Спосіб визначення культур lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Винахід належить до способу визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції, що використовують при дослідних та виробничих роботах з ідентифікації ДНК молочнокислих бактерій Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, а саме фрагмента ДНК Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus розміром 110 bр у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. UA 112951 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовують спосіб на підприємствах молочної та м'ясопереробної галузі, у наукових дослідженнях при проведенні моніторингу зразків заквасок, бактеріальних препаратів та ферментованих харчових продуктів, технологічних роботах у промисловості, виробничих роботах і для контролю якості продукції згідно з нормативними та супровідними документами відповідно на виробництві та у торгівельних мережах. Лактобацили є важливим біотехнологічним об'єктом і використовуються у складі заквасок при виробництві кисломолочних продуктів (йогурт, кисле молоко, ряжанка і сири). Лактобацили входять до складу лікарських пробіотичних препаратів та біологічно активних добавок для профілактики кишкових розладів у людей, також у кормові добавки для тварин [1]. Актуальність роботи. У зв'язку з інтенсивним розвитком молочної промисловості в даний час існує проблема виробництва кисломолочних продуктів із заданими стабільними показниками якості. Для контролю їх якості досі немає чітко виробленої схеми, за якою б визначалася не лише технологічна придатність, але і безпека використання чистих культур бактерій і бактеріальних заквасок для виробництва кисломолочних продуктів. Проблема достовірного визначення якості і, насамперед, видової ідентифікації молочнокислих бактерій, що входять до складу бактеріальних заквасок, є особливо актуальною [2]. Одним з підходів до вирішення описаних проблем, пов'язаних з контролем якості та експертизою молочних продуктів, є використання тест-систем, заснованих на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), для точної ідентифікації мікроорганізмів, що входять до складу бактеріальних заквасок, бактеріальних концентратів і чистих культур, що використовуються у виробництві кисломолочної продукції [3]. Бактерії Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus є основним компонентом кисломолочних продуктів функціонального харчування. Вживання молочних продуктів, що містять ці мікроорганізми, сприяє нормалізації кишкової мікрофлори, зміцненню імунітету організму. Для ідентифікації молочнокислих бактерій, що застосовуються у бактеріальних заквасках, використовують стандартні мікробіологічні підходи: виділення та встановлення їх таксономічного положення на основі вивчення морфологічних, біохімічних, культуральних і технологічних властивостей. Проте неможливо провести видову ідентифікацію молочнокислих бактерій лише за допомогою класичних фенотипових методів [4, 5]. Крім того, використання традиційних технологій не завжди дозволяє ефективно підбирати безпечні і технологічні штами молочнокислих бактерій для використання їх як заквашувальних культур у виробництві ферментованих молочних продуктів і пробіотичних препаратів. Ідентифікацію видів і генетичне типування на рівні штамів молочнокислих бактерій, які на практиці використовуються у харчовій промисловості, необхідно провадити за допомогою міжнародно визнаних молекулярних методів [6]. Альтернативою класичній ідентифікації може стати метод генотипування з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Розробка нових та оптимізація вже відомих молекулярно-генетичних методик індикації і точної видової ідентифікації бактерій роду Lactobacillus є актуальним, практично значущим та своєчасним завданням [7]. Полімеразна ланцюгова реакція дозволяє ефективно проводити ідентифікацію та детекцію генів культур мікроорганізмів за допомогою підібраних специфічних праймерів. Праймери - це синтетичні олігонуклеотиди, які являють собою короткі фрагменти нуклеїнової кислоти, комплементарні певним послідовностям ДНК або РНК. Вони ініціюють синтез нового комплементарного ланцюга ДНК, починаючи з 3'-кінця за участі ДНК-полімерази і одночасно обмежують ділянку ДНК, що піддається ампліфікації [8]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило метод ПЛР зручним та загальновживаним. Для гена або ділянки ДНК, яка цікавить дослідників, підбирається пара праймерів, за допомогою якої можна провести ампліфікацію ділянки характерної довжини і отримати відповідні амплікони, які ідентифікують за допомогою розділення методом електрофорезу в агарозному гелі [9]. Біохімічні та морфологічні властивості лактобацил є на сьогодні основним і єдиним критерієм міжродової та видової належності цих мікроорганізмів. Рід Lactobacillus налічує близько 140 видів. Однак диференціація близькоспоріднених видів на підставі біохімічних властивостей ускладнена внаслідок схожих властивостей штамів, а ідентифікація молочнокислих бактерій лише на підставі морфологічних ознак не є можливою через високий рівень фенотипової мінливості [10]. До способів детекції бактерій