Спосіб визначення культури lactococcus lactis subsp. cremoris за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Винахід належить до способу визначення культури Lactococcus lactis subsp. cremoris за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. UA 105349 C2 (12) UA 105349 C2 UA 105349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До недавнього часу при відборі штамів для створення бактеріальних заквасок використовувалися лише стандартні мікробіологічні підходи, такі як виділення культур, ідентифікація їх таксономічного положення на основі вивчення морфологічних, фізіологобіохімічних властивостей, визначення умов культивування. Однак, застосування тільки цих традиційних підходів не завжди дозволяє ефективно відбирати безпечні і технологічні штами молочнокислих бактерій для виробництва бактеріальних препаратів та ферментованих харчових продуктів. Альтернативним способом, заснованим на детекції та ідентифікації послідовностей нуклеїнових кислот є аналіз їх ДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції, скорочено - ПЛР. Полімеразна ланцюгова реакція дозволяє ефективно проводити ідентифікацію та детекцію видоспецифічних генів культур за допомогою підібраних специфічних праймерів. Праймери - синтетичні олігонуклеотиди - короткі фрагменти нуклеїнової кислоти комплементарні певним послідовностям ДНК або РНК, які ініціюють синтез комплементарного ланцюга за участі ДНК-полімерази. Праймерів має бути два - прямий та зворотній, які обмежують ділянку ДНК, що піддається ампліфікації, тобто чисельному копіюванню. Праймери ініціюють синтез нового ланцюга ДНК починаючи з 3'-кінця [1]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило спосіб ПЛР зручним та загальновживаним [2]. На сьогодні спосіб ПЛР широко використовується для ідентифікації та детекції видоспецифічних генів [3]. Для гену або ділянки ДНК, яка цікавить дослідників, підбирається пара праймерів, за допомогою якої можна провести ампліфікацію ділянки характерної довжини і отримати відповідні амплікони, які ідентифікуть розділенням їх в агарозному гелі методом електрофорезу [4]. Відомий спосіб ідентифікації та детекції нуклеїнової кислоти штамів культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis за допомогою праймерів не є ефективним, оскільки існує високий рівень подібності між послідовностями нуклеїнових кислот цих штамів. Крім того, ці праймери були підібрані для аналізу полімеразної ланцюгової реакції із проксимальної ділянки фрагменту гену 16S рибонуклеїнової кислоти [5]. Спосіб визначення ДНК за шістьма парами праймерів до генів Lactococcus lactis, використано для визначення генотипу до рівня підвидів, але він є громіздким, не забезпечує точність ідентифікації культур, не дає чіткого визначення окремих підвидів культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis [6]. Спосіб визначення ДНК за допомогою праймерів методом ПЛР може бути використано для визначення генотипу культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis до рівня підвидів. Такий підхід не забезпечує технічну простоту і точність диференціації культур, а відомі праймери для гену gadB не дали чіткого визначення окремих підвидів Lactococcus lactis [7]. Штами молочнокислих бактерій є важливим біотехнологічним об'єктом, оскільки вони широко застосовуються при виробництві ферментованих харчових продуктів: йогуртів, простокваші, ряжанки, м'яких та твердих сирів, тощо. Деякі штами молочнокислих бактерій мають пробіотичні властивості і використовуються в складі лікарських препаратів, БАДів, продуктів функціонального харчування людини і кормових добавок для тварин. Створення нових заквасок та бактеріальних препаратів для виробництва ферментованих харчових продуктів вимагає швидкої ідентифікації молочнокислих бактерій. Найбільш вживаним організмом у стартерних молочних культурах є Lactococcus lactis. Оскільки за морфологічними та біохімічними ознаками штами культур Lactococcus lactis можуть мати однакові властивості, за ними складно провести їх підвидову належність. Для точної ідентифікації та диференціації культур Lactococcus lactis використаємо спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції. Спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції є об'єктом даного винаходу. Запропонований спосіб може бути застосовано при дослідних та виробничих роботах з ідентифікації молочнокислих бактерій Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції. Спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. lactic та Lactococcus lactis subsp. cremoris у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах методом 1 UA 105349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полімеразної ланцюгової реакції використовує пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гену асmА: прямий праймер асmА L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 20 bр та зворотній праймер acmA L.l.cr. R: 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bр - для ампліфікації 90 bр фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. cremoris; прямий праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp та зворотній - acmA L.l.lac. R: 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp - для ампліфікації 153 bp фрагменту ДНК культури Lactococcus lactic subsp. lactis. При цьому специфічний прямий праймер acmA L.I. F підібрано таким чином, що він є уніфікованим для визначення кожного фрагменту ДНК гену acmA Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, а специфічні