Спосіб комплексної переробки сланей ламінарії з отриманням засобів з широким спектром терапевтичної дії

Реферат: Винахід належить до способу комплексної переробки сланей ламінарії з отриманням засобів з тиреотропною, противірусною та антибактеріальною дією і передбачає сушіння і подрібнення сировини, екстракцію та обробку з подальшим отриманням продуктів, причому сировину екстрагують спирто-водною сумішшю (30 % спирт етиловий) при співвідношенні сировина:екстрагент 1:5 при температурі 18-20 ºС протягом 3-5 діб і відділяють шляхом UA 107846 C2 (12) UA 107846 C2 фільтрації екстракт ламінарії, який відправляють на другу стадію, на якій з екстракту ламінарії проводять відгін спирту етилового, упарюють до водного залишку і відправляють на третю стадію, на якій з отриманого водного залишку при 50-60 ºС і тиску 80-87 кПа одержують водний екстракт ламінарії, частину якого використовують безпосередньо, а з іншої частини водного екстракту осаджують олігосахариди в 3-4-кратний об'єм спирту етилового, які потім відділяють шляхом фільтрації під вакуумом при 50-60 ºС і тиску 80-87 кПа і висушують на повітрі. UA 107846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до фармації та медицини, зокрема до комплексної переробки ламінарії з одержанням біологічно активних речовин рослинного походження, а саме - тиреотропного, противірусного (проти вірусів грипу та герпесу) та антибактеріального засобів рослинного походження зі сланей ламінарії. Ламінарія характеризується багатим хімічним складом і має широкі терапевтичні можливості при різноманітних захворюваннях. Слані ламінарії містять солі альгінової кислоти, ламінарин, маніт, L-фруктозу, клітковину, білкові речовини, вітаміни (А, В 1, В2, В12, С і D), макро- і мікроелементи (йод, бром, селен, калій, натрій, кальцій, марганець, мідь, кобальт, бор, арсен). Завдяки здатності полісахаридів набухати, слані ламінарії збільшують свій об'єм, стимулюють рецептори слизової оболонки кишечнику і сприяють його випорожненню. Ламінарія активно впливає на функцію щитовидної залози, що зумовлено високим вмістом йоду. Крім того, слані ламінарії виявляють протизапальну, сечогінну, загальнозміцнюючу, протисклеротичну, гіпоглікемічну дію, регулюють обмін речовин, сприяють виведенню радіонуклідів із організму [5, 6]. Тому актуальною є розробка лікарських засобів на основі ламінарії з вираженою ефективністю та мінімальною кількістю побічних ефектів. У зв'язку з цим перспективним є одержання біологічно активних субстанцій рослинного походження шляхом комплексної переробки вихідної лікарської рослинної сировини і отримання кількох засобів різного терапевтичного спрямування. Відомий спосіб одержання біологічно активних речовин з біломорської ламінарії, у відповідності з яким після осадження білково-полісахаридного комплексу зі спиртового розчину осаджують комплекс ламінарану з фукоїданом, з подальшим розділення його на індивідуальні компоненти [7]. До недоліків відомого способу можна віднести одержання засобів на основі одного класу біологічно активних сполук, а саме одержання білково-полісахаридного комплексу, ламінарану і фукоїдану, що мають лише один вид терапевтичної дії (послаблююча). Найближчим до заявленого способу є спосіб одержання маніту з ламінарії, в результаті якого одержують як побічні продукти концентрат ламінарії, екстракт ламінарії і солі, що мають назву вітамінно-мінеральний концентрат. Відповідно до цього способу, водорості висушують, подрібнюють, потім проводять екстракцію ламінарії 82 %-вим спиртом етиловим при співвідношенні сировина:екстрагент 1:5 і температурі кипіння спирту протягом 1 год. з моменту закипання. Спиртовий екстракт зливають, відганяють розчинник, а отриману смолу і водний екстракт розділяють. Водний екстракт використовують для отримання маніту-сирцю, а потім маніту шляхом багатократних кристалізацій і перекристалізацій. Смолу використовують для отримання концентрату ламінарії омиленого [2]. Недоліком такого способу можна вважати його тривалість і багатостадійність, великі енергозатрати, низький вихід продуктів та одно направленість терапевтичної дії отриманих засобів. Задачею винаходу є комплексна переробка сланей ламінарії з одночасним одержанням тиреотропного, противірусних та антибактеріальних засобів. Отримані рослинні субстанції можуть бути використані як діючі речовини фармацевтичних препаратів, виконаних у різних лікарських формах, придатних як для внутрішнього, так і для зовнішнього використання хворими без вікових обмежень. Авторами вперше проведена комплексна переробка сланей ламінарії з отриманням кількох засобів різного терапевтичного спрямування, досліджено очевидні тиреотропну, противірусну та антибактеріальну дії комплексу біологічно активних речовин зі сланей ламінарії, одержаних саме за заявленим способом, який є новим, не відомим з джерел інформації. Всі параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом при проведенні численних дослідів. Використання як екстрагентів води та спирто-водних сумішей дозволяє максимально вилучити із сланей ламінарії продукти зі специфічними тиреотропною, противірусною та антибактеріальною діями. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Спосіб включає подрібнення сировини, екстракцію водою або спирто-водними сумішами, обробку з подальшим отриманням продуктів, при цьому обробку проводять в три стадії, на першій з яких подрібнену сировину екстрагують спирто-водною сумішшю при температурі 1820 °C протягом 3-5 діб і відділяють шляхом фільтрації екстракт ламінарії, який відправляють на другу стадію, на якій з екстракту ламінарії проводять відгін спирту етилового, упарюють до водного залишку і відправляють на третю стадію, на якій з отриманого водного залишку осаджують олігосахариди, які відділяють шляхом фільтрації під вакуумом і висушують. 1 UA 107846 C2 5 10 15 20 25 30 Вихід готового продукту складає понад 3-5 % від повітряно-сухої сировини. Отриманий екстракт ламінарії - це рідина коричневого кольору, з характерним запахом водорості і специфічним смаком. Отримані олігосахариди ламінарії - це порошок сірувато-білого кольору. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 1 кг повітряно-сухої сировини сланей ламінарії, подрібненої до розміру часток, які проходили крізь сито з діаметром отворів 1-3 мм, вміщували в екстрактор, заливали 5 л 375 мл 30 % спирту етилового з урахуванням поглинання води сировиною. Екстракцію здійснювали методом мацерації при температурі 18-20 °C протягом 3-5 діб. Отриманий екстракт фільтрували і концентрували у вакуум-випарному апараті при температурі 50-60 °C і тиску 80-87 кПа. З отриманого водного екстракту (4 л) осаджували олігосахариди у 12 л спирту етилового 96 % і відстоювали протягом доби при температурі 5-7 °C. Фільтрували і відділяли олігосахариди під вакуумом і висушували на повітрі. Отримали 4 л водного екстракту ламінарії та 50 г сухого порошку олігосахаридів. Вихід олігосахаридів склав 5 % від повітряно-сухої сировини. Приклад 2. Вивчення тиреотропної дії водного екстракту зі сланей ламінарії, одержаного за заявленим способом, проводили стандартним методом "зобної" реакції на щурах [4]. Досліджуваний водний екстракт зі сланей ламінарії та препарат порівняння йодомарин вводили у лікувально-профілактичному режимі перорально 1 раз на день, щоденно, у дозах: екстракт зі сланей ламінарії - 0,5, 1,0; 2,0 мл, йодомарин - 20 мкг. Тривалість експерименту складала 10 діб, після чого тварин шляхом миттєвої декапітації виводили з експерименту, брали кров та в плазмі крові визначали рівень тиреоїдних гормонів - трийодтироніну (Т3) та тетрайодтироніну (Т4). Визначення Т3 та Т4 в плазмі крові щурів проводили методом імуноферментного аналізу з використанням тест-систем імуноферментних (ТОВ НВЛ "Гранум", м. Харків). У представлених тест-системах використовується принцип конкурентного імуноферментного аналізу. У лунки мікропланшета, на поверхні якого адсорбовані специфічні анти-Т3-антитіла (або анти-Т4антитіла), вносять досліджуваний зразок та кон'югат Т 3-пероксидаза (або Т4-пероксидаза). Т3 (або Т4) із зразка конкурує з кон'югованим антигеном за зв'язок з антитілами на поверхні лунки. Після відмивки активність ферменту, зв'язаного на поверхні лунки мікропланшета, проявляється і вимірюється додаванням хромоген-субстратної суміші, стоп-розчину та фотометрією при 450 нм. Інтенсивність кольорової реакції зворотно пропорційна кількості Т 3 (або Т4) у зразку. Дослідні тварини були поділені на групи: інтактний контроль, ліковані екстрактом ламінарії; ліковані йодомарином. Кожна група складалася з 5 тварин. Результати досліду наведені у таблиці 1. 35 Таблиця 1 Вивчення тиреотропної дії екстракту зі сланей ламінарії, одержаного за заявленим способом, у порівнянні з йодомарином Трийодтиронін (Т3) Доза, мл С, нмоль/л Тетрайодтиронін (Т4) Достовірність C, нмоль/л 1 Водний екстракт Водний екстракт (розведення 1:5) Йодомарин Контроль 0,5 2,0 3,75±0,06*/** 0,5 4,78±0,24*/** 1,0 Р 0,2 75±1,71 UA 107846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дані табл. 1 об'єктивно свідчать про наявність вираженої тиреотропної дії екстракту зі сланей ламінарії, одержаного за заявленим способом. На користь використання екстракту ламінарії як тиреотропного засобу свідчить той факт, що ефект екстракту ламінарії у дозі 0,5 мл більш ніж на 40 % перевищує