виду Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus належать дослідження з використаним різноманітних селективних середовищ. На селективному середовищі G-MRS (Galactose MRS) вони утворюють білі колонії неправильної форми; на 1 UA 112951 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 селективному середовищі TPPYPB (TPPY з берлінською лазуррю) Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus утворює маленькі білі колонії з блакитним ореолом; на селективному середовищі TPPY (Tryptose Proteose Peptone yeast extract-eriochrome T agar) - пласкі, прозорі, дифузні колонії невизначеної форми з нерівною кромкою [11]. Також Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ідентифікують за появою колоній цих мікроорганізмів із характерним білим забарвленням при вирощуванні на кров'яному агарі з біфідофактором, блакитним забарвленням за методом ГГДС (гомофермантативнихгетероферментативних диференціальних середовищ). До теперішнього часу основним способом типування штамів і ізолятів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus є метод, заснований на накопиченні даних бактерій в знежиреному молоці. Молочнокислі бактерії, як правило, хемоорганотрофи і ферментують вуглеводи з виробленням молочної кислоти як основного кінцевого продукту. Ідентифікацію, визначення бактерій за фенотиповими ознаками проводять шляхом співставлення отриманих результатів з даними диференціальних таблиць, наведених у довіднику [12]. До недоліків даного способу можна віднести необхідність проведення великої кількості біохімічних досліджень, тривалість процесу тестування і високу собівартість. Молекулярні методи можуть використовуватися для таксономічних аналізів і первинного визначення виду, до якого належить бактерія. До них належать ДНК-гібридизація, секвенування, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), риботипування, полімеразна ланцюгова реакція поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (ПЛР-ПДРФ), рестрикційний ферментний аналіз (РФА), рандомна ампліфікація поліморфної ДНК (RAPD), REP-ПЛР, AFLP, профілювання плазмід і імпульсний гель-електрофорез у електричному полі (PFGE). Однак, ідентифікація, визначення може бути зроблене з високим ступенем достовірності тільки за допомогою перевіреного методу, зондів або правильно підібраних праймерів з попередньою перевіркою на бактеріях близьких родів, видів або штамів [13, 14, 15]. Розроблено метод генотипування Lactobacillus, що включає послідовний синтез олігонуклеотидних праймерів на міжгенні вставки 16S-23S рРНК [16]. Дослідження, засновані на рДНК 16S призвели до нової диференціації видів Lactobacillus на три основні групи: Leuconostoc, Delbrueckii, Casei-Pediococcus [17, 18]. Відомий метод генотипування Lactobacillus, що включає послідовний синтез олігонуклеотидних праймерів на міжгенних вставках 16S-23S рРНК, синтез послідовності ДНК міжгенних вставок і гідроліз їх ендонуклеазою. Далі проводиться електрофорез і порівняння отриманих паттернів за 6 специфічними базовими точками з референтними штамами. Цей метод дозволяє розрізняти майже всі ізольовані культури на рівні виду [19]. До недоліків даного методу можна віднести необхідність проведення гідролізу ампліконів і порівняння отриманих паттернів кожного зразка з референтними штамами, що обумовлює довготривалість і високу вартість процесу тестування [20]. Найбільш близьким рішенням, прийнятим за прототип, є спосіб генотипування, що включає синтез ДНК міжгенних вставок 16S-23S рРНК з подальшим гідролізом її 11 ендонуклеазами і порівняння отриманих патернів з референтними штамами. Практично створені праймери мають найбільший ступінь гомології до ділянок нуклеотидної послідовності ДНК 16S рРНК мікроорганізмів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і мають високу специфічність. Цей спосіб дозволяє розрізняти майже всі ізольовані культури на рівні виду, але не підвиду. Крім того цей спосіб базується на визначенні генів 16S рРНК, а не геномної ДНК, що ускладнює аналіз. [21]. Спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції є об'єктом даного винаходу. Для точної детекції та ідентифікації культур Lactobacillus delbrueckii використовуємо спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР. Спосіб визначення ДНК за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР використовують для детекції та ідентифікації культур Lactobacillus delbrueckii на видовому рівні, що дозволяє ефективно відбирати безпечні і технологічні культури Lactobacillus delbrueckii для виробництва заквасок, бактеріальних препаратів, ферментованих харчових продуктів та здійснювати контроль їх наявності. Підбір праймерів ґрунтується на таких критеріях: високий рівень подібності фрагментів ДНК з ДНК різних штамів Lactobacillus delbrueckii, вміст основ GC не менше 50 %, неможливість утворення димерів, комплементарність послідовностям ДНК на граничних ділянках фрагмента. 