нуклеотидна послідовність є відомою, то нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло або його поліпептид, можна збирати з хімічно синтезованих олігонуклеотидів (наприклад, згідно з методом, описаним у Kutmeier та ін, BioTechniques 17, 1994, с. 242), що включає синтез перекривних олігонуклеотидів, що містять ділянки послідовності, що кодує антитіло, "віджиг" і лігування цих олігонуклеотидів і подальшу ампліфікацію лігованих олігонуклеотидів, наприклад, за допомогою ПЛР. В альтернативному варіанті молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його поліпептид, можна отримувати з прийнятного джерела. Якщо клон, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує конкретне антитіло, не є доступним, але послідовність антитіла є відомою, то нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, можна отримувати з прийнятного джерела (наприклад, бібліотеки кДНК антитіла або бібліотеки кДНК, створеної з будь-яких тканин або клітин, експресуючих імуноглобулін) за допомогою, наприклад, ПЛР-ампліфікації з використанням синтетичних праймерів, які можуть гібридизуватися з 3'-і 5'-кінцями послідовності, або шляхом клонування з використанням олігонуклеотидного зонда, специфічного щодо конкретної генної послідовності. Якщо антитіло, яке специфічно розпізнає конкретний антиген, не надходить у продаж (або не доступне джерело кДНК-бібліотеки, призначеної для клонування нуклеїнової кислоти, що кодує зазначений імуноглобулін), то антитіла, специфічні щодо конкретної антигену, можна створювати за допомогою будь-якого методу, відомого в даній області, наприклад, шляхом імунізації пацієнта або з використанням прийнятною тваринної моделі, такої як кролик або миша, для створення поліклональних антитіл, або більш переважно шляхом створення моноклональних антитіл, наприклад, згідно з методом, описаним у Kohler і Milstein (Nature 256, 1975, сс. 495-497), або описаному у Kozbor та ін, (Immunology Today 4, 1983, с. 72), або у Cole та ін, (в: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, вид-во Alan R. Liss, Inc., 1985, сс. 77-96). В альтернативному варіанті клон, який кодує щонайменше Fab-фрагмент антитіла, можна отримувати шляхом скринінгу експресуючих Fab бібліотек (наприклад, згідно з методом, описаним у Huse та ін, Science 246, 1989, сс. 1275-1281) щодо клонів Fab-фрагментів, які зв'язуються зі специфічним антигеном, або шляхом скринінгу бібліотек антитіл (див., наприклад, Clackson та ін, Nature 352, 1991, с. 624; Hane та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, с. 4937). Після того, як отримана послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше варіабельний домен антитіла, її можна інтродуціювати в вектор, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує константні області антитіла (див., наприклад, публікації міжнародних заявок на патент WO 86/05807; WO 89 / 01036 і US 5122464). Вектори, що містять повний легкий або важкий ланцюг, які забезпечують експресію повної молекули антитіла, є доступними. Потім нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, можна застосовувати для інтродукції нуклеотидної (их) заміни (н) або делеції (ий), необхідних для заміни (або делеції) одного або декількох залишків цистеїну варіабельної області, який (і) приймає (ють) участь в утворенні всередині ланцюга 20 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дисульфідного містка між амінокислотним залишком, який не містить сульфгідрильні групи. Такі модифікації можна здійснювати за допомогою будь-якого відомого в даній області методу інтродукції специфічних мутацій або делецій в нуклеотидну послідовність, такого, наприклад, як (але не обмежуючись лише ними) хімічний мутагенез і сайтнаправленний мутагенез in vitro (див., наприклад, Hutchinson та ін., J. Biol. Chem. 253, 1978, с. 6551). Крім того, розроблено методики для отримання "химерних антитіл" (див., наприклад, Morrison та ін, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 851855; Neuberger та ін, Nature 312, 1984, сс. 604-608; Takeda та ін, Nature 314, 1985, сс. 452-454). Химерне антитіло являє собою молекулу, в якій різні ділянки виводять з різних видів тварин, наприклад, воно має варіабельну область, виведену з мишачого моноклонального антитіла, і константну область людського імуноглобуліну, наприклад, являє собою гуманізоване антитіло. Після того, як отримана послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, можна отримувати вектор для виробництва антитіла за допомогою технології рекомбінантної ДНК з використанням методик, відомих в даній області. Для конструювання експресійних векторів, що містять кодують послідовності антитіла і відповідні контролюючі транскрипцію і трансляцію сигнали, можна застосовувати методи, відомі фахівцям в даній області. Ці методи включають, наприклад, технології