Рослинна композиція для запальних порушень, що містить екстракт квіткових і плодових голівок sphaeranthus indicus

1. Застосування композиції для лікування запального порушення, опосередкованого фактором некрозу пухлини-а (TNF-a), інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8), молекулою міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ1), молекулою адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM1) та Є-селектином, причому композиція включає терапевтично ефективну кількість екстракту квіткових і плодових голівок рослини Sphaeranthus 2 (19) 1 3 95612 4 11. Застосування за будь-яким з пп. 1-8, де запальне порушення є виразковим колітом. 12. Застосування за будь-яким з пп. 1-8, де запальне порушення є атеросклерозом. Галузь даного винаходу Даний винахід стосується нової рослинної композиції, що включає екстракт квіткових і плодових голівок рослини Sphaeranthus indicus. Даний винахід додатково стосується рослинної композиції, що містить екстракт, отриманий із квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus, що включає сполуку 3а-гідрокси-5а,9-диметил-3-метилен3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2-b]фуран2-он (7-гідрокси-4,11(13)-еудесмадієн-12,6-олід) (сполука 1) як біоактивний маркер і необов'язково інший активний(і) компонент(и), для ефективного лікування запальних порушень. Даний винахід також стосується фармацевтичної композиції, що включає 3а-гідрокси-5а, 9-диметил-3-метилен3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2-b]фуран2-он (сполука 1) як активний інгредієнт і фармацевтично прийнятні носії, для застосування в лікуванні запальних порушень. Даний винахід також стосується способу одержання композицій. Композиції за даним винаходом адаптовані для лікування запальних порушень. Даний винахід також стосується інгібіторної активності композицій стосовно фактора некрозу пухлини-α (TNF-α) і інтерлейкіну (IL-1, IL-6, IL-8). Даний винахід додатково стосується інгібування композиціями експресії молекули міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекули адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Єселектину. Даний винахід також розкриває способи введення композицій для лікування запальних порушень. Необов'язково екстракт або композицію, що включає зазначений екстракт, або композицію, що включає сполуку 1, можна застосовувати в комбінації, щонайменше, з одним іншим протизапальним агентом. Передумови даного винаходу Запалення відіграє фундаментальну роль в імунному захисті і прогресуванні хвороб, опосередкованих імунітетом. Запальна відповідь ініціюється у відповідь на ушкодження (наприклад, травма, ішемія і чужорідні частки) і інфекцію (наприклад, бактеріальна або вірусна інфекція) багатьма шляхами, включаючи хімічні медіатори (наприклад, цитокіни і простагландини) і запальні клітини (наприклад, лейкоцити). Він характеризується посиленням кровотоку до тканини, викликаючи пирексію, еритему, ущільнення і біль. Чуттєва добре збалансована взаємодія між гуморальними і клітинними імунними елементами в запальній відповіді дозволяє елімінувати шкідливі агенти та ініціювати відновлення ушкодженої тканини. Якщо ця чуттєво збалансована взаємодія зруйнована, запальна відповідь може призвести до значного ушкодження нормальної тканини, і може бути більш шкідливою, ніж початкове ушкодження, що ініціює реакцію. В таких випадках нерегульованих запальних відповідей потрібне клінічне втручання для запобігання ушкодження тканини і дисфункції органу. Хвороби, такі як ревматоїдний артрит, остеоартрит, хвороба Крона, астма, алергії, синдром септичного шоку, атеросклероз, хвороба запалення кишечнику, серед інших клінічних станів, характеризуються хронічним запаленням. Цитокіни, особливо IL-1, IL-6, IL-8 і TNF-α, відіграють важливу роль у запальному процесі. TNF-α, плеотропний цитокін, продукується, головним чином, макрофагами, але може також продукуватися іншими типами клітин. TNF-α демонструє сприятливу, а також патологічну активності. Він проявляє ефекти, що стимулюють ріст, і здатності, що інгібують ріст, крім того, являється саморегулюючим. Сприятливі функції TNF-α включають підтримку гомеостазу регуляцією циркадного ритму організму, установкою імунної відповіді на бактеріальні, вірусні, грибкові і паразитарні інфекції, заміною або реконструкцією ушкодженої тканини шляхом стимулювання росту фібробласта та, як припускає назва, убиваючи визначені пухлини. Хоча TNF-α відіграє критичну роль в уродженій і надбаній імунних відповідях, неадекватне продукування TNF-α може викликати патологічні зміни, що призводять до хронічного запалення та ушкодження тканини. Показали, що TNF-α відіграє критичну роль у патогенезі багатьох хронічних запальних хвороб, таких як хвороба запалення кишечнику, ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, псоріазний артрит, остеоартрит, рефракторний ревматоїдний артрит, хронічний неревматоїдний артрит, остеопороз/резорбція кістки, коронарна хвороба серця, васкуліт, виразковий коліт, псоріаз, синдром розладу дихання у дорослих, діабет, порушення гіперчутливості шкіри уповільненого типу і хвороба Альцгеймера. Інтерлейкін-1 (IL-1) є важливою частиною системи уродженого імунітету, що регулює функції адаптивної імунної системи. Баланс між IL-1 і антагоністом рецептора IL-1 (IL-1ra) у локальних тканинах впливає на можливий розвиток запальної хвороби і структуральне ушкодження, що виникає. У присутності надмірної кількості IL-1 запальні та аутоімунні порушення можуть розвиватися в суглобах, легенях, шлунково-кишковому тракті, центральній нервовій системі (ЦНС) або кровоносних судинах. Серед різних запальних порушень ревматоїдний артрит (РА) є аутоімунним порушенням. РА являє собою хронічну, системну, запальну хворобу суглоба невідомої етіології. При РА звичайно тонка синовіальна вистілка суглобів заміняється запальною, високо васкуляризованою, інвазивною фіброколагеназною тканиною (панусом), що руйнує і хрящ, і кістку. Зони, що можуть бути пошкоджені, включають суглоби рук, зап'ястя, шию, щелепу, лікті, коліно, ступню і щиколотки. Руйнування хряща при РА пов'язані з порушеною експресією цитокінів і фактора росту в уражених суглобах. 5 Двома клінічно важливими цитокінами, що вивільняються в синовіальну оболонку, є IL-1 і TNFα.TNF-α може активувати свою власну експресію, а також полегшувати експресію інших генів, залучених до РА, включаючи IL-1, IL-6, IL-8, циклооксигеназу-2 (СОХ-2), синтетазу оксиду азоту, що індукується (iNOS), молекулу міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекулу адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Є-селектин. Цей тип позитивної системи регулювання може підсилити і зберегти локальні запальні відповіді. Тому, неадекватність або надекспресія TNF-α призводить до координованого посилення експресії багатьох генів, чиї продукти опосередковують запальну та імунну відповіді і, таким чином, призводять до клінічних проявів РА. Рекрутмент та ретенція лейкоцитів є критичними подіями в патогенезі усіх хронічних запальних порушень, включаючи РА. Більш того, адгезія циркулюючих лейкоцитів, особливо моноцитів, для васкулярного ендотелію також є критичною подією у розвитку атеросклерозу. Цей процес залежить від взаємодії між адгезійними молекулами, експресованими на поверхні ендотеліальних