Спосіб визначення культур streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Винахід належить до способу визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. UA 111130 C2 (12) UA 111130 C2 UA 111130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до способу визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. Донедавна під час відбору штамів для створення бактеріальних заквасок використовували стандартні мікробіологічні підходи оцінки заквашувальних культур, такі як: виділення, ідентифікація таксономічного положення на основі вивчення їх морфологічних, фізіологобіохімічних, культуральних і технологічних властивостей. На сьогоднішній день науковцями засвідчено, що лише за допомогою класичних фенотипічних методів не можливо провести видову ідентифікацію молочнокислих бактерій, що належать до різних родів, а саме: Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus та Streptococcus [1]. Крім того, використання традиційних технологій не завжди дозволяє ефективно відбирати безпечні і технологічні штами молочнокислих бактерій для використання їх як заквашувальних культур у виробництві ферментованих молочних продуктів і пробіотичних препаратів. Ідентифікацію видів і генетичну типізацію на рівні штамів молочнокислих бактерій, які на практиці використовуються у харчовій промисловості, необхідно проводити за допомогою міжнародно визнаних молекулярних методів [2]. Одним із сучасних генетичних методів визначення культур, основаним на детекції та ідентифікації послідовностей нуклеїнових кислот, є аналіз ДНК з використанням полімеразної ланцюгової реакції, скорочено - ПЛР. Полімеразна ланцюгова реакція дозволяє ефективно проводити ідентифікацію та детекцію видоспецифічних генів культур за допомогою підібраних специфічних праймерів [3]. Праймери - синтетичні олігонуклеотиди - короткі фрагменти нуклеїнової кислоти, комплементарні певним послідовностям ДНК або РНК, які ініціюють синтез комплементарного ланцюга за участі ДНК-полімерази. Праймерів має бути два - прямий та зворотний, які обмежують ділянку ДНК, що піддається ампліфікації, тобто чисельному копіюванню. Праймери ініціюють синтез нового ланцюга ДНК починаючи з 3'-кінця [4]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило спосіб ПЛР зручним та загальновживаним [5]. На сьогодні полімеразна ланцюгова реакція широко використовується для ідентифікації та детекції видоспецифічних генів [4]. Для гена або ділянки ДНК, яка цікавить дослідників, підбирається пара праймерів, за допомогою якої можна провести ампліфікацію ділянки характерної довжини і отримати відповідні амплікони, які ідентифікують розділенням в агарозному гелі методом електрофорезу [6]. На сьогодні відомо традиційний спосіб детекції бактерій виду Streptococcus thermophilus - це мікробіологічні дослідження з використанням селективного середовища, ST-агар, середовище Lee тощо, за появою колоній цих мікроорганізмів із характерним забарвленням [7]. Відомо спосіб детекції Streptococcus thermophilus, що включає синтез олігонуклеотидних праймерів на 16S рРНК, проведення порівняння даного гена з послідовностями, специфічними для Streptococcus thermophilus згідно з базою даних GenBank [8]. Цей спосіб дозволяє ідентифікувати бактеріальні ізоляти на рівні виду [9, 10]. До недоліків даного способу можна віднести необхідність проведення гідролізу і секвенування ампліконів, порівняння кожного з базою даних GenBank, що обумовлює довготривалість і високу вартість процесу тестування [11]. Найбільш близьким способом до винаходу, що заявляється є специфічні праймери на основі вибраного фрагмента ДНК гена пеніцилінзв'язуючого протеїну 2В, скорочено - ген pbp2b, специфічного для Streptococcus thermophilus, із залученням аналізу повних геномів референтних штамів Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066 і LMD9, представлених у базі даних GenBank (HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Вибрані фрагменти ДНК було перевірено за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Однак ці праймери не достатньо специфічні та мають високий ступінь самокомплементарності [12]. Спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції є об'єктом даного винаходу. Створення нових заквасок та бактеріальних препаратів для виробництва ферментованих харчових продуктів вимагає швидкої ідентифікації молочнокислих бактерій. Одним з найбільш вживаних