лікувальний ефект йодомарину, при тому, що екстракт ламінарії вводили у дозі, меншій, ніж доза йодомарину, що беззаперечно свідчить про більш виражену тиреотропну активність екстракту ламінарії у порівнянні з йодомарином. Слід зауважити, що найбільшу активність показав водний екстракт у розведенні 1:5, отриманий за заявленим способом, у дозі 0,5 мл, що більш ніж на 70 % перевищує лікувальний ефект йодомарину. Приклад 3. Вивчення антивірусної дії олігосахаридів ламінарії, одержаних за заявленим способом, проводили класичним вірусологічним методом зараження курячих ембріонів у хоріоналантоїсну оболонку. Для вивчення і ідентифікації вірусу грипу в алантоїсній рідині, отриманій після розтину курячих ембріонів, використовували метод імуноферментного аналізу. Як препарати порівняння використовували таблетки "Альтабор" та сироп "Імунофлазид". 1. Класичний вірусологічний метод зараження курячих ембріонів в хоріон-алантоїсну оболонку [1]. 1.1. Контроль вірусу Ембріони (3) овоскопуємо, наносячи олівцем мітку над повітряним мішком. Відмічене місце ретельно знезаражуємо спиртовим розчином йоду, пробиваємо отвір в шкаралупі і вводимо культуральний штам вірусу грипу в об'ємі 0,1-0,2 мл на глибину 10-15 мм, паралельно подовжній осі яйця. Після зараження отвір дезінфікуємо спиртовим розчином йоду, запечатуємо парафіном і поміщаємо для інкубації в термостат при температурі 35 °C на 48 год. Перед розтином ембріони поміщається в холодильник на 12 год. при 4 °C для максимального звуження кровоносних судин. Під час розтину, шкаралупу над повітряним мішком знезаражуємо спиртовим розчином йоду. Стерильними ножицями зрізуємо шкаралупу, по позначеній олівцем мітці. Підіймаємо алантоїсну оболонку (плівку) і візуалізуємо стан ембріона за 3 показникам: - наявність білих бляшок на хоріон-алантоїсній плівці (свідчать про вірусне зараження); - ступінь прозорості алантоїсної рідини (каламутна свідчать про загибель ембріона після зараження); - стан кровоносних судин (блякла з геморагічними вкрапленнями кровоносна система свідчать про вірусне зараження). За перерахованими ознаками робимо висновок про хворобу або здоров'я ембріона. Відбираємо алантоїсну рідину пастерівськими піпетками і переносимо її в центрифужні пробірки. Отриману після зараження алантоїсну рідину центрифугуємо при 1000-1500 об./хв. протягом 10-15 хв., надосадову рідину стерильною голкою переносимо в стерильний контейнер для подальшої ідентифікації вірусу грипу після пасивування, а також для тривалого зберігання в морозильній камері при -70 °C з використанням в подальших дослідах. 1.2. Контроль речовини (8 ембріонів) Готуємо розведення 1:10 випробовуваної речовини в гарячому стерильному фізіологічному розчині, для чого наважку олігосахаридів ламінарії 5 г розчиняємо в 45 мл фізіологічного розчину. Далі методом перекату готуємо подвійні розведення випробовуваної речовини, для чого 5 мл олігосахаридів ламінарії в розведенні 1:10 переносимо в додатковий ряд пробірок з 5 мл фізіологічного розчину, отримуючи розведення випробовуваного препарату від 1:10 до 1:80. Ембріони (8) овоскопуємо, наносячи олівцем мітку над повітряним мішком. Відмічене місце ретельно знезаражуємо спиртовим розчином йоду, пробиваємо отвір в шкаралупі і вводимо випробовувану речовину з пробірок додаткового ряду в розведеннях від 1:10 до 1:80 (по 2 ембріони на кожне розведення) в об'ємі 0,2 мл на глибину 10-15 мм, паралельно подовжній осі яйця. Після зараження отвір дезінфікуємо спиртовим розчином йоду, запечатуємо парафіном і поміщаємо для інкубації в термостат при температурі 35 °C на 48 год. Перед розтином ембріони поміщаємо в холодильник на 12 год. при 4 °C для максимального звуження кровоносних судин. Під час розтину, шкаралупу над повітряним мішком знезаражуємо спиртовим розчином йоду. Стерильними ножицями зрізуємо шкаралупу, по позначеній олівцем мітці. Підіймаємо алантоїсну оболонку (плівку) і візуалізуємо стан ембріона за 2 показниками: - ступінь прозорості алантоїсної рідини (каламутна свідчить про загибель ембріона після зараженні і токсичності використаної концентрації речовини); - розмір і рівень розвитку ембріона, порівнюючи з контрольними (у яких вводили фізіологічний розчин (2), а також з тим, який не заражали вірусом (1). 3 UA 107846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 За перерахованими ознаками робимо висновок про токсичність або безпечність випробовуваної речовини для курячих ембріонів. 1.3. Контроль розвитку ембріонів (1 ембріон) 1 ембріон овоскопуємо, переконуючись, що він живий. Залишаємо його цілим, як контроль розвитку, для порівняння з зараженими ембріонами. 