2 UA 112951 C2 5 10 15 20 25 30 35 Завданням даного винаходу є розробка способу визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140, відповідального за зв'язування гідролази клітинної стінки методом полімеразної ланцюгової реакції. Підбір пари високоспецифічних олігонуклеотидних праймерів з низьким ступенем самокомплементарності здійснюється за принципом молекулярної ампліфікації генспецифічної полімеразної ланцюгової реакції. Спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, в якому для визначення ДНК культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus використовують пару олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140: прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Запропонований спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції застосовують у наукових дослідженнях, виробничих роботах, контролі якості продукції з ідентифікації ДНК молочнокислих бактерій Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції. Для визначення ДНК культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus використовують пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140: прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Підбір пари праймерів проводять згідно з правилами молекулярного дизайну. Для підбору праймерів використовують програми Primer, Oligo або їх аналоги, які дозволяють здійснювати багатофакторний аналіз вибраних послідовностей ДНК. Порівняльний аналіз підібраної пари специфічних олігонуклеотидних праймерів здійснюють за допомогою програми Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) для виключення фрагментів, гомологічних до ДНК споріднених та неспоріднених видів. Геномний аналіз проводять за повними послідовностями геномів бактерій, доступних в GenBank, на основі гомології до нуклеотидних послідовностей генів молочнокислих бактерій за допомогою програми Blast. Досліджувані організми належать до: Cellular organisms; Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactobacillus; L. delbrueckii; L. d. Bulgaricus; Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Для визначення ДНК культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus вибирають ген LBUL_0140 з Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC BAA-365, complete genome. 3 UA 112951 C2 5 10 за даними GenBank per. № CP000412.1 (фрагмент від 132205 p до 133344 p довжиною 1140 bp), див. Фігура 1 "Послідовність гена LBUL_0140 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ1066, complete genome". Спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах - виконання підбору пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140: - прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, тобто - прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bp діє з 225 р, а зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр діє з 334 р. Розмір послідовності: 1140 bр. 4 UA 112951 C2 5 10 15 20 25 30 Див. Фігура 2 "Підбір праймерів до гена LBUL_0140 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ1066, complete genome". Спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції виконання перевірки дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140: - прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), див. Фігура 3 "Перевірка пари праймерів до гена LBUL_0140 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ1066, complete genome". Спосіб визначення культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції виконується таким чином: - вибір гена LBUL_0140; - підбір пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140; - перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140 за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast); - перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140 методом полімеразної ланцюгової реакції. Підібрану пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140: прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - комплементарні до гена LBUL_0140 для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus використовують для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад. Перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів. У способі визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовували реакційну суміш з термостабільної Taq-полімерази, відповідного десятикратного розведення ПЛР-буферу з MgCl2, розчину чотирьох дезоксирибонуклеотидтрифосфатів, праймерів та проб в об'ємі: Н2О 8,5 мкл 5 UA 112951 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Taq-полімераза 0,5 мкл 10Х буфер з MgCl2 25 мМ 2 мкл dNTP 0,5 мМ 2 мкл праймер 1F (10 пкМ/мкл) 2,5 мкл праймер 2R (10 пкМ/мкл) 2,5 мкл проба 2 мкл 25 мкл, де: праймер 1 F-Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 2R-Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, проби об'ємом 2 мкл: 1 - проба ДНК йогурту, який містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 2 - проба ДНК бактеріального препарату Лактіале, який містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 3 - проба ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який не містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - негативний контроль; 4 - проба ДНК бактерального препарату Лактуале, який містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 5 - деіонізована вода, контроль реакційної суміші з праймерами. Отримали аліквоти 1-5 об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Полімеразну