Трансгенна рослина зі збільшеним рівнем рослинного крохмалю
Номер патенту: 109141
Опубліковано: 27.07.2015
Автори: Самойлов Владімір, Рааб Р. Майкл, Емері Йонас, Лессард Філіп А., Бугрі Олег, Ланахан Майкл
Формула / Реферат
1. Трансгенна рослина, яка включає конструкцію РНКі, що включає:
першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45;
другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти;
спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера і розташований між ними; і
промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером, де при експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНК-послідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю і збільшення рівня рослинного крохмалю в трансгенній рослині.
2. Трансгенна рослина за п. 1, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
3. Трансгенна рослина за п. 1, де друга нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої послідовності нуклеїнової кислоти.
4. Трансгенна рослина за п. 1, де перша послідовність драйвера являє собою виділену нуклеїнову кислоту, яка містить послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37.
5. Трансгенна рослина за п. 1, де трансгенна рослина являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
6. Трансгенна рослина за п. 1, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
7. Трансгенна рослина за п. 1, де трансгенна рослина є продуктом трансформації рослини Agrobacterium із застосуванням вектора, що містить РНКі-конструкцію, або її трансгенним потомством.
8. Трансгенна рослина за п. 7, де вектор має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47.
9. Трансгенна рослина за будь-яким з попередніх пунктів, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
10. Трансгенна рослина, одержана з енергетичної культури, харчової культури або з фуражної культури рослини, яка включає РНКі-конструкцію, що включає:
першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45;
другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою;
спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера; і
промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і спейсером,
де при експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНК-послідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю і збільшення рівня рослинного крохмалю в трансгенній рослині.
11. Трансгенна рослина за п. 10, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
12. Трансгенна рослина за п. 10, де друга виділена нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої нуклеїнової кислоти.
13. Трансгенна рослина за п. 10, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
14. Трансгенна рослина за п. 10, де енергетична культура, харчова культура або фуражна культура рослини являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
15. Трансгенна рослина за п. 10, де ген включає послідовність, яка має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43.
16. Трансгенна рослина за п. 10, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
17. Трансгенна рослина за п. 10, де трансгенна рослина являє собою продукт трансформації рослини Agrobacterium із застосуванням вектора, який має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47, або її трансгенне потомство.
18. Спосіб сільськогосподарської переробки або одержання тваринного корму, який включає:
надання трансгенної рослини, причому трансгенна рослина включає РНКі-конструкцію, яка містить першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45; другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти; спейсер, функціонально зв'язаний і розташований між першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера; і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і спейсером; і
переробку трансгенної рослини,
де перша і друга послідовності драйвера експресуються в трансгенній рослині, збільшуючи в ній рівень рослинного крохмалю, порівняно з диким видом рослини.
19. Спосіб за п. 18, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
20. Спосіб за п. 18, де друга нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої послідовності нуклеїнової кислоти.
21. Спосіб за п. 18, де перша послідовність драйвера являє собою виділену нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37.
22. Спосіб за п. 18, де трансгенна рослина являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
23. Спосіб за п. 18, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
24. Спосіб за п. 18, де трансгенна рослина є продуктом трансформації рослини Agrobacterium із застосуванням вектора, що містить РНКі-конструкцію, або її трансгенним потомством.
25. Спосіб за п. 24, де вектор має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47.
26. Спосіб за п. 18, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
27. Спосіб за п. 18, де стадія переробки включає щонайменше одну стадію, вибрану з групи, що складається з процесу переробки для тваринного корму, сушіння, підготовки до ферментації, кислотного гідролізу і амілазного гідролізу.
28. Продукт, одержаний способом за будь-яким з пп. 18-27.
29. Спосіб сільськогосподарського процесу переробки або одержання тваринного корму, який включає:
надання трансгенної рослини, одержаної з енергетичної культури, харчової культури або фуражної культури рослини, де трансгенна рослина включає РНКі-конструкцію, яка містить першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45; другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою; спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера; і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером, де при експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНК-послідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю; і
переробку трансгенної рослини,
де перша і друга послідовності драйвера експресуються в трансгенній рослині, збільшуючи в ній рівень рослинного крохмалю порівняно з диким видом рослини.
30. Спосіб за п. 29, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
31. Спосіб за п. 29, де друга виділена нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої нуклеїнової кислоти.
32. Спосіб за п. 29, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
33. Спосіб за п. 29, де енергетична культура, харчова культура або фуражна культура рослини являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
34. Спосіб за п. 29, де ген включає послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43.
35. Спосіб за п. 29, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
36. Спосіб за п. 29, де трансгенна рослина є продуктом трансформації рослини Agrobacterium із застосуванням вектора, який має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47, або її трансгенним потомством.
37. Спосіб за п. 29, де стадія переробки включає щонайменше одну стадію, вибрану з групи, що складається з переробки для тваринного корму, сушіння, підготовки до ферментації, кислотного гідролізу і амілазного гідролізу.
38. Продукт, одержаний способом за будь-яким з пп. 29-37.
39. Спосіб зміни рівня рослинного крохмалю в рослині, де рослина представляє собою трансгенну рослину, який включає забезпечення рослини РНКі-конструкцією, яка містить першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45; другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти; спейсер, функціонально зв'язаний і розташований між першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера; і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером, де експресія РНК-конструкції в рослині змінює активність щонайменше одного ферменту, пов'язаного з метаболізмом крохмалю в рослині, шляхом інгібування експресії гена, що кодує фермент, і збільшує рівень рослинного крохмалю в рослині.
40. Спосіб за п. 39, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
41. Спосіб за п. 39, де друга нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої послідовності нуклеїнової кислоти.
42. Спосіб за п. 39, де перша послідовність драйвера являє собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37.
43. Спосіб за п. 39, де трансгенна рослина являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
44. Спосіб за п. 39, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
45. Спосіб за п. 39, де трансгенна рослина є продуктом трансформації рослини Agrobacterium із застосуванням вектора, що містить РНКі-конструкцію, або її трансгенним потомством.
46. Спосіб за п. 45, де вектор має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47.
47. Спосіб за п. 39, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
48. Спосіб за п. 39, де трансгенна рослина одержана з енергетичної культури, харчової культури або фуражної культури рослини.
49. Спосіб за п. 48, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
50. Спосіб за п. 48, де друга виділена нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої нуклеїнової кислоти.
51. Спосіб за п. 48, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
52. Спосіб за п. 48, де енергетична культура, харчова культура або фуражна культура рослини являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
53. Спосіб за п. 48, де ген включає послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43.
54. Спосіб за п. 39, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
55. Спосіб за п. 39, де трансгенна рослина є продуктом трансформації рослини Agrobacterium із застосуванням вектора, який має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47, або її трансгенним потомством.
56. Виділена нуклеїнова кислота, яка включає послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з будь-якою з SEQ ID NO: 15-18, 23 і 47, і здатна підвищувати рівень рослинного крохмалю в рослині при експресії.
57. Вектор, який включає РНКі-конструкцію, причому РНКі-конструкція включає:
першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45;
другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою;
спейсер, функціонально зв'язаний і розташований між першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера; і
промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і спейсером, де в організмі-хазяїні, що містить ген, і при експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНК-послідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю і збільшення рівня рослинного крохмалю в організмі-хазяїні.
58. Вектор за п. 57, де спейсер являє собою інтрон, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера.
59. Вектор за п. 57, де друга нуклеїнова кислота являє собою інвертовану комплементарну послідовність першої послідовності нуклеїнової кислоти.
60. Вектор за п. 57, де перша послідовність драйвера являє собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37.
61. Вектор за п. 57, де перша послідовність драйвера розташовується в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер розташовується в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї.
62. Вектор за п. 57, який має послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47.
63. Вектор за п. 57, де перша виділена нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 44, і друга нуклеїнова кислота має послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з SEQ ID NO: 46.
64. Вектор за п. 57, де вектор являє собою проміжний вектор.
65. Вектор за п. 57, де вектор являє собою трансформуючий вектор.
66. Вектор за п. 57, який містить виділену нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47.
67. Спосіб одержання трансгенної рослини, який включає трансформацію рослини за допомогою вектора за будь-яким з пп. 57-66.
68. Спосіб за п. 67, де рослина являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з енергетичної культури, харчової культури або фуражної культури рослини.
69. Спосіб за п. 67, де рослина являє собою рослину, вибрану з групи, що складається з рису, проса, сорго, кукурудзи і томата.