рекомбінантної ДНК in vitro, методи синтезу і генетичну рекомбінацію in vivo (див., наприклад, методи, описані у Sambrook та ін, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2-е вид., Вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1990; та Sambrook та ін, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3-е вид., Вид-во Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, NY, 2001; і в: Current Protocols in Molecular Biology, під ред. Ausubel та ін, вид-во John Wiley & Sons, N.Y., 1993-2006). Експресійний вектор, що містить нуклеотидну послідовність антитіла, або нуклеотидну послідовність антитіла можна переносити в клітину-хазяїна за допомогою загальноприйнятих методів (наприклад, шляхом електропорації, ліпосомної трансфекції, осадження фосфатом кальцію або трансдукції), і що утворилися клітини потім культивувати загальноприйнятими методами для отримання антитіл. У конкретних варіантах здійснення винаходу експресію антитіла регулюють з використанням конститутивного, індуцибельного або тканиноспецифічного промотора. Клітини-господарі, застосовувані для експресії рекомбінантного антитіла, можуть являти собою або бактеріальні клітини, такі як Escherichia coli, або переважно еукаріотичні клітини, насамперед для експресії рекомбінантних молекул імуноглобулінів. Зокрема, клітини ссавців, такі як клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO), у поєднанні з вектором, що містить основний проміжний ранній генний промотор людського цитомегаловірусу, являють собою ефективну експресійну систему для імуноглобулінів (див., наприклад, Foecking та ін, Gene 45, 1986, с.101; Cockett та ін, BioTechnology 8, 1990, с. 2). Клітинна лінія CHO може являти собою, наприклад, DG44 або CHO-S. Іншим прикладом системи, за допомогою якої можна експресувати антитіло, є система CHEF (див., наприклад, U.S. 5888809.) Для експресії антитіл можна застосовувати ряд інших систем господар-експресійний вектор. Зазначені системи господар-експресійний вектор представляють собою носії, за допомогою яких кодують послідовності антитіла можна отримувати і потім очищати, але вони являють собою також клітини, які можуть після трансформації або трансфекції відповідними нуклеотидними такими, що кодують послідовностями, екпресувати in situ молекулу антитіла у вигляді конкретного імуноглобуліну. Вони включають (але не обмежуючись лише ними) мікроорганізми, такі як бактерії (наприклад, E. coli і B. subtilis), трансформовані експресійними векторами на основі рекомбінантного ДНК-бактеріофагу, плазмідної ДНК або космідної ДНК, які містять кодуючі послідовності імуноглобулінів; дріжджі (наприклад, Saccharomyces pichia), трансформовані рекомбінантними дріжджовими експресійними векторами, несучими кодуючі послідовності антитіл; системи на основі клітин комах, інфікованих вірусними експресійними векторами (наприклад, бакуловірусної), що містять кодуючі послідовності імуноглобулінів; системи на основі клітин рослин, інфікованих рекомбінантними вірусними експресійними векторами (наприклад, на основі вірусу мозаїки кольорової капусти (CaMV) і вірусу мозаїки тютюну (TMV)), або трансформовані рекомбінантними плазмідними експресійними векторами (наприклад, на основі Ti-плазмід), що містять кодуючі послідовності антитіл; або системи на основі клітин ссавців (наприклад, клітин COS, CHO, CHO-S, BH, 293, 293T або 3T3), несучих рекомбінантні експресійної конструкції, які містять промотори, виведені з генома клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу; 7,5 K-промотор вірусу коров'ячої віспи). Для застосування в бактеріальних системах можна вибирати цілий ряд бажаних експресійних векторів залежно від передбачуваного застосування експресуємого антитіла. 21 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, коли потрібно отримувати велику кількість зазначеного білка, то може виявитися бажаним застосовувати вектори, які забезпечують високі рівні експресії злитих білкових продуктів, що легко піддаються очищенню. Такі вектори включають (але не обмежуючись лише ними) експресійний вектор E. coli pUR278 (Ruther та ін, EMBO J. 2, 1983, сс. 1791-1794), в яких кодуюча послідовність антитіла можна індивідуально вбудовувати шляхом лігування у вектор в рамці зчитування із кодуючою областю lac Z з отриманням злитого білка; вектори pIN (Inouye і Inouye, Nucleic Acids Res. 13, 1985, сс. 3101-3109; Van Heeke і Schuster, J. Biol. Chem. 24, 1989, сс. 5503-5509) і т.