мікроорганізмів, які застосовуються у заквашувальних культурах є Streptococcus thermophilus. Ідентифікація Streptococcus thermophilus на рівні фенотипу з використанням стандартних мікробіологічних методів, за біохімічними ознаками з використанням комерційних тест-систем АРІ 20 Strep (фірма "BioMerieux", Франція) може бути ускладнена внаслідок 1 UA 111130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 гетерогенності бактерій в межах виду, що не завжди дозволяє встановити точне таксономічне положення та отримати цілісну оцінку їх властивостей. Для точної детекції та ідентифікації культур Streptococcus використаємо спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР. Спосіб визначення ДНК за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР використовують для детекції та ідентифікації бактерій Streptococcus thermophilus на видовому рівні, що дозволяє ефективно відбирати безпечні і технологічні культури Streptococcus thermophilus для виробництва заквасок, бактеріальних препаратів, ферментованих харчових продуктів та здійснювати контролювання їх наявності. Вибір праймерів ґрунтується на таких критеріях: високий рівень подібності фрагментів ДНК з ДНК різних штамів Streptococcus thermophilus, вміст основ GC не менше 50 %, не утворення димерів, компліментарність послідовностям ДНК на граничних ділянках фрагмента. Задачею даного винаходу є розробка способу визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена пеніцилінзв'язуючого протеїну 2В (penicillin-binding protein 2В) - ген pbp2b методом полімеразної ланцюгової реакції, де підбір пари високоспецифічних олігонуклеотидних праймерів з низьким ступенем самокомплементарності здійснюється за принципом молекулярної ампліфікації генспецифічної полімеразної ланцюгової реакції [13]. Спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, в якому для визначення ДНК культур Streptococcus thermophilus використовують пару олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus. Запропонований спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції застосовують у наукових дослідженнях та виробничих роботах з ідентифікації ДНК молочнокислих бактерій Streptococcus thermophilus у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції. Для визначення ДНК культур Streptococcus thermophilus використовують пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus. Підбір пари праймерів проводять згідно з правилами молекулярного дизайну. Для підбору праймерів використовують програми Primer, Oligo, або їх аналоги, які дозволяють здійснювати багатофакторний аналіз вибраних послідовностей ДНК. Порівняльний аналіз підібраної пари специфічних олігонуклеотидних праймерів здійснюють за допомогою програми Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) для виключення фрагментів гомологічних до ДНК споріднених та неспоріднених видів. Геномний аналіз проводять за повними послідовностями геномів бактерій, доступних в GenBank, на основі гомології до нуклеотидних послідовностей генів молочнокислих бактерій за допомогою програми Blast. Досліджувані організми належать до: Cellular organisms; Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus, Streptococcus thermophilus. Для визначення ДНК культур Streptococcus thermophilus вибирають ген pbp2b - ген пеніцилінзв'язуючого протеїну 2В (penicillin-binding protein 2B) з Streptococcus thermophilus CNRZ1066, complete genome. 2 UA 111130 C2 5 10 15 за даними GenBank per. № CP000024.1 (фрагмент від 576647 p до 578761 p довжиною 2115 bp), див. Фігура 1 "Послідовність гена pbp2b Streptococcus thermophilus CNRZ1066, complete genome". Спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах - виконання підбору пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'- TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus, тобто - прямий праймер StT F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр діє з 1919 р, а зворотний праймер StT R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 19 bр діє з 2093 р. Розмір послідовності: 2115 bр. 3 UA 111130 C2 5 10 15 20 25 30 35 Див. Фігура 2 "Підбір праймерів до гена pbp2b Streptococcus thermophilus CNRZ1066, complete genome". Спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах - виконання перевірки дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus, за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), див. Фігура 3 "Перевірка пари праймерів до гена pbp2b Streptococcus thermophilus CNRZ1066, complete genome". Спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції виконується таким чином: - вибір гена pbp2b; - підбір пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b; - перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast); - перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b методом полімеразної ланцюгової реакції. Підібрану пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - комплементарні до гена pbp2b для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus використовують для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 1. Перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів У способі визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовували реакційну суміш з термостабільної Taqполімерази, відповідного десятикратного ПЛР-буфера з MgCl2, розчину чотирьох дезоксирибонуклеотидтрифосфатів, праймерів та проб в об'ємі: 4 UA 111130 C2 Н2О Taq-полімераза 10Х буфер з MgCl2 25 мМ dNTP 0,5 мМ праймер 1F (10 пкМ/мкл) праймер 2R (10 пкМ/мкл) проба 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 8,5 мкл 0,5 мкл 2 мкл 2 мкл 2,5 мкл, 2,5 мкл, 2 мкл, 25 мкл, де: праймер 1 F-Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 2R-Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, проби об'ємом 2 мкл: - проба ДНК бактеріального препарату Lyofast ST064, який містить Streptococcus thermophilus; - проба ДНК бактеріального препарату ALBA THB-02, який містить Streptococcus thermophilus; - проба ДНК бактеріального препарату Lyofast MO30N, який не містить Streptococcus thermophilus; - проба ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який містить Streptococcus thermophilus; - деіонізована вода. Отримали аліквоти 1-5 прикладу 1 об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Полімеразну ланцюгову реакцію 5-ти аліквот проводили у термоциклері "GeneAmp PCR System 9600" з відповідним програмним забезпеченням. Параметри: - початкова стадія денатурації ДНК при 95 °C впродовж 2 хвилин; - 40 циклів, які складаються з: - етапу при 95 °C впродовж 30 секунд, - етапу при 60 °C впродовж 30 секунд, - етапу при 72 °C впродовж 60 секунд; - кінцева стадія елонгації при 72 °C впродовж 5 хвилин. У кожній з аліквот прикладу 1 використовували пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus, разом з різними пробами ДНК: - ДНК бактеріального препарату ALBA THB-02, який містить Streptococcus thermophilus; - ДНК бактеріального препарату Lyofast ST064, який містить Streptococcus thermophilus; - ДНК бактеріального препарату Lyofast MO30N, який не містить Streptococcus thermophilus негативний контроль; - ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який містить Streptococcus thermophilus; - повна відсутність ДНК у пробі - деіонізована вода, контроль реакційної суміші з праймерами. Результати полімеразної ланцюгової реакції аліквот 1-5 прикладу 1 наведено в таблиці 1 "Перевірка роботи пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". Амплікони характерної довжини 175 bр специфічного фрагмента ДНК гена pbp2b культури Streptococcus thermophilus розрізняють після електрофоретичного розділення в агарозному гелі. Для розділення фрагментів ДНК, отриманих під час ПЛР, проводили електрофорез у 2 % агарозному гелі в трис-ацетат-EDTA буфері, який містив барвник бромистий етидій для фарбування ампліконів і подальшої візуалізації результатів під дією ультрафіолетових променів. З кожної аліквоти 1-5 прикладу 1 відібрали по 10 мкл і кожну 10 мкл аліквоту окремо змішали з 3 мкл буфера для нанесення. У лунки 2 % агарозного гелю внесли: - маркер молекулярної ваги з кроком 100 bр; - у лунки з 1 по 5 внесли аліквоти 1-5 прикладу 1. 