Фракція гіалуронової кислоти або її солі для застосування в офтальмології, спосіб одержання фракції натрієвої солі гіалуронової кислоти та фармацевтичний препарат для використання в офтальмології

1 Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли со средним молекулярным весом в пределах от 750000 Дальтон до 1230000 Дальтон, отличающаяся тем, что она имеет следующие характеристики: а) показатель статической вязкости, определенный при температуре 25° С в 0,15 М растворе NaCI при рН = 7,0 с использованием вискозиметра Убеллоде с суспензионной средой, находится в пределах от 14,5 до 21 дл/г, б) содержание белка не превышает 0,2% в расчете на альбумин, в) ультрафиолетовое поглощение при 257 им и при 280 нм не превышает 1,0ат.ед при измерении в 1% (вес/об.) водном растворе, г) динамическая вязкость 1% раствора (вес/об.) в 0,15 М NaCI при рН - 7,0 не превышает указанных ниже предельных значений при определенных скоростях сдвига с использованием ротационного вискозиметра при температуре 20" С, Скорость сдвига Динамическая вязкость (мПа*сек при 20 •С) 1 сек"1 не более чем 20000 мПа"сек 10 сек не более чем 2000 мПа"сек 100 сек 1 не более чем 1000 мПа*сек 1 350 сек" не более чем 500 мЛа'сек, д) содержание сульфатированного мукополисахарида не превышает 0,07% в расчете у физиологического раствора, подвергнутых естественному старению и термической стерилизации, определяемая по измерению показателя статической вязкости и выраженная как соответствующее снижение среднего молекулярного веса, не превышает следующих пределов. 97% начального значения (хранение при 25° С в течение 6 месяцев), 75% начального значения (стерилизация при 118° С в течение 32 минут), 80% начального значения (стерилизация при 121° С в течение 16 минут), 90% начального значення (стерилизация при 124° С в течение 8 минут), для применения в офтальмологии 2 Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли по п 1, отличающаяся тем, что указанный средний молекулярный вес находится в пределах от 925000 до 1230000 Дальтон. 3. Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли по п 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная фракция свободна от молекул гиалуроновой кислоты, имеющих молекулярный вес 30000 Дальтон или менее. 4 Способ получения фракции натриевой соли гиалуроновой кислоты, характеризующейся параметрами, указанными в п. 1, отличающийся тем, что он включает' а) экстракцию органического вещества из куриных гребешков экстракционным растворителем, представляющим собой ацетон или этанол, и дополнительно содержащим фенантролин или его диметиловое производное, с получением экстракта, практически свободного от ионов железа, б) обработку указанного экстракта протеолитическим агентом, выбранным из группы, включающей папаин, пепсин, трипсин, проназу и хлоргидрат цисте и на, в) пропускание обработанного таким образом экстракта через колонку, наполненную смолой на основе сульфоновой кислоты в форме тетрабутиламмониевой соли, г) элюирование целевого продукта с получением раствора, содержащего тетрабутиламмониевую О о см см СМ метиленхлоридом, и) обработку раствора, полученного на стадии (з), галогенидом натрия с получением гиалуроната натрия, к) осаждение полученного гиалуроната натрия, л) солюбилизацию осадка в воде и диализ данного раствора, м) обработку диализованного раствора для осаждения гиалуроната натрия, н) молекулярную фильтрацию осадка через мембрану с пределом исключения молекул с мол весом 30000 Дальтон для получения раствора, содержащего натриевую соль гиалуроновой кислоты, имеющую мол вес от 750000 до 1230000. 