Текст
Реферат: У винаході запропоновано вектори для зміни експресії одного або більше ферментів регуляції крохмалю. З використанням запропонованих векторів одержують трансгенні рослини зі збільшеним рівнем рослинного крохмалю. Рослини включають конструкцію РНКі, яка включає першу послідовність драйвера, другу послідовність драйвера, спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера і розташований між ними, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. При експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНКпослідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю. UA 109141 C2 (12) UA 109141 C2 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перехресне посилання на споріднені заявки Це заявка заявляє пріоритет попередньої патентної заявки Сполучених Штатів № 61/358720 від 25 червня 2010 року, яка включена в даний документ посиланням в повному обсязі. ПІДТВЕРДЖЕННЯ ДЕРЖАВНОЇ ПІДТРИМКИ Даний винахід був здійснений, щонайменше частково, при державній підтримці з номером державного замовлення 2009-10001-05118, одержаним від Національного Інституту Харчування і Сільського Господарства, Департаменту сільського господарства США. Держава володіє певними правами на винахід. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний опис стосується рослин із зміненим рівнем рослинного крохмалю. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Глюкоза являє собою переважну молекулярну сировину, однак її доступність і вартість нещодавно стали лімітуючими факторами при попиті на дешеву сировину у вигляді біопалива і збалансованого тваринного корму. Попит на кукурудзу і цукрову тростину значно збільшив вартість цього продукту. Крохмаль являє собою чудове джерело глюкози завдяки його простій молекулярній структурі α-1-4- і α-1-6-глюкозні зв'язки) і відносній легкості, з якою ці зв'язки доступні і гідролізуються за допомогою недорогих і високоефективних ферментів (наприклад, αамілази і глюкоамілази). Гідроліз рослинних тканин типу зерна з високим вмістом крохмалю забезпечує одержання відносно чистої глюкози, тобто ефективно трансформованої в м'ясні або хімічні кінцеві продукти. Сахароза, розчинний консервуючий вуглевод, також являє собою сировинну молекулу, одержувану з рослин, яка легко застосовується з використанням ферментуючих організмів. Системи обробітку і процесу одержання сільськогосподарських культур, в яких застосовується сировина у вигляді сахарози, така як цукровий буряк і сорго цукрове, обмежені вузьким інтервалом збирання урожаю, зберіганням і стабільністю. Сорго цукрове повинно оброблятися аналогічно цукровій тростині в період збирання його урожаю для обмеження мікробної ферментації сахарози завдяки високому вмісту вологості в зібраному матеріалі (брак). Терміни проведення кампанії зменшують загальну капітальну ефективність, орієнтовану на технологічне обладнання. Лігноцелюлозні субстрати менш переважна сировина через труднощі процесу одержання. Лігноцелюлозна біомаса містить суміш гексоз і пентоз, і їх опірність гідролізу (кристалічність і перехресні зшивки з лігніном) робить гідроліз і економічну деградацію важкими в застосовуваних цукрах. При одержанні біопалива були розроблені дорогі попередні обробки для допомоги в завершенні гідролізу лігноцелюлозних матеріалів. Повне застосування одержаних в результаті сумішей цукрів для паливної і хімічної продукції також вимагає, щоб спеціалізовані ферментуючі організми трансформували одержані в результаті цукри в кінцеві продукти, такі як етанол, бутанол, янтарна кислота і інші хімічні речовини. СУТЬ ВИНАХОДУ У одному аспекті винахід стосується трансгенної рослини, яка включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера і розташований між ними, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. У одному аспекті винахід стосується трансгенної рослини, одержаної з енергетичної культури, харчової культури або з фуражної культури рослини, що включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності по довжині виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. При експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНК-послідовність, транскрибована з 1 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена. У одному аспекті винахід стосується способу сільськогосподарського процесу одержання або приготування тваринного корму. Спосіб включає надання трансгенної рослини. Трансгенна рослина включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера і розташований між ними, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. Спосіб також включає процес одержання трансгенної рослини, де перша і друга послідовності драйвера експресуються в трансгенній рослині. Експресія першої і другої послідовностей драйвера може здійснюватися перед стадією процесу одержання. У одному аспекті винахід стосується продукту, одержуваного способом сільськогосподарського процесу одержання або приготування тваринного корму. У одному аспекті винахід стосується способу сільськогосподарського процесу одержання або приготування тваринного корму. Спосіб включає надання трансгенної рослини, одержаної з енергетичної культури, харчової культури або фуражної культури рослини. Трансгенна рослина включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності по довжині виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. При експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНКпослідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена. Спосіб також включає процес одержання трансгенної рослини, де перша і друга послідовності драйвера експресуються в трансгенній рослині. Експресія першої і другої послідовностей драйвера може здійснюватися перед стадією процесу одержання. У одному аспекті винахід стосується продукту, одержуваного способом сільськогосподарського процесу одержання або приготування тваринного корму. У одному аспекті винахід стосується способу зміни рівня рослинного крохмалю в рослині. Спосіб включає експресію виділеної нуклеїнової кислоти в рослині. Експресія виділеної нуклеїнової кислоти в рослині змінює активність щонайменше одного ферменту, пов'язаного з метаболізмом крохмалю в рослині. У одному аспекті винахід стосується способу зміни рівня рослинного крохмалю в рослині. Спосіб включає експресію виділеної нуклеїнової кислоти в рослині. Експресія виділеної нуклеїнової кислоти в рослині змінює активність щонайменше одного ферменту, пов'язаного з метаболізмом крохмалю в рослині. Рослина є трансгенною рослиною. Трансгенна рослина включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера і розташований між ними, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. У одному аспекті винахід стосується способу зміни рівня рослинного крохмалю в рослині. Спосіб включає експресію виділеної нуклеїнової кислоти в рослині. Експресія виділеної нуклеїнової кислоти в рослині змінює активність щонайменше одного ферменту, пов'язаного з метаболізмом крохмалю в рослині. Рослина являє собою трансгенну рослину, одержану з енергетичної культури, харчової культури або фуражної культури рослини. Трансгенна рослина включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності по довжині 2 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. При експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНКпослідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена. У одному аспекті винахід стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що включає послідовність, яка має щонайменше 90 % ідентичності з будь-якою з SEQ ID NO: 7-8,11-18, 2123, 32-33, 37, 38 і 39-47. У одному аспекті винахід стосується вектора, що включає РНКі-конструкцію. РНКіконструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності по довжині виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера і розташований між ними, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. У одному аспекті винахід стосується способу одержання трансгенної рослини. Спосіб включає трансформацію рослини вектором. Вектор включає РНКі-конструкцію. РНКі-конструкція включає першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності по довжині виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю, і другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. РНКі-конструкція також включає спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і з другою послідовністю драйвера і розташований між ними, і промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і зі спейсером. У одному аспекті винахід стосується вектора, що містить виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 14. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Подальший докладний опис переважного варіанта здійснення даного винаходу буде краще зрозумілий при його читанні разом з прикладеними кресленнями. Для цілей ілюстрації винаходу представлені креслення варіантів здійснення, які на даний час є переважними. Однак зрозуміло, що винахід не обмежений точними представленими порядком і засобами. На кресленнях: Фіг. 1A-G ілюструють стратегії експресії інтерферуючих РНК в трансгенних рослинах. Фіг. 2 ілюструє проміжний РНКі-вектор, pAL409. Фіг. 3 ілюструє РНКі-касети, з направленим впливом на рисові гени GWD, DSP і ISA3. Фіг. 4 ілюструє порівняння послідовності між частиною GWD2 [SEQ ID NO: 9], одержаною з глюкан-вода-дикіназного гена, і частиною гена GWD з томата (Solanum lycopersicon) [SEQ ID NO: 10]. Фіг. 5 ілюструє pAL409j SbGWDko2. Фіг. 6 ілюструє детектування гомологів ISA3 за допомогою аналізу по Саузерну. Фіг. 7 ілюструє вирівнювання вибірки з генів GWD рису (OsGWD) [SEQ ID NO: 24 і 28], сорго (SbGWD) [SEQ ID NO: 25 і 29], маїсу (ZmGWD) [SEQ ID NO: 26 і 30] і томата (SlGWD) [SEQ ID NO: 27 і 31]. Також ілюструються праймери dgGWup2 [SEQ ID NO: 32] і dgGWdown2 [SEQ ID NO: 33]. Фіг. 8 ілюструє порівняння відносної довжини і розташування інтронів всередині корового сегмента гомології генів GWD з рису, сорго, Arabidopsis і з проса. Фіг. 9 ілюструє зображення точкової матриці вирівнювань BLASTn між геномними послідовностями проса і сорго для глюкан-вода-дикіназних генів. Горизонтальна вісь послідовність проса; вертикальна вісь - послідовність рису. Діагональні сегменти представляють ділянки, де дві послідовності високогомологічні. Фіг. 10 ілюструє рівень мРНК GWD серед рослин, що несуть або pAG2100, або pAG2101, і у контрольних рослин дикого типу (WT). 3 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 11 ілюструє рівень мРНК DSP серед рослин, що несуть pAG2102, і у WT-контролів. Фіг. 12 ілюструє рівень мРНК ISA3 серед рослин, що несуть pAG2103, і у WT-контролів. Фіг. 13 ілюструє підвищений рівень крохмалю серед вибраних ліній рису і проса, які несуть РНКі-конструкції. Фіг. 14 ілюструє вміст крохмалю в трансгенних рисових лініях, зібраних приблизно через 19 тижнів після посадки. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ У наступному описі використовується термінологія тільки для зручності, і вона не є обмеженням. При використанні в даному документі терміни "виділена нуклеїнова кислота", "виділений полінуклеотид", "виділений олігонуклеотид", "виділена ДНК" або "виділена РНК" означають нуклеїнову кислоту, полінуклеотид, олігонуклеотид, ДНК або РНК окремо від організму, з якого вони походять, або від природного геному, локалізації або молекул, з якими вони звичайно асоційовані, або являють собою нуклеїнову кислоту, одержану синтетичними методами. При використанні в даному документі терміни "виділений білок", "виділений поліпептид", "виділений олігопептид" або "виділений пептид" означають білок, поліпептид, олігопептид або пептид окремо від організму, з якого вони походять, або окремо від природної локалізації або від молекул, з якими вони звичайно асоційовані. При використанні в даному документі термін "варіант" означає молекулу, яка зберігає біологічну активність, таку ж або по суті таку ж, як у вихідної послідовності. Варіант може бути з того ж або з іншого виду або може бути синтетичною послідовністю на основі природної молекули або молекули-попередника. Нуклеїнові кислоти, нуклеотидні послідовності, білки або амінокислотні послідовності, позначені в даному документі, можуть бути виділеними, очищеними, синтезованими хімічно або одержаними за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Всі ці методи добре відомі з рівня техніки. При використанні в даному документі термін "функціонально зв'язаний" означає асоціацію двох або більше біомолекул в конфігурації одна відносно одної, так що може здійснюватися нормальна функція біомолекули. Відносно нуклеотидних послідовностей термін "функціонально зв'язаний" означає асоціацію двох або більше послідовностей нуклеїнових кислот в конфігурації одна відносно одної, так що може здійснюватися нормальна функція послідовностей. Наприклад, нуклеотидна послідовність, що кодує послідовність-попередник або секреторний лідер, функціонально зв'язана з нуклеотидною послідовністю поліпептиду, якщо він експресується у вигляді білка-попередника, який бере участь в секреції поліпептиду; промотор або енхансер функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію кодуючої послідовності; і сайт зв'язування рибосоми з нуклеїновою кислотою функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташовується так, щоб полегшити зв'язування рибосоми з нуклеїновою кислотою. Однина при використанні в формулі винаходу і у відповідних розділах опису визначається як така, що включає одну або більше із згаданих ознак доти, поки конкретно не встановлене інше. Термінологія включає слова, спеціально згадані вище, їх похідні і слова, схожі по значенню. Фраза "щонайменше" з подальшим переліком з двох або більше ознак, таких як "А, В або С", означає будь-яку індивідуальну ознаку з А, В або С, а також будь-яку їх комбінацію. Список послідовностей, озаглавлений "Список_Послідовностей", з розміром файла приблизно 219033 байт цим включений в даний документ як посилання в повному обсязі. У одному варіанті здійснення пропонується спосіб зміни кількості крохмалю, який накопичується в рослинних тканинах рослин, за допомогою інгібування активності ферментів, які звичайно відповідають за мобілізацію рослинного крохмалю (в даному документі позначається як "Зелений Крохмаль" або "рослинний крохмаль") протягом циклів день/ніч. Пропонуються виділені нуклеїнові кислоти для зміни кількості крохмалю, який накопичується в рослинних тканинах рослин, шляхом інгібування активності ферментів, які звичайно відповідають за мобілізацію Зеленого Крохмалю. Пропонуються трансгенні рослини, які включають нуклеїнові кислоти для зміни кількості крохмалю, який накопичується в рослинних тканинах рослин, шляхом інгібування активності ферментів, які звичайно відповідають за мобілізацію Зеленого Крохмалю. Будь-яка рослина може пропонуватися у вигляді трансгенної рослини. У одному варіанті здійснення у вигляді трансгенної рослини пропонуються рис, просо, сорго або інші енергетичні або фуражні культури. У одному варіанті здійснення пропонуються застосування для тваринного корму, які включають підвищений рівень крохмалю в рослинних тканинах. У варіантах здійснення в даному документі можуть пропонуватися легкоферментовані цукри, доступні в процесі 4 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментації. Виробництво біопалива може бути збільшене шляхом одержання легкоферментованих цукрів. Способи одержання легкоферментованих цукрів і способи збільшення виробництва біопалива пропонуються у варіанті здійснення в даному документі. Культури з підвищеним рівнем рослинного крохмалю мають різноманітні застосування і використання. У одному варіанті здійснення пропонується біомаса з рослин, які накопичують підвищений рівень рослинного крохмалю відносно рослин дикого типу. Ці рослини можуть мати підвищену ефективність у вигляді сировини для процесу ферментації або при застосуванні для тваринного корму. Наприклад, в типовому целюлозному процесі полісахариди, такі як целюлоза і геміцелюлоза, які присутні в біомасі, гідролізуються до простих цукрів, які можуть потім ферментуватися до етанолу, бутанолу, ізобутанолу, жирних кислот або до інших вуглеводів за допомогою мікроорганізмів. Через опірність біомаси для вивільнення простих цукрів з полімерів, таких як целюлоза і геміцелюлоза, часто потрібне використання агресивних умов попередньої обробки і гідролізу за допомогою відносно дорогих сумішей ферментів. Навпаки, будь-який крохмаль, який присутній в біомасі, являє собою додаткове джерело простих цукрів (а саме глюкоза), які можуть дуже легко вивільнятися і набагато менш дорогим способом або за допомогою обробки розведеною кислотою, або за допомогою гідролізу амілазами, які на даний час доступні і набагато менш дорогі, ніж ферменти, які вимагаються для гідролізу целюлози і геміцелюлози. У результаті, будь-яке збільшення кількості крохмалю, присутнього в біомасі, буде одночасно збільшувати кількість ферментованого цукру, який може бути витягнутий (і, таким чином, кількість етанолу, бутанолу і т. д., які можуть бути одержані), при цьому з невідповідно маленьким збільшенням вартості процесу (тобто при додаванні недорогих амілази або кислотної обробки). Аналогічно, біомаса, яка містить підвищений рівень крохмалю, може мати більш високу значущість в фуражних застосуваннях, де рослинний матеріал служить кормом для худоби. Крім того, надлишок крохмалю, присутнього в даному матеріалі, легше перетравлюється більшістю тварин, ніж целюлозний матеріал, забезпечуючи при цьому більше енергії на одиницю біомаси, ніж біомаса при звичайному рівні крохмалю. Варіанти здійснення включають застосування трансгенної рослини, представленої в даному документі, для будьякого з цих методів. Способи даного документа, які включають представлені в попередньому параграфі, можуть включати модифікацію рослин для створення трансгенних рослин, вирощування трансгенних рослин, збирання рослин і або процес їх одержання для застосування як тваринного корму, як інших фуражних культур, або їх сушіння і обробку для застосування в процесах ферментації, аналогічно типу обробки, який використовується в целюлозних процесах, але з додаванням обробки, такої як кислотний або амілазний гідроліз, для гідролізу крохмалю до компонентів у вигляді цукрів. Будь-яка одна стадія, ряд стадій або всі стадії, представлені в даному параграфі, можуть пропонуватися в даному способі. Були ідентифіковані гени для направленої зміни Зеленого Крохмалю. Будь-який фермент, білок або нуклеїнова кислота, залучені до метаболізму крохмалю, можуть бути мішенями для зміни рівня Зеленого Крохмалю. У одному варіанті здійснення зміни досягають за допомогою пригнічення експресії генів, пов'язаних з Зеленим Крохмалем. У одному варіанті здійснення зміна являє собою збільшення кількості Зеленого Крохмалю. Конкретні ферменти, які можуть бути мішенями, включають, зокрема, білок глюкан-вода-дикіназу (також відому як GWD, R1, sex1); фосфоглюкан-вода-дикіназу (також відому як PWD); протеїнфосфатазу з подвійною специфічністю (також відому як DSP, sex4); ß-амілазу (BAM), ізоамілазу (також відому як ISA3), граничну декстриназу (також відому як LDA); фермент диспропорції і інші дерозгалужувальні ферменти. GWD фосфорилує крохмаль, який потім сприйнятливий до ферментів деградації крохмалю. PWD фосфорилує крохмаль і може залежати від попередньої дії GWD завдяки епістазу. DSP являє собою регуляторний фермент і може активувати ферменти деградації крохмалю. DSP також може фосфорилувати крохмаль. Крім того, передбачається, що DSP має ендоамілазну активність, яка може бути синергічна з ß-амілазною і ізомеразною мобілізацією крохмалю. BAM (але не α-амілаза) і ISA3 залучені до мобілізації рослинного крохмалю. BAMактивність залежить від GWD, і ISA3-активність залежить від BAM. У одному варіанті здійснення мішені пригнічуються, і пригнічення може досягатися за допомогою РНКі-пригнічення генної експресії. РНКі-конструкції пропонуються для пригнічення експресії білків-мішеней. Білки-мішені можуть бути ферментами. Фермент-мішень може бути вибраний з ферменту, залученого до мобілізації Зеленого Крохмалю. Пропонуються РНКіконструкції, які пригнічують щонайменше один з GWD, PWD, DSP, BAM, ізоамілази, LDA, ферменту диспропорції і інших дерозгалужувальних ферментів. Був розроблений ряд стратегій для експресії РНКі в трансгенних рослинах. Див., наприклад, публікацію Horiguchi G., RNA silencing in plants: а shortcut to functional analysis (2004) 5 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Differentiation 72(2-3):65-73, яка включена в даний документ посиланням в повному обсязі. Див. також Smith N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijk P.A., Green A.G., Waterhouse P.M., Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs (2000), Nature 407:319-20; Stoutjesdijk P.A., Singh S.P., Liu Q., Hurlstone C.J., Waterhouse P.A., Green A.G., hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing (2002) Plant Physiol. 129(4):1723-31, які включені в даний документ посиланням в повному обсязі. При посиланні на фіг. 1A-G ілюструються типові стратегії для РНКі. Варіанти здійснення в даному документі включають РНКі-конструкції, способи і трансгенні рослини, одержані за допомогою РНКі-стратегії. Промотори 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 і 108 можуть давати можливість транскрипції нуклеїнової кислоти в конструкціях. Стратегія, представлена на фіг. 1E, включає XVE-респонсивний промотор 109, і стратегія на фіг. 1D включає промоторні фрагменти 110 і 111. Термінатори 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 і 131 також проілюстровані у вигляді транскрибованих термінаторних послідовностей 122a і 123a. Спейсери 132, 133 і 134 ілюструються для стратегій на фіг. 1A, 1С і 1D, і транскрибовані спейсери 132a і 132b ілюструються для фіг. 1A і 1С. Інтрони 140, 141 і 142 і транскрибований інтрон 140a ілюструються на фіг. 1B, 1E і 1F. Представлені кДНК-фрагменти 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 і 161, а також транскрибована кДНК 150a, 151a, 152a, 153a, 154a і дволанцюжковий РНК-ланцюг 154a'. На фіг. 1E і 1F ілюструються loxP-сайти 170, 171 і 172. Варіанти здійснення включають способи, що застосовують РНК драйвера, розділену за допомогою інтронного спейсера, як проілюстровано на фіг. 1B, і РНКі-конструкції, вектори, проміжні вектори, трансформуючі вектори, праймери і трансгенні рослини для здійснення РНКі-стратегії, зображеної на фіг. 1B. Але варіанти здійснення в даному документі не обмежуються стратегією, проілюстрованою на фіг. 1B. У одному варіанті здійснення пропонуються виділені нуклеїнові кислоти, що мають послідовність, представлену в будь-якій з нуклеїнових кислот, перерахованих в даному документі, або комплементарні ним. У одному варіанті здійснення пропонуються виділені нуклеїнові кислоти, що мають послідовність, яка гібридизується з нуклеїновою кислотою, що має послідовність будь-якої з нуклеїнових кислот, перерахованих в даному документі, або комплементарної ним. У одному варіанті здійснення умови гібридизації являють собою умови низької жорсткості. У одному варіанті здійснення умови гібридизації являють собою умови помірної жорсткості. У одному варіанті здійснення умови гібридизації являють собою умови високої жорсткості. Приклади протоколів гібридизації і методи оптимізації протоколів гібридизації описані в наступних книгах: Molecular Cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; і Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl, Volume 1, John Wiley & Sons, 2000, які включені в даний документ посиланням в повному обсязі. Як приклад, але не обмеження, наведені процедури для умов гібридизації середньої жорсткості: фільтри, що містять ДНК, попередньо обробляють протягом 2-4 год. при 68 °C в розчині, що містить 6X SSC (Amresco, Inc., Solon, OH), 