зворотні праймери acmA L.l.cr. R та acmA L.l.lac. R визначають фрагмент ДНК характерної довжини для кожного підвиду Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis. Запропонований спосіб визначення культур та Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції застосовують при дослідних та виробничих роботах з ідентифікації ДНК молочнокислих бактерій Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції. Для визначення ДНК культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, використовують пари специфічних олігонуклеотидних праймерів: прямий праймер acmA L.I. F: 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp та зворотній праймер acmA L.l.cr. R: 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp - для ампліфікації 90 bp фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. cremoris; прямий праймер acmA L.I. F: 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp та зворотній праймер acmA L.l.lac. R: 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp - для ампліфікації 153 bp фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. lactis. Підбір пар праймерів проводили згідно правил молекулярного дизайну. Для підбору праймерів використовували програми Primer, Oligo, або їх аналоги, які дозволяють здійснювати багатофакторний аналіз вибраних послідовностей ДНК. Порівняльний аналіз вибраних олігонуклеотидних праймерів здійснювали за допомогою програми Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) для виключення фрагментів гомологічних до ДНК споріднених та неспоріднених видів. Геномний аналіз проводився за повними послідовностями геномів бактерій, доступних в GenBank, на основі гомології до нуклеотидної послідовності генів молочнокислих бактерій за допомогою програми Blast. Досліджувані організми відносяться до: Cellular organisms; Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae; Lactococcus; Lactococcus lactis. Для визначення ДНК культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis обрали ген acmA N-ацетилмурамідази (англ. N-acety lmuramidases): Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 chromosome, complete genome за даними GenBank per. № NC009004.1 (фрагмент від 266918p до 265605 p довжиною 1314 bp), див. Фігура 1. "Послідовність гену acmA Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 chromosome"; Lactococcus lactis subsp. lactis 111403 chromosome, complete genome за даними GenBank per. № NC_002662.1 (фрагмент від 268750 p до 270069 p довжиною 1320 bp), див. Фігура 2. "Послідовність гену acmA Lactococcus lactis subsp. lactis 111403 chromosome". Нуклеотидні послідовності гену N-ацетилмурамідази acmA підвидів Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis відрізняються на певних ділянках послідовностей ДНК [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi]. Таким чином, у відповідності з запропонованим способом, специфічні пари праймерів дозволяють за цими ділянками гену acmA точно встановити приналежність культур всередині виду Lactococcus lactis до підвиду lactis або cremoris. Див. Фігура 3. "Порівняння послідовностей гену acmA Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 chromosome та гену acmA Lactococcus lactis subsp. lactis 111403 chromosome". Спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для ідентифікації ДНК Lactococcus lactis subsp. cremoris або Lactococcus lactis subsp. lactis, культури яких використовують при дослідних та виробничих роботах у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, передбачає застосування таких праймерів: 2 UA 105349 C2 5 пара специфічних праймерів для гену acmA Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 chromosome, для ампліфікації 90 bp фрагменту ДНК прямий праймер acmA L.1.F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp діє з 430 р та зворотній праймер acmA L.l.cr. R 5'-CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp діє з 519 p. Розмір послідовності: 1314 bp. 10 Пара специфічних праймерів для гену acmA Lactococcus lactis subsp. lactis I11403 chromosome, complete genome, для ампліфікації 153 bp фрагменту ДНК - прямий праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp діє з 430 р та зворотній праймер acmA L.l.lac. R 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp діє з 582 p. Розмір послідовності: 1320 bp. Розмір фрагменту: 153 bp 15 20 25 Спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції працює таким чином: підібрані специфічні пари праймерів прямий праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bр та зворотній праймер acmA L.l.cr. R 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp, комплементарні до гену acmA для ампліфікації 90 bр фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 chromosome; прямий праймер acmA L.I. F: 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp та зворотній праймер acmA L.l.lac. R: 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp - комплементарні до гену acmA для ампліфікації 153 bp фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. lactis 111403 chromosome використали для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 1 3 UA 105349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 У способі визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовували термостабільну Taq ДНК полімеразу, відповідний десятикратний ПЛР-буфер з MgCb, розчини чотирьох дезоксирибонуклеотидтрифосфатів в об'ємі: Н2О 8,5 мкл 10Х буфер з MgCl2 25 мМ 2 мкл dNTP 0,5 мМ 2 мкл Taq-полімераза 0,5 мкл праймер 1 F (10 