клітин, таких як ІСАМ-1,VCAM-1, Є-селектин, і родинних їм лігандів на лейкоцитах. Тому, ІСАМ-1,VCAM-1 і Є-селектин відповідають за рекрутмент запальних клітин, таких як нейтрофіли, еозинофіли і Τ лімфоцити, від циркуляції до ділянки запалення. Ці адгезійні протеїни знаходяться у нормі на низькому рівні на поверхні ендотеліальних клітин, але значно індукуються різними прозапальними цитокінами, такими як TNF-α. Сама загальна терапія для лікування запальних порушень включає застосування нестероїдних протизапальних лікарських засобів (NSAID), наприклад, напроксен, диклофенак, ібупрофен, для полегшення симптомів, таких як біль. Однак, незважаючи на широко розповсюджене застосування NSAID, багато індивідуумів не можуть переносити дози, необхідні для лікування порушення протягом тривалого періоду часу, оскільки NSAID, як відомо, заподіюють ерозії шлунка. Крім того, NSAID просто лікують симптоми порушення, а не причину. Якщо пацієнти не реагують на NSAID, застосовуються інші лікарські засоби, такі як метотрексат, солі золота, D-пеніциламін і кортикостероїди. Такі лікарські засоби також мають істотні токсичні ефекти. Лікарські засоби моноклональних антитіл, такі як інфліксимаб, етанерсепт та адалімумаб, застосовуються як протизапальні агенти, але мають недоліки, такі як спосіб введення (тільки парентеральний), висока вартість, індукція алергії, активація латентного туберкульозу, підвищення ризику рака і хвороби серцевої недостатності. Отже, існує необхідність у розвитку поліпшених та альтернативних лікарських засобів зі зниженими побічними ефектами для запобігання і лікування запальних порушень, викликаних посиленням IL-1 і TNF-α. Трави були відомі і застосовувалися в усьому світі для лікування багатьох станів. Існує свідчення, що продукти, отримані з рослин, мають потенційні фармакологічні і терапевтичні ефекти на ссавців і мають тенденцію виявляти менш шкідливі побічні ефекти, ніж синтетичні лікарські засоби. 95612 6 Даний винахід розкриває нову рослинну композицію, що містить екстракт квіткових і плодових голівок рослини Sphaeranthus indicus. Композицію можна застосовувати для лікування різних запальних порушень з мінімальними побічними ефектами. Sphaeranthus indicus являє собою загальновідомий бур'ян, що зустрічається на рисових полях. Ця рослина належить до сімейства Asteraceae, а у творах Аюрвєди відома як mahamundi або gorakhmundi. Рослина, що росте по всій Індії, являє собою розгалужену трав'янисту рослину з пурпурними квітками. Її застосовують при порушеннях печінки і шлунка. Рослину застосовують у народній медицині як засіб при різних захворюваннях, включаючи дизентерію, біль у матці і піхві, хворобах грудей, при очищенні і збагаченні крові, інфекціях шляхів сечовиведення, загоєнні ран і деяких інших хвороб. Полірослинна формуляція "RV-08", що містить Sphaeranthus indicus, розроблена для протидії імунодефіцитним порушенням (Indian Journal of Pharmacology, 33, 454-55, (2001)). Повідомили про виділення нового сесквітерпенового глікозида сфаєрантаноліда з квіток Sphaeranthus indicus. Виділена сполука сфаєрантанолід виявляла імуностимулюючу активність (Phytochemistry, 29(8), 2573-76, (1990)). Повідомили про імуномодулюючі активності метанольного екстракту квіткових голівок Sphaeranthus indicus (Ars Pharmaceutica 45:3; 281-91, (2004)). Повідомляють, що водний екстракт, отриманий з коренів Sphaeranthus indicus, був помірно активним у пригніченні Propionibacterium acnes, індукуючи утворення TNF-α і IL-8. Sphaeranthus indicus заподіював меншу, але усе ще значну, супресію видів, що реагують з киснем (Phytomedicine, 10(1), 34-38, (2003)). Наскільки відомо, не зустрічаються повідомлення про будь-який лікарський засіб, що містить екстракт квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus для лікування запальних порушень. Для подолання проблем побічних ефектів існуючого напрямку лікування, таких як індукція алергії, активація латентного туберкульозу, мієлосупресія, підвищення ризику рака і хвороба серцевої недостатності, зв'язаних з відомими в даній галузі композиціями, даний винахід забезпечує нову рослинну композицію, ефективну проти запалення, що має інгібіторну активність проти TNF-α, інтерлейкінів (IL-1, IL-6, IL-8) і експресії молекули міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекули адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Є-селектина. Композиції за даним винаходом можна також застосовувати в комбінації, щонайменше, з одним іншим протизапальним агентом. Цілі даного винаходу Ціль даного винаходу спрямована на забезпечення нової рослинної композиції, що включає терапевтично ефективну кількість екстракту квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus як активний інгредієнт разом з фармацевтично прийнятними носіями. Іншою метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну 7 кількість 3а-гідрокси-5а,9-диметил-3-метилен3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2-b]фуран2-она (сполука 1) як активного інгредієнта разом з фармацевтично прийнятними носіями, для лікування запальних порушень. Іншою додатковою метою даного винаходу є забезпечення способу одержання композицій. Ще однією додатковою метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування порушень, опосередкованих TNF-α і інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8). Наступною додатковою метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування порушень, опосередкованих молекулою міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекулою адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Є-селектином. Іншою метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень. Ще однією метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень, опосередкованих TNF-α. Ще однією метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень, опосередкованих інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8). Наступною метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень, опосередкованих молекулою міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекулою адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Єселектином. Ще однією метою даного винаходу є забезпечення композиції, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, у комбінації, щонайменше, з однією біоактивною речовиною, для одержання синергічного ефекту. Наступною метою даного винаходу є забезпечення застосування зазначених композицій окремо або в комбінації, щонайменше, з одним іншим протизапальним агентом для лікування запальних порушень, що включають ревматоїдний артрит. Інші цілі і додаткова можливість застосовності даного винаходу стануть очевидними з наступного детального опису. Короткий опис даного винаходу Таким чином, за одним аспектом даного винаходу передбачена нова рослинна композиція, що включає терапевтично ефективну кількість екстракту квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indi 95612 8 cus як активного інгредієнта разом з фармацевтично прийнятними носіями. За іншим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість 3а-гідрокси-5а,9-диметил-3метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2b]фуран-2-она (сполука 1) як активного інгредієнта разом з фармацевтично прийнятними носіями, для лікування запальних порушень. За наступним аспектом даного винаходу