5 Фармацевтический препарат для использования в офтальмологии, содержащий активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, отличающийся тем, что в качестве активного ингредиента он содержит эффективное количество фракции гиалуроновой кислоты или ее соли со средним молекулярным весом в пределах от 750000 Дальтон до 1230000 Дальтон, имеющей следующие характеристики а) показатель статической вязкости, определенный при температуре 25° С в 0,15 М растворе NaCI при рН = 7,0 с использованием вискозиметра Убеллоде с суспензионной средой, находится в пределах от 14,5 до 21 дл/г, б) содержание белка не превышает 0,2% в расчете на альбумин, в) ультрафиолетовое поглощение при 257 им и при 280 нм не превышает 1,0атед при измерении в 1% (вес /об ) водном растворе, г)динамическая вязкость 1% раствора (вес/об) в Изобретение представляет собой новый процесс получения высокочистых фракций гиалуроновой кислоты и ее солей Кроме того изобретение касается особой фракции гиалуроновой кислоты и ее солей, в частности натриевой соли, получаемой указанным способом и обладающую средним молекулярным весом в пределах заданного диапазона Гиалуроновая кислота (ГК) является типичным и важным представителем класса биологических макромолекул, известных под названием гликозаминогликанов (мукополисахаридов) ГК представляет собой биологический полимер, который содержится при идентичном молекулярном строении во всех соединительных тканях позвоночных организмов, где она играет структурную и биологическую роль в том смысле, что ее локальные концентрации строго коррелируют с мышечным тонусом, трофическими явлениями и восстановлением ткани в случае повреждения Обзор физиологической роли этих биологических веществ про при 20° С) 1 сек 1 не более чем 20000 мПа*сек 10 сек"1 не более чем 2000 мПа'сек 100 сек 1 не более чем 1000 мПа'сек 350 сек"1 не более чем 500 мПа*сек, д) содержание сульфатированного мукополисахарида не превышает 0,07% в расчете на серу, е) содержание железа не превышает 10 частей/млн , и ж) стабильность изотонических буферных растворов с величиной рН данной фракции, такой же как у физиологического раствора, подвергнутых естественному старению и термической стерилизации, определяемая по измерению показателя статической вязкости и выраженная как соответствующее снижение среднего молекулярного веса, не превышает следующих пределов 97% начального значения (хранение при 25° С в течение 6 месяцев), 75% начального значения (стерилизация при 118° С в течение 32 минут), 80% начального значения (стерилизация при 121" С в течение 16 минут), 90% начального значения (стерилизация при 124" С в течение 8 минут) 6 Фармацевтический препарат по п 5, отличающийся тем, что молекулярный вес указанной фракции гиалуроновой кислоты находится в пределах от 925000 до 1230000 Дальтон 7 Фармацевтический препарат по п 5, отличающийся тем, что указанная фракция гиалуроновой кислоты свободна от молекул, имеющих молекулярный вес 30000 Дальтон или менее да (D-глюкороновая кислота и N - ацетилгликозамин), с поочередной полимеризацией, с образованием длинных неразветвленных молекулярных цепей, различающихся по молекулярному весу, достигающему максимум 8 000 000 дальтонов (К Мейер Химическое строение гиалуроновой кислоты - Fed Proceed 17,1075,1958, ТКЛорент Химия и молекулярная биология внутриклеточного матрикса Academic Press,N Y ,1970, с 703 - 732) Поведение этого биополимера в водном растворе гарантирует особую вязкость, называемую вязкоупругостью, типичную для некоторых биологических жидкостей как, например, синовиальная жидкость и стекловидная жидкость, в которых ГК находится в концентрациях 0,12 - 0,24% (Е А Балаз и др Гиалуроновая кислота и замена стекловидного и водного тела -Mod РгоЫ Ophtal, 1972, 10, с 3 21) Было также обнаружено, что водная жидкость человека содержит ГК в средней концентрации 1,14мкг/г (У Б Г Лорент Гиалуронат в водной В с 9,7 15,5 9,2 15,1 8,8 14,8 100 100 93,2 96,6 Таблица 9 Стабильность раствора стерилизации Предельная вязкость (дл/г) Образец ГК-1 А В С Начальная 20 9 104 97 155 |у 172 62 63 109 Iliy Illy 18 3 199 66 72 67 73 11 5 126 Изменение м( ного вес Начальная 'У 100 100 100 100 77 1 Є 50 2 £ 56 2 Є 62 5; € где - Образцы А, В и С такие же, как для ления содержания железа - Растворы приблизительно 10мг/мл продукта в 0,9% весового объема раствор 0,002 М