ланцюгову реакцію 5-ти аліквот проводили у термоциклері "GeneAmp PCR System 9600" з відповідним програмним забезпеченням. Параметри: - початкова стадія денатурації ДНК при 95 °C впродовж 2 хвилин; - 40 циклів, які складаються з: - етапу при 95 °C впродовж 30 секунд, - етапу при 62 °C впродовж 30 секунд, - етапу при 72 °C впродовж 60 секунд; - кінцева стадія елонгації при 72 °C впродовж 5 хвилин. У кожній з аліквот використовували пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена LBUL_0140: прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури, разом з різними пробами ДНК: 1 - ДНК проби йогурту, який містить, який містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 2 - ДНК проби бактеріального препарату Лактіале, який містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 3 - ДНК проби бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який не містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - негативний контроль; 4 - ДНК проби бактерального препарату Лактуале, який містить Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; 5 - повна відсутність ДНК у пробі - деіонізована вода, контроль реакційної суміші з праймерами. Результати полімеразної ланцюгової реакції аліквот 1-5 наведено в таблиці 1 "Перевірка роботи пари специфічних олігонуклеотидних праймерів за ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". Амплікони характерної довжини 110 bр специфічного фрагмента ДНК гена LBUL_0140 культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus розрізняють після електрофоретичного розділення в агарозному гелі. Для розділення фрагментів ДНК, отриманих під час ПЛР, проводили електрофорез у 2 % агарозному гелі в тріс-ацетат-EDTA буфері, який містив барвник бромистий етидій для фарбування ампліконів і подальшої візуалізації результатів під дією ультрафіолетових променів. З кожної аліквоти 1-5 відібрали по 10 мкл; кожні 10 мкл аліквоти змішали з 3 мкл буферу для нанесення. У лунки 2 % агарозного гелю внесли: - у лунки з 1 по 3 внесли аліквоти 1-3 - у лунку 4 внесли маркер молекулярної ваги з кроком 100 bр; - у лунки 5-6 внесли аліквоти 4-5. 6 UA 112951 C2 5 10 15 20 25 Провели електрофорез при напрузі 70 В. Результати електрофорезу оцінювали, переглядаючи та фотографуючи гель в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 нм на приладі "Трансілюмінатор", див. фото 1. Фотографія 1 "Дієвість пари специфічних олігонуклеотидних праймерів по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". Як видно на фото 1 у аліквотах 1, 2 та 5 присутній амплікон 110 bр, що свідчить про наявність 110 bр специфічного фрагмента ДНК гена LBUL_0140 культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. У аліквотах 3 та 6 амплікон 110 bр відсутній. Результатом застосування способу визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР є ампліфікація фрагментів 110 bр специфічного фрагмента ДНК гена LBUL_0140 культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, що дозволяє визначити присутність ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. Запропонований спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції має такі переваги: значну економію реактивів, зменшення часових витрат і точність детекції та ідентифікації культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Запропонований спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР використовують для якісного визначення ДНК культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, видової ідентифікації культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus у наукових дослідженнях, технологічних роботах у промисловості, виробничих роботах і для контролю якості продукції. Рекомендовано використовувати спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для визначення ДНК культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus при проведенні моніторингу зразків заквасок, бактеріальних препаратів та ферментованих харчових продуктів, перевірки наявності Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus згідно з нормативними та супровідними документами відповідно на виробництві та у торгівельних мережах. Таблиця "Перевірка роботи пари специфічних олігонуклеотидних праймерів за ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів" № аліквоти 1 2 3 4 5 Проба ДНК Праймери Ампліфікат проба ДНК йогурту, який містить Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus проба ДНК бактеріального препарату Лактіале, який містить Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus проба ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який не містить Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus проба ДНК бактерального препарату Лактуале, який містить Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bp Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bp 110 bp Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bp Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bp 110 bp Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bp Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bp Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bp Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bp 110 bp Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bp Деіонізована вода Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bp - не виявлено, не ідентифіковано. 