передбачений спосіб одержання композицій. За іншим додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування порушень, опосередкованих TNF-α та інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8). За наступним додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування порушень, опосередкованих молекулою міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ1), молекулою адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM1) і Є-селектином. За додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень. За додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень, опосередкованих TNF-α. За додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень, опосередкованих інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8). За додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, для лікування запальних порушень, опосередкованих молекулою міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ1), молекулою адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM1) і Є-селектином. За наступним додатковим аспектом даного винаходу передбачена композиція, що включає терапевтично ефективну кількість активного інгредієнта, вибраного з екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1 у комбінації, щонайменше, з однією біоактивною речовиною для досягнення синергічного ефекту. За іншим додатковим аспектом даного винаходу передбачене застосування композицій окремо або в комбінації, щонайменше, з одним іншим протизапальним агентом для лікування запальних порушень, що включають ревматоїдний артрит. Детальний опис даного винаходу Варто розуміти, що детальний опис і специфічні приклади, що визначають приклади здійснення 9 даного винаходу, наведені тільки для ілюстрації, оскільки різні зміни і модифікації в ідеї та обсязі даного винаходу стануть очевидними фахівцю в даній галузі. Фахівець у даній галузі на основі опису зможе використовувати даний винахід у його самих широких межах. Наступні специфічні приклади здійснення варто розглядати тільки як ілюстративні, а не обмежуючі того, що випливає з опису, будь-яким шляхом. Якщо не зазначено інакше, усі технічні і наукові вирази, застосовувані тут, мають ті ж значення, що і загальноприйняті в галузі, до якої належить даний винахід. Вираз "запальне порушення", як застосовується тут, означає хворобу або стан, що характеризується хронічним запаленням, включаючи, але не обмежуючись, ревматоїдний артрит, остеоартрит, ювенільний ревматоїдний артрит, псоріазний артрит, рефракторний ревматоїдний артрит, хронічний неревматоїдний артрит, остеопороз/резорбцію кістки, коронарну хворобу серця, атеросклероз, васкуліт, виразковий коліт, псоріаз, хворобу Крона, синдром розладу дихання у дорослих, порушення гіперчутливості шкіри уповільненого типу, синдром септичного шоку і хворобу запалення кишечнику. Вираз "фармацевтично прийнятні", як застосовується тут, означає носій, розчинник, наповнювачі та/або солі, що повинні бути сумісними з іншими інгредієнтами формуляції і не шкідливим для реципієнта. Вираз "фармацевтично прийнятний носій", як застосовується тут, означає нетоксичну, інертну тверду речовину, напівтверду речовину, розчинник, матеріал капсули або допоміжну формуляцію будь-якого типу. Деякі приклади матеріалів, що можуть служити фармацевтично прийнятними носіями, являють собою цукри, такі як лактоза, глюкоза і сахароза; крохмалі, такі як кукурудзяний крохмаль і картопляний крохмаль; целюлозу та її похідні, такі як натрію карбоксиметилцелюлоза, етилцелюлоза та целюлози ацетат; солод; желатин; тальк; а також інші нетоксичні сумісні агенти, що змазують, такі як натрію лаурил сульфат і магнію стеарат, а також барвники, агенти вивільнення, агенти покриття, підсолоджувачі, смакові та ароматичні агенти; консерванти та антиоксиданти також можуть бути присутніми у композиції відповідно до обговорення розроблювача рецептур. Вираз "терапевтично ефективна кількість", як застосовується тут, означає кількість сполуки або композиції (наприклад, екстракту Sphaeranthus indicus), достатнє для значної індукції позитивної модифікації в стані, що вимагає регуляції або лікування, але досить низьке для запобігання побічних ефектів (при розумному співвідношенні користі до ризику), у рамках обґрунтованого медичного обговорення. Терапевтично ефективна кількість сполуки або композиції буде варіювати в залежності від конкретного стану, що лікують, віку та фізичного стану пацієнта, серйозності стану, що лікують/попереджають, тривалості лікування, природи конкурентної терапії, застосовуваної специфічної сполуки або композиції, конкретного застосовуваного фармацевтично прийнятного носія і подібних 95612 10 факторів. Як застосовується тут, усі відсотки визначаються за вагою, якщо не визначено інакше. Вираз "біоактивний маркер" застосовується тут для визначення характеристики (або фітохімічного профілю), що корелює з прийнятним ступенем фармацевтичної активності. "Максимальна застосовна доза" являє собою найбільшу кількість лікарського засобу, яку дорослий може безпечно прийняти. Слід зазначити, що, як застосовується в описі і прикладеній формулі, форми однини включають множину позначеного, якщо з контексту явно не випливає інше. "Sphaeranthus indicus екстракт" або "екстракт Sphaeranthus indicus", згаданий тут, означає суміш сполук, що присутні в рослині Sphaeranthus indicus. Ці сполуки екстрагують із сухих квіткових і плодових голівок рослини за допомогою методик екстракції, добре відомих у даній галузі (наприклад, застосування органічних розчинників, таких як нижчі спирти, алкільні складні ефіри, алкільні прості ефіри, алкільні кетони, хлороформ, простий ефір нафти, гексан, та/або неорганічних розчинників, таких як вода). Даний процес екстракції рослинних похідних, що входять до складу, із квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus можна розширити до великомасштабного виготовлення. Вираз "активний інгредієнт", як застосовується тут, означає "екстракт Sphaeranthus indicus", або "сполука 1", або "збагачений екстракт Sphaeranthus indicus, що містить суміш двох або більш активних сполук". Екстракт Sphaeranthus indicus можна стандартизувати за допомогою традиційних методів, таких як Високо Ефективна Рідинна Хроматографія (ВЕРХ) або Високо Ефективна Тонкошарова Хроматографія (ВЕТШХ). У прикладі здійснення даний винахід стосується рослинної композиції, що включає стандартизований екстракт Sphaeranthus indicus разом з фармацевтично прийнятними носіями. Біоактивні маркерні сполуки можна виділити з екстракту квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus шляхом очищення на колонковій хроматографії, що визначає біоактивність, та препаративній ВЕРХ. Сполуки можна охарактеризувати аналізом даних спектра. Рослинна композиція за даним винаходом містить екстракт квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus, включаючи 2-9 % 3а-гідрокси-5а,9диметил-3-метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро3Н-нафто[1,2-b]фуран-2-она (сполуки 1) у якості біоактивного маркера і необов'язково інший активний(і) агент(и). У прикладі здійснення даний винахід стосується композиції, що включає 3а-гідрокси5а,9-диметил-3-метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9bоктагідро-3Н-нафто[1,2-b]фуран-2-он (сполука 1) як активний інгредієнт разом з фармацевтично