1.4. Контроль зараження (2 ембріони) Ембріони (2) овоскопуємо, наносячи олівцем мітку над повітряним мішком. Відмічене місце ретельно знезаражуємо спиртовим розчином йоду, пробиваємо отвір в шкаралупі і вводимо стерильний фізіологічний розчин в об'ємі 0,2 мл на глибину 10-15 мм, паралельно подовжній осі яйця. Після зараження отвір дезінфікуємо спиртовим розчином йоду, запечатуємо парафіном і поміщаємо для інкубації в термостат при температурі 35 °C на 48 год. Перед розтином ембріони поміщаються в холодильник на 12 год. при 4 °C для максимального звуження кровоносних судин. Під час розтину, шкаралупу над повітряним мішком знезаражуємо спиртовим розчином йоду. Стерильними ножицями зрізуємо шкаралупу, по позначеній олівцем мітці. Підіймаємо алантоїсну оболонку (плівку) і візуалізуємо стан ембріона за 2 показникам: - ступінь прозорості алантоїсної рідини (каламутна свідчить про загибель ембріона після зараження і незадовільних умовах); - розмір і рівень розвитку ембріона, порівнюючи з контрольним (який не заражали вірусом п 1.3). За перерахованими ознаками робимо висновок про можливість обліку результатів експерименту, з урахуванням умов стерильності. 1.5. Власне дослід - контроль противірусної активності досліджуваної речовини - реакція нейтралізації на курячих ембріонах Принцип методу заснований на здатності речовини з передбачуваною противірусною активністю інгібувати розмноження вірусу в курячому ембріоні. У додатковий ряд пробірок (п. 1.2) з 0,5 мл випробовуваної речовини в розведеннях 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 вноситься по 0,5 мл прототипного штаму вірусу грипу в розведенні 1:10 (його робоче розведення було відтитровано в попередніх експериментах п.1.1). Залишаємо суміш при температурі 28-30 °C на інкубацію 30-40 хв. В цей час 8 ембріонів овоскопуємо, наносячи олівцем мітку над повітряним мішком. Відмічене місце ретельно знезаражуємо спиртовим розчином йоду, пробиваємо отвір в шкаралупі і вводимо випробовувану суміш після інкубації з пробірок в об'ємі 0,2 мл на глибину 10-15 мм, паралельно подовжній осі яйця. Після зараження отвір дезінфікуємо спиртовим розчином йоду, запечатуємо парафіном і поміщаємо для інкубації в термостат при температурі 35 °C на 48 год. Перед розтином ембріони поміщаються в холодильник на 12 год. при 4 °C для максимального звуження кровоносних судин. Під час розтину, шкаралупу над повітряним мішком знезаражуємо спиртовим розчином йоду. Стерильними ножицями зрізуємо шкаралупу, по позначеній олівцем мітці. Підіймаємо алантоїсну оболонку (плівку) і візуалізуємо стан ембріонів за 3 показниками: - наявність білих бляшок на хоріон-алантоїсній плівці (свідчать про вірусне зараження, а значить відсутність противірусної активності випробовуваної речовини в певному розведенні); - ступінь прозорості алантоїсної рідини (каламутна свідчить про загибель ембріона після зараження, а значить відсутність противірусної активності випробовуваної речовини в певному розведенні); - стан кровоносних судин (блякла з геморагічними вкрапленнями кровоносна система свідчить про вірусне зараження, а значить відсутність противірусної активності випробовуваної речовини в певному розведенні). За перерахованими ознаками робимо висновок про хворобу або здоров'я ембріона. Відбираємо алантоїсну рідину стерильною пастерівською піпеткою і переносимо її в центрифужні пробірки. Отриману після зараження, алантоїсну рідину центрифугуємо при 10001500 об./хв. протягом 10-15 хв., надосадову рідину стерильною голкою переносимо в стерильний контейнер для подальшого вивчення і ідентифікації в ній вірусу грипу А/Вікторія. Експериментальні дані вивчення противірусної активності речовини олігосахаридів ламінарії відносно штаму вірусу грипу А/Вікторія представлені в табл. 2. 4 UA 107846 C2 Таблиця 2 Вивчення противірусної дії олігосахаридів ламінарії, одержаних за заявленим способом № п/п кур. ембр. 1 (три) 2 (три) Речовини, що вносяться в курячі ембріони Вірус грипу 1:5 Вірус грипу 1:10 Речовина 1:10 Речовина 1:20 Речовина 1:40 Речовина 1:80 Призначення зараження курячих ембріонів Кількість Результат зараження при візуальній оцінці заражених курячих живі, хворі, Інтерпретація ембріонів здорові мертві результатів Контроль вірусу 3 0 3 Вірус активний Контроль вірусу 3 0 3 Вірус активний 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 1 1 2 2 0 1 1 0 Контроль препарату Контроль 4 (два) препарату Контроль 5 (два) препарату Контроль 6 (два) препарату Противірусна Речовина Вірус 7 (два) активність 1:10 1:10 препарату 1:10 Противірусна Речовина Вірус 8 (два) активність 1:20 1:10 препарату 1:20 Противірусна Речовина Вірус 9 (два) активність 1:40 1:10 препарату 1:40 Противірусна Речовина