5 UA 111130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Провели електрофорез при напрузі 70 В. Результати електрофорезу оцінювали, переглядаючи та фотографуючи гель в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 нм на приладі "Трансілюмінатор", див. фото 1. Фотографія 1 "Дієвість пари специфічних олігонуклеотидних праймерів по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". Як видно на фото 1 у аліквотах 1, 2 та 4 прикладу 1 присутній амплікон 175 bр, що свідчить про наявність 175 bр специфічного фрагмента ДНК гена pbp2b культури Streptococcus thermophilus. У аліквотах 3 та 5 прикладу 1 амплікон 175 bр відсутній. Приклад 2. Перевірка бактеріальних препаратів ІПР за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР. Для виконання прикладу 2 брали бактеріальні препарати розробником і власником яких є Інститут продовольчих ресурсів: - Lactococcus lactis S1 ІПР (IMB В-7234), - Streptococcus thermophilus 2163 ІПР (IMB В-7373), - Streptococcus thermophilus 2173 ІПР (IMB В-7512), - Streptococcus thermophilus 2179 ІПР (IMB B-7511). Приклад 2 виконували аналогічно прикладу 1, де: праймер 1 F-Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 2R-Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, проби об'ємом 2 мкл: - деіонізована вода, контроль реакційної суміші з праймерами; - проба ДНК Lactococcus lactis S1 ІПР (IMB В-7234), який не містить Streptococcus thermophilus - негативний контроль; - проба ДНК бактеріального препарату Streptococcus thermophilus 2163 ІПР (IMB В-7373), який містить Streptococcus thermophilus; - проба ДНК бактеріального препарату Streptococcus thermophilus 2173 ІПР (IMB В-7512), який містить Streptococcus thermophilus; - проба ДНК бактеріального препарату Streptococcus thermophilus 2179 ІПР (IMB В-7511), який містить Streptococcus thermophilus. Отримали аліквоти 1-5 прикладу 2 об'ємом 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Полімеразну ланцюгову реакцію 1-5 аліквот прикладу 2 проводили аналогічно прикладу 1. У кожній аліквоті прикладу 2 використовували пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus, разом з різними пробами ДНК: - повна відсутність ДНК у пробі - деіонізована вода; - ДНК Lactococcus lactis S1 ІПР (1MB В-7234), який не містить Streptococcus thermophilus; - ДНК бактеріального препарату Streptococcus thermophilus 2163 ІПР (IMB В-7373), який містить Streptococcus thermophilus; - ДНК бактеріального препарату Streptococcus thermophilus 2173 ІПР (IMB В-7512), який містить Streptococcus thermophilus; - ДНК бактеріального препарату Streptococcus thermophilus 2179 ІПР (IMB В-7511), який містить Streptococcus thermophilus. Результати полімеразної ланцюгової реакції аліквот 1-5 прикладу 2 наведено в таблиці 2 "Перевірка бактеріальних препаратів ІПР за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР» Для розділення фрагментів ДНК, отриманих під час ПЛР прикладу 2, проводили електрофорез аналогічно прикладу 1. Результати електрофорезу наведені на фото 2. Фотографія 2 "Амплікони бактеріальних препаратів ІПР після електрофоретичного розділення". Як видно на фото 2 у аліквотах 3, 4 та 5 присутній амплікон 175 bр, що свідчить про наявність 175 bр специфічного фрагмента ДНК гена pbp2b культури Streptococcus thermophilus. У аліквотах 1 та 2 амплікон 175 bр відсутній. Результатом застосування способу визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР є ампліфікація фрагментів 175 bр специфічного фрагмента ДНК гена pbp2b культури Streptococcus thermophilus, що дозволяє визначити присутність ДНК культури Streptococcus thermophilus у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. 6 UA 111130 C2 5 10 Запропонований спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою специфічних праймерів методом ПЛР має переваги у значній економії реактивів, витрат часу та в точності детекції та ідентифікації культур Streptococcus thermophilus. Запропонований спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР використовують для якісного визначення ДНК культур Streptococcus thermophilus, видової ідентифікації культур Streptococcus thermophilus у наукових дослідженнях та технологічних роботах у промисловості. Рекомендовано використовувати спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР для визначення ДНК культур Streptococcus thermophilus при проведенні моніторингу зразків заквасок, бактеріальних препаратів та ферментованих харчових продуктів, перевірки відповідності наявності Streptococcus thermophilus згідно з нормативними та супровідними документами на виробництві та у торгівельній мережі. Таблиця 1 «Перевірка роботи пари специфічних олігонуклеотидних праймерів за ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". № аліквоти прикладу 1 1 2 3 4 5 Проба ДНК Ампліфік Праймери Бактеріальний препарат ALBA THB02 bp Бактеріальний препарат Lyofast ST064 bp Бактеріальний препарат Lyofast MO30N bp Бактеріальний препарат Danisco ТА Lyo 125DCU bp ат 175 bp Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 175 bp Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 175 bp Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 Вода Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bp - не виявлено, не ідентифіковано. 