прийнятними носіями. У прикладі здійснення даний винахід стосується застосування зазначеної композиції, що включає 3а-гідрокси-5а,9-диметил3-метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Ннафто[1,2-b]фуран-2-он (сполука 1), для одержання лікарського засобу для лікування запальних порушень. Даний винахід додатково стосується способу одержання композицій, прийнятних для 11 лікування запальних порушень. Стандартизований екстракт Sphaeranthus indicus змішують з фармацевтично прийнятними носіями і формулюють у терапевтичні дозовані форми. Доза для щоденного введення повинна бути вибрана для задоволення бажаного ефекту. У прикладі здійснення зазначена рослинна композиція, що включає стандартизований екстракт Sphaeranthus indicus, передбачена для лікування запальних порушень. В іншому прикладі здійснення за даним винаходом композиція, що включає 3а-гідрокси-5а,9-диметил3-метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Ннафто[1,2-b]фуран-2-он (сполука 1) разом з фармацевтично прийнятними носіями, передбачена для лікування запальних порушень. Сполука 1 3агідрокси-5а,9-диметил-3-метилен3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2-b]фуран2-он виділили з екстракту Sphaeranthus indicus методикою, відомою в суміжних галузях, і характеризували за допомогою Ядерного Магнітного Резонансу (ЯМР) та Мас-спектрометрії. Композиція включає сполуку 1 3а-гідрокси-5а,9-диметил-3метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2b]фуран-2-он, яку також можна одержати з інших рослинних джерел або можна одержати традиційними синтетичними способами, відомими фахівцю в даній галузі. В обсяг даного винаходу включена фармацевтична композиція, що містить сполуку 1, яку можна одержати з інших джерел, для застосування в лікуванні запальних порушень. У наступному прикладі здійснення даного винаходу передбачений спосіб одержання фармацевтичної композиції, що включає 3а-гідрокси-5а,9-диметил3-метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Ннафто[1,2-b]фуран-2-он (сполука 1), шляхом змішування сполуки 1 з одним або більше фармацевтично прийнятним носієм і формулювання в терапевтичні дозовані форми. Дозу для щоденного введення потрібно вибрати для прийнятного бажаного ефекту. Композиції за даним винаходом можна вводити орально, наприклад, у формі пігулок, таблеток, покритих таблеток, капсул, гранул, еліксирів або сиропу. Екстракт квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus застосовують для одержання оральних препаратів, що містять 3-70 % за вагою зазначеного екстракту, що ретельно змішують із традиційною основою, як буде нижче описано в деталях. Екстракту квіткових і плодових голівок, що містить 2-9 % (вага/вага) сполуки 1 як біоактивного маркера, достатньо для досягнення бажаних результатів. Сполуку 1 3а-гідрокси-5а,9-диметил3-метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Ннафто[1,2-b]фуран-2-он застосовують для одержання оральних препаратів, що містять 3-99 % за вагою зазначеної сполуки, яку ретельно змішують із традиційною основою, як буде нижче описано в деталях. Композиції за даним винаходом можна застосовувати для місцевого та черезшкірного введення. Місцеві композиції, застосовувані в даному винаході, включають формуляції, прийнятні для місцевого нанесення на шкіру. Композиції можна формулювати у типи продукту, що широко варіюють, які включають, але не обмежуються, лосьйони, креми, гелі, стіки, спреї або мазі. Екст 95612 12 ракт квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus застосовують для одержання місцевих препаратів, що містять 1-15 % за вагою зазначеного екстракту, що ретельно змішують із традиційною основою, як буде нижче описано в деталях. Екстракту квіткових і плодових голівок Sphaeranthus indicus, що містить близько 2-9 % (вага/вага) сполуки 1 як біоактивного маркера, достатньо для досягнення бажаних результатів. У прикладі здійснення композиції передбачені для лікування запальних порушень, опосередкованих TNF-α і інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8). У прикладі здійснення композиції передбачені для лікування запальних порушень, опосередкованих молекулою міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекулою адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Є-селектином. Актуальні рівні дозування активного інгредієнта, екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, у композиціях за даним винаходом можуть варіювати для одержання кількості активного інгредієнта, що ефективно для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції і способу введення. Вибраний рівень дозування буде залежати від ряду факторів, включаючи активність конкретного застосовуваного активного інгредієнта, екстракту Sphaeranthus indicus або сполуки 1, спосіб введення, час введення, швидкість виведення конкретної використовуваної композиції, тривалість лікування, застосування в комбінації з іншими екстрактами, вік, стать, вага, стан, загальний стан здоров'я і попередня історія хвороби пацієнта, що потребує лікування, і подібні фактори, добре відомі в медицині. В іншому прикладі здійснення даний винахід стосується композиції, що включає активний інгредієнт, екстракт Sphaeranthus indicus або сполуку 1, у комбінації, щонайменше, з одним іншим рослинним екстрактом, що виявляє протизапальну активність, для одержання синергічного ефекту. Цю іншу рослину можна вибрати з рослин, таких як Curcuma longa і Zingiber officinale. У наступному прикладі здійснення композиція додатково містить активний інгредієнт, екстракт Sphaeranthus indicus або сполуку 1, у комбінації, щонайменше, з однією біоактивною речовиною для одержання синергічного ефекту. У наступному прикладі здійснення композиція за даним винаходом, що включає активний інгредієнт, екстракт Sphaeranthus indicus або сполуку 1, може необов'язково містити, щонайменше, один інший протизапальний агент або може також застосовуватися в комбінації з традиційним протизапальним агентом. Протизапальний агент можна вибрати зі стероїдів, таких як преднізолон, гідрокортизон; протиревматичних лікарських засобів, що модифікують хворобу (DMARD), таких як метотрексат, сульфасалазин; або NSAID, таких як напроксен, диклофенак, ібупрофен та подібне. У прикладі здійснення рослинна композиція, що включає активний інгредієнт, екстракт Sphaeranthus indicus або сполуку 1, виділену з екстракту Sphaeranthus indicus, передбачена для лікування ревматоїдного артриту. 13 Інший приклад здійснення за даним винаходом також стосується інгібіторної активності на TNF-α і інтерлейкін (IL-1, IL-6, IL-8) композицій, що включають активний інгредієнт. Наступний приклад здійснення за даним винаходом також стосується інгібування експресії на клітинній поверхні молекул адгезії, таких як молекула міжклітинної адгезії 1 (ІСАМ-1), молекула адгезії васкулярних клітин 1 (VCAM-1) і Є-селектин, композиціями, що включають активний інгредієнт. Композиції за даним винаходом є прийнятними для застосування в лікуванні гострої і хронічної форм запальних порушень, опосередкованих TNFα, інтерлейкінами (IL-1, IL-6, IL-8), ІСАМ-1, VCAM-1 і Є-селектином, зокрема, ревматоїдного артриту, ювенільного ревматоїдного артриту, псоріазного артриту, остеоартриту, рефракторного ревматоїдного артриту, хронічного неревматоїдного артриту, остеопорозу/резорбції кістки, коронарної хвороби серця, васкуліту, виразкового коліту, псоріазу, синдрому розладу дихання у дорослих, хвороби Альцгеймера у людей. Також композиції за даним винаходом можна застосовувати для лікування запалення при хворобах, подібних до хвороби запалення кишечнику, хвороби Крона, синдрому септичного шоку, атеросклерозу і різних аутоімунних хвороб серед інших клінічних станів. Даний винахід також стосується способу лікування запальних порушень, що включає введення композицій селективно оральним шляхом, місцевим нанесенням, черезшкірним нанесенням. Наступні приклади ілюструють, але не обмежують, обсяг даного винаходу. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що дане обговорення являє собою тільки типові приклади здійснення, не призначені для обмеження більш широких аспектів даного винаходу, що являють приклад здійснення в типовому розумінні. Приклад 1 Готування метанольного екстракту Sphaeranthus indicus Сухі квіткові і плодові голівки Sphaeranthus indicus (200 г) подрібнили. Порошковий матеріал екстрагували за допомогою метанолу (2,5 л) збовтуванням при 60 °C протягом 3 годин. Екстракт відфільтрували під вакуумом. Цей процес екстракції повторили ще два рази. Екстракти об'єднали і випарили. Вихід: 23,29 г (11,65 % вага/вага). З'ясували, що екстракт прикладу 1 містить 6 % сполуки 1 (описаної в прикладі 4), як оцінили за допомогою ВЕТШХ. Приклад 2 Готування етилацетатного екстракту Sphaeranthus indicus Сухі квіткові і плодові голівки Sphaeranthus indicus (350 г) подрібнили. Порошковий матеріал екстрагували за допомогою етилацетату (3 л) збовтуванням при 60 °C протягом 3 годин. Екстракт відфільтрували під вакуумом. Цей процес екстракції повторили ще два рази. Екстракти об'єднали і випарили. Вихід: 19 г (9,5 % вага/вага). Приклад 3 Готування водного екстракту Sphaeranthus indicus 95612 14 Сухі квіткові і плодові голівки Sphaeranthus indicus (200 г) подрібнили. Порошковий матеріал екстрагували за допомогою води (1,2 л) збовтуванням при 80 °C - 90 °C протягом 3 годин. Екстракт відфільтрували під вакуумом. Цей процес екстракції повторили. Екстракти об'єднали і випарили для видалення води. Далі неочищений екстракт висушили сушінням з виморожуванням. Вихід: 21 г (10,5 % вага/вага). Приклад 4 Виділення 3а-гідрокси-5а,9-диметил-3метилен-3а,4,5,5а,6,7,8,9b-октагідро-3Н-нафто[1,2b]фуран-2-она (сполука 1) Метанольний екстракт (32 г), виготовлений способом, описаним у прикладі 1, очистили колонковою хроматографією (силікагель, метанол у хлороформі). Остаточне очищення виконали препаративною ВЕРХ (колонка силікагелю, гексан:ізопропанол, 95:5) для одержання зазначеної сполуки. 1H ЯМР (CDCI3, 500 MHz): 51,085 (3Н, СН3), 4,997 (1H, s), 5,801 (1H, s), 6,270 (1Н, s); MC: + m/e (ES) 248 (M ). Сполуку охарактеризували порівнянням отриманих даних спектра з відомими в літературі (Indian Journal of Chemistry, Vol. 25B, 233-238, (1986); J. Chem Soc. Perkin Trans. 1:(2), 157-160, (1988); J. Chem. Research (M), 0501-0509,1989). Фармакологічні результати Ефективність даних рослинних екстрактів, сполук, виділених очищенням екстракту, і формуляцій за інгібуванням активності TNF-α і інтерлейкінів (IL-1, IL-6 і IL-8) визначали рядом фармакологічних досліджень, добре відомих у даній галузі та описаних нижче. In vitro обстеження для ідентифікації інгібіторів TNF-α Приклад 5 Первинне обстеження - мононуклеарні клітини периферійної крові людини (hPBMC) TNF-α, що продукуються ліпополісахаридами (LPS) у hPBMC, виміряли способом, описаним Jansky, L. et al (Physiol. Res. 52: 593-598, (2003)). Кров відбирали у здорових донорів у пробірки з вакуумом (BD вакутейнер) з калію EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота). РВМС виділили за допомогою градієнтного центрифугування в розчині Histopaque-1077 (Sigma). Виділені РВМС суспендували в культуральному середовищі RPMI (Gibco BRL, Pasley, Великобританія), що містить 10 % ембріональної бичачої сироватки (FBS) (Hyclone, Utah, США), 100 Одиниць/мл пеніциліну (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) і 100 мкг/мл стрептоміцину (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO). 6 Концентрацію клітин відрегулювали до 1  10 клітин/мл. Життєздатність, як визначено видаленням барвника трипанового синього, складала рівномірно >98 %. Клітинну суспензію (100 мкл) додали в лунки 96-лункового культурального планшета. Після висіву клітин 79 мкл культурального середовища та 1 мкл восьми різних концентрацій аналізованих зразків (остаточна концентрація 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 мкг/мл), розчинених у DMSO (диметилсульфоксид, Sigma, МО, США), додали до клітин. Остаточну концентрацію DMSO довели до 0,5 %. Розчинник (0,5 % DMSO) використовува 15 95612 ли як контроль. Роліпрам (100, 300 мкМ) використовували як стандарт. Планшети інкубували 30 хвилин при 37 °C в атмосфері 5 % СО2. Наприкінці додали 20 мкл (10 мкг/мл) на лунку LPS, (Escherchia coli 0127:B8, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) до остаточної концентрації 1 мкг/мл. Планшети інкубували при 37 °C 5 годин в атмосфері 5 % СО2. Для оцінювання цитотоксичного ефекту рослинних екстрактів аналіз клітинної життєздатності виконували за допомогою реагенту MTS (3-(4,5 16 диметилтіазол-2-іл)-5-(3-карбоксиметоксифеніл)-2(4-сульфоніл)-2Н-тетразоліум) після 5 годин інкубації. Супернатанти зібрали і досліджували на TNF-α за допомогою ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), як описано виробником (OptiEIA ELISA sets, BD Biosciences, Pharmingen). Реєстрували % інгібування. Оцінювали відсоток цитотоксичності аналізованих зразків у порівнянні з контролем. Результати наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Інгібування TNF-α в мононуклеарних клітинах периферичної крові людини Зразок Екстракт приклада 1 Концентрація (мкг/мл) 0,1 1 10 100 0,1 1 10 100 0,1 1 10 100 100 300 Екстракт приклада 2 Екстракт приклада 3 Роліпрам (мкМ) Приклад 6 Ефект на прозапальні цитокіни, що вивільняються hPBMC, які стимулюються LPS Ефект рослинного екстракту на прозанальні цитокіни: TNF-α, інтерлейкін-1 (IL-1), інтерлейкін-6 (IL-6) і інтерлейкін-8 (IL-8) виміряли за допомогою утворення супернатантів у первинному до % інгібування TNF 0,0 14,0 96,0 97,0 0,0 34,0 97,0 97,0 0,0 0,0 4,0 96,0 84,0 90,0 % токсичності за 5 годин 0 0 7 0 20 13 22 8 0 11 0 0 2 21 слідженні. Рівні цих цитокінів оцінили за допомогою ELISA, як описано виробником (OptiEIA ELISA sets, BD Biosciences, Pharmingen). Значення 50 % інгібіторної концентрації (ІС50) розрахували методом нелінійної регресії за допомогою програмного забезпечення GraphPad (Prism 3.03). Таблиця 2 Ефект екстракту приклада 1 на прозапальні цитокіни Серійний номер 01 02 03 04 Прозапальні цитокіни TNF-α IL-1 IL-6 IL-8 Висновок: виявили інгібування екстрактом приклада 1 прозапальних цитокінів (TNF-α, IL-1, IL-6 і IL-8), що вивільняються hPBMC, які стимулюються LPS. Приклад 7 Ефект сполуки 1 на прозапальні цитокіни, що вивільняються hPBMC, які стимулюються LPS Сполуку 1 одержали за допомогою методики приклада 4. Оцінювання біоактивності виконали за методикою приклада 6. Ефект сполуки 1 на проза Екстракт приклада 1, ІС50 мкг/мл, (hPBMC) 5,1 4,9 26,8 31,0 пальні цитокіни: TNF-α, інтерлейкін-1 (IL-1), інтерлейкін-6 (IL-6) і інтерлейкін-8 (IL-8), виміряли за допомогою утворення супернатантів у первинному дослідженні. Рівні цих цитокінів оцінили за допомогою ELISA, як описано виробником (OptiEIA ELISA sets, BD Biosciences, Pharmingen). Значення 50 % інгібіторної концентрації (ІС50) розрахували методом нелінійної регресії задопомогою програмного забезпечення GraphPad (Prism 3.03). Результати наведені в таблиці 3. 