Вірус 10 (два) активність 1:80 1:10 препарату 1:80 Контроль 11 (два) Фіз. розчин 0,2 мл зараження Контроль 12 (один) розвитку 3 (два) 5 Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 50 % Чистота зараження Живий, здоровий Олігосахариди ламінарії, отримані за заявленим способом, не токсичні для курячих ембріонів та мають достатню виражену антивірусну дію у відношенні до прототипного штаму вірусу грипу А/Вікторія в розведеннях 1:10-1:80. За вираженістю антивірусної дії олігосахариди ламінарії, одержані за наведеним способом, переважали препарат порівняння "Імунофлазид" і не поступалися препарату "Альтабор". Експериментальні дані вивчення противірусної активності препарату порівняння "Імунофлазид" відносно штаму вірусу грипу А/Вікторія представлені в табл. 3. 10 5 UA 107846 C2 Таблиця 3 Вивчення противірусної дії препарату порівняння "Імунофлазид" № п/п кур. ембр. 1 (три) 2 (три) 3 (два) Речовини, що вносяться в курячі ембріони Вірус грипу 1:5 Вірус грипу 1:10 Препарат без розведення Препарат 1:10 Препарат 1:20 Препарат 1:40 Препарат Вірус без 1:10 розведення Призначення зараження курячих ембріонів Кількість Результат зараження при візуальній оцінці заражених курячих живі, хворі, Інтерпретація ембріонів здорові мертві результатів Контроль вірусу 3 0 3 Вірус активний Контроль вірусу 3 0 3 Вірус активний Контроль препарату 2 0 2 Препарат токсичний 2 1 1 2 1 1 2 2 0 2 0 2 2 0 2 2 1 1 Не активний, не токсичний 2 1 1 Не активний, не токсичний 2 2 0 Чистота зараження 1 1 0 Живий, здоровий Контроль препарату Контроль 5 (два) препарату Контроль 6 (два) препарату Противірусна 7 (два) активність препарату Противірусна Препарат Вірус 8 (два) активність 1:10 1:10 препарату 1:10 Противірусна Препарат Вірус 9 (два) активність 1:20 1:10 препарату 1:20 Противірусна Препарат Вірус 10 (два) активність 1:40 1:10 препарату 1:40 Контроль 11 (два) Фіз. розчин 0,2 мл зараження Контроль 12 (один) розвитку 4 (два) 5 Препарат слабо токсичний Препарат слабо токсичний Препарат не токсичний Препарат токсичний або вірус активний Препарат токсичний або вірус активний Препарат порівняння "Імунофлазид" був токсичним для курячих ембріонів у як у готовій формі, так і у розведеннях 1:10 та 1:20, і не показав антивірусної активності у відношенні до прототипного штаму вірусу грипу А/Вікторія. Експериментальні дані вивчення противірусної активності препарату порівняння "Альтабор" відносно штаму вірусу грипу А/Вікторія представлені в табл. 4. 6 UA 107846 C2 Таблиця 4 Вивчення противірусної дії препарату порівняння "Альтабор" № п/п кур. ембр. 1 (три) 2 (три) 3 (два) 4 (два) 5 (два) 6 (два) 7 (два) 8 (два) 9 (два) 10 (два) 11 (два) 12 (два) 13 (два) 14 (два) 5 10 Речовини, що вносяться в курячі ембріони Вірус грипу 1:5 Вірус грипу 1:10 Препарат 1:10 Препарат 1:20 Препарат 1:40 Препарат 1:80 Препарат 1:160 Призначення зараження курячих ембріонів Кількість Результат зараження при візуальній оцінці заражених курячих живі, хворі, Інтерпретація ембріонів здорові мертві результатів Контроль вірусу 3 0 3 Вірус активний Контроль вірусу 3 0 3 Вірус активний 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 2 1 1 2 2 0 Препарат не нейтралізує вірус 50 % 2 2 0 Чистота зараження 2 2 0 Живий, здоровий Контроль препарату Контроль препарату Контроль препарату Контроль препарату Контроль препарату Противірусна Препарат Вірус активність 1:10 1:10 препарату 1:10 Противірусна Препарат Вірус активність 1:20 1:10 препарату 1:20 Противірусна Препарат Вірус активність 1:40 1:10 препарату 1:40 Противірусна Препарат Вірус активність 1:80 1:10 препарату 1:80 Противірусна Препарат Вірус активність 1:160 1:10 препарату 1:160 Контроль Фіз. розчин 0,2 мл зараження Контроль розвитку Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат порівняння "Альтабор" не токсичний для курячих ембріонів у розведеннях 1:101:160 і має високу антивірусну активність у відношенні до прототипного штаму вірусу грипу А/Вікторія. 2. Методи вивчення і ідентифікації вірусу грипу в алантоїсній рідині, отриманій після розтину курячих ембріонів. Для вивчення і ідентифікації відбирали алантоїсну рідину курячих ембріонів, використаних в досліді для олігосахаридів ламінарії, одержаних за заявленим способом (табл. 5), та препарату порівняння "Альтабор" (табл. 4). Препарат "Імунофлазид" не брав участі у даному дослідженні, оскільки виявив токсичні властивості для курячих ембріонів та показав низьку антивірусну активність. 