п. Можна застосовувати також вектори pGEX для експресії чужорідних поліпептидів у вигляді білків, злитих з глутатіон-S-трансферази (GST). У цілому, зазначені злиті білки є розчинними і їх легко можна очищати з лізованих клітин шляхом адсорбції та зв'язування з агарозном гранулами з глутатіоновим матриксом з подальшою елюцією у присутності вільного глутатіону. Вектори pGEX створюють так, щоб вони включали сайти протеазного розщеплення тромбіну або фактору Xa, так, щоб клонований цільовий генний продукт можна було вивільняти з GST-фрагмента. У системах на основі комах в якості вектора для експресії чужорідних генів можна застосовувати вірус ядерного поліедроза каліфорнійської совки Autographa californica (AcNPV) або аналогічний вірус з Drosophila melanogaster. Вірус вирощують в клітинах Spodopiera frugipenta. Кодуючу послідовність антитіла можна клонувати індивідуально в таких, що не мають вирішального значення областях (наприклад, в гені поліедріну) вірусу і поміщати під контроль промотору AcNPV (наприклад, промотора поліедріну). У клітинах-господарях ссавців можна застосовувати ряд експресійних систем на основі вірусів. У випадках, коли в якості експресійного вектора застосовують аденовірус, що представляє інтерес кодуючу послідовність антитіла можна вбудовувати шляхом лігування в аденовірусний контролюючий транскрипцію / трансляцію комплекс, наприклад, пізній промотор і троїсту лідерну послідовність. Цей химерний ген потім можна вбудовувати в геном аденовірусу за допомогою рекомбінації in vitro або in vivo. Вбудовування в таку, що не має вирішального значення область вірусного генома (наприклад, E1 або E3) призводить до створення рекомбінантного вірусу, який є життєздатним і має здатність експресувати молекулу імуноглобуліну в інфікованих господарях (див., наприклад, Logan і Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 355-359). Для ефективної трансляції вбудованих кодуючих послідовностей антитіл можуть вимагатися також специфічні ініціюючі сигнали. Ці сигнали включають кодон ініціації ATG і примикаючі послідовності. Крім того, кодон ініціації функціонально пов'язують з рамкою зчитування необхідної послідовності, що кодує для гарантії трансляції повної вставки. Ці екзогенні контролюючі трансляцію сигнали і кодони ініціації можуть мати різне походження, являти собою як такі, що зустрічаються в природних умовах, так і синтетичні елементи. Ефективність експресії можна підвищувати шляхом включення відповідних елементів, що представляють собою енхансери транскрипції, термінатори транскрипції і т.д. (див., наприклад, Bittner та ін., Methods in Enzymol. 153, 1987, сс. 51-544). Крім того, можна вибирати штам клітин-хазяїв так, щоб модулювати експресію вбудованих послідовностей або модифікувати та процесувати генний продукт конкретним потрібним чином. Зазначені модифікації (наприклад, глікозилювання) і процесинг (наприклад, розщеплення) білкових продуктів може бути важливим для функції білка. Різні клітини-господарі мають характеристики і специфічні механізми для пост-трансляційного процесингу і модифікації білків і генних продуктів. Відповідні клітинні лінії або системи-господарі можна вибрати для гарантії правильної модифікації і процесингу чужорідного експресуємого білка. Для цієї мети можна використовувати еукаріотичні клітини-господарі, які мають клітинний механізм для необхідного процесингу первинного транскрипту, глікозилювання і фосфорилювання генного продукту. Зазначені клітини-хазяї ссавців включають (але не обмежуючись лише ними) CHO (наприклад, DG44 або CHO-S), VERY, BH, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D, CRL7030 і Hs578Bst. Для довготривалого виробництва з високим виходом рекомбінантних білків кращою є стабільна експресія. Наприклад, можна створювати клітинні лінії, які стабільно експресують антитіло. Замість застосування експресійних векторів, які містять вірусні сайти ініціації реплікації, можна використовувати клітини-хазяї, які трансформують ДНК під контролем відповідних контролюючих експресію елементів (наприклад, промоторні, енхансерні послідовності, термінатори транскрипції, сайти поліаденілювання і т.д.), і використовувати селектуємий маркер. Після інтродукції чужорідної ДНК сконструйованим клітинам можна давати рости протягом 1-2 днів у збагачених середовищах, а потім пересівати в селективні середовища. Селектуємий маркер в рекомбінантній плазміді надає стійкість до фактору селекції і дозволяє клітинам стабільно інтегрувати плазміду в їх хромосоми і рости з утворенням 22 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 осередків, які, у свою чергу, можна клонувати і розмножувати з отриманням клітинних ліній. Цей метод можна з успіхом застосовувати для створення клітинних ліній, що експресують антитіло. Зазначені сконструйовані клітинні лінії можуть бути особливо цінними для скринінгу і оцінки пухлинних антигенів, які взаємодіють безпосередньо чи опосередковано з антитілом. Для селекції можна застосовувати цілий ряд систем. Наприклад, можна застосовувати гени тимідинкінази вірусу герпесу простого (див., наприклад, Wigler та ін, Cell 11, 1977, с. 223), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (див., наприклад, Szybalska і Szybalski, Proc. Natl Acad. Sci. USA 48, 1992, с. 202) і аденинфосфорибозилтрансферазы (див., наприклад, Lowy та ін, Cell 22, 1980, с. 817) у tk -, hgprt - або aprt - клітинах відповідно. Крім того, можна використовувати стійкість до метаболитам в якості основи для селекції наступних генів: DHFR, який надає стійкість до метотрексату (див., наприклад, Wigler та ін., Proc. Natl. Acad Sci. USA 77, 1980, сс. 3567-3570; O'Hare та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1981, сс. 1527-1531); gpt, який надає стійкість до мікофенолової кислоти (див., наприклад, Mulligan і Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1981, сс. 2072-2076); neo, який надає стійкість до аміноглікозидів G-418 (див., наприклад, Clinical Pharmacy 12, сс. 488-505; Wu і Wu, Biotherapy 3, 1991, сс. 87-95; Tolstoshev, Arm. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32, 1993, сс. 573-596; Mulligan, Science 260, 1993, сс. 926-932; Morgan і Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62, 1993, сс. 191217; та May, TIB TECH 11 (5), 1993, сс. 155-215) і hygro, який надає стійкість до гігроміціну (див., наприклад, Santerre та ін, Gene 30, 1984, сс. 147-150). Загальноприйняті в даній галузі методи на основі технології рекомбінантної ДНК, які можна використовувати, описані в: Current Protocols in Molecular Biology, під ред. Ausubel та ін, вид-во John Wiley & Sons, NY, 1993-2006; у Kriegler, Gene Transfer and Expression. A laboratory Manual, вид-во Stockton Press, NY, 1990 і в главах 12 і 13 в: Current Protocols in Human Genetics, під ред. Dracopoli та ін,вид-во, John Wiley & Sons, NY, 1994, і у ColberreGarapin та ін, Mol. Biol. 150, 7, 1981, сс. 1-14). Рівні експресії антитіла можна підвищувати шляхом ампліфікації вектора (див. огляд Bebbington і Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", т. 3., Вид-во Academic Press, New York, 1987). Коли маркер у векторній системі, що експресує антитіло, є ампліфікованим, то підвищення рівня інгібітора, присутнього в культурі клітини-хазяїна, повинно приводити до збільшення числа копій маркерного гена. Оскільки область що ампліфікується асоційована з нуклеотидною послідовністю антитіла, то виробництво антитіла також має збільшуватися (див., наприклад, Crouse та ін., Mol. Cell. Biol. 3, 1983, сс. 257-266). Клітину-хазяїна можна контрасфектувати двома експресійними векторами, при цьому перший вектор кодує виведений з важкого ланцюга поліпептид, а другий вектор кодує виведений з легкого ланцюга поліпептид. Два вектора можуть містити однакові або різні маркери що селектуються, які дають можливість експресувати в еквівалентних кількостях поліпептиди важкого і легкого ланцюгів. В альтернативному варіанті можна застосовувати один вектор, для того, щоб кодувати поліпептиди важкого і легкого ланцюгів. У таких ситуаціях легкий ланцюг, як правило, поміщають перед важким ланцюгом для того, щоб уникнути надмірної токсичності вільної важкого ланцюга (див., наприклад, Proudfoot, Nature 322, 1986, сс. 562-565; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, сс. 2197-2199). Кодуючі послідовності важкого і легкого ланцюгів можуть містити кДНК або геномну ДНК. Після рекомбінантної експресії антитіла його можна очищати за допомогою будь-якого прийнятного методу очищення антитіла, наприклад, шляхом хроматографії (наприклад, іонообмінної, афінної, зокрема на основі афінності до специфічного антигену після здійснення іммобілізації на білку A і колонкової гель-фільтрації), центрифугування, на основі різної розчинності або за допомогою будь-якої іншої стандартної методики очищення білків. Вичерпний опис всіх стадій, застосовуваних для отримання моноклональних антитіл, пропонованих в даному винаході, представлено у Yokoyama та ін, "Production of Monoclonal Antibodies", Current Protocols in Immunology, частина 2.5, 2006. Приклади Приклад 1: Афінність до CD33 Афінності CD33-зв'язуючих агентів як до CD33 людини, так і CD33 мавп ціномолгус, характеризуються величинами KD, складовими 10нMабо менш, на клітинних лініях HL60 і HEK293-ціномолгусCD33 відповідно. Чотирнадцять CD33-зв'язуючих агентів (повністю людські моноклональні антитіла, перераховані в таблиці під № № 1-14 відповідно) до CD33 людини і мавп ціномолгус оцінювали з використанням аналізу Скетчарда для обробки результатів, отриманих за допомогою FACS, згідно з методом, який описаний у Brockhoff і ін, Cytometry, 17 (1) 1 вересня 1994 р., сс. 75-83), на експресуючих CD33 клітинах (виведена з ГМЛ клітинна лінія HL60, рекомбінантна клітинна 23 UA 112062 C2 5 10 15 лінія HEK293-ціномолгусCD33). У цілому, метод полягав у наступному: наготовлювали розведення CD33-зв'язуючого агента для дослідження в 96-лунковому планшеті, починаючи з концентрації 