17 95612 18 Таблиця 3 Ефект сполуки 1 на прозапальні цитокіни Серійний номер 01 02 03 04 Прозапальні цитокіни TNF-α IL-1 IL-6 IL-8 Висновок: виявили інгібування сполукою 1 прозапальних цитокінів (TNF-α, IL-1, IL-6 і IL-8), що вивільняються hPBMC, які стимулюються LPS. Приклад 8 Ефект на прозапальні цитокіни, утворені синовіальними клітинами, отриманими від пацієнта з РА Утворення цитокінів синовіальними клітинами, отриманими від пацієнта з ревматоїдним артритом (РА), що переніс хірургічне заміщення на коліні, виміряли відповідно до способу, описаному Brennan, F. M. et аl (The Lancet. July 29: 244-247, (1989)). Тканину синовіальної мембрани помістили в DMEM (середовище Ігла, модифіковане Дюльбекко) (Gibco), що містить 10 % FBS, 100 Одиниць/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину, 4 мг/мл колагенази типу І (Worthington), 1,5 мкг/мл ДНКази типу І (Sigma) і 15 Одиниць/мл гепарину, та інкубували при 37 °C 3 години. Після інкубації занурену тканину відфільтрували через 70-мкм мембрану, а клітини промили 3 рази в повному середовищі (DMEM з 10 % FBS). Синовіальні клітини культиву6 вали при 1  10 клітин/мл у присутнос Сполука 1, IC50 мкМ, (hPBMC) 0,7 0,4 1,6 8,9 ті/відсутності аналізованого зразка протягом 10 годин. Супернатанти зібрали центрифугуванням, а рівні цитокінів (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8) вимірили за допомогою ELISA. Для оцінювання цитотоксичного ефекту рослинних екстрактів аналіз клітинної життєздатності виконували за допомогою реагенту MTS. Значення 50 % інгібіторної концентрації (ІС50) розрахували методом нелінійної регресії за допомогою програмного забезпечення GraphPad (Prism 3.03). Висновок: виявили інгібування екстрактом приклада 1 прозапальних цитокінів (TNF-α, IL-1, IL-6 і IL-8), що продукуються синовіальними клітинами, отриманими від пацієнта з РА. Приклад 9 Ефект сполуки 1 на прозапальні цитокіни, що продукуються синовіальними клітинами, отриманими від пацієнта з РА Ефект сполуки 1 на прозапальні цитокіни, що продукуються синовіальними клітинами, отриманими від пацієнта з РА, вивчали за сполукою 1, як описано методикою приклада 8. Результати наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Ефект сполуки 1 на прозапальні цитокіни, що продукуються синовіальними клітинами Серійний номер 01 03 04 Прозапальні цитокіни TNF-α IL-6 IL-8 Висновок: виявили інгібування сполукою 1 прозапальних цитокінів (TNF-α, IL-6 і IL-8), що продукуються синовіальними клітинами, отриманими від пацієнта з РА. Приклад 10 Клітинний ELISA для експресії адгезійних молекул Дослідження розробили на основі посилання на Transplantation, Vo 63(5), 759-764, 1997 з модифікаціями. Клітинна культура і реагенти Ендотеліальні клітини пупкової вени людини (HUVEC) одержали від Cascade Biologies і витримували в М200 (Cascade Biologies, Portland, Or), доповненої ростовою добавкою з низьким вмістом сироватки (LSGS) при 37 С в інкубаторі з 5 % СО2. Клітини U937 (АТСС, Manassas, VA) вирощували на середовищі RPMI 1640, доповненому 10 % FBS (Hyclone, Logan, UT). Рекомбінантний людський TNF-α, антитіла до VCAM-1, ICAM-1, Є-селектину Сполука 1, ІС50 (мкМ), синовіальні клітини 0,8 1,4 10,9 одержали від R&D Systems, a LPS одержали від Sigma (St. Louis, МО). Клітинний ELISA для експресії адгезійних молекул 5 HUVEC висіяли при 7  10 клітин/лунка в 96лункові планшети, покриті фібронектином. Клітини стимулювали TNF-α (10 нг/мл) або LPS (1 мкг/мл) через 30 хвилин після додавання аналізованої сполуки. Після стимуляції клітини (Є-селектин і ІСАМ-1) фіксували параформальдегідом у фосфатному буферному розчині (PBS). Неспецифічне зв'язування блокували 2 % бичачим сироватковим альбуміном (ВSA) у фосфатному буферному розчині (PBS) протягом 1 години, а клітини інкубували з первинним антитілом протягом 2 годин. Для визначення VCAM-1 клітини блокували, інкубували з первинним антитілом протягом ночі, а потім фіксували. Клітини промили 0,1 % BSA у PBS та інкубували з кон'югованим з пероксидазою антитілом (Ab) до мишачого імуноглобуліну G (Ig), доданим 19 95612 протягом 90 хвилин. Після семиразового промивання додали 3,3'5,5'-тетраметилбензидиновий рідкий субстрат (ТМВ субстрат), і визначили оптичну щільність кожної лунки при 450 нм за допомогою пристрою, що зчитує, мікротитрувального планшета (Spectramax, Molecular Devices, CA). BAY 11-7082 [(Е)-3-(4-метилфенілсульфоніл)-2 20 пропеннітрил] використовували як стандарт, a DMSO як контроль розчинника. Оцінювали відсоток інгібування аналізованого зразка в порівнянні з контролем. Значення 50 % інгібуючої концентрації (ІС50) для кожного зразка в порівнянні з контролем визначали методом нелінійної регресії. Результати наведені в таблиці 5. Таблиця 5 Клітинний ELISA для експресії адгезійних молекул для екстракту приклада 1 і сполуки 1 Екстракт приклада 1, ІС50 (мкг/мл) 7,6 6,4 3,5 ІСАМ-1 VCAM-1 Є-селектин Висновок: екстракт приклада 1 та сполука 1 у залежності від дози знижують TNF-α-індуковану поверхневу експресію в ендотеліальних клітинах адгезійних молекул, таких як ІСАМ-1, VCAM-1 і Єселектин. Приклад 11 Адгезія ТНР-1 мононуклеарних клітин до HUVEC моношарів Дослідження адгезії виконували на лінії промоноцитних клітин ТНР-1, що визнана за прийнятну модель для моноцитів при дослідженнях адгезії в Сіrс. Res., 97, 236-243, 2005 з модифікаціями. Клітини ТНР-1 двічі промили середовищем для 5 мічення (М200 плюс LSGS). Клітини ТНР-1 (6  10 клітин на мол) позначили 10 мкг/мл ацетоксиметилового ефіру біс-карбоксиетилкарбоксифлюоресцина (флуоресцентна проба, BCECF-AM; Sigma) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після гасіння з 0,1 % BSA гранулу ресуспендували в середовищі для мічення. Для Сполука 1 ІС50 (мкМ) 0,52 0,4 0,2 оцінки адгезії з моноцитами HUVEC моношари обробили TNF-α (1 нг/мл) у присутності або відсутності різних концентрацій аналізованого зразка. Середовище видалили, промили, додали клітини, 4 мічені ТНР-1 у лунки (6  10 клітин на лунку) та інкубували 10 хвилин при кімнатній температурі в темряві. Після спільного інкубування лунки промили, наповнили буфером, що здійснює лізис (0,1 % Тритон-Х у 1,5М Tris буфера), та інкубували 30 хвилин. Флуоресценцію вимірили за допомогою пристрою, що зчитує, для флуоресценції (PolarStar Optima, BMG Labtech) з піком порушення 485 нм і піком емісії 520 нм. Значення є середніми значеннями + SEM (стандартна помилка середнього значення), представляючи дані флуоресценції адгезії. BAY 11-7082 [(Е)-3-(4-метилфенілсульфоніл)-2пропеннітрил] використовували як стандарт, a DMSO як контроль розчинника. Результати наведені в таблиці 6. Таблиця 6 Адгезія ТНР-1 мононуклеарних клітин до HUVEC моношарів для екстракту приклада 1 і сполуки 1 Серійний номер Аналізований зразок 01 Екстракт приклада 1 02 Сполука 1 03 BAY 11-7082 04 Нестимульований DMSO контроль Стимульований DMSO контроль Висновок: Екстракт приклада 1 і сполука 1 інгібували стимульовану TNF-α адгезію моноцитних ТНР-1 клітин до HUVEC при 10 мкг/мл і 1 мкМ, відповідно. Оскільки ці сполуки інгібують на поверхні клітин експресію адгезії молекул на HUVEC, а також моноцитну адгезію до HUVEC, таким чином, вони можуть утрудняти міграцію лейкоцитів, що є Концентрація 1 (мкг/мл) 3 (мкг/мл) 10 (мкг/мл) 30 (мкг/мл) 0,1 (мкм) 0,3 (мкМ) 1(мкМ) 3 (мкМ) 0,5 (мкМ) 1 (мкМ) Інтенсивність флуоресценції 39768 35302 13183 10236 33421 34024 10195 5728 18442 14271 2544 30791 Кратність контролю 23 21 6 5 13 13 4 2 10 8 1 18 ключовою подією в хронічних запальних хворобах, і могли б бути корисними при ряді запальних порушень. In vivo дослідження Приклад 12 21 95612 Вивільнення фактора некрозу пухлини TNF-α, індукованого ліпополісахаридами (LPS), у мишей BALB/c Протокол, описаний Fukuda Т. et al (Eur. J. Pharmacol., 391:317-320, (2000)), є наступним. Мишей BALB/c розподілили на групи по десять у кожній. Аналізований зразок суспендували в Tween 80 та 0,5 % карбоксиметилцелюлозі (КМЦ), орально (р.