пкМ/мкл) 2,5 мкл, праймер 2 R (10 пкМ/мкл) 2,5 мкл, 2 мкл, проба ДНК 25 мкл. праймер 1 F - праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bр - (10пкМ/мкл) 2,5 мкл, праймер 2 R - праймер acmA L.l.cr. R 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp - (10пкМ/мкл) 2,5 мкл, проба ДНК - ДНК з закваски суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis-2 мкл. Отримали аліквоту об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 2 Виконували аналогічно прикладу 1, а замість праймера 2 R брали - праймер 3 R (10пкМ/мкл) праймер 3 R-acmA L.l.lac. R 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20bp- (10пкМ/мкл)-2,5 мкл. Отримали аліквоту об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 3 Виконували аналогічно прикладу 1, а замість проби ДНК з закваски суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis брали - ДНК з бакпрепарату суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis. Отримали аліквоту об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 4 Виконували аналогічно прикладу 1, а замість праймера 2 R брали праймер 3R(10пкM/мкл) праймер 3 R-acmA L.l.lac. R 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp (10пкМ/мкл) - 2,5 мкл, та замість проби ДІЖ з закваски суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis брали - ДНК з бак препарату суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis. Отримали аліквоту об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 5 Виконували аналогічно прикладу 1, а замість проби ДНК з закваски суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis брали - деіонізовану воду. Отримали аліквоту об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Полімеразну ланцюгову реакцію 5-ти аліквот з прикладів 1-5 проводили у термоциклері "GeneAmp PCR System 9600" з відповідним програмним забезпеченням. Параметри: початкова стадія денатурації ДНК при 95 °C впродовж 2 хвилин; 40 циклів, які складаються з: етапу при 95 °C впродовж 30 секунд, етапу при 60 °C впродовж 30 секунд, етапу при 72 °C впродовж 60 секунд; кінцева стадія елонгації при 72 °C впродовж 5 хвилин. Результати полімеразної ланцюгової реакції наведено в таблиці 1 "Якісне визначення ДНК за праймерами". У кожному прикладі використовували специфічні праймери разом з різними пробами ДНК: приклад 1 ампліфікація ДНК з закваски суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, з праймерами праймер 1 F - праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp, праймер 2 R - праймер acmA L.l.cr. R 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp, приклад 2 ампліфікація ДНК з закваски суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, з праймерами праймер 1 F - праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp, праймер 3 R - праймер acmA L.l.lac. R 5'-GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp, приклад 3 ампліфікація ДНК з бакпрепарату суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, з праймерами 4 UA 105349 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 праймер 1 F - праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp, праймер 2 R - праймер acmA L.l.cr. R 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp, приклад 4 ампліфікація ДНК з бакпрепарату суміші культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, з праймерами праймер 1 F - праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp, праймер 3 R праймер acmA L.l.lac. R 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp, приклад 5 при повній відсутності ДНК у пробі - деіонізована вода, з праймерами праймер 1 F - праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp, праймер 2 R праймер acmA L.l.lac. R 5' - GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp. Для розділення фрагментів ДНК отриманих під час ПЛР проводили електрофорез у 2 % агарозному гелі в трис-ацетат-EDTA буфері, який містив барвник бромистий етидій для фарбування ампліконів і подальшої візуалізації результатів під дією ультрафіолетових променів. З кожної 25 мкл аліквоти прикладів №№ 1-5 відібрали по 10 мкл і кожну 10 мкл аліквоту змішали з 3 мкл буферу для нанесення; почергово внесли у 2 % агарозний гель у лунки з 1 по 5; в лунку 6 внесли маркер молекулярної ваги; провели ектрофорез при напрузі 70 В. Результати електрофорезу оцінювали, переглядаючи та фотографуючи гель в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 нм на приладі "Трансілюмінатор". Фотографія 1 "Амплікони фарбовані бромистим етидієм після електрофоретичного розділення в агарозному гелі при опроміненні ультрафіолетом". Амплікони характерної довжини розрізняють після електрофоретичного розділення в агарозному гелі: 90 bр специфічного фрагменту ДНК гену асmА культури Lactococcus lactis subsp. cremoris; 153 bp специфічного фрагменту ДНК гену acmA культур Lactococcus lactis subsp. lactis. Результатом застосування способу визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції є ампліфікація фрагментів 90 bр специфічного фрагменту ДНК гену acmA культури Lactococcus lactis subsp. cremoris та 153 bp специфічного фрагменту ДНК гену acmA культур Lactococcus lactis subsp. lactis, що дозволяє визначити присутність геномної ДНК культури Lactococcus lactis subsp. cremoris та/або Lactococcus lactis subsp. lactis. Запропонований спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції передбачає застосування наступних праймерів: прямий праймер acmA acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp та зворотній праймер acmA