100-400нм в першій лунці (80 мкл), після чого здійснювали наступні 11 стадій розведення (1:2, 40+40 мкл). У пробірки для FACS-аналізу додавали по 50 мкл розведень CD33зв'язуючого агента, в кожну пробірку для FACS-аналізу додавали по 150 мкл клітин 6 5 (0,8×10 /мл=1,2×10 клітин/пробірку). Клітини обережно перемішували і інкубували протягом 1 год. на льоду. Потім додавали 50 мкл кон'югованого з ФІТЦ вторинного антитіла (концентрація 15 мкг / мл; мишаче МАт до людського IgG), перемішували і інкубували протягом 30 хв на льоду. Потім додавали 4 мл ЗФР, рН 7,2, що містить 0,02 % кислоти, клітини пеллетували і ресуспендували в 300 мкл ЗФР, pH 7,2, після чого піддавали FACS-аналізу з використанням пристрою BD FACS Canto. Всі стадії експериментів здійснювали на вологому льоду, всі розведення CD33-зв'язуючих агентів наготовлювали в ЗФР / 0,5 % БСА + 0,02 % кислоти. Для калібрування FACS використовували гранули Quantum FITC MESF (Premix) (фірма Bangs Laboratories). Кількісну оцінку всіх зразків здійснювали з використанням однакових параметрів FACS. Співвідношення пов'язаного IgG і вільного IgG розраховували на основі величин MFI (середня інтенсивність флуоресценції) при різних концентраціях CD33-зв'язуючих агентів і представляли у вигляді графіка Скетчарда. На основі отриманих даних будували лінію регресії, кут нахилу цієї лінії відповідав від'ємному значенню константи асоціації. Результати представлені в таблиці 2. 20 Таблиця 2 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 25 30 35 Клон ID № 280-03-08 280-21-09 280-29-12 280-31-01 280-31-01(mut) 280-34-02 280-50-01 280-50-01(mut) 280-61-07 283-03-03 283-05-01 283-07-03 283-11-03 283-14-01 Людський CD33 KD (нM) 0,3 0,4 0,5 0,4 1 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,2 0,3 0,3 3,2 CD33 мавпа циномолгус KD (нM) 0,03 0,3 0,6 0,3 0,5 0,5 0,5 1,7 0,4 1,9 1,1 2,1 0,6 2,3 Приклад 2: Кінетика інтерналізації Поняття "інтерналізація" антитіла належить до зниження кількості комплексів антитіло / антиген на клітинній поверхні клітини-мішені після інкубації з антитілом. Аналізи інтерналізації здійснювали з використанням що експресує CD33 клітинної лінії HL60. Клітини інкубували з фіксованою кількістю CD33-зв'язуючого агента (10 мкг / мл повністю людських моноклональних антитіл, перерахованих у таблиці 1 під № № 1-14), протягом певних періодів часу (0 год., 1 год., 4 год., 24 год.) при 37° C, даючи здійснитися інтерналізації комплексу антитіло / антиген. У зазначені моменти часу в інкубаційну суміш додавали кислоту для запобігання подальшій інтерналізації. Після цього додавали фіксовану кількість CD33-зв'язуючого агента для насичення всіх антигенних сайтів CD33 на клітинній поверхні. Загальну кількість CD33зв'язуючого агента, пов'язаного з клітинною поверхнею, визначали за допомогою FACS-аналізу, використовуючи кон'юговане з ФІТЦ вторинне антитіло до людського IgG. Момент часу 0 год. використовували для визначення початкового рівня комплексів антитіло до CD33/антиген і приймали його за 100 %. Результати представлені на фіг. 3 та проілюстровані на фіг. 1-3. 24 UA 112062 C2 Таблиця 3 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 10 15 20 25 30 35 40 Клон ID № 280-03-08 280-21-09 280-29-12 280-31-01 280-31-01(mut) 280-34-02 280-50-01 280-50-01(mut) 280-61-07 283-03-03 283-05-01 283-07-03 283-11-03 283-14-01 Такі, що залишилися на поверхні клітин комплекси антитіло до CD33/антиген після інкубації з антитілом протягом 4 год. (%) 49 41 49 44 52 44 53 55 47 45 51 48 46 47 Лінтузумаб застосовували в якості референс-антитіла. Комплекси лінтузумаб/CD33 швидко інтерналізувались після зв'язування лінтузумаба, що відповідало опублікованими даними. Після 4-годинного періоду інкубації на клітинній поверхні залишалося тільки приблизно 20 % початкової кількості комплексів CD33/лінтузумаб. При створенні винаходу неочікувано було встановлено, що інтерналізація всіх 14 CD33-зв'язуючих агентів, пропонованих в даному винаході, виявилася сповільненою порівняно з лінтузумабом. Приклад 3: ADCC-активність Уповільнена швидкість інтерналізації обумовлює підвищену ADCC-активність in vitro. Для оцінки впливу сповільненої інтерналізації на ADCC-активність CD33-зв'язуючих агентів (повністю людських моноклональних антитіл, перерахованих у таблиці 1 під № № 14 січня) клітини-мішені (HL60) інкубували з CD33-зв'язуючим агентів протягом 0, 1, 4 і 24 г. Потім здійснювали аналіз ADCC-активності з використанням стимульованих IL-2 PBMC в якості ефекторних клітин і сенсибілізованих антитілом HL60-клітин в якості клітин-мішеней. У всіх експериментах застосовували МАт в концентрації 30 мкг / мл. Спільне культивування ефекторних клітин і клітин-мішеней у присутності CD33-зв'язуючого агента здійснювали в чотирьох або трьох повторно в 96-лункових круглодонних титраційних