7 UA 107846 C2 Таблиця 5 Результати проведення реакції нейтралізації на курячих ембріонах № п/п кур. ембр. 1 (три) 2 (три) 3 (три) 4 (три) 5 (три) 6 (три) 7 (два) 5 10 Речовини, що вносяться в курячі ембріони Вірус грипу 1:10 Речовина 1:40 Речовина 1:80 Призначення зараження курячих ембріонів Кількість Результат зараження при візуальній оцінці заражених курячих живі, хворі, Інтерпретація ембріонів здорові мертві результатів Контроль вірусу 3 3 3 3 0 3 3 0 3 3 0 3 2 1 3 3 0 2 Контроль препарату Контроль препарату Противірусна Речовина Вірус активність 1:40 1:10 препарату 1:40 Противірусна Речовина Вірус активність 1:80 1:10 препарату 1:80 Контроль Фіз. розчин 0,2 мл зараження Контроль розвитку 0 2 0 Вірус активний Препарат не токсичний Препарат не токсичний Препарат нейтралізує вірус 100 % Препарат нейтралізує вірус 50 % Чистота зараження Жив, здоров 2.1. Метод імуноферментного аналізу Імуноферментний аналіз (ІФА) виконували з використанням тест-системи виробництва "Вектор-Бест" для виявлення антигену вірусу грипу А відповідно до інструкції. Облік результатів здійснювали в імуноферментному аналізаторі АІФР-01 при довжині хвилі 452 нм. 2.2. Хід виконання ІФА 1. У кожну луночку планшета для виконання ІФА з сорбованими антитілами до вірусу грипу А вносили по 100 мкл алантоїсної рідини заражених ембріонів, відповідно до таблиці 5. У луночки G1 і Н1 вносили по 100 мкл позитивні контролі від виробника тест-системи. У луночки G2 і Н2 вносили по 100 мкл негативні контролі від виробника. Розміщення дослідних зразків представлені в таблиці 6. Розміщення дослідних зразків препарату порівняння "Альтабор" представлені в табл. 7. 15 8 UA 107846 C2 Таблиця 6 Результати ідентифікації алантоїсної рідини заражених в реакції курячих ембріонів методом ІФА* для олігосахаридів ламінарії Нумерація лунок і стрипів планшета** А Зміна кольору лунок В Зміна кольору лунок С Зміна кольору лунок Д Зміна кольору лунок Е Зміна кольору лунок F Зміна кольору лунок G Зміна кольору лунок Н Зміна кольору лунок 1 2 3 Ембріон № 1 Змінений 0,278 Ембріон № 1 Змінений 0,292 Ембріон № 1 Змінений 0,293 Ембріон № 2 Не змінений 0,087 Ембріон № 2 Не змінений 0,066 Ембріон № 2 Не змінений 0,057 Позитивний контроль ІФА Змінений 0,286 Позитивний контроль ІФА Змінений 0,269 Ембріон № 3 Не змінений 0,070 Ембріон № 3 Не змінений 0,066 Ембріон № 3 Не змінений 0,071 Ембріон № 4 Не змінений 0,065 Ембріон № 4 Не змінений 0,049 Ембріон № 4 Не змінений 0,054 Негативний контроль ІФА Не змінений 0,057 Негативний контроль ІФА Не змінений 0,067 Ембріон № 5 Не змінений 0,075 Ембріон № 5 Не змінений 0,066 Ембріон № 5 Змінений 0,249 Ембріон № 6 Не змінений 0,066 Ембріон № 6 Не змінений 0,064 Ембріон № 6 Не змінений 0,059 Ембріон № 7 Не змінений 0,060 Ембріон № 7 Не змінений 0,077 Примітка: *В таблиці 6 нумерація ембріонів відповідає нумерації таблиці 5; ** Таблиця 6 містить в цифровому вираженні дані оптичної густини, відповідно до виміру в імуноферментному аналізаторі. 9 UA 107846 C2 Таблиця 7 Результати ідентифікації алантоїсної рідини заражених в реакції курячих ембріонів методом ІФА* для препарату порівняння "Альтабор" Нумерація лунок і стрипів планшета** 1 2 3 4 А Ембріон* № 1 Ембріон № 12 Ембріон № 12 Позитивний контроль К+ Зміна кольору лунок Змінений 0,686 Змінений 0,176 Змінений 0,171 Змінений 0,906 В Ембріон № 1 Ембріон № 4 Ембріон № 7 Позитивний контроль К+ Зміна кольору лунок Змінений 0,230 С Ембріон № 2 Зміна кольору лунок Змінений 0,285 Д Ембріон № 2 Зміна кольору лунок Змінений 0,212 Не змінений 0,129 Ембріон № 4 Не змінений 0,139 Ембріон № 5 Не змінений 0,147 Не змінений 0,105 Ембріон № 7 Не змінений 0,125 Ембріон № 8 Не змінений 0,127 Ембріон № 5 Ембріон № 8 Ембріон № 11 Не змінений 0,136 Не змінений 0,125 Змінений 0,164 Ембріон № 6 Ембріон № 9 Ембріон № 11 Не змінений 0,124 Не змінений 0,103 Не змінений 0,137 Ембріон № 6 Ембріон № 9 Ембріон № 13 Не змінений 0,121 Не змінений 0,122 Не змінений 0,138 Е Зміна кольору лунок F Зміна кольору лунок G Зміна кольору лунок Н Зміна кольору лунок Негативний контроль КНе змінений0,130 Негативний контроль КНе змінений 0,122 Контроль кон'югата Не змінений 0,127 Контроль кон'югата Не змінений 0,121 Змінений 0,177 Ембріон № 3 Не змінений Ембріон № 3 Не змінений 0,136 Ембріон № 10 Ембріон № 10 Ембріон № 13 Не змінений 0,124 Не змінений 0,098 Не змінений 0,141 Примітка: *В таблиці 7 нумерація ембріонів відповідає нумерації таблиці 4; ** Таблиця 7 містить в цифровому вираженні дані оптичної густини, відповідно до виміру в імуноферментному аналізаторі. 5 10 15 2. Планшет з внесеними матеріалами залишали в термостаті при 37 °C в режимі струшування на 1 год. у вологій камері. 3. Планшет промивали, переносили у вошер, в режимі три рази по три струшування розчином для промивання від виробника. 4. У кожну луночку планшета вносили по 100 мкл робочого розчину кон'югата. 