о.) вводили мишам. Через одну годину LPS, розчинені в стерильному апірогенному сольовому розчині, вводили і.р. (інтраперітоніально) при дозі 1 мг/кг. Група негативного контролю одержувала сольовий розчин у вигляді і.р. ін'єкції, тоді як всі інші групи одержували LPS. Роліпрам (30 22 мг/кг, р.о.) використовували як стандартний лікарський засіб. Через одну годину і півгодини під уретановою анестезією (1,5 г/кг, і.р.) кров відбирали з абдомінальної артерії за допомогою 1 мл шприца, промитого гепарином (500 міжнародних одиниць/мл). Гепарин (5 мкл) використовували як антикоагулянт у пробірках із зібраною кров'ю. Плазму відокремили центрифугуванням при 10000 rpm при кімнатній температурі, поділили на аліквоти і зберігали при -70 °C до аналізу. Рівні TNF-α у зразках крові досліджували за допомогою ELISA, і розрахували відсоток інгібування вивільнення TNF-α у порівнянні з контрольною групою. Результати наведені в таблиці 7. Таблиця 7 Вивільнення фактора некрозу пухлини (TNF)-a, індукованого ліпополісахаридами (LPS), у мишей BALB/c для екстракту приклада 1 і для сполуки 1 Серійний номер 01 02 Аналізований зразок Екстракт приклада 1 Сполука 1 Висновок: екстракт приклада 1 і сполука 1 інгібують вивільнення TNF-α у мишей BALB/c. Приклад 13 Індукований колагеном артрит (ІКА) у мишей DBA/1J Самців мишей DBA/1J віком 8-10 тижнів імунізували 200 мкг колагену типу II у вигляді емульсії в повному ад'ютанті Фрейнда внутрішньошкірною ін'єкцією в основу хвоста. Через двадцять один день мишам ввели бустерну дозу 100 мкг колагену типу II. Ряд наївних мишей також витримували поруч. Починаючи з дня 23, мишей оцінили на виникнення ревматоїдного артриту за допомогою Суглобного Індексу у якості параметра. У дослі Доза мг/кг 100 10 30 100 % інгібування 43,2±4,52 28,69±13,71 39,98±10,32 87,10±3,67 дженні використовували мишей з мінімальною оцінкою на задній лапі 2. Екстракт приклада 1 вводили при дозі 400 m.p.k (міліграм на кілограм ваги тіла) оральним шляхом двічі в день протягом 12 днів. Сполуку 1 вводили при дозі 50 m.p.k. та 100 m.p.k. оральним шляхом двічі в день протягом 12 днів. Енбрел (3 мг/кг) використовували як стандарт і вводили підшкірно один раз у день. Щодня реєстрували об'єм лапи і Суглобний Індекс. Дані аналізували за статистичною значимістю. Наприкінці експерименту лапи мишей обробили для гістопатологічної оцінки. Дані зниження товщини лапи і зниження Суглобного Індексу наведені в таблиці 8. Таблиця 8 Ефективність екстракту приклада 1 і сполуки 1 на моделі ІКА Параметри ІКА Доза мг/кг Зниження товщини лапи Зниження Суглобного Індексу Екстракт приклада 1 400 Статистично значиме у порівнянні з Статистично значиме у порівнянні з контролем при рівні значимості 0,01 контролем при рівні значимості від 0,05 до 0,06 Сполука 1 50 Статистично значиме у порівнянні з Статистично значиме у порівнянні з контролем при рівні значимості 0,05 контролем при рівні значимості 0,05 100 Статистично значиме у порівнянні з Статистично значиме у порівнянні з контролем при рівні значимості 0,01 контролем при рівні значимості 0,01 Аналізований зразок Гістопатологічний аналіз Оцінювали сприятливий ефект екстракту приклада 1 і сполуки 1 на патологію артриту (ІКА) мишей DBA/1J. Мікроскопію виконували після фарбування синовіальних суглобів гематоксиліном і еозином, а також сафраніном О. Гістопатологічний аналіз показав, що і екстракт приклада 1, і сполука 1 виявляли сприятливі ефекти на зниження руйну вання хряща, руйнування кістки та синовіт у порівнянні з групою, обробленою розчинником. Висновок: і екстракт приклада 1, і сполука 1 виявляли сприятливі ефекти на ІКА моделі артриту. Дослідження токсичності Приклад 14 Гостра оральна токсичність 23 95612 Екстракт приклада 1 аналізували за гострою оральною токсичністю на щурах Sprague Dawley відповідно до керівних принципів, встановлених в "Списку Y" Закону про лікарські і косметичні засоби, 1940 (Індія). Екстракт приклада 1, суспендований у 0,5 % Tween 80 у воді, вводили орально примусовим шляхом як окрему дозу групі щурів з п'яти самців і п'яти самок з максимально прийнятною дозою 2000 мг/кг ваги тіла. Тварин спостерігали за смертністю та ознакам інтоксикації протягом 14 денного періоду після введення дози, і також реєстрували вагу їх тіл. У завершенні дослідження на всіх щурах виконали некропсію. Висновок: у даному дослідженні окреме оральне введення екстракту приклада 1 щурам Sprague Dawley з максимальною прийнятною дозою 2000 мг/кг не викликало смертність у оброблених щурів. З'ясували, що середня летальна доза (LD50) екстракту приклада 1 після орального введення у вигляді окремої дози щурам Sprague Dawley, і самцям, і самкам, склала більш ніж 2000 мг/кг ваги тіла. Приклад 15 Підгостра оральна токсичність Вивчення підгострої оральної токсичності (28 днів) екстракту приклада 1 на щурах Sprague Dawley відповідно до керівних принципів, встановлених в "Списку Y" Закону про лікарські і косметичні засоби, 1940 (Індія). Групам шести самців і шести самок щурів Sprague Dawley вводили щодня дози 0,250, 500 або 1000 мг/кг ваги тіла екстракту приклада 1 примусовим оральним шляхом протягом 28 днів, а на 24 день 29 щурів забили для оцінки його токсичності. Щурів обстежували щодня на ознаки токсичності. Вагу тіла і споживання їжі для окремих щурів реєстрували протягом періоду експерименту разом із усіма випадками смертності та ознаками погіршення здоров'я. По закінченню дослідження виконали лабораторні обстеження крові. Усіх тварин піддали повної некропсії і зареєстрували вагу певних органів. Гістопатологічну оцінку виконали на всіх перерахованих протоколом тканинах у всіх тваринних контрольних груп і груп високого дозування. Усі тварини, що одержували екстракт приклада 1 при дозах 1000 мг/кг і не більше 1000 мг/кг вижили протягом періоду лікування. Не спостерігалося клінічних ознак токсичності у будь-якої з оброблених тварин. Дані збільшення ваги тіла і прийому їжі не показали ніякого несприятливого ефекту через аналізований зразок при дозах 1000 мг/кг і не більш 1000 мг/кг. Висновок: на основі отриманих даних даного дослідження не спостерігали ніякого рівня несприятливого ефекту (NOAEL) екстракту приклада 1 на щурах після орального введення протягом 28 днів не більш ніж 1000 мг/кг ваги тіла. Формуляції Приклад 16 Готування капсули Загальна методика: Інгредієнти 01-05 у визначеній