мікропланшетах, використовуючи кінцевий об'єм 200 мкл / лунку середовища аналізу, що містить 10 % людської сироватки і 1 % БСА в RPMI в співвідношенні 1:1. Спочатку висівали ефекторні клітини (свіжовиділені PBMC-клітини в 100 мкл 10 % людської сироватки в RPMI на лунку), після чого вносили клітини-мішені і розчин CD33-зв'язуючого агента (розведений в 50 мкл 1 % БСА в RPMI). В якості контролю ефекторні клітини культивували тільки в середовищі для аналізу (контроль ефекторних клітин), а клітини-мішені культивували або тільки в середовищі для аналізу (спонтанний лізис), або в середовищі для аналізу, доповненому 1 % Тритон X-100 (максимальний лізис). Спільну культуру інкубували при 37° C у вологому CO2-інкубаторі протягом 3 г. Наприкінці періоду інкубації клітини видаляли із культурального середовища шляхом центрифугування (200 × g, тобто 1000 об / хв; 10 хв) при кімнатній температурі. Безклітинні супернатанти (100 мкл / лунку) переносили у відповідні лунки 96-лункового плоскодонного планшета. Для визначення LDH-активності (лактатдегідрогеназної активності) у ці супернатанти додавали по 100 мкл реакційної суміші (свіжоперемішаний розчин, що містить 250 мкл каталізатору і 11,25 мл барвника) у кожну лунку і інкубували протягом 30 хв при кімнатній температурі в темряві. Потім вимірювали абсорбцію відповідно до описаного нижче методу. Для вимірювання ADCC-активності застосовували набір для визначення цитотоксичності (Cytotoxicity Detection Kit) (LDH; фірма Roche, 11644793001). Виявлення цитотоксичності засноване на вимірюванні активності ферменту LDH, вивільненого з клітин з ушкодженою плазматичною мембраною. Вивільнена в клітинні супернатанти LDH відновлювала сіль тетразолію з набору з утворенням формазану. Вимірювали максимальну абсорбцію формазанового барвника при 490 нм відносно абсорбції при довжині референс-хвилі 650 нм з використанням планшет-рідеру для ELISA. Для визначення відсотка клітинозалежної 25 UA 112062 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 токсичності розраховували середню абсорбцію для чотирьох або трьох повторностей і вичитали фоновий рівень. Ці скориговані величини підставляли в наступне рівняння для розрахунку ADCC (%): (суміш ефекторних клітин / клітин-мішеней - контроль ефекторних клітин - спонтанне вивільнення), поділений на (максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення). ADCC-активність в момент часу 0 год. (без попередньої інкубації клітин-мішеней з антитілом) приймали за 100 % ADCC-активності. ADCC-активність в різні моменти часу після попередньої інкубації з антитілом розраховували щодо активності в момент часу 0 год. і виражали в вигляді відносної цитотоксичності (%). Уповільнена інтерналізація CD33-зв'язуючих агентів в порівнянні з лінтузумабом приводила до підвищеної ADCC-активності в порівнянні з лінтузумабом. Зроблено висновок про те, що уповільнена інтерналізація призводить до підвищеної ADCC-активності. Інтерналізація описаних CD33-зв'язуючих агентів перебувала в зворотній кореляції з ADCC-активністю CD33-зв'язуючих агентів, що свідчить про переваги зазначених CD33-зв'язуючих агентів з точки зору клінічної активності. На фіг. 4 продемонстровані результати цих експериментів, що стосуються кінетики інтерналізації, а на фіг. 5 - що стосуються ADCC-активності. Приклад 4: Епітопне картування Зв'язування з епітопами CD33-зв'язуючих агентів, представлених у даному описі, у порівнянні з епітопом лінтузумаба визначали за допомогою мас-спектрометрії дейтеріюводневого обміну (HXMS). Цей метод дозволяє визначати чутливість воднів амідного каркаса білку CD33 до заміни на D2O. Експерименти проводили з використанням тільки рекомбінантного білка CD33 і білка CD33 з доданим CD33-зв'язуючим агентом / лінтузумабом (нижче в цьому прикладі варіант позначений як "антитіло / антитіла"). При цьому продемонстрований виражений захист областей білку CD33 від обміну в результаті зв'язування з антитілом. Роздільна здатність методу визначалася з пептидів, що утворилися в результаті розщеплення пепсином, наприклад, утворена амінокислотна послідовність може бути крупніше, ніж фактичний епітоп антитіла. Зазначені що утворилися з CD33 пептиди ідентифікували за допомогою додаткових контрольних експериментів з які не мають замін зразками, застосовуючи стандартні точні масспектрометричні і РХВР МС / МС-технології. У разі зразка, що містить білок + антитіло, білок CD33 і антитіло інкубували протягом 15 хв при кімнатній температурі. Кінцеве молярне співвідношення антитіло/CD33 становило 2:1. При використанні автоматичної системи (автосемплер) LEAP (планшет для обміну підтримували при 25 °C, планшет для зразка / реакції "гасіння" підтримували при 4 °C) додавали 8 мкл зразка до 80 мкл буфера для обміну (10мM NaH2PO4 в D2O, pH=7 або 10мМ NaH2PO4 в