фосфатном буфере, рН=7,5 п лись а) естественному старению хранением ние 6 месяцев при комнатной температуре в темноте с проверками через три мес Таблицу 8), б) стерилизации в автоклаве в сл0,6 по точному тесту Фишера) Осложнения включали повышение внутриглазного давления до 30 мм рт ст или выше (7/158=4,4% у пациентов, обработанных ГК - 1, 5/56=8,9% у пациентов, обработанных Геалоном) и отек роговицы, ирит, конъюнктивит, гифему, отекщее пятно роговицы, истечение из ранки, циклитную оболочку и подконъюнктивальное кровотечение Как видно из таблицы 3, в которой приводятся данные тонометрии, полученные перед и после операции (через 3 часа и 1, 7, 30 дней) - между группами больных не отмечалось значимого различия по среднему внутриглазному давлению, однако у пациентов, обработанных Геалоном было более высокое среднее внутриглазное давление как через 3 часа, так и через 1 день после операции и значительно более высокое стандартное отклонение внутриглазного давления через 1 день после операции, чем у пациентов, обработанных ГК - 1 Исследования методом щелевого лампового биомикроскопа, пахиметрия (для определения толщины роговицы) и офтальмоскопические исследования не выявили различий между двумя группами 26) Второе клиническое исследование - У несколько большего количества пациентов, обработанных Геалоном (37,0%), чем у пациентов, обработанных ГК - 1 (28,6%) выявлены послеоперационные осложнения (Таблица 4) Осложнения включали повышение внутриглазного давления (5/42=11,9% - ГК - 1, 11/46=23,9% - Геалон) и случаи гифемы, истечения из раны, кровотечение из стекловидного тела, помутнение задней капсулы, расщепление сосудистой оболочки глаза, атрофия радужной оболочки и отекшее пятно роговицы - Статистически две группы не различались в отношении среднего внутриглазного давления или изменения внутриглазного давления при операции как в начальный момент после операции, так и в последующий период с первого до девяностого дня после операции (Таблица 5) В течение первых 9 часов после операции оказывается, что Геалон (удаленный из глаза) и ГК - 1 (не удаленный) вызывали послеоперационное распределение внутриглазного давления, которое отличалось, в первую очередь, относительно стандартных отклонений Обработанные Геалоном пациенты имели большие стандартные отк 10 27229 лонения и значительно более высокие средние значения через 1 час после операции, а у пациентов, обработанных ГК-1 были повышенные, но только ограниченно значимые стандартные отклонения, через 6 и 9 часов после операции Через 1 час после операции у 22,7% обработанных Геалоном пациентов и у 10% обработанных ГК - 1 пациентов внутриглазное давление было 21 ммртст или выше Через 6 и 9 часов после операции сравнимые количества обработанных ГК - 1 пациентов ( 73,2% через 6 часов и 65,0% через 9 часов) и обработанных Геалоном пациентов ( 68,2% через 6 часов и 71,4% через 9 часов) имели давление 21 мм рт ст и выше - Никаких других различий не отмечалось между двумя группами в отношении наблюдений первого исследования Зеркальная микроскопия (определение количества эндотелиальных клеток) тоже не выявила существенных различий ( Таблица 6) 3 Количественные оценки Оценки остроты зрения показали, что эффективность двух вязкоупругих веществ была сравнимой ,в частности - Первое клиническое исследование Не было существенного различия между количеством обработанных Геалоном пациентов (77,8%) и количеством обработанных ГК - 1 пациентов (84,7%), которые достигли остроты зрения 20/40 на 30 - й день после операции - Второе клиническое исследование Не было существенного различия между количеством пациентов (73,9% - Геалон) и (71,4% - ГК - 1), которые достигли остроты зрения 20/40 или лучше на 30 - й день после операции На 90 - й день эти количества были почти идентичными Результаты двух клинических исследований, описанных здесь, Таблица 2 Послеоперационные осложнения 1 - е клиническое исследование Больные с ГК-1 N = 158 N (%) День 1 Нет 149(94,3) 9 (5,7) Да* День 7 Нет 153(98,1) 3(1,9) Да День 30 Нет Да Больные с Геалоном N = 56N (%) 52 (96,3) 2 (3,7) Всего ГК-1 7 497 8 453 3 979 4 147 3 491 3 730 3 744 3 718 Таблица 5 Суммарная статистика тонометрии (мм рт ст) по группам больных Группа больных Всего ГК-1 Геалон 206 (97,6) 5 (2,4) Всего ГК-1 Геалон Всего ГК-1 Геалон Всего ГК-1 Геалон Всего ГК-1 Геалон День 1 Всего ГК-1 Геалон День 7 Всего ГК-1 Геалон День 30 * Количество больных с Геалоном с осложнениями значительно выше (р=0,079 по точному тесту Фишера), чем количество больных с ГК - 1 Таблица 3 Оценка внутриглазного давления (тонометрия в (мм рт ст ) 1-е исследование Группа больных 7 760 7417 8 718 Больные с Больные с Всего больных НА-1 Геалоном N=42 N=46 N=88 N (%) N (%) N (%) После one рационные осложнения Нет 30 (71 4) 59 (67 0) 29 (63 0) 12(28 6) 17(37 0) 29 (33 0) Да 208(98,1) 4(1,9) 154(98,1) 3(1,9) 3,176 "Стандартные отклонения через 1 день у двух групп больных значительно отличаются (р=0,0508 по тесту Фишера) Таблица 4 Послеоперационные осложнения 2 - е клиническое исследование 197(92,1) 17(7,9) 55 (98,2) 1(1,8) 56 16,643 | Через 3 часа после операции Всего 176 18 077 ГК-1 129 18 027 Геалон 47 18 213 День 1 Всего 212 19 146 ГК-1 18 580 157 Геалон 55 20 327 День 7 Всего 200 14 431 ГК-1 14 468 148 Геалон 52 14 327 День 30 15 002 Всего 207 14 932 ГК-1 154 15 208 Геалон 53 Всего больных N = 214 N (%) 48 (85,7) 8 (14,3) Геалон Среднее зна- Стандартное отклочение нение Перед операцией 16,671 213 3,598 157 16 682 3,747 К-во 11 К-во Среднее Стандартное отклонение Перед операцией 86 3 365 15 256 40 15 575 3 296 46 14 978 3 435 Через 1 час после операции 84 12 167 9 937 40 9 925* 7 430** 44 14 206 11 473 Через 3 часа после one рации 84 23 012 14 244 41 22 805 15 481 43 13 139 23 209 Через 6 часов после операции 85 12 200 27 318 41 13 757*** 28 707 44 10 542 26 023 Че эез 9 часов после операции 82 26 451 11 863 40 27 050 13 449**** 42 25 881 10 261 87 41 46 20 839 21 805 19 978 8 868 9 474 8 301 84 39 45 14 381 15 051 13 800 5 411 5 973 4 865 27229 Таблица 5 (продолжение) Группа больных Всего ГК-1 Геалон День 90 Всего ГК-1 Геалон К-во 83 40 43 80 39 41 некоторых отношениях эти два вязкоупругих продуктов сравнимы, но они различаются в отношении послеоперационных осложнений Геалон, удаляемый из глаза, связан с большим повышением внутриглазного давления, чем Г К - 1 , удаляемый из глаза, а неудаленный Г К - 1 дает послеоперационное внутриглазное давление, сравнимое с Геалоном, удаляемым после операции Из этих результатов следует, что наиболее важной особенностью Г К - 1 является возможность его оставления без вызывания послеоперационных осложнений Эта возможность дает следующие ценные преимущества 1 Она упрощает хирургический процесс, поскольку исключается этап удаления продукта после операции 2 Уменьшается риск осложнений, связанных с подготовительными процедурами (т е во время аспирации) Примерами такого риска являются травмы, связанные с хирургическими процессами и их последствиями Настоящее изобретение касается также фармацевтических препаратов, содержащих в качестве активного ингредиента новую молекулярную фракцию гиалуроновой кислоты в виде ее натриевой соли ГК - 1, особенно в виде солевых растворов с нейтральной величиной рН Выбранная концентрация ГК - 1 такова, что достигается требуемая степень вязкости, например, вязкость порядка 300 мПа с (при 350 сек ) и порядка 10 000 мПа с (при 1 сек) Изобретение также касается применения новой фракции гиалуроната натрия ГК - 1 в глазной хирургии, особенно в операциях на катаракте или имплантации хрусталика Следующие примеры иллюстрируют изобретение Пример 1 Процесс получения фракции ГК - 1 и ее относительная характеристика Куриные гребешки, свежие или замороженные, (3000 г), тонко измельчают в мясорубке и затем тщательно гомогенизируют в механическом гомогенизаторе Получаемую в результате пасту помещают в стеклянный сосуд с 10 объемами безводного ацетона или этанола, содержащими 