7 UA 112951 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Джерела інформації: [1]. Gupta В., Garg P. / Probiotics.//Indian J Med Microbiol, 2009 Jul-Sep; 27(3):202-9. [2] Lactic Acid Bacteria: Biodiversity and Taxonomy/ edited by Wilhelm H. Holzapfel, Brian J.B. Wood.: John Wiley & Sons, 2014, ISBN 1118655273, 9781118655276. - 632 p. [3] Ботина С.Г. Видовая идентификация и паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Молочная промышленность. - 2008. - № 3. - с. 52-54. [4] Мікробіологічні основи молочного виробництва - М.: Агропроіздат, 1987. - с. 15-18. [5] Визначник бактерій Берджі У 2-х т. / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Кріга, П.Сніта, Дж. Стейлі, С. Уілльмса - М.: // Світ, 1997. - Т. 2. - с. 574-576. [6] Е. Stackebrandt, W. Frederiksen, G. M. Garrity, P.A. D. Grimont, P. Kampfer, M. С. J. Maiden, X. Nesme, R. Rossello-Mora, J. Swings, H. G. Truper, L. Vauterin, A. C. Ward, W. B. Whitman / Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002. - Vol. 52. - p. 1043-1047. [7] RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim / Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science, 1985, - v.230, - p. 1350-1354. [8] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. / Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science, 1988. - v. 239. - p.487-491. [9] PCR Protocols / Innis et al. // Academic Press. Inc., 1990, - p. 219-227. [10] Семенихин В.И., Юрик С.А. / Выявление термофильных гоферментативных лактобацил и стрептококков в заквасочных культурах с помощью ПЦР. ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, г. Новосибирск, Россия // borona.net. [11] Dave R.I., Shah N.P. / Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus thermophillus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and Bifidobacteria // J. Dairy Sci., 1996. - Vol. 79, N 9. - p. 1529-1536. [12] Банникова Л.А., Королева H.C., Семенихина В.Ф. / Микробиологические основы молочного производства. Справочник / Под ред. к.т.н. Костина Я.И. // - М.: Агропромиздат, 1987. - 400 с: ил. [13] Ботина С.Г. Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии. // DisCollection.ru. - 14.03.2011. - RU 2376367 С2. 10.03.2006. [14] Беспоместных К.В., Галстян А.Г., Короткая Е.В. Исследование биохимических и морфологических свойств штаммов бактерий рода Lactobacillus // Техника и технология пищевых производств, 2011. - № 2. - с. 60-64. [15] Короткая Е.В., Беспоместных К.В., Бабич О.О. / Генетическое разнообразие штаммов бактерий вида Lactobacillus bulgaricus // Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологии: материалы II Всероссийской научно-практической (заочной) конференции. - М.: Издательско-полиграфический комплекс НИИРРР, 2010. - с. 67-70. [16] Джобулаева А.К., Саданов А.К., Айткельдиева С.А., Байкара Б.Т., Джакибаева Г.Т., Кебекбаева К.М. / Молекулярно-генетическая идентификация двух штаммов молочнокислых бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S RRNA гена // Биологические науки № 8 за 2014 год. (часть 1) - с. 63-67. [17] Морейра JLS, Мота Р., Орта Ф. ін. / Ідентифікація до виду з Lactobacillus, виділених в пробіотичних пошукових досліджень людського, тваринного або харчової походження за 16S23S рРНК профілювання обмеження // Мікробіологія ВМС, 2005. - Том 5-15. - с. 1-9. [18] Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus / Точилина А.Г.: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.04, 03.00.07: защищена 19.12.2009 // - Нижний Новгород, 2009. - 25 с. [19] Беспоместных К.В. Конструирование родоспецифичных и видоспецифичных праймеров для индикации и идентификации штаммов бактерий рода Lactobacillus / К.В. Беспоместных, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Техника и технология пищевых производств, 2010. № 1. - c. 64-68. [20] Исследование свойств микроорганизмов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и разработка тест-системы для их идентификации / тема диссертации и автореферата по ВАК 05.18.04, кандидат технических наук Беспоместных, Константин Владимирович // Научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat. - С. 125. [21] Короткая Е.В., Беспоместных К.В. / Идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР-тест-системы // Сибирский вестник с.-х. науки, 2011. - № 7-8. - с. 109-117. 8 UA 112951 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб визначення культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, який відрізняється тим, що для визначення ДНК культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus використовують пари олігонуклеотидних праймерів до гена LВUL_0140: прямий праймер Ldsb F 5'-TGTCAGCGTTGTTCTTGGTG-3' 20 bр та зворотний праймер Ldsb R 5'-CCAAGCCTCCGTTGAACAAA-3' 20 bр - для ампліфікації 110 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. 9 UA 112951 C2 10 UA 112951 C2 11 UA 112951 C2 12 UA 112951 C2 13 UA 112951 C2 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 14