L.l.cr. R 5'- CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp - для ампліфікації 90 bp фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. cremoris', і прямий праймер acmA acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3 22 bp та зворотній праймер acmA L.l.lac. R 5'- GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp - для ампліфікації 153 bp фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. lactis. При цьому специфічний прямий праймер acmA L.I. F 5'- TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 20 bp підібрано таким чином, що він є уніфікованим для визначення кожного фрагменту ДНК гену acmA Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis, а специфічні зворотні праймери визначають фрагмент ДНК характерної довжини для кожного підвиду Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis. Запропонований спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції дає переваги в економії коштів на синтез уніфікованого прямого праймера acmA L.I. F 5'TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 20 bp, замість двох різних праймерів. Запропонований спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції застосовують для дослідних та технологічних робіт у промисловості, якісного визначення ДНК технологічних штамів молочнокислих бактерій у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, ідентифікації ДНК культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та/або Lactococcus lactis subsp. lactis. Рекомендовано використовувати спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для визначення ДНК культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis при проведенні моніторингу зразків бактеріальних препаратів, 5 UA 105349 C2 5 10 15 20 25 перевірки відповідності вмісту Lactococcus lactis subsp. cremoris та/або Lactococcus lactis subsp. lactis нормативним та супровідним документам на виробництві та у торгівельній мережі. Запропонований спосіб визначення культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactic за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції має переваги у значній економії витрат часу та точності ідентифікації ДНК культур Lactococcus lactis subsp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis. Джерела інформації: [1] Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia/RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p.1350-1354. [2] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA.// Science, 1988, v. 239, p. 487-491. [3] Species-Specific Identification of Penicillium Linked to Patulin Contamination/ DombrinkKurtzman MA, McGovern AE.// J Food Prot., 2007, v. 70(11), p. 2646-2650. [4] PCR Protocols/ Innis et al.// Academic Press. Inc., 1990, p.219-227. [5] Quantitative PCR for DNA identification based on genome-specific interspersed repetitive elements/ Walker JA, Hughes DA, Hedges DJ, Anders BA, Laborde ME, Shewale J, Sinha SK, Batzer MA.// Genomics, 2004, v. 83 (3) p. 518-527. [6] Rapid PCR-based method which can determine both phenotype and genotype of Lactococcus lactis subspecies./ Masaru Nomura, Miho Kobayashi, and Takashi Okamoto/ Appl Environ Microbiol. 2002 May; 68(5): 2209-2213. [7] Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии. Ботина Светлана Геннадиевна, Москва, 2011.-287 с: ил. РГБ QJL71 12-3/16 Таблиця 1 "ЯКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ДНК ЗА ПРАЙМЕРАМИ" № прикладу 1 2 3 4 Проба ДНК Lactococcus lactis ssp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis (закваска) Lactococcus lactis ssp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis (закваска) Lactococcus lactis ssp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis (бакпрепарат) Lactococcus lactis ssp. cremoris та Lactococcus lactis subsp. lactis (бакпрепарат) Праймери Ампліфікат праймер 1 F- праймер acmA L.I. F 5'TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp праймер 2 R - праймер acmA L.I. cr. R 5'CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp 90 bp праймер 1 F- праймер acmA F 5'TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp праймер 3 R - праймер acmA L.I. lac. R 5'GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp 153 bp праймер 1 F- праймер acmA F 5'TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp праймер 2 R - праймер acmA L.I. cr. R 5'(XAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bp 90 bp праймер IF- праймер acmA F 5'TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp праймер 3 R - праймер acmA L.I. lac. R 5'GTCAGTTGCATATTTTCCTG-3' 20 bp 153 bp праймер 1 F - праймер acmA F 5'TATCCTTCCTTTAATCAAAGTT-3' 22 bp 5 Вода праймер 2 R - праймер acmA L.I. cr. R 5'ССAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19bp - не виявлено, не ідентифіковано. 6 UA 105349 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Спосіб визначення культури Lactococcus lactis subsp. cremoris за допомогою специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, який відрізняється тим, що для визначення ДНК культури Lactococcus lactis subsp. сremoris використовують пару олігонуклеотидних праймерів до гену асmА N-ацетилмурамідази: прямий праймер acmA L.1. F 5'- TATCCTTCCTTTA ATCAAAGTT -3' 20 bр та зворотній праймер acmA L.1.cr. R: 5'-CCAAGCCTTAGCGTAATAG-3' 19 bр - для ампліфікації 90 bр фрагменту ДНК культури Lactococcus lactis subsp. сremoris. 7 UA 105349 C2 8 UA 105349 C2 9 UA 105349 C2 10 UA 105349 C2 11 UA 105349 C2 12 UA 105349 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 13