0,1% весового объема специфического хелатообразующего агента, способного образовывать комплекс с железом Примерами использования хелатообразующих агентов являются 1,10 - фенантролин (С A R N 66-71-7) или его диметиловые производные Стеклянные емкости и специфические хелатообразователи используются для того, чтобы избежать процесса деполимеризации натриевой соли гиалуроновой кислоты, который иначе мог бы быть вызван ионами железа из стальных сосудов или остатками крови Куриные гребешки обрабатываются до полного удаления ионов железа (Приборный контроль спектр поглощения комплекса железо-хелатообразователь в фазе ацетона или этанола в 1 см клетках при длине волны максимального поглощения (510 нм, в случае 1,10-фенантролина, не более 0,005 атомных единиц) Дальнейший процесс промывки выполняется с использованием тех же объемов безводного аце Среднее Стандартное отклонение 14 313 3 732 14 825 3 761 13 837 3 683 13 138 13 128 13 146 3 252 3 357 3 190 *Две группы больных значительно различаются в отношении среднего внутриглазного давления (Р=0,0442 по тесту, приспособленному для неравных изменений) ** Стандартные отклонения групп больных значительно различаются (р=0,0070 по тесту Фишера) *** Стандартные отклонения групп больных имеют гранично значимое различие (р=0,0886 по тесту Фишера) **** Стандартные отклонения групп больных имеют гранично значимое различие (р=0,0898 по тесту Фишера) Таблица 6 Результаты статистики микроскопии с расширителем по группам больных по количеству эндотелиальных клеток Группа бо- К-во льных Перед операцией Всего 85 ГК-1 40 Геалон 45 День 90 Всего 80 ГК-1 39 Геалон 41 Среднее Стандартное отклонение 2283 1 2234 6 2326 1 451 24 433 72 466 86 2158 1 2068 2 2243 5 505 73 585 52 405 08 показывают ценную эффективность использования Г К - 1 при удалении катаракты и имплантации хрусталика В частности показано, что Г К - 1 хорошо переносится Фактически этот продукт вызывает меньше послеоперационных осложнений (примерно в 2,5 раза), чем Геалон, испытанный в тех же экспериментальных условиях, т е с удалением препарата после операции (как описано в первом клиническом исследовании) Из послеоперационных осложнений особое внимание должно быть уделено повышению внутриглазного давления Следует также отметить, что в обоих исследованиях послеоперационные течение болезни у пациентов, которым вводился ГК - 1, и у тех, кому вводился Геалон, отличались в отношении внутриглазного давления В первом исследовании, где ГК - 1 и Геалон удалялись после операции, у большего количества пациентов, обработанных Геалоном, выявлялось повышение внутриглазного давления выше 21 мм рт ст на первый день после операции по сравнению с пациентами, обработанными Г К - 1 Во втором исследовании, когда ГК - 1 не удалялся после операции, в отличие от Геалона, профили изменения внутриглазного давления для Г К - 1 были сопоставимыми Таким образом, можно сделать вывод, что в 12 27229 тона (или этанола) для удаления всех остатков хелатообразователя Такая обработка производится до получения отрицательных результатов приводимого ниже теста "А" Тест "А" 5 мл ацетоновой (или этаноловой) фазы выпаривается при пропускании умеренного потока азота Остаток растворяется в 5 мл воды, и измеряется поглощение при длине волны максимального поглощения хелато-образователя Тест считается отрицательным, когда абсорбция составляет менее 0,1 атомных единиц Конечный продукт реакции перемешивается в течение 6 часов со скоростью 50 об/мин и остаивается в течение 12 часов, после чего растворитель откачивается сифоном и удаляется Этот процесс экстракции повторяется до тех пор, пока растворитель не достигнет правильного нужного уровня влажности (метод Карла-Фишера) Получаемое в результате вещество затем обрабатывается в центрифуге и высушивается в вакууме при подходящей температуре в течение 5 — 8 часов В результате этого процесса получается 500 - 600 г сухого порошка Затем 300 г сухого порошка подвергается процессу ферментного