15 Таблиця 2 «Перевірка бактеріальних препаратів ІПР за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР» № аліквоти прикладу 2 1 Ампліфік Проба ДНК Праймери Вода Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-CCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 175 bp ат bp 2 3 4 Lactococcus lactis S1 ІПР (IMB В- 7234) bp Бактеріальний препарат Streptococcus thermophilus 2163 ІПР bp (IMB В-7373) Бактеріальний препарат Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 7 175 bp UA 111130 C2 Streptococcus bp thermophilus 2173 ІПР (IMB В- 7512) Бактеріальний препарат Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bp 5 Streptococcus Stt R 5'-TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 thermophilus 2179 ІПР bp (IMB В- 7511) - не виявлено, не ідентифіковано. 5 10 15 20 25 30 35 40 175 bp Джерела інформації: [1] Lactic Acid Bacteria: Biodiversity and Taxonomy / edited by Wilhelm H. Holzapfel, Brian J.B. Wood.: John Wiley & Sons. - 2014, ISBN 1118655273, 9781118655276. - 632 p. [2] E. Stackebrandt, W. Frederiksen, G.M. Garrity, P.A.D. Grimont, P. Kampfer, M.С.J. Maiden, X. Nesme, R. Rossello-Mora, J. Swings, H.G. Truper, L. Vauterin, A.С. Ward, W.B. Whitman Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2002. Vol. 52. P. 1043-1047. http://ijs.sgmjournals.org. [3] Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia/RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p. 1350-1354. [4] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. // Science, 1988, v. 239, p. 487-491. [5] Species-Specific Identification of Penicillium Linked to Patulin Contamination / DombrinkKurtzman MA, McGovern AE. // J Food Prot., 2007, v. 70(11), p. 2646-2650. [6] PCR Protocols / Innis et al. // Academic Press. Inc., 1990, p. 219-227. [7] Dave R.I., Shah N.P. Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus thermophillus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and Bifidobacteria // J. Dairy Sci. - 1996. - Vol.79, N 9. - P. 1529-1536; Davis J.G., Ashton T.F., MaCaskill M. // Dairy Ind. - 1971. - Vol. 36. - P. 569. [8] Quantitative PCR for DNA identification based on genome-specific interspersed repetitive elements / Walker JA, Hughes DA, Hedges DJ, Anders BA, Laborde ME, Shewale J, Sinha SK, Batzer MA. // Genomics, 2004, v. 83 (3) p. 518-527. [9] Генетическое разнообразие природных штаммов бактерий вида Streptococcus thermophilus [Текст] / С.Г. Ботина [и др.] // Генетика. - 2007. - Т. 43, № 5. - С. 601-608. [10] Выявление термофильных гоферментативных лактобацил и стрептококков в заквасочных культурах с помощью ПЦР. Семенихин В.И., Юрик С.А., ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, г. Новосибирск, Россия // borona.net. [11] Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии. БОТИНА С.Г. / DisCollection.ru. 14.03.2011. RU 2376367 С2, 10.03.2006. [12] Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления Streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыров / Патент на изобретение № 2455363/. [13] Disruption of the gene encoding penicillin-binding protein 2b (pbp2b) causes altered cell morphology and cease in exopolysaccharide production in Streptococcus thermophilus Sfi6. Stingele F, Mollet B. Nestlé Research Centre, Nestec Ltd, Vers-chez-les-Blanc, Lausanne 26, Switzerland. francesca.stingele@chlsnr.nestrd.ch// Molecular Microbiology [1996, 22(2):357-366]. 8 UA 111130 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб визначення культур Streptococcus thermophilus за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквасках, бактеріальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, який відрізняється тим, що для визначення ДНК культур Streptococcus thermophilus використовують пари олігонуклеотидних праймерів до гена pbp2b: прямий праймер Stt F 5'-CAGCCGAAACCTATGCAACA-3' 20 bр та зворотний праймер Stt R 5'TCCATGATAGCTTTAACGGCAT-3' 22 bр - для ампліфікації 175 bр фрагмента ДНК культури Streptococcus thermophilus. 9 UA 111130 C2 10 UA 111130 C2 11 UA 111130 C2 12 UA 111130 C2 13 UA 111130 C2 14 UA 111130 C2 15 UA 111130 C2 16 UA 111130 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 17