0,5 % SDS (Amersco, Inc., Solon, ВІН), 5X розчин Денхардта (Amersco, Inc., Solon, OH) і 100 мкг/мл денатурованої ДНК сперми лосося (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA). Приблизно 0,2 мл розчину для попередньої обробки використовують на один квадратний сантиметр використовуваної мембрани. Гібридизацію проводять в тому ж розчині з наступними модифікаціями: можуть використовуватися 0,01M EDTA (Amersco, Inc., Solon, OH), 6 32 100 мкг/мл ДНК сперми лосося і 5-20×10 імп/хв. P-мічені або флуоресцентно мічені зонди. Фільтри інкубують в гібридизаційній суміші протягом 16-20 год. при 68 °C і потім відмивають протягом 15 хвилин при кімнатній температурі (25 °C±5) в розчині, що містить 2X SSC і 0,1 % SDS, при м'якому перемішуванні. Розчин для відмивання замінюють на розчин, що містить 0,1X SSC і 0,5 % SDS, і інкубують додаткові 2 год. при 68 °C при м'якому перемішуванні. Фільтри сушать і експонують для проявлення зображення на аналізаторі зображень або за допомогою радіоавтографії. Якщо необхідно, фільтри промивають третій раз і повторно експонують для проявлення зображення. Як приклад, але не обмеження, умови низької жорсткості означають умови гібридизації, при яких застосовують низьку температуру для гібридизації, наприклад температуру від 37 °C до 60 °C. Як приклад, але не обмеження, умови високої жорсткості представляють умови гібридизації, наведені вище, але модифіковані застосуванням високих температур, наприклад температури гібридизації близько 68 °C. У одному варіанті здійснення пропонуються виділені нуклеїнові кислоти, що мають послідовність, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності по довжині з безперервною ділянкою нуклеїнової кислоти, яка має будь-яку з послідовностей, представлених в даному документі, або комплементарної ним. Безперервна ділянка може являти собою суцільну довжину послідовності, представленої в даному документі, або комплементарної їй. Ідентичність може бути виміряна за допомогою алгоритму Сміта 6 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ватермана (Smith T.F., Waterman M.S. (1981), "Identification of Common Molecular Subsequences", Journal of Molecular Biology 147:195-197, який включений в даний документ посиланням в повному обсязі). У одному варіанті здійснення пропонуються виділені нуклеїнові кислоти, полінуклеотиди або олігонуклеотиди, що мають частину послідовності, представленої в будь-якій з нуклеїнових кислот, перерахованих в даному документі, або комплементарні ним. Ці виділені нуклеїнові кислоти, полінуклеотиди або олігонуклеотиди не обмежені, але можуть мати довжину в інтервалі від 10 нуклеотидів до повної довжини, 10-600, 10-500, 10-400,10-300, 10-200, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15 або 20-30 нуклеотидів або 10,15, 20 або 25 нуклеотидів. Виділена нуклеїнова кислота, полінуклеотид або олігонуклеотид, що мають довжину всередині одного з вищезгаданих інтервалів, можуть мати специфічну довжину всередині наведеного вище інтервалу, включаючи кінцеві точки. Задана довжина нуклеотидів може починатися в будь-якому унікальному положенні всередині еталонної послідовності (тобто будь-яка з нуклеїнових кислот, представлених в даному документі), де достатньо нуклеотидів після унікального положення, щоб забезпечити задану довжину. У одному варіанті здійснення гібридизаційний зонд або праймер комплементарний нуклеїновій кислоті тієї ж довжини, що і у зонда або праймера, на 85-100 %, 90-100 %, 91-100 %, 92-100 %, 93-100 %, 94-100 %, 95-100 %, 96-100 %, 97-100 %, 98-100 %, 99-100 % або 100 %, і має послідовність, вибрану з довжини нуклеотидів, відповідної довжині зонда або праймера в тій частині послідовності, що представлена в будь-якій з нуклеїнових кислот, перерахованих в даному документі. У одному варіанті здійснення гібридизаційний зонд або праймер гібридизується по довжині з нуклеїновою кислотою відповідної довжини, що має послідовність, представлену в будь-якій з нуклеїнових кислот, представлених в даному документі. У одному варіанті здійснення умови гібридизації являють собою умови низької жорсткості. У одному варіанті здійснення умови гібридизації являють собою умови помірної жорсткості. У одному варіанті здійснення умови гібридизації являють собою умови високої жорсткості. Будь-яка з виділених нуклеїнових кислот, представлених в даному документі, може пропонуватися у вигляді набору реагентів. Набір реагентів може використовуватися для одержання РНКі-конструкції, одержання трансгенних рослин, для тестування рослини на присутність гена, що представляє інтерес, тестування рослини на присутність РНКі-конструкції, як описано в даному документі, або для будь-якого іншого способу або мети, описаних в даному документі. Набір реагентів може включати один або більше векторів, представлених в даному документі, або один або більше зондів або праймерів, представлених в даному документі. У одному варіанті здійснення пропонується трансгенна рослина. Трансгенна рослина може бути одержана з будь-якої рослини. Трансгенна рослина може бути одержана з енергетичної культури рослин, з фуражної культури або з харчової культури рослин. Енергетична культура рослин може бути, зокрема, кукурудзою, просом, тополею або міскантом. Фуражна культура рослин може являти собою, зокрема, сорго. Харчова культура рослин може являти собою, зокрема, кукурудзу або томат. Трансгенна рослина може включати РНКі-конструкцію. Рослина може являти собою рис, просо, сорго, кукурудзу або томат. РНКі-конструкція може бути сконструйована для здійснення будь-якої РНКі-стратегії, включаючи, зокрема, проілюстровані на фіг. 1A-G. РНКі-конструкція може включати першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, відповідну частині гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю. Перша послідовність драйвера може включати першу виділену нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності по довжині виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в трансгенній рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю. Довжина першої нуклеїнової кислоти може бути будь-якої придатної довжини для забезпечення РНКівпливу. РНКі-конструкція може включати другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти при in situ умовах в трансгенній рослині. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти при умовах низької жорсткості. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти при умовах помірної жорсткості. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою послідовністю нуклеїнової кислоти при умовах високої жорсткості. Друга послідовність нуклеїнової кислоти може являти собою інвертовану комплементарну послідовність першої послідовності нуклеїнової кислоти. РНКі-конструкція 7 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 може включати спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера і розташований між ними. Функціонально зв'язаний спейсер може забезпечувати зв'язок між першою і другою виділеними нуклеїновими кислотами, так що РНКпослідовності, транскрибовані з першої і другої виділених нуклеїнових кислот, можуть гібридизуватися одна з одною. Функціонально зв'язаний спейсер може являти собою інтрон. Інтрон може сплайсувати першу і другу послідовності драйвера. Перша послідовність драйвера може розташовуватися в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього. Спейсер може розташовуватися в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї. Перша послідовність драйвера може розташовуватися в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер може розташовуватися в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї. РНКі-конструкція також може включати промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і спейсером. Функціонально зв'язаний промотор може давати можливість транскрипції першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера. Функціонально зв'язаний промотор може являти собою будь-який тип промотору. Функціонально зв'язаний промотор може являти собою індукований промотор. Функціонально зв'язаний промотор може являти собою конститутивний промотор. Транскрипція першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера може означати експресію послідовності драйвера і спейсера. При експресії першої послідовності драйвера, спейсера і другої послідовності драйвера РНК-послідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, здатні гібридизуватися одна з одною. РНК-транскрипти, що гібридизувалися, першої і другої послідовностей драйвера можуть бути здатні інгібувати експресію гена. Трансгенна рослина може включати більше одного типу РНКі-конструкцій. Кожний відмінний тип РНКі-конструкції може бути направлений на інгібування експресії різних генів, експресуючих різні білки-мішені. РНКі-конструкція може включати першу послідовність драйвера. Перша послідовність драйвера може включати послідовність першої нуклеїнової кислоти, яка має будь-яку придану послідовність для впливу РНКі на ген, що кодує білок-мішень. Перша послідовність драйвера може включати першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45. Ідентичність може бути виміряна по довжині першої виділеної нуклеїнової кислоти. Довжина першої виділеної нуклеїнової кислоти може дорівнювати довжині еталонної послідовності. РНКі-конструкція може включати першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. РНКі-конструкція може включати першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. РНКі-конструкція може включати першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. РНКі-конструкція може включати другу послідовність драйвера, що має другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою нуклеїновою кислотою при in situ умовах в трансгенній рослині. РНКі-конструкція може включати другу послідовність драйвера, що має другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою нуклеїновою кислотою при умовах низької жорсткості. РНКі-конструкція може включати другу послідовність драйвера, що має другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою нуклеїновою кислотою при умовах помірної жорсткості. РНКі-конструкція може включати другу послідовність драйвера, що має другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою нуклеїновою кислотою при умовах високої жорсткості. РНКі-конструкція може включати другу послідовність драйвера, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з послідовністю, комплементарною еталонній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ 8 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45. Ідентичність може бути виміряна по довжині послідовності, комплементарної еталонній послідовності. Довжина другої нуклеїнової кислоти може дорівнювати довжині послідовності, комплементарної еталонній послідовності. Спейсером може бути будь-яка послідовність. Спейсером може бути інтрон. Інтрон може бути будь-яким інтроном. Інтроном може бути OsUbiintron. Послідовність OsUbiintron може бути виявлена при посиланні на фіг. 2, яка ілюструє pAL409 разом з OsUbiintron між положеннями 4519-566. Послідовність pAL409 представлена нижче і в SEQ ID NO: 13. Нумерація нуклеотидів в SEQ ID NO: 13 може варіюватися як на фіг. 2, але при цьому порівняння відмічених послідовностей (наприклад, сайти рестрикції) між фіг. 2 і SEQ ID NO: 13 дає можливість ідентифікації будь-якої специфічної послідовності, характерної для pAL409. Інтрон може мати послідовність, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з OsUbiintron. Інтрон може мати послідовність, яка гібридизується з OsUbiintron або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах низької жорсткості. Інтрон може мати послідовність, яка гібридизується з OsUbiintron або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах помірної жорсткості. Інтрон може мати послідовність, яка гібридизується з OsUbiintron або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах високої жорсткості. Промотором може бути будь-якою промотор. Промотор може являти собою індукований промотор. Приклади індукованих промоторів включають, зокрема, промотор, індукований спиртом, промотор, індукований тетрацикліном, промотор, індукований стероїдами, або промотор, індукований гормонами. Промотор може являти собою конститутивний промотор. Промотор може бути функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і спейсером. Промотор може являти собою промотор P-OsUbi. Послідовність промотору P-OsUbi може бути виявлена при посиланні на фіг. 2, яка ілюструє pAL409 разом з промотором P-OsUbi між положеннями 3574-4507. Послідовність pAL409 представлена нижче і в SEQ ID NO: 13. Нумерація нуклеотидів в SEQ ID NO: 13 може варіюватися як на фіг. 2, але при цьому порівняння відмічених послідовностей (наприклад, сайти рестрикції) між фіг. 2 і SEQ ID NO: 13 дає можливість ідентифікації будь-якої специфічної послідовності, характерної для pAL409. Промотор може включати послідовність, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з промотором P-OsUbi. Промотор може включати послідовність, яка гібридизується з промотором P-OsUbi або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах низької жорсткості. Промотор може включати послідовність, яка гібридизується з промотором P-OsUbi або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах помірної жорсткості. Промотор може включати послідовність, яка гібридизується з промотором P-OsUbi або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах високої жорсткості. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має будь-яку придатну послідовність для впливу РНКі на ген, що кодує білок-мішень. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має будь-яку придатну послідовність для впливу РНКі на ген, щокодує білок-мішень. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах in situ в 9 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 трансгенній рослині. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах низької жорсткості. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах помірної жорсткості. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах високої жорсткості. Білок-мішень може являти собою будь-який білок, залучений до регуляції Зеленого Крохмалю. Наприклад, білок-мішень може являти собою один з білка глюкан-вода-дикінази, фосфоглюкан-вода-дикінази, протеїнфосфатази з подвійною специфічністю, ß-амілази, ізоамілази, граничної декстринази, ферменту диспропорції або дерозгалужувального ферменту. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, яка гібридизується з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. Ген, що кодує білокмішень, може мати послідовність, яка гібридизується з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, яка гібридизується з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. Трансгенна рослина може бути створена за допомогою будь-якого методу трансформації. Наприклад, може використовуватися біолістична трансформація. Трансформація може здійснюватися з використанням будь-якого придатного вектора, який включає або складається з однієї або більше РНКі-конструкцій, представлених в даному документі. Може використовуватися трансформація, опосередкована Agrobacterium. Трансформація, опосередкована Agrobacterium, може використовувати будь-який придатний трансформуючий вектор, що несе одну або більше РНКі-конструкцій, представлених в даному документі. Трансформація, опосередкована Agrobacterium, може здійснюватися з використанням вектора, який має послідовність, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47. Будь-яка трансгенна рослина, представлена в даному документі, може бути запропонована в способі сільськогосподарського процесу одержання або в застосуваннях для тваринного корму. Трансгенна рослина може включати будь-яку одну або декілька РНКі-конструкцій, описаних в даному документі. Стадія одержання трансгенної рослини може включати її одержання з іншої частини, яку вона виробляє. Стадія одержання може включати створення трансгенної рослини. Спосіб сільськогосподарської переробки або застосування для тваринного корму може включати переробку трансгенної рослини. Послідовності драйвера в РНКіконструкції в трансгенній рослині можуть експресуватися в будь-якій стадії способу. Послідовності драйвера в РНКі-конструкції в трансгенній рослині можуть експресуватися перед стадією обробки рослини. Послідовності драйвера в РНКі-конструкції в трансгенній рослині можуть експресуватися під час стадії обробки рослини. Експресія може бути індукованою. Сільськогосподарський процес одержання може включати застосування створеної сировини з підвищеним рівнем крохмалю. Сировина може включати будь-яку трансгенну рослину, представлену в даному документі, індивідуально або в комбінації з іншими компонентами. Інший компонент може включати інший рослинний матеріал. Сільськогосподарська обробка являє собою маніпуляцію або перетворення будь-якої сільськогосподарської сировини для конкретного продукту або застосування. Сільськогосподарський процес одержання включає, зокрема, щонайменше одну з операцій у вигляді збирання урожаю, пресування, дрібного дроблення, перемелювання, рубання, дроблення, роздавлювання, гранулювання, екстракції компонента з сировини, очищення компонента або частин сировини, екстракції або очищення 10 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 крохмалю, гідролізу полісахаридів до олігосахаридів або моносахаридів, силосування, ферментації, хімічного перетворення або хімічного каталізу сировини. Один варіант здійснення включає спосіб зміни рівня рослинного крохмалю в рослині. Спосіб може включати експресію виділеної нуклеїнової кислоти в рослині. Експресія виділеної нуклеїнової кислоти в рослині може змінювати активність щонайменше одного ферменту, пов'язаного з метаболізмом крохмалю в рослині. Рослина може бути будь-якою трансгенною рослиною, представленою в даному документі. Трансгенна рослина може включати будь-яку одну або декілька РНКі-конструкцій, описаних в даному документі. У одному варіанті здійснення пропонується виділена нуклеїнова кислота, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з будь-якою з SEQ ID NO: 7-8, 11-18, 21-23, 3233, 37, 38 і 39-47. У одному варіанті здійснення пропонується виділена нуклеїнова кислота, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, яка гібридизується з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7-8, 11-18, 21-23, 32-33, 37, 38 і 39-47 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. У одному варіанті здійснення пропонується виділена нуклеїнова кислота, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, яка гібридизується з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7-8, 11-18, 21-23, 32-33, 37, 38 і 39-47 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. У одному варіанті здійснення пропонується виділена нуклеїнова кислота, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, яка гібридизується з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7-8, 11-18, 21-23, 32-33, 37, 38 і 39-47 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. Один варіант здійснення включає вектор, який містить будь-які РНКі-конструкції, представлені в даному документі. Вектор може бути проміжним вектором. Вектор може бути трансформуючим вектором. РНКі-конструкція у векторі може містити першу послідовність драйвера, що включає першу виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності по довжині першої виділеної нуклеїнової кислоти з частиною гена в рослині, що кодує білок-мішень, залучений до мобілізації рослинного крохмалю. РНКі-конструкція у векторі також може включати другу послідовність драйвера, що включає другу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою при умовах in situ в рослині, в яку може бути трансформований вектор. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою при умовах низької жорсткості. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою при умовах помірної жорсткості. Друга виділена нуклеїнова кислота може бути здатна гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою при умовах високої жорсткості. РНКі-конструкція у векторі також може включати спейсер, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера. Спейсер може розташовуватися між першою послідовністю драйвера і другою послідовністю драйвера. РНКіконструкція у векторі також може включати промотор, функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, з другою послідовністю драйвера і зі спейсером. Вектор, представлений в даному документі, може бути сконструйований для експресії в організмі-хазяїні гена, на який направлена дія РНКі-конструкції. При експресії РНКпослідовність, транскрибована з першої виділеної нуклеїнової кислоти, і РНК-послідовність, транскрибована з другої виділеної нуклеїнової кислоти, можуть бути здатні гібридизуватися одна з одною і викликати інгібування експресії гена в організмі-хазяїні. Вектор, представлений в даному документі, може включати першу послідовність драйвера, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, і SEQ ID NO: 37. Вектор, представлений в даному документі, може включати першу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. Вектор, представлений в 11 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даному документі, може включати першу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. Вектор, представлений в даному документі, може включати першу виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44 і SEQ ID NO: 45 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. Як представлено вище, друга виділена нуклеїнова кислота в будьякому векторі, описаному в даному розділі, може бути сконструйована так, щоб вона була здатна гібридизуватися з першою виділеною нуклеїновою кислотою. Гібридизація першої і другої виділених нуклеїнових кислот може здійснюватися в умовах in situ, що мають місце в рослині, в яку може бути трансформований вектор. Гібридизація першої і другої виділених нуклеїнових кислот може здійснюватися при умовах низької жорсткості. Гібридизація першої і другої виділених нуклеїнових кислот може здійснюватися при умовах помірної жорсткості. Гібридизація першої і другої виділених нуклеїнових кислот може здійснюватися при умовах високої жорсткості. Друга виділена нуклеїнова кислота може являти собою інвертовану комплементарну послідовність першої виділеної послідовності нуклеїнової кислоти. Спейсер у векторі, представленому в даному документі, може являти собою будь-яку послідовність. Спейсером може бути інтрон. Інтрон може бути будь-яким інтроном. Інтроном може бути OsUbiintron. Послідовність OsUbiintron може бути виявлена при посиланні на фіг. 2, яка ілюструє pAL409 разом з OsUbiintron між положеннями 4519-566. Послідовність pAL409 представлена нижче і в SEQ ID NO: 13. Нумерація нуклеотидів в SEQ ID NO: 13 може варіюватися відносно того, як відмічено на фіг. 2, але при цьому порівняння відмічених послідовностей (наприклад, сайти рестрикції) між фіг. 2 і SEQ ID NO: 13 дає можливість ідентифікації будь-якої специфічної послідовності, характерної для pAL409. Інтрон може мати послідовність, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з OsUbiintron. Інтрон може мати послідовність, яка гібридизується з OsUbiintron або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах низької жорсткості. Інтрон може мати послідовність, яка гібридизується з OsUbiintron або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах помірної жорсткості. Інтрон може мати послідовність, яка гібридизується з OsUbiintron або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах високої жорсткості. Промотор у векторі може являти собою будь-який промотор. Промотор може являти собою індукований промотор. Промотор може являти собою конститутивний промотор. Промотор може бути функціонально зв'язаний з першою послідовністю драйвера, другою послідовністю драйвера і спейсером. Промотор може являти собою промотор P-OsUbi. Послідовність промотору P-OsUbi може бути виявлена при посиланні на фіг. 2, яка ілюструє pAL409 разом з промотором P-OsUbi між положеннями 3574-4507. Послідовність pAL409 представлена нижче і в SEQ ID NO: 13. Нумерація нуклеотидів в SEQ ID NO: 13 може варіюватися відносно того, як відмічено на фіг. 2, але при цьому порівняння відмічених послідовностей (наприклад,сайти рестрикції) між фіг. 2 і SEQ ID NO: 13 дає можливість ідентифікації будь-якої специфічної послідовності, характерної для pAL409. Промотор може включати послідовність, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з промотором P-OsUbi. Промотор може включати послідовність, яка гібридизується з промотором P-OsUbi або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах низької жорсткості. Промотор може включати послідовність, яка гібридизується з промотором P-OsUbi або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах помірної жорсткості. Промотор може включати послідовність, яка гібридизується з промотором P-OsUbi або з послідовністю, комплементарною йому, при умовах високої жорсткості. Перша послідовність драйвера у векторі, представленому в даному документі, може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має будь-яку придатну послідовність для впливу РНКі на ген, що кодує білок-мішень. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37 або з 12 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. Перша послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має послідовність, здатну гібридизуватися з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 і SEQ ID NO: 37 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, яка має будь-яку придатну послідовність для впливу РНКі на ген, що кодує білок-мішень. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах in situ в трансгенній рослині. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах низької жорсткості. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах помірної жорсткості. Друга послідовність драйвера може являти собою виділену нуклеїнову кислоту, здатну гібридизуватися з першою послідовністю драйвера при умовах високої жорсткості. Білок-мішень, на який направлений вплив РНКі-конструкції у векторі, представленому в даному документі, може являти собою будь-який білок, залучений до регуляції Зеленого Крохмалю. Наприклад, білок-мішень може являти собою один з білка глюкан-вода-дикінази, фосфоглюкан-вода-дикінази, протеїнфосфатази з подвійною специфічністю, ß-амілази, ізоамілази, граничної декстринази, ферменту диспропорції або дерозгалужувального ферменту. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, яка має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, що гібридизується з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах низької жорсткості. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, що гібридизується з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах помірної жорсткості. Ген, що кодує білок-мішень, може мати послідовність, що гібридизується з нуклеїновою кислотою, яка включає, по суті складається з або складається з еталонної послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 43 або з комплементарних ним послідовностей, при умовах високої жорсткості. Вектор, представлений в даному документі, включає першу послідовність драйвера в 5'області відносно спейсера і прилягає до нього. Вектор, представлений в даному документі, може включати спейсер в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї. Вектор, представлений в даному документі, може включати першу послідовність драйвера, яка розташована в 5'-області відносно спейсера і прилягає до нього, і спейсер, який розташований в 5'-області відносно другої послідовності драйвера і прилягає до неї. Вектор, представлений в даному документі, може містити послідовність, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 47. 13 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Вектор, представлений в даному документі, може містити послідовність, яка включає, по суті складається з або складається з послідовності, що має щонайменше 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичності з еталонною послідовністю, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 14. У одному варіанті здійснення пропонується спосіб одержання трансгенної рослини. Спосіб включає трансформацію рослини з використанням одного або більше векторів, представлених в даному документі. Рослина може бути рослиною будь-якого типу. Рослина може являти собою енергетичну культуру рослин, харчову культуру або фуражну культуру рослин. Рослина може являти собою рис, просо, сорго, кукурудзу або томат. Додаткові варіанти здійснення включають ті, що формуються при читанні будь-якого залежного пункту формули винаходу, наведеної нижче, будучи залежними від будь-якого одного або більше з попередніх пунктів формули винаходу, аж до і включаючи їх основні незалежні пункти формули винаходу. Додаткові варіанти здійснення, представлені в даному документі, включають ті, що можуть бути сформовані шляхом доповнення будь-якого варіанта здійснення одним або більше елементами з інших, будь-якого одного або більше, варіантів здійснення, представлених в даному документі. Приклади - Наступні окремі приклади представлені для ілюстрації конкретних варіантів здійснення. Всі варіанти здійснення можуть бути доповнені одним або більше елементами з будь-якого одного або більше прикладів, наведених нижче. Приклад 1 Бібліотеки з вставкою Т-ДНК з різних організмів можуть бути досліджені на предмет локалізації в цих організмах генів, пов'язаних з регуляцією крохмалю. На основі відкриття таких генів може бути проведене дослідження для виявлення схожих генів в рослині, що представляє інтерес. Гени, що представляють інтерес, можуть використовуватися в конструкціях, представлених в даному документі, для того щоб викликати зміну в регуляції крохмалю. Для генерування або ідентифікації нульових алелей серед генів був розроблений ряд інших методів. Серед них TILLING (Till B.J., Cooper J., Tai T.H., Colowit Р., Greene E.A., Henikoff S., Comai L. Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING (2007) BMC Plant Biol. 7:19) і направлений вплив на ген за допомогою Tos17 ретротранспозонів або сконструйованих маїсових (Zea mays) Ac і Ds/dSpm транспозонів (Krishnan А., Guiderdoni Е., An G., Hsing Y.I., Han C.D., Lee M.C., Yu S.M., Upadhyaya N., Ramachandran S., Zhang Q., Sundaresan V., Hirochika Н., Leung Н., Pereira А. 2009. Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses. Plant Physiol. 149:165-70, і посилання цих публікацій), які включені в даний документ посиланням в повному обсязі. Ці методи можуть використовуватися для генерування або ідентифікації нульових алелей серед генів, пов'язаних з регуляцією крохмалю. Приклад 2 Приклад проміжного РНКі-вектора являє собою pAL409, який проілюстрований на фіг. 2. Як представлено на фіг. 2, інвертовані копії сегментів з транскрибованої ділянки з гена, на який направлений вплив, можуть вводитися в pAL409 по AvrII-сайту 220 (положення 4507) і по BspEIсайту 210 (положення 4519), і знов по AgeI-сайту 295(положення 566) і по NheI-сайту 290 (положення 620). При транскрипції з рисового убіквітинового промотору 230 (P-OsUbi3), інвертовані копії сегментів (послідовності драйвера) дозволяють одержувати РНК з утворенням шпильки, в якій OsUbi3-інтрон 200 служить як спейсер між повторюваними елементами. Сигнал поліаденілювання 280 (NOS 3') служить як термінатор транскрипції. Цільна експресуюча касета (від промотору до термінатора) може бути вирізана з цієї плазміди у вигляді фрагмента PacIXmaI за допомогою гідролізу по PacI-сайту 240 (положення 3574) і по XmaI-сайту 270 (положення 911). pAL409 також включає ColEI, Е. coli послідовність початку реплікації 260; і bla 250, маркер стійкості до ампіциліну. Послідовність pAL409 представлена нижче, але нумерація нуклеотидів і їх орієнтація відрізняються від зображених на фіг. 2. Фахівець здатний порівняти послідовність, наведену нижче, з векторною картою на фіг. 2, де наведена схема вектора. Проміжний РНКі-вектор, такий як pAL409, може використовуватися для введення тандемних інвертованих копій теоретично будь-яких послідовностей драйвера. >Послідовність pAL409 55 14 UA 109141 C2 15 UA 109141 C2 16 UA 109141 C2 17 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 У варіантах здійснення, представлених в даному документі, пропонуються проміжні РНКівектори, які реплікуються з одержанням великого числа копій в Е. coli, мають низьку складність геному і мають декілька стандартних сайтів рестрикції. pAL409 має ці характеристики. Вектори з такими характеристиками застосовні для збирання РНКі-експресуючих касет, які потім можуть бути перенесені в трансформуючий Agrobacterium вектор. Приклад 3 Типовий трансформуючий вектор, pAG2004, проілюстрований на фіг. 3 pAG2004 [SEQ ID NO: 14]. pAG2004 включає інтрон рисового убіквітину 300 (OsUbi3-інтрон), рисовий убіквітиновий промотор 330 (P-OsUbi3), PacI-сайт 340 (положення 155), XmaI-сайт 370 (положення 214), NOS 3', сигнал поліаденілювання 380, і ColE1, Е. coli послідовність початку реплікації 360. pAG2004 також включає ген фосфоманозоізомерази (PMI) 390, RB 391, st AT 392 і aadA 393. pAG2004 або схожі вектори можуть переноситися з Е. coli в Agrobacterium tumefaciens LBA4404 за допомогою кон'югаційного перенесення, в процесі якого плазміда інтегрується в pSB1 (резидентна Ti-плазміда) за допомогою гомологічної рекомбінації. Спільне культивування одержаного рекомбінантного штаму Agrobacterium разом з рослинними клітинами може привести в результаті до перенесення одержаної з pAG2004 ДНК в геном рослини. Варіанти здійснення, представлені в даному документі, включають трансформуючий вектор, що містить послідовності драйвера, зв'язані з мішенями для зміни Зеленого Крохмалю. Варіанти здійснення, представлені в даному документі, включають трансформуючий вектор, який містить фрагмент з pAL409, що включає послідовності драйвера, зв'язані з мішенями для зміни Зеленого Крохмалю. Варіанти здійснення, представлені в даному документі, включають трансформуючий вектор, який містить фрагмент PacI-XmaI з pAL409, що включає послідовності драйвера, зв'язані з мішенями для зміни Зеленого Крохмалю, замість фрагмента PacI-XmaI з pAG2004. Приклад 4 Послідовності з будь-якого гена, пов'язаного з регуляцією крохмалю, можуть бути представлені в проміжному РНКі-векторі, трансформуючому векторі або в трансгенній рослині, представленій в даному документі. Ці типові гени для направленого впливу на РНК інтерференцію в рисі являють собою GWD, DSP і ISA3. У SEQ ID NO: 1-3 наведені послідовності для рисових генів GWD, DSP і ISA3, відповідно. У SEQ ID NO: 4-6 наведені передбачені кодуючі послідовності для рисових генів GWD, DSP і ISA3, відповідно. Послідовності генів GWD, DSP і ISA3 взяті з бази даних RiceGE: реєстраційні № 0s06g30310 (GWD); 0s03g01750 (DSP) і 0s09g29404 (ISA3). 