выпаривания с 0,2 г подходящего протеолитического агента (папаин, пепсин, трипсин или пронеза) в водной среде с фосфатным буфером, используя такое количество хлоргидрида цистеина, чтобы обеспечивалось его отношение к сухому порошку от 20 0,01 до 20 1 Затем эта смесь перемешивается в течение 24 часов со скоростью 60 об/мин при постоянной температуре 60-65 °С Полученная масса охлаждается до 25 °С, затем добавляется 60 г Целита (Celite), и перемешивание продолжается еще один час Полученная в результате смесь фильтруется до получения чистой жидкости Этот водный раствор, разбавленный до концентрации 2 мг/мл дистиллированой водой, вводится в колонну, заполненную макромолекулярной ионообменой смолой DOWEX М-15, получаемой в виде тетрабутиламмония (ТВА+) путем обработки гидроокисью тетрабутиламмония Раствор, элюированный из колонны выпаривается, а высушенный остаток растворяется в подходящем объеме N-метилпирролидона (или диметилсульфоксида) для достижения концентрации 2 мг/мл) Полученный раствор фильтруется, охлаждается при температуре 4 °С, и к нему добавляется равный объем воды Выполняют три последовательных процесса промывки с использованием хлористого метилена, и каждый раз самая низкая фаза удаляется Затем верхняя фаза обрабатывается бромидом натрия (NaBr используется в молярном соотношении 3 1с гиалуроновой кислотой) при температуре 4 °С, водный раствор осаждается путем добавки 3 объемов этанола, и осадок несколько раз промывается этанолом Осадок солюбизируется в воде, и полученный раствор подвергается диализу Раствор доводится к 0,1 М путем добавления хлорида натрия, и температура доводится до 50 °С В процессе перемешивания продукта при 60 г/мин к нему добавляется 45 г хлорида цетилпиридиния Эта смесь перемешивается в течение 60 мин, после чего добавляется 50 г Целита При взбалтывании температу ра продукта снижается до 25 °С, а образованный осадок собирают при помощи центрифугирования Полученный таким образом осадок суспензируется в 0,01 М растворе хлорида натрия (5 литров), содержащем 0,05% хлорида цетилпиридинхлорида Он перемешивается в течение еще 60 мин при температуре 50 °С Температура понижается до 25 °С, и осадок центрифугируется Затем трижды повторяется процесс промывки, и осадок собирается в сосуды, содержащие 3 литра 0,05 М раствора хлорида натрия, содержащего 0,05% хлорида цетилпиридиния Раствор перемешивается при 60 г/мин в течение 60 мин и выдерживается при постоянной температуре в 25 °С в течение 2 часов Всплывшее вещество удаляется при помощи центрифугирования Этот процесс повторяется несколько раз с использованием 0,1 М раствора хлорида натрия, содержащим 0,05% хлорида цетилпиридиния Смесь центрифугируется, и всплывшее вещество удаляется Осадок диспергируется в 0,30 М растворе хлорида натрия, содержащем 0,05% цетилпиридинхлорида (3 1) Смесь перемешивается, и собираются как осадок, так и чистая жидкость Экстракция осадка повторяется три раза с применением каждый раз 0,5 литра того же водного раствора Остаток осадка удаляется, а чистая жидкость собирается в один сосуд Температура жидкости повышается до 50 °С во время перемешивания Затем жидкость приводится к 0,23 М хлоридом натрия Добавляется 1 г цетилпиридинхлорида и перемешивание продолжается в течение 12 часов Смесь охлаждается до 25° С, затем фильтруется, сначала через набивку Целита, а затем через фильтр (1 мкм) Полученный раствор проходит молекулярную ультрафильтрацию через мембраны с исключением молекул мол весом 30 000, осущуствляется ультрафильтрация 3 исходных объема с добавлением 0,33 М раствора хлорида натрия Вводимый раствор хлорида натрия суспензируется, а объем жидкости уменьшается до четверти ее исходного объема Концентрированный таким образом раствор осаждается при перемешивании (60 г/мин) при температуре 25 °С тремя объемами этанола (95%) Осадок собирается центрифугированием, а всплывшее вещество удаляется Осадок разводится в 1 литре 0,1 М раствора хлорида натрия, и процесс осаждения