5. Планшет залишали на інкубацію в термостаті при 37 °C в режимі струшування на 1 год. 6. Планшет промивали, переносили у вошер, в режимі три рази по три струшування розчином для промивання від виробника. 7. У кожну лунку планшета вносили по 100 мкл робочого розчину субстрату (ТМБ). 8. Результат враховували після зміни кольори лунок з позитивним контролем від виробника G1, Н1 в імуноферментному аналізаторі Уніплан при довжині хвилі 452 нм. Середня оптична густина (ОГ) негативного контролю 0,057+0,067=0,124: 2=0,062. Оптична густина критична 0,200 + ОГ К- ср.=0,262. Позитивними вважаються лунки, в яких ОГ більше критичного, у тому числі А1, В1, С1, G1, Н1, слабо позитивний С 3. В результаті проведеної в експерименті реакції нейтралізації вірусу грипу А/Вікторія випробовуваною речовиною олігосахаридами ламінарії, одержаними заявленим способом, на 7 10 UA 107846 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 добових курячих ембріонах, методом зараження в хоріон-алантоїсну рідину, з подальшою ідентифікацією вірусовмісного матеріалу методом ІФА для виявлення антигену вірусу грипу А, за зміною оптичної густини, було встановлено: 1. Олігосахариди ламінарії, отримані за заявленим способом, та препарат порівняння "Альтабор" не токсичні для курячих ембріонів, в наведених розведеннях. 2. Олігосахариди ламінарії, отримані за заявленим способом, за враженістю антивірусної дії відносно прототипного штаму вірусу грипу А/Вікторія не поступаються препарату порівняння "Альтабор", що підтверджено методом ІФА. 3. Підтверджена лікувально-терапевтична доза препарату олігосахаридів ламінарії - в розведенні 1:80 методом ІФА за зміною оптичної густини лише в одній лунці С1, з трьох, до яких була внесена алантоїсна рідина заражених ембріонів, після нейтралізації прототипного штаму вірусу грипу А. 4. Після введення в курячі ембріони, без нейтралізації випробовуваним препаратом олігосахаридами ламінарії, прототипний штам вірусу грипу А/Вікторія зберіг свої властивості, що підтверджує зміна оптичної густини в лунках з контролем вірусу А1, В1, С1. Приклад 5. Вивчення антигерпетичної дії олігосахаридів ламінарії, одержаних за заявленим способом, проводили класичним вірусологічним методом зараження культури клітин з подальшим переглядом у світловому мікроскопі, відносно вірусу герпесу типу 1/Вірджинія [1]. 1.1 Контроль вірусу У пробірки з моношарів культури тканини (3) вносимо по 0,2 мл вірусної суспензії в розведенні 1:4, залишаємо на контакт при кімнатній температурі на 20-30 хв., заливаємо підтримуючим середовищем і поміщаємо для інкубації в термостат при температурі 36 °C на 3 доби зі щоденним переглядом у світловому мікроскопі при збільшенні Х40-Х90. Облік результатів проводимо по цитопатичній дії (ЦПД) на моношари перевиваної культури тканини. При наявності ЦПД, пробірки тричі заморожуємо і розморожуємо при -20 °C для найкращого відшаровування клітин від скла. Далі вміст пробірок переносимо в стерильні центрифужні пробірки, центрифугуємо при 3000 об./хв., надосадову рідину відбираємо в стерильні контейнери для подальшого вивчення і зберігаємо при -20-70 °C. 1.2. Контроль речовини У додатковому ряді пробірок готуємо розведення від 1:10 і 1:80 випробуваної речовини на теплому стерильному фізіологічному розчині, для чого наважку олігосахаридів ламінарії 5 г розчиняємо в 45 мл фіз. розчину. Далі методом перекату готуємо подвійні розведення випробуваного речовини, для чого по 5 мл олігосахаридів ламінарії з розведення 1:10 до 1:80 переносимо в додатковий ряд пробірок з 5 мл фіз. розчину. Пробірки з культурою клітин мікроскопуємо для встановлення наявності моношару і вносимо випробовувану речовину з пробірок додаткового ряду в розведеннях від 1:10 до 1:80 (по 3 пробірки на кожне розведення) в об'ємі 0,2 мл на моношар клітин, залишаємо на контакт при кімнатній температурі на 20-30 хв. і поміщаємо в термостат при температурі 36 °C на 3 доби зі щоденним переглядом у світловому мікроскопі при збільшенні Х40-Х90. Облік результатів по збереженню моношару перевиваної культури тканини на пробірках, що свідчить про наявність або відсутність токсичних елементів у випробуваному речовині для перевиваних клітин. 1.3 Контроль культури клітин Пробірки з моношарів клітинного пласта залишаємо цілісними, не заражуємо, для порівняння із зараженими. 1.4 Контроль зараження Пробірки з культурою клітин мікроскопуємо для встановлення наявності моношару і вносимо стерильний фіз. розчин в об'ємі 0,2 мл на моношар клітин, залишаємо на контакт при кімнатній температурі на 20-30 хв. і поміщаємо в термостат при температурі 36 °C на 3 доби зі щоденним переглядом у світловому мікроскопі при збільшенні Х40-Х90. За наявності цілісності моношару робимо висновок про можливість обліку результатів експерименту, при збереженні умов стерильності. 