кількості зважили і помістили до прийнятного міксера. Вміст добре змішали, додали інгредієнти 09, 10 і 11, а змішування продовжили. До цієї суміші додали інгредієнти 06, 07 і 08, та масу змішували 30-45 хвилин. Суміш пропустили крізь сито 40 меш і використовували для наповнення капсул. Таблиця 9 Капсульна формуляція Sphaeranthus indicus Кожна капсула містить Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 Інгредієнт Екстракт прикладу 1 Натрію метил парабен Натрію пропіл парабен Бромерол Натрію бензоат Тальк Магнію стеарат Аеросил Натрію крохмаль гліколят Лактоза Двоосновний кальцію фосфат Приклад 17 Готування таблетки Загальна методика: Інгредієнти 01-05 у визначеній кількості зважили і помістили до прийнятного міксера. Додали інгредієнт 13, і вологу масу добре змішали. До цього додали інгредієнти 09, 10, 11 і 12, та змішування продовжили до одержання го Кількість % вага/вага 69,72 0,39 0,13 0,18 0,39 2,61 1,74 0,87 2,18 8,72 13,07 могенізованої маси. Цю зволожену масу пропустили крізь сито 16 меш, та вологі гранули сушили при 70 °C±5 °C. До отриманих гранул додали інгредієнти 06, 07 і 08, а масу змішували 30-45 хвилин. Потім суміш пропустили крізь сито 40 меш, і пресували таблетки за допомогою прийнятного пуансона. 25 95612 26 Таблиця 10 Таблеткова формуляція Sphaeranthus indicus Кожна таблетка містить Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 Інгредієнт Екстракт приклада 1 Натрію метил парабен Натрію пропіл парабен Бромерол Натрію бензоат Тальк Магнію стеарат Аеросил Натрію крохмаль гліколят Лактоза Двоосновний кальцію фосфат Крохмаль Ізопропанол Кількість % вага/вага 66,53 0,37 0,12 0,17 0,37 2,50 1,66 0,83 2,50 8,32 12,47 4,16 * * тільки при грануляції Приклад 18 Готування сиропу Загальна методика Інгредієнт 01 зважили і додали до нього інгредієнт 15 при постійному перемішуванні. До цього додали зважені кількості інгредієнтів 03, 04, 05, 06, 08, 09, 10, 11, 12 і 14 при постійному перемішуванні до розчинення. Інгредієнти 02 і 13 зважили і розчинили в інгредієнті 07. До цього додали очищену воду до об'єму 10 мл. Отриманий розчин відфільтрували крізь фільтр-прес / нейлонову тканину. Таблиця 11 Сиропна формуляція Sphaeranthus indicus Кожні 10 мл сиропу містять Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 Інгредієнт Екстракт прикладу 1 Порошок м'яти перцевої Мед Цукор Розчин сорбітолу 70 % Рідка глюкоза Пропіленгліколь Моногідрат лимонної кислоти Натрію метил парабен Натрію пропіл парабен Натрію бензоат Бронопол Смакова добавка свіжої м'яти "S" Барвник паленого цукру Очищена вода Приклад 19 Готування формуляції крему Загальна методика Інгредієнт 01 зважили і суспендували в інгредієнті 17. Розплавили інгредієнти 02-07. Зважили інгредієнти 08, 09, 10, 11, 13 і 14 та змішали з пор Кількість % вага/вага 4 0,025 0,25 50 5 10 5 0,5 0,2 0,02 0,2 0,02 0,25 0,75 До 10 мл цією 18. Інгредієнт 12 зважили, додали до порції інгредієнта 18, що залишилася, і змішали з інгредієнтами 15 і 16. Вміст всіх етапів змішали при 55 °C і гомогенізували, дозволили остудитися і запакували в прийнятний тюбик. 27 95612 28 Таблиця 12 Формуляція крему Sphaeranthus indicus Кожні 100 г крему містять Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Інгредієнт Екстракт прикладу 1 Цетостеариловий спирт- 12,0 г Цетомакрогол-1000 Сорбітану моноолеат S.E. гліцерол моностеарат Ізопропілміристат Стеаринова кислота Натрію метил парабен Натрію пропіл парабен Феноксиетанол Динатрію EDTA Карбомер-940 Натрію лаурилсульфат Симетикон Триетаноламін Пропіленгліколь Ізопропанол Вода Приклад 20 Готування формуляції гелю Загальна методика Інгредієнт 01 зважили і суспендували в інгредієнті 06. Інгредієнт 04 розчинили в інгредієнті 07. Кількість % вага/вага 05,00 12,00 03,00 02,00 03,00 02,50 02,50 00,40 00,08 00,52 00,02 00,75 00,75 01,00 01,00 05,00 10,00 50,48 Інгредієнти 05 і 08 змішали. Інгредієнти 02 і 03 змішали. Суміш добре перемішали і запакували в прийнятний тюбик. Таблиця 13 Формуляція гелю Sphaeranthus indicus Кожні 100 г гелю містять Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 Інгредієнт Екстракт прикладу 1 Бутильований гідрокситолуол Бутильований гідроксианізол Карбопол-940 Поліетиленгліколь-400 Ізопропанол Пропіленгліколь Сорбітан моноолеат Приклад 21 Готування формуляції мазі Загальна методика Кількість % вага/вага 05,00 00,025 00,025 02,95 30,00 05,00 55,00 02,00 Інгредієнти 02-06 зважили і розплавили в прийнятній судині. До цього додали інгредієнт 01. До суміші додали інгредієнти 07 і 08. Вміст добре перемішали і запакували в прийнятний тюбик. 29 95612 30 Таблиця 14 Формуляція мазі Sphaeranthus indicus Кожні 100 г мазі містять Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 Інгредієнт Екстракт прикладу 1 Білий бджолиний віск Твердий парафін Мікрокристалічний віск Білий м'який парафін Легкий рідкий парафін Бутильований гідрокситолуол Бутильований гідроксианізол Приклад 22 Готування таблетки Загальна методика Інгредієнти 01 і 02 зважили окремо, просіяли крізь сито 20 меш і змішали. Кількість % вага/вага 05,00 15,00 25,00 15,00 30,00 09,95 0,025 0,025 Інгредієнти 03-07 зважили і просіяли крізь сито 40 меш. Інгредієнти 03,04,05 і 07 змішали і додали до суміші інгредієнтів 01 і 02. До цієї суміші додали інгредієнт 06 і змішали. Отриману змазану суміш пресували на прийнятному механічному пристрої. Таблиця 15 Таблеткова формуляція сполуки 1 Кожна таблетка містить Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 Інгредієнт Сполука 1 Мікрокристалічна целюлоза Тальк Натрію крохмаль гліколят Колоїдний диоксид кремнію Магнію стеарат Барвник хіноліновий жовтий Приклад 23 Готування таблетки Загальна методика Інгредієнти 01 і 02 зважили окремо і просіяли крізь сито 20 меш. Інгредієнт 04 розчинили в інгредієнт 08 при перемішуванні. Отриману суміш гранулювали за допомогою розчину, що зв'язує. Вологу масу пропустили крізь прийнятне сито. Кількість % вага/вага 58,33 35,97 2,50 1,60 0,80 0,50 0,30 Просіяну масу сушили при кімнатній температурі (25 °C), а потім при близько 40 °C. Суху масу просіяли крізь прийнятне сито. Інгредієнти 03, 05 і 07 окремо просіяли крізь сито 40 меш і змішали. Додали до цієї сухої маси і змішали. До цієї суміші додали інгредієнт 06, і змазану суміш пресували на прийнятному механічному пристрої. Таблиця 16 Таблеткова формуляція сполуки 1 Кожна таблетка містить Серійний номер 01 02 03 04 05 06 07 08 Інгредієнт Сполука 1 Лактози моногідрат Натрію кроскармелоза Полівінілпіролідон Колоїдний діоксид кремнію Магнію стеарат Барвник хіноліновий жовтий Ізопропіловий спирт Кількість % вага/вага 61,40 35,15 1,40 0,85 0,35 0,50 0,35 Необхідна кількість 31 95612 Приклад 24 Готування капсули Загальна методика Інгредієнти 01 і 02 зважили окремо, просіяли крізь сито 20 меш і змішали. Інгредієнт 03 зважи 32 ли і просіяли крізь сито 40 меш. Всі інгредієнти змішали і змазали інгредієнтом 04. Сумішшю наповнили порожню тверду желатинову капсулу за допомогою прийнятного механічного пристрою. Таблиця 17 Формуляція капсули сполуки 1 Кожна капсула містить Серійний номер 01 02 03 04 Інгредієнт Сполука 1 Мікрокристалічна целюлоза Колоїдний діоксид кремнію Магнію стеарат Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Кількість % вага/вага 98,59 0,75 0,47 0,19 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601