повторяется с тремя объемами 95%-ного этанола Осадок собирается и промывается, сначала 75% этанолом (3 раза), затем абсолютным этанолом (3 раза) и, наконец, абсолютным ацетоном (3 раза) Полученный таким образом продукт (фракция ГК - 1) имеет средний молекулярный вес от 750 000 до 1 230 000 дальтон (предпочтительно между 925 000 и 1 230 000) Выход гиалуроновой кислоты равен 0,6% исходной свежепрепарированной ткани Конечный продукт, полученный в результате описанного выше процесса, имеет следующие характеристики - молекулярный вес 1 000 000 дальтон, - предельная вязкость от 14,5 до 21 дл/г, изме 13 27229 ренная при 25 °С в 0,15 М растворе NaCI при рН=7,0 с использованием вискозиметра Уббельходе Это соответствует среднему молекулярному весу от 750 000 до 1 230 000 дальтон (предпочтительно между 925 000 и 1 230 000), - содержание белков не выше 0,2%, выраженное в рачете на альбумин, определенное тестом Лоури (Лоури Дж и др "Измерение содержания белка при помощи фолинфенолового реактива" Журнал биологии и химии, 193, 265 — 275, 1951), - ультрафиолетовое поглощение при 257 нм и при 280 нм не превышает 1,0 атомную единицу, измеренная на 1% (вес об) водном растворе, динамическая вязкость 1% (вес/об) раствора в 0,15 М растворе NaCI при рН=7,0 не превышает нижеследующие пределы, определенные по скоростям сдвига с использованием ротационного вискозиметра, подобного описанному в US Pharmacopea XXII ed (911), стр 1619, при температуре 20 °С Скорость сдвига Динамическая вязкость (мПа с при 20° С) 1с1 воров с физиологическим рН фракции ГК - 1, прошедшей естественное старение и термостерилизацию, определяемая оценкой статическойой вязкости и выраженная как соответствующее уменьшением среднего молекулярного веса, не превышает следующие пределы - 97% исходного значения (хранение при 25 °С в течение 6 месяцев), - 75% исходного значения (стерилизация при 118 °С в течение 32 минут), - 80% исходного значения (стерилизация при 121 °С в течение 16 минут), - 90% исходного значения (стерилизация при 124 °С в течение 8 минут) Было проведено сравнительное исследование между изотоническим буферным раствором с физиологическим рН ГК - 1 и аналогичными промышленно получаемыми растворами гиалуроновой кислоты с целью определения стабильности в условиях - естественного старения (хранение в течение 6 месяцев при комнатной температуре), - термостерилизация в различных условиях Использовались фармацевтические материалы и оборудование, доказавшие свою надежность для описанных целей Использовались в частности Бесцветные стеклянные пробирки со следующими характеристиками -боросиликатное стекло типа 1 ( Ph Eur II ed ), - минимальная толщина стенки - 0,90 мм, максимальная толщина стенки - 1,00 мм Пробки из галобутиликовой резины со следующими характеристиками - тип эластомера хлоробутил, - инертная масса каолин, - пигменты двуокись титана и углеродная сажа, - вулканизирующее вещество окись цинка, - характеристики готового изделия в соответствии с Ph Eur II ed VI 2 3 1, - алюминиевые крышки, - вода для инъекций - в соответствии с Ph Eur lied Использовались реактивы аналитического сорта Для стерилизации применялся автоклав Федегари, модель F0F5 Суперспектра Статическая вязкость определялась вискозиметром Уббельходе с суспензированной средой при 25 °С в 0,15 М растворе NCI при рН=7,0 Соответствующий средний молекулярный вес подсчитывался по уравнению Марка - Хоуинка (X Марк - Z Elektrochemie, 1934, 40, с 499, Р Хоуинк -1 Prakt Chem , 1940, 157, с 15) Значения среднего молекулярного веса были выражены в процентах от начального значения для лучшей оценки тенденций деполимеризации Полученные результаты (Таблицы 8 и 9) показывают, что Г К - 1 обладает большей стабильностью (по крайней мере в два раза) чем этальнные образцы (см таблицу 7), у которых содержание железа значительно выше, чем у ГК -1 Таблица 8 Стабильность раствора влияние естественного старения не более 20 000 мПа с не более 2 000 мПа с не более 1 000 мПа с не