1.5 Власне дослід - контроль противірусної активності випробуваного речовини - реакція нейтралізації на культурі тканини. Принцип методу базується на здатності речовини з передбачуваною противірусною активністю інгібувати розмноження вірусу в перевиваній культурі клітин. У додатковий ряд пробірок (п. 1.2) з 0,5 мл випробуваного речовини в розведеннях від 1:10 до 1:80 вносимо по 0,5 мл прототипу штаму вірусу герпесу в розведенні 1:4 (його робоче розведення для реакції нейтралізації). Залишаємо суміш при кімнатній температурі (28-30 °C) на інкубацію 30-40 хв. Далі суміш вірусу і речовини з додаткового ряду пробірок переносимо в пробірки з моношарів культури клітин, по 3 пробірки на кожне розведення речовини. Заражені пробірки 11 UA 107846 C2 5 10 поміщаємо для інкубації в термостат при температурі 36 °C на 3 доби зі щоденним переглядом у світловому мікроскопі при збільшенні Х40-Х90. Облік результатів проводимо за збереженням цілісності моношару культури клітин і наявності ЦПД. Наявність ЦПД в експериментальних пробірках з клітинної культурою свідчить про дії вірусу і відсутності противірусної активності випробуваного речовини. Після обліку результатів, експериментальні пробірки тричі заморожуємо і розморожуємо при -20 °C для найкращого відшаровування клітин від скла. Далі вміст пробірок переносимо в стерильні центрифужні пробірки, центрифугуємо при 3000 об./хв., надосадову рідина відбираємо в стерильні контейнери для подальшого вивчення і зберігаємо при -20-70 °C. Експериментальні дані вивчення противірусної активності речовини олігосахаридів ламінарії проти штаму вірусу герпесу типу 1/Вірджинія представлені в таблиці 8. Ілюстрації цитопатичної дії вірусу представлені на фігурах 1-3, що включають контроль вірусу; контроль культури клітин та нейтралізацію цитопатичної дії вірусу герпесу олігосахаридами ламінарії відповідно. Таблиця 8 Вивчення антигерпетичної дії олігосахаридів, одержаних за заявленим способом, реакцією нейтралізації на культурі клітин Наявність ЦПД при перегляді у світловому Речовини, що Призначення мікроскопі при збільшенні Х40 і Х90 протягом 3 № з/п вносяться в пробірки з зараження діб культур моношаром культури культури клітин Інтерпретація тканини клітин 1 доба 2 доба 3 доба результатів Вірус Контроль 1 (три) ЦПД ЦПД ЦПД Вірус активний герпесу 1:4 вірусу Речовина Контроль Препарат не 2 (три) немає немає немає 1:10 препарату токсичний Речовина Контроль Препарат не 3 (три) немає немає немає 1:20 препарату токсичний Речовина Контроль Препарат не 4 (три) немає немає немає 1:40 препарату токсичний Речовина Контроль Препарат не 5 (три) немає немає немає 1:80 препарату токсичний Контроль Умови зараження 6 (три) Фіз. Розчин немає немає немає зараження стерильні Контроль Старіння культури 7 (три) немає немає немає культури клітин Препарат Вірус Речовина 8 (три) Власне дослід немає немає немає нейтралізує вірус герпесу 1:4 1:10 100 % Препарат Вірус Речовина 9 (три) Власне дослід немає ЦПД немає нейтралізує вірус герпесу 1:4 1:20 60 % Препарат Вірус Речовина 10 (три) Власне дослід немає ЦПД ЦПД нейтралізує вірус герпесу 1:4 1:40 30 % Препарат не Вірус Речовина 11 (три) Власне дослід ЦПД ЦПД ЦПД нейтралізує вірус герпесу 1:4 1:80 герпесу 15 20 В результаті проведеної в експерименті реакції нейтралізації вірусу герпесу типу 1 Вірджинія олігосахаридами ламінарії, одержаними за заявленим способом, на перевиваній клітинній лінії Неlа, з нейтралізацією цитопатичної дії вірусу на моношар, було встановлено, що олігосахариди ламінарії не токсичні для культури клітин в розведеннях від 1:10 до 1:80; олігосахариди ламінарії мають противірусну активність відносно прототипу штаму вірусу герпесу типу 1/Вірджинія в розведеннях від 1:10 до 1:40. Приклад 6. Вивчення антибактеріальної активності олігосахаридів ламінарії, одержаних за заявленим способом, проводили методом дифузії в агар [3]. Відповідно до рекомендацій ВОО3 для оцінки активності препаратів використовували референтні тест-штами: Staphylococcus 12 UA 107846 C2 5 10 15 20 25 aureus ATCC 26923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Basillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 885/653, Proteus vulgaris ATCC 4636. Мікробне 7 навантаження складало 10 мікробних клітин на 1 мл середовища та встановлювалось за стандартом McFarland. В роботі використовували 18-24-годинну культуру мікроорганізмів. Для досліджень агар Мюллера-Хінтона. Згідно з методикою методу "колодязів", визначення активності олігосахаридів проводили на двох шарах