H2O, pH=7), перемішували і давали пройти обміну протягом різних проміжків часу (15, 60, 120, 240 і 600 с) при 25 °C. Потім 80 мкл цього розчину переносили в 80 мкл буфера для припинення реакції (буфер для "гасіння") (1M сечовина, 0,1 M TCEP-HCl) при 4 °C і перемішували. Потім 90 мкл цього розчину переносили в 10 мкл пепсину (4 мг / мл) при 4 °C і перемішували. Через 2 хв 60 мкл цього розчину ін'єктували в картридж що уловлює Michrom C18. Картридж промивали H2O+0,1 % ТФК протягом 2 хв зі швидкістю 100 мкл / хв. Потім клапан перемикали і вміст картриджа елюювали на колонці Phenomenex Jupiter C5, 1,0 × 50 мм, 5 мкм, 300Å. Рухома фаза A являла собою воду / ацетонітрил / ТФК (99/0, 95/0, 05), а рухлива фаза Б представляла собою ацетонітрил / воду / ТФК (95/4, 95/0, 05). Швидкість потоку становила 100 мкл / хв. Використовували наступний градієнт: 0 хв (0 % Б), 6 хв (40 % Б), 7 хв (40 % Б), 8 хв (90 % Б), 10 хв (90 % Б), 11 хв (0 % Б). В системі LEAP відбувалося попереднє охолодження рухомої фази до 4 °C і підтримувалася також температура уловлюючої колонки та аналітичної колонки на рівні 4 °C. Для МС-експериментів (які застосовуються для кількісної оцінки обміну з D2Oбуфером) застосовували метод отримання одного відсканованого зображення при 300-2000 протягом 14 хв при дозволі 60000. Для МС / МС експериментів (застосовуються для ID з H2Oбуфером для обміну) застосовували метод отримання 7 сканованих зображень протягом 14 хв. Перше відскановане зображення являло собою відскановане зображення в повному діапазоні від 300-2000 при вирішенні 30000. Наступні скановані зображення представляли собою CIDскановані зображення 6 іонів, що характеризуються найбільшою інтенсивністю, отриманих на сканованому зображенні № 1. Ширина виділення становила 1,5 а.е.м., енергія зіткнення складала 35 В, тривалість активації становила 30 мс. Отримані після розщеплення пепсином пептиди ідентифікували з використанням даних про фрагментацію та програмне забезпечення Proteome Discoverer (фірма Thermo). Ідентифіковані пептиди аналізували з використанням програми, яка є власністю фірми, що дозволяла розраховувати середню масу несучих заміни пептидів. 26 UA 112062 C2 5 10 Всі CD33-зв'язуючі агенти захищали ідентичний пептидний фрагмент, що має амінокислотну послідовність FFHPIPYYDKNSPVHGYW (SeqID No: 141) (таблиця 4). Послідовність CD33, що захищається CD33-зв'язуючими агентами, представленими в даному описі, відрізнялася і не перекривала пептидну послідовність CD33, що захищалася при зв'язуванні лінтузумаба (MDPNFWLQVQE, SeqID No: 142). Використання методу комп'ютерного моделювання ("in silico") із застосуванням кристалічної структури SIGLEC-5, гомологічного CD33 представника сімейства SIGLEC, дозволило виявити зв'язуючі епітопи всіх антитіл в найближчому домені білку, при цьому епітоп, з яким зв'язується лінтузумаб, відрізнявся від епітопів CD33-зв'язуються агентів, представлених у даному описі. Таким чином, CD33-зв'язуючі агенти, описані в даній заявці на патент, зв'язуються з епітопом, відмінним від епітопу лінтузумабу. Таблиця 4 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Клон ID № 280-03-08 280-21-09 280-29-12 280-31-01 280-31-01 (mut) 280-34-02 280-50-01 280-50-01 (mut) 280-61-07 283-03-03 283-05-01 283-07-03 283-11-03 283-14-01 лінтузумаб Епітоп CD33 FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW FFHPIPYYDKNSPVHGYW MDPNFWLQVQE 27 UA 112062 C2 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюCd33 binding agents
Автори англійськоюKonopetzry, Renate, Borges, Eric, Adam, Paul, Heider, Karl-Heinz
Автори російськоюКонопицки Ренате, Боргес Эрик, Адам Пол, Хайдер Карл-Хайнц
МПК / Мітки
МПК: C07K 16/28, A61K 39/395
Мітки: агент, cd33-зв'язувальний
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/142-112062-cd33-zvyazuvalnijj-agent.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Cd33-зв’язувальний агент</a>
Похідне азолу, спосіб його одержання, проміжна сполука і хімічний агент, призначений для застосування в сільському господарстві і садівництві, і агент для захисту промислових матеріалів
Номер патенту: 110647
Опубліковано: 25.01.2016
Автори: Міяке Таідзі, Обата Єміко, Аракі Нобуюкі, Імай Єію
МПК: C07D 405/06, A01P 3/00, A01N 43/653, C07D 233/60, C07D 249/08
Мітки: похідне, сільському, азолу, господарстві, захисту, садівництві, застосування, одержання, матеріалів, промислових, призначений, сполука, хімічний, агент, проміжна, спосіб
Формула / Реферат:
1. Похідне азолу загальної формули (І): , (I)де R1 означає незаміщену або заміщену атомом галогену С1-С6-алкільну групу;R2 означає функціональну групу, яка включає карбонільну групу, де атом вуглецю карбонільної групи приєднаний до атома вуглецю в циклопентановому циклі, який заміщений групою R1, і також до R3, OR3 або NR3R4;кожний R3 і R4...
Похідне біфеніламідину, проліки, інгібітор коагуляції крові, агент для профілактики тромбозу або емболії та агент для терапії тромбозу або емболії
Номер патенту: 52797
Опубліковано: 15.01.2003
Автори: Сугіура Сатосі, Таказава Єсіхару, Такарада Рейко, Цуцумі Такахару, Хара Такаюкі, Такано Ясунобу, Накада Томохіса
МПК: A61P 7/02, C07D 207/16, C07D 211/22, C07D 211/62, C07C 257/00, C07D 211/26, C07C 251/18, C07D 207/09, C07D 207/08, C07D 211/28, C07D 211/40
Мітки: тромбозу, похідне, емболії, агент, проліки, профілактики, інгібітор, біфеніламідину, коагуляції, терапії, крові
Формула / Реферат:
1. Похідне біфеніламідину загальної формули (І), (I)в якійR1 являє собою атом водню, атом фтору, атом хлору, атом брому, гідроксильну групу, аміногрупу, нітрогрупу, С1-8-алкільну групу або С1-8-алкоксильну групу;L являє собою простий зв’язок або С1-4-алкіленову групу;R2 являє собою атом фтору; атом хлору; атом брому; гідроксильну групу; аміногрупу;С1-8-алкоксильну групу; карбоксильну групу;...
Розділовий агент
Номер патенту: 20701
Опубліковано: 15.02.2007
Автор: Петращук Євгеній Олександрович
МПК: C04B 41/45, C04B 16/00
Мітки: агент, розділовий
Формула / Реферат:
Розділовий агент, що включає наповнювач, при цьому наповнювач виконаний у вигляді гідрофобного кальциду чи аналогічної за фізико-механічними властивостями речовини, який відрізняється тим, що він додатково містить пігмент при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: наповнювач 50-95 пігмент 5-50.
Сільськогосподарська композиція і кондиціонуючий агент
Номер патенту: 77674
Опубліковано: 15.01.2007
Автори: Васвік Терьє, Снартланн Сусанне Гадман, Хансен Еспен Фрідхоф
Мітки: композиція, сільськогосподарська, кондиціонуючий, агент
Формула / Реферат:
1. Сільськогосподарська композиція, яка включає субстрат, що є азотовмісним добривом, і 0,05-1,5 мас.% покриття, що включає віск, масло і поверхнево-активну речовину, яка відрізняється тим, що покриття містить 5-50 мас.% воску, 5-75 мас.% масла, що включає рослинні олії, рідкі тваринні жири, жири морських тварин або їх препарати і 2-15 мас.% поверхнево-активного агента.2. Сільськогосподарська композиція за п. 1, яка відрізняється тим,...
Кристалічний терапевтичний агент
Номер патенту: 72631
Опубліковано: 15.03.2005
Автори: Вуд Альберт Шо, Харріс Лоренс Джеймс, Сторі Річард Ентоні
МПК: A61P 43/00, C07D 487/04, A61K 31/519, A61P 15/10
Мітки: агент, терапевтичний, кристалічний
Формула / Реферат:
Поліморф 1-{6-етоксі-5-[3-етил-6,7-дигідро-2-(2-метоксіетил)-7-оксо-2Н-піразоло[4,3-d]піримідин-5-іл]-3-піридилсульфоніл}-4-етилпіперазину, що має імітований тип порошкової рентгенограми з головними піками, переважно, як визначено нижче: d-інтервал Інтенсивність (%) d-інтервал
Попередній патент: Активуючі ampk гетероциклічні сполуки і способи їх використання
Наступний патент: Реакторні системи механічного псевдозрідження шару й способи, придатні для виробництва кремнію
Випадковий патент: Капсула, яка містить вміщену в ній рідину, і курильний виріб, який містить згадану капсулу