более 500 мПа с Юс ' 100 с' 350 с 1 - содержание сульфатированного мукополисахарида в расчете на серу не превышает 0,07% при измерении с помощью плазменного прибора с индуктивной связью (I С Р ) с использованием подходящего эталонного вещества, - содержание железа не превышает 10 частей на миллион, измеренное методом атомного поглощения или прибором I С Р Проводилось сравнительное исследование между фракцией ГК - 1 и другими растворами натриевых солей гиалуроновой кислоты, получаемых в промышленности, в отношении содержания в них железа Полученные результаты (Таблица 7) четко показывают разное содержание железа у фракции ГК-1 содержание железа намного ниже, чем у других продуктов Таблица 7 Содержание железа (частей на миллион) в НА-1 относительно других продуктов ГК-1 Железо (частей на миллион) 7,5 с 1М NaOH, затем раствор дважды промывается хлористым метиленом (CH2CI2), каждый раз с удалением нижней фазы Верхняя фаза осаждается во время перемешивания со скоростью 60 об/мин при температуре 25 °С с тремя объемами этанола (95%) Осадок извлекается центрифугированием, а верхняя фаза удаляется Осадок собирается и промывается сначала 75% этанолом, затем абсолютным этанолом и, наконец, ацетоном Промытый продукт затем высушивается в вакууме в течение не менее 20 часов при температуре 25 °С Высушенный продукт солюбилизируется в воде обратным осмосом так, чтобы получить раствор конценрацией > 1 мг/мл Добавляется подходящее количество хлорида натрия для получения молярности между 0,1 и 0,4, и раствор подщелачивается при помощи 1 М NaOH Затем раствор фильтруют через стерилизующие фильтры Раствор осаждается при перемешивании (60 об/мин) при температуре 25 °С тремя объемами этанола (95%) Осадок выделяется центрифугированием, а верхняя фаза выбрасывается Осадок собирается и промывается сначала 75% этанолом, затем абсолютным этанолом и, наконец, ацетоном Промытый продукт высушивается в вакууме в течение не менее 50 часов при температуре 25 °С Полученный таким образом продукт имеет молекулярный вес 1 180 000 Примеры фармацевтических препаратов Приводимые ниже примеры служат для того, чтобы описать, только с целью иллюстрации, возможные фармацевтические препараты для терапевтического применения фракции ГК-1 Рецептура 1 ампулы по 2 мл, каждая ампула содержит Натриевая соль гиалуроновой кислоты (ГК-1) мг 24,0 одноосновный фосфат натрия 2Н2О мг 0,1 двухосновныйфосфат натрия 12Н2О мг 1,2 хлорид натрия мг 17,0 вода для доведения до объема мл 2,0 Рецептура 2 стерильные, заполненные шприцы 1,1 мл, каждый шприц содержит натриевая соль гиалуроновой кислоты (ГК- 1) мг 20,0 хлорид натрия мг 9,350 одноосновный фосфат натрия 2Н2О мг 0,055 двухосновный фосфат натрия 12Н2О мг 0,660 вода для доведения до объема мл 1,1 Рецептура 3 0,2 мл емкости одноразовых доз натриевая соль гиалуроновой кислоты (ГК-1) мг 400,0 хлорид натрия мг 440,0 одноосновный фосфат натрия 2Н2О мг 5,0 двухосновный фосфат натрия 12Н2О мг 60,0 вода для доведения до объема мл 100,0 Рецептура 4 0,2 мл, емкости одноразовых доз натриевая соль гиалуроновой кислоты (ГК-1) мг 200 хлорид натрия мг 670 хлорид калия мг 250,0 одноосновный фосфат натрия 2Н2О мг 5,0 двухосновный фосфат натрия 12Н2О мг 60,0 вода для доведения до объема мл 100,0 Состав 5 флаконы по 5 мл, каждый флакон содержит натриевая соль гиалуроновой кислоты (ГК-1) мг 200,0 хлорид натрия мг 670,0 хлорид калия мг 250,0 одноосновный фосфат натрия 2Н20 мг 5,0 двухосновный фосфат натрия 12Н20 мг 60,0 этил-меркуритиосалицилат натрия мг 5,0 вода для доведения до объема мл 100,0 Описаное таким образом изобретение, может осуществляться различными путями Такие изменения не должны рассматриваться как отклонение от сферы действия и объема изобретения, и все эти модификации, что очевидно для всех специалистов, охватываются формулой изобретения Тираж 50 екз ДП « Український інститут промислової власності» (Укрпатент) Україна , 01133, м Киів-133, бул Л Українки, 26 (044)295-81-42 (044)295-61-97 16