18 UA 109141 C2 5 Приклад 5 На основі кодуючих послідовностей в SEQ ID NO: 3-4 синтезували штучну кДНК і забезпечували джерело експресії відповідних генів в гетерологічних системах (наприклад, Е. coli або дріжджі), які, в свою чергу, роблять можливим одержання антитіла для застосування в аналізі одержуваних трансгенних рослин. Плазмідні ДНК, що несуть цільні кодуючі послідовності SEQ ID NO: 3-4, використовували як матриці в ПЛР-реакціях для одержання послідовностей драйвера, використовуваних в РНКіконструкціях. Для гена GWD одержували дві окремі послідовності драйвера. >GWD1 послідовність драйвера (одна копія) 10 >GWD2 послідовність драйвера (одна копія) 15 20 25 30 GWD1 одержана з ділянки поруч з 5'-кінцем кодуючої послідовності GWD. Друга послідовність драйвера GWD, GWD2, одержана з ділянки поблизу середини кодуючої послідовності GWD, яка відповідає ділянці відносно високої консервативності генів GWD з різних видів. Див. фіг. 4, яка ілюструє порівняння між GWD2, одержаною з рисового гена глюканвода-дикінази, і геном GWD з томата (Solanum lycopersicon). Несподівано, аналіз BLAST [публікація Zhang Z., Schwartz S. Wagner L. and Miller W., А greedy algorithm for aligning DNA sequences (2000), J Comput. Biol. 2000; 7(1-2):203-14, яка включена в даний документ посиланням в повному обсязі] цих двох послідовностей виявив суттєву гомологію, незважаючи на філогенетичну віддаленість, яка розділяє ці два види (рис - однодольна рослина, в той час як томат - дводольна). Це передбачає, що дана ділянка гена GWD могла б служити як широко застосовна мішень для РНК-інтерференції. На фіг. 4 запитна послідовність (Query) (верхня) являє собою ділянку послідовності драйвера GWD2 [SEQ ID NO: 9]; і порівнювана з нею (Sbjct) (нижня послідовність) являє собою кДНК-послідовність GWD томата [SEQ ID NO: 10]. Завдяки гомології послідовностей на протязі цієї ділянки можливо, щоб РНКі-конструкція, направлена проти цієї ділянки в рисовому гені, також могла б застосовуватися для пригнічення експресії гомологічних генів GWD в інших видах рослин. Варіанти здійснення включають способи, вектори і трансгенні рослини, що включають послідовності РНКі з направленим впливом на GWD. 19 UA 109141 C2 Ділянки генів DSP і ISA3 з рису також вибрали, щоб вони служили як послідовності драйвера. >Послідовність драйвера DSP1 5 >Послідовність драйвера ISA3 10 15 20 25 30 Кожну послідовність драйвера, GWD1, GWD2, DSP1 і ISA3, ампліфікували за допомогою ПЛР, так що кожна була фланкована сайтами розпізнавання ферментів рестрикції (наприклад, NheI і XmaI). Фрагменти спочатку лігували в pCRBlunt II TOPO (Invitrogen), з підтвердженням за допомогою гідролізу множини ферментів рестрикції і за допомогою секвенування, потім розрізали (з використанням ферментів рестрикції, які розщеплюють введені фланковані сайти) і лігували спочатку по сайтах BspEI і AvrII і потім по сайтах NheI і AgeI з pAL409 (фіг. 2), які розташовувалися у вигляді двох копій в протилежних орієнтаціях. Одержані в результаті РНКікасети вирізали з похідних pAL409 у вигляді фрагментів PacI-XmaI і лігували в pAG2004 (фіг. 3), з одержанням плазмід pAG2100, pAG2102 і pAG2103. На фіг. представлені РНКі-касети з направленим впливом на рисові гени GWD, DSP і ISA3, де дві верхні послідовності одержані з гена GWD, середня з DSP і нижня з гена ISA3. Кожний з цих елементів драйвера представлений у вигляді дубльованих інвертованих копій, які розділені за допомогою інтрона OsUbi3 і прилягають до нього. Ліворуч перераховані назви конструкцій, які збирали в плазміді pAL409. Праворуч перераховані назви плазмід, які були одержані, коли РНКі-касети вирізали з pAL409 у вигляді фрагментів PacI-XmaI і вставляли в pAG2004. Все ще посилаючись на фіг. 3, pAL409-6WDko1-конструкція включає промотор P-OsUbi 331, послідовність драйвера GWD1 310, OsUBi-інтрон 301, інвертовану послідовність драйвера GWD1 311 і NOS 3', послідовність поліаденілювання 381. pAL409-6WDko2-конструкція включає промотор P-OsUbi 332, послідовність драйвера GWD2 312, OsUBi-інтрон 302, інвертовану послідовність драйвера GWD2 313 і NOS 3', послідовність поліаденілювання 382. pAL409DSPko1-конструкція включає промотор P-OsUbi 333, послідовність драйвера DSP1 314, OsUBiінтрон 303, інвертовану послідовність драйвера DSP1 315 і NOS 3', послідовність поліаденілювання 383. pAL409-ISA3kol-конструкція включає промотор P-OsUbi 334, 20 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 послідовність драйвера ISA3 316, OsUBi-інтрон 304, інвертовану послідовність драйвера ISA3 317 і NOS 3', послідовність поліаденілювання 384. За допомогою заміни фрагмента PacI-XmaI pAG2004 на фрагменти PacI-XmaI конструкцій pAL409-6WDko1, pAL409-6WDko2, pAL409DSPko1 і pAL409-ISA3ko1, одержували плазміди pAG2100 [SEQ ID NO: 15], pAG2101 [SEQ ID NO: 16], pAG2102 [SEQ ID NO: 17] і pAG2103 [SEQ ID NO: 18], відповідно. Приклад 6 Генерування трансгенних рослин Штами E. coli, що несуть pAG2100, pAG2101, pAG2102 або pAG2103, використовували для кон'югації з Agrobacterium і для подальшої трансформації рису, маїсу і проса. РНКі-конструкція сорго План геномної послідовності, відповідної передбачуваному гену GWD з Сорго двокольорового [SEQ ID NO: 19], був одержаний зі сторінки Сорго двокольорового Об'єднаного Інституту Генома (JGI) за адресою (http://genome.jgi-psf.org/Sorbil/Sorbil.home.html). З цієї послідовності ідентифікували ділянку, приблизно відповідну ділянці гена GWD2 рису [SEQ ID NO: 20]. У сорго кодуючі послідовності в цій ділянці розриваються одним або більше інтронами, як ідентифіковано за допомогою JGI, і інтрони приблизно відповідають нуклеотидам 140-342, нуклеотидам 507-628 і нуклеотидам 723-795 в SEQ ID NO: 20. Нативний інтрон, одержаний з геному сорго, застосовували в збиранні РНКі-касети для вимкнення гена GWD в сорго. Ділянку гена GWD сорго ампліфікували. Ампліфікована ділянка включала один повний екзон (на основі прогнозу JGI) всередині висококонсервативної серединної ділянки (описано раніше, див. фіг. 4), сусідній інтрон, і 10 основ подальшого екзона (для збереження границь 3' інтрон/екзон). Сайт XmaI інкорпорували в 5'-області першого екзона, а сайти AgeI і NheI інкорпорували в 3'-області укороченого другого екзона в процесі ПЛР-ампліфікації продукту. Даний продукт (SbGWDko2a) спочатку лігували в pCRBluntII TOPO (Invitrogen), і його склад підтверджували за допомогою гідролізу з використанням множини ферментів рестрикції і за допомогою секвенування. >SbGWDko2a (з фланкуючими сайтами рестрикції) Другий ПЛР-продукт (SbGWDko2b), відповідний тільки першому екзону, згаданому вище, також ампліфікували за допомогою ПЛР з введенням фланкуючих сайтів NheI і XmaI на 5'- і 3'кінцях (відносно напряму транскрипції) і лігували в pCRBluntII TOPO. Склад даного фрагмента також підтверджували за допомогою гідролізу з використанням множини ферментів рестрикції і за допомогою секвенування. >SbGWDko2b (з фланкуючими сайтами рестрикції) Потім SbGWDko2b вирізали з pCRBluntII у вигляді фрагмента NheI-XmaI, і лігували по сайтах NheI і AgeI плазміди, що несе SbGWDko2a, розташовуючи SbGWDko2b в 3'-області відносно інтрона і в протилежній орієнтації з SbGWDko2a. У даній орієнтації послідовності в sbGWDko2b-ділянці плазміди присутні у вигляді інвертованих комплементарних послідовностей всередині ділянки sbGWDko2a. Посилаючись на фіг. 5, дану цільну касету вирізали у вигляді фрагмента XmaI-NheI і лігували в pAL409j, з одержанням плазміди pAL409j SbGWDko2 [SEQ ID 21 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 47]. pAL409j несе РНКі-касету з направленим впливом на ген GWD Сорго двокольорового. Послідовність драйвера 510 (sbGWDko2a) показана на фіг. 5 в 5'-області відносно інтрона 520 (sbGWDi), який показаний в 5'-області відносно послідовності драйвера 530 (sbGWDko2b). pAL409j відрізняється від pAL409 тільки в тому, що з'єднання між промотором OsUbi3 і OsUbi3iінтроном було модифіковане для відображення нативного контексту в геномі рису. Як така дана операція може оберігати енхансерні функції OsUbi3i відносно промотору OsUbi3. Як представлено на фіг. 5, дві інвертовані, гомологічні послідовності драйвера, одержані з екзона всередині гена GWD сорго (GWDex), розділені нативним екзоном сорго гена GWD сорго (SbGWDi). Інші елементи мають назви як на фіг. 2. Потім вирізали цільну РНКі-касету з pAL409j SbGWDko2 у вигляді фрагмента PacI-XmaI і лігували по сайтах PacI і XmaI pAG2004, з одержанням трансформуючого Agrobacterium вектора pAG2106 [SEQ ID NO: 23] так, як описано в посиланні на фіг. 3. Штам E. coli, що несе pAG2106, використовували для кон'югації з Agrobacterium і для подальшої трансформації сорго. Приклад 7 Секвенування генів GWD проса Гомологи GWD і ISA3 детектували в геномі проса, і кількість гомологів, які присутні для кожного, оцінювали з використанням стратегії аналізу по Саузерну. Результати аналізу по Саузерну з використанням зонда ISA3 рису представлені на фіг. 6. На фіг. 6 представлене детектування гомологів ISA3 за допомогою аналізу по Саузерну. Геномну ДНК екстрагували з рису, сорго, маїсу і проса, гідролізували за допомогою HindIII, і розділяли з використанням електрофорезу на агарозному гелі. ДНК потім переносили на нейлонову мембрану за допомогою капілярного блотингу і блоти гібридизували з DIG-міченою ДНК, одержаною з клонованого гена ISA3 рису. У той час як зонд гібридизувався тільки з унікальними фрагментами в рисі і сорго, той же самий зонд гібридизувався з 3-5 фрагментами в геномах маїсу і проса. Як контроль використовували плазмідну ДНК, що несе кодуючу послідовність ISA3 рису; і маркер у вигляді молекулярних масових стандартів ДНК. Були одержані аналогічні результати, коли як зонд використовували фрагмент GWD2 (не показано). Було визначено, що на відміну від рису і сорго, які містять єдині копії GWD і ISA3, просо містить множину гомологів кожного з цих генів. Ділянку гена GWD проса ідентифікували і клонували з використанням методу виродженої ПЛР. Вироджена ПЛР застосовує олігонуклеотидні праймери, що містять одну або більше невизначених основ, які дають можливість праймерам відпалюватися на послідовностях матриці, для яких доступна тільки приблизна інформація про послідовність. Тобто, в ділянках суттєвої консервативності послідовності між генами значно віддалених видів, фахівець може зробити висновок про інтервал можливих послідовностей, які можуть бути присутніми у відповідному гені з недостатньо охарактеризованих видів, таких як просо. Потім фахівець може сконструювати вироджені праймери, які будуть відпалюватися на передбачених послідовностях, даючи можливість ПЛР-ампліфікації і клонування ділянки гена, який розглядається. Проводячи стратегію виродженої ПЛР, вирівнювали ділянки генів GWD, одержаних з рису, сорго, маїсу і томата. Сильне вирівнювання спостерігалося в ділянці генів GWD, яка описана на фіг. 4. Короткі (~40 нт) ділянки поблизу кінців цих ділянок гомології були вибрані для більш докладного порівняння послідовностей (фіг. 7). Фіг. 7 ілюструє вирівнювання вибірки з генів GWD рису (OsGWD) [SEQ ID NO: 24 (верхня) і 28 (нижня)], сорго (SbGWD) [SEQ ID NO: 25 (верхня) і 29 (нижня)], маїсу (ZmGWD) [SEQ ID NO: 26 (верхня) і 30 (нижня)] і томата (SIGWD) [SEQ ID NO: 27 (верхня) і 31 (нижня)]. Нуклеотидні положення, які консервативні, щонайменше в двох з чотирьох послідовностей відмічені ясно-сірим. Внизу для кожної групи представлена консенсусна послідовність, для якої були сконструйовані вироджені праймери (dgGWDup2 і dgGWDdown2 [SEQ ID NO: 32 і 33, відповідно]) для ПЛР-ампліфікації. Примітно, що тільки неповна послідовність доступна для маїсового гомолога, з ділянкою невідомої послідовності, представленої як Ns. Чотири послідовності, вирівняні у верхньому сегменті, відповідають ділянці кодуючих послідовностей GWD, які можна виявити на ділянці нуклеотидів 1803-1840 кодуючої послідовності томата (як визначено на фіг. 4), в той час як вирівнювання в нижньому сегменті відповідають нуклеотидам 2208-2249 послідовності томата. Нуклеотидні скорочення для вироджених нуклеотидів представлені нижче: Y, С або Т; W, А або Т; K, G або Т; R, А або G, M, А або С; Н, А або С, або Т; S, G або С; D, А або G, або T. На основі даної інформації конструювали вироджені праймери (dgGWDup2: 5'-TGGAATTYTTGTWTGGATKAGRTTCATGGCTACMAGGCA-3' і dgGWDdown2: 5'-GGYTCWGAATGRATMGSWCGRTCATARCTCAADAGACGCTCT-3'). Геномну ДНК, яка була виділена з сорго, потім використовували як матрицю в реакціях ПЛР з даними праймерами. За допомогою виродженої ПЛР з геномною ДНК сорго як матрицею одержували ПЛР-продукт з 22 UA 109141 C2 5 10 15 20 25 30 розміром приблизно 800 п.о. Секвенування даного ПЛР-продукту виявило, що він має близьку спорідненість з послідовністю, яка була передбачена для гена GWD сорго за допомогою бази даних JGI (див. вище), яка виявила, що вироджені праймери будуть достовірно ампліфікувати сегмент гена GWD. Ті ж праймери потім використовували в ПЛР-реакціях, в яких використовували геномну ДНК проса (екотип Alamo) як матрицю. Ці реакції продукували дискретні ПЛР-продукти розміром приблизно 1100 п.о. Ці продукти лігували в pCRBluntII TOPO і п'ять одержаних в результаті плазмід секвенували. На основі цих п'яти послідовностей визначили, що: • Кожний клонований ПЛР-продукт одержували з гена з дуже суттєвою гомологією з геном GWD рису. • Серед п'яти секвенованих продуктів було три очевидних класи (високогомологічних) послідовностей, які передбачають, що клони були одержані з трьох різних гомологів GWD всередині геному проса. Це спостереження узгоджується з даними аналізу по Саузерну, який передбачає множину генів GWD, розташованих всередині геному проса. • Головні відмінності в розмірах продуктів, які були одержані з виродженої ПЛР сорго і проса, можуть пояснюватися відмінностям по довжині передбачуваних інтронів в кожному з відповідних генів. При посиланні на фіг. 8, ілюструється порівняння відносної довжини і розташування інтронів всередині корового сегмента гомології генів GWD з рису, сорго, Arabidopsis, і з проса. Темні бокси представляють екзони, а світлі бокси представляють інтрони. Послідовності екзонів дуже консервативні і легко розпізнавані. У той час як відносні положення кожного з інтронів також дуже консервативні серед видів, при цьому довжина і послідовність інтронів не так консервативні. Довжини інтронів і екзонів вказані в п.о. всередині кожного елемента. Як показано нижче, вирівнювання послідовностей з трьох одержаних з проса продуктів виродженої ПЛР, представлених нижче, демонструє, що відносно небагато одиничних нуклеотидних змін і дві деякі вставки/делеції по довжині відрізняють ці три GWD-гомологи в даній ділянці. Ці три продукти являють собою PvGWD-2 [SEQ ID NO: 34], PvGWD-5 [SEQ ID NO: 35] і PvGWD-1 [SEQ ID NO: 36]. CLUSTAL 2.0.10 вирівнювання множини послідовностей 23 UA 109141 C2 24 UA 109141 C2 25 UA 109141 C2 5 10 15 Послідовності екзонів з гена(ів) GWD проса були виведені на основі вищеописаної інформації. Виведені послідовності використовували для (1) розробки РНКі-конструкції, яка буде направлено впливати на дану центральну ділянку одного або всіх з генів GWD проса, і (2) визначення більшої кількості геномних послідовностей для кожного з цих (щонайменше для трьох) GWD-гомологів в просі. Для розробки РНКі-конструкції ПЛР використовували для ампліфікації ділянок з двох екзонів, охоплених в продуктах виродженої ПЛР, описаних вище. Ці два продукти потім зшивали за допомогою SOEPCR (Horton R.M., Hunt H.D., Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R., Engineering hybrid genes with out the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension (1989), Gene 77(1):61-8), яка включена в даний документ посиланням в повному обсязі. Зшиті продукти включали безперервну послідовність, яка, як очікувалося, була більш близька одній або більше мРНК GWD проса. Сайти NheI і XmaI інкорпорували в кінець зшитого продукту, щоб була можливість подальшого клонування в pAL409. Послідовність даного продукту (названого "PvGWDko2" поряд з фланкуючими сайтами рестрикції) зображена нижче. >Послідовність драйвера РНКі PvGWDko2 26 UA 109141 C2 5 10 15 20 Одну копію даного елемента лігували по сайтах AvrII і BspEI pAL409, потім другу копію лігували по сайтах NheI і AgeI одержаної плазміди з одержанням РНКі-касети pAL409 PvGWDko2, яка містила елементи, розташовані в протилежних орієнтаціях, розділених інтроном OsUbi3, як описано в посиланні на фіг. 3. РНКі-касету вирізали з даної плазміди у вигляді фрагмента PacI-XmaI і лігували по сайтах PacI і XmaI pAG2004 (фіг. 3). Одержаний трансформуючий Agrobacterium вектор назвали pAG2104 [SEQ ID NO: 38]. Штам E. coli, що несе дану плазміду, використовували для кон'югації з Agrobacterium і для подальшої трансформації проса. При вивченні повних геномних послідовностей кожного з генів GWD в просі може бути можлива ідентифікація потенційних унікальних послідовностей (5'- і 3'-нетрансльованих ділянок), які фланкують кожний з цих генів. З використанням даної інформації можливе конструювання РНКі-конструкцій, які специфічно направлено впливають на один з цих генів або на інші. Для ідентифікації більшої кількості послідовностей, асоційованих з кожним з GWD гомологів, додержувалися стратегії, яка застосовує зворотну ПЛР (зПЦР (iPCR)), а також вироджену ПЛР. Геномну ДНК з проса гідролізували з використанням або EcoRI, HindIII, або Bgl II. Потім їх піддавали самолігуванню, розводили приблизно в 100 разів і використовували як матриці для зворотних ПЛР-реакцій. Послідовності перших праймерів, використаних в зПЦР-реакціях, підсумовані в таблиці 1. Таблиця 1 Послідовності праймерів, використовуваних для зворотної ПЛР PvGWDi-1 PvGWDi-2 PvGWDi-3 PvGWDi-4 25 30 35 40 45 CCGTGGCTTCACATTATAGTTCTTATTCCA GAGATAAGCAAAGCACAAGATAGGT GCCTGCCCAAGGAGAGACATAACCA GATATAAGTGTTTACTGGGACACCT SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 Зворотні ПЛР-реакції або з праймерами PvGWDi-1 і PvGWDi-2, або з праймерами PvGWDi-3 і PvGWDi-4 проводили з використанням матриць, гідролізованих за допомогою EcoRI або HindIII (і самолігованих). За допомогою цих реакцій одержували невелику кількість чистих продуктів, які очищали з агарозних гелів і лігували в pCRBluntII-TOPO. Аналіз послідовності одержаних в результаті плазмід давав можливість розширення відомої послідовності генів GWD проса в обох напрямах, в 5' і в 3' загалом до 3,4 т.п.о. І знов, послідовності з індивідуальних клонів відрізнялися приблизно на 1-2 %, узгоджуючись з ідеєю, що клоновані ПЛР продукти одержували з окремих, але дуже схожих GWD-гомологів в геномі проса. Це випробування повторювали з новими сконструйованими праймерами, включаючи як зворотну ПЛР, так і вироджену ПЛР для додаткового розширення відомої послідовності. Ідентифікували приблизно 7 т.п.о. послідовності GWD проса. Пропонується укрупнена послідовність, що представляє послідовності гена GWD проса, відкриті в даному документі. Представлена послідовність не включає всі з варіантів, ідентифікованих серед гомологів. Таким чином, послідовність може розглядатися як химера даних гомологів. Дана послідовність охоплює сегмент приблизно 1-2 т.п.о., для якого немає даних про послідовність. Даний сегмент представлений як послідовність Ns. Посилаючись на фіг. 9 ілюструється зображення точкової матриці вирівнювань BLASTn між геномними послідовностями проса і рису для глюкан-вода-дикіназних генів. Горизонтальна вісь представляє послідовність проса; і вертикальна вісь представляє послідовність рису. Діагональні сегменти представляють ділянки, де дві послідовності високогомологічні. Дана схема представляє гомологію послідовності проса, представленої нижче, з відповідною послідовністю гена GWD рису. 27 UA 109141 C2 >гомологи GWD проса 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюPlants with altered levels of vegetative starch
Автори англійськоюLessard, Philip, A., Lanahan, Michael, Samoylov, Vladimir, Bougri, Oleg, Emery, Janas, Raab, R., Michael
Автори російськоюЛессард Филлип А., Ланахан Майкл, Самойлов Владимир, Бугри Олег, Эмери Йонас, Рааб Р. Майкл
МПК / Мітки
МПК: A01H 5/00, C12N 15/52, C12N 15/82
Мітки: рівнем, рослина, рослинного, збільшеним, трансгенна, крохмалю
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/146-109141-transgenna-roslina-zi-zbilshenim-rivnem-roslinnogo-krokhmalyu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна рослина зі збільшеним рівнем рослинного крохмалю</a>
Реактивний двигун з збільшеним рівнем реактивної тяги та зменшеним рівнем акустичних шумів
Номер патенту: 15477
Опубліковано: 17.07.2006
Автори: Гріцун Сергій Миколайович, Федосенко Володимир Олегович, Тарасова Галіна Борісовна, Фєдосєнко Олєг Фьодоровіч, Павлов Сергій Петрович
МПК: F02K 9/84
Мітки: шумів, рівнем, реактивної, зменшеним, реактивний, тяги, двигун, акустичних, збільшеним
Формула / Реферат:
1. Реактивний двигун з збільшеним рівнем реактивної тяги та зменшеним рівнем акустичних шумів, що містить газогенератор із соплом для формування діаграми витікаючого газового потоку, який відрізняється тим, що співвісно з соплом реактивного двигуна додатково установлено об'ємний резонатор з реактивним соплом, герметично з'єднаним з корпусом газогенератора.2. Реактивний двигун з збільшеним рівнем реактивної тяги та зменшеним рівнем...
Трансгенна рослина кукурудзи mir604
Номер патенту: 94893
Опубліковано: 25.06.2011
Автори: Чен Ерік, Мегхіджі Мьоз, Штейнер Генрі-Йорк
МПК: C12Q 1/68, A01H 5/00, G01N 33/53, C12N 15/11
Мітки: mir604, кукурудзи, рослина, трансгенна
Формула / Реферат:
1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 або комплементи SEQ ID NO: 1-4.2. Амплікон, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.3. Рослина кукурудзи, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.4. Рослина кукурудзи за п. 3, у якій після розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою KрnІ при гібридизації в строгих умовах з використанням...
Стійка до грибків трансгенна рослина solanaceae
Номер патенту: 102522
Опубліковано: 25.07.2013
Автори: ван дер Воссен Едвін Андріс Герард, Мюскенс Марина Воутера Марія, Аллефс Йозефус Якобс Хенрікус Марія
МПК: C12N 15/82, C12N 15/29, A01H 5/00
Мітки: рослина, solanaceae, трансгенна, стійка, грибків
Формула / Реферат:
1. Трансгенна рослина або трансгенна тканина, або їх частина, що є представником родини Solanaceae, яка включає рослинну клітину, яка включає: (i) полінуклеотид, що кодує білок Rpi-blb2, який включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, яка складається з:(а) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує принаймні зрілу форму поліпептиду, представленого у SEQ ID NO: 2 або 4;(b) молекули нуклеїнової кислоти, яка включає...
Днк, яка включає промоторну послідовність (варіанти), і трансформована з її використанням трансгенна рослина
Номер патенту: 74535
Опубліковано: 16.01.2006
Автори: Чунг Йонг-Йун, Лі Січул, Ан Гунхйонг, Джеон Джонг-Сеонг
МПК: A01H 5/00, C12N 15/09, C07K 14/415, C12N 15/82
Мітки: трансформована, днк, послідовність, використанням, варіанти, трансгенна, рослина, яка, промоторну, включає
Формула / Реферат:
1. ДНК для експресії кодувальної послідовності, яка має нуклеотидну послідовність, яка на 50% або більше ідентична нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 2, і яка включає промоторну послідовність, яка має здатність забезпечувати експресію зв'язаної кодувальної послідовності специфічно в тапетумі, тканині ендотецію і сполучній тканині пиляків, але не в мікроспорах чи пилку, причому експресія кодувальної послідовності починається на стадії...
Модифікований фермент dmo та трансгенна рослина, що його продукує
Номер патенту: 94613
Опубліковано: 25.05.2011
Автори: Вікс Дональд П., Фен Пол К.К., Думітру Разван, Клементе Томас Е., Фласінскій Станіслав
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00
Мітки: модифікований, продукує, трансгенна, фермент, рослина
Формула / Реферат:
1. Молекула нуклеїнової кислоти, вибрана з групи, що складається з:a) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з SEQ ID NO:1;b) молекули нуклеїнової кислоти, що включає послідовність з SEQ ID NO:2; іc) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності з поліпептидом з SEQ ID NO:1, де поліпептид має дикамба-монооксигеназну активність і включає цистеїн у...
Попередній патент: Гетероциклічні сполуки бензодіоксолу або бензодіоксепіну як інгібітори фосфодіестераз
Наступний патент: Спосіб зупинки автомобіля, що наїхав на огорожу дороги, та пристрій для його здійснення
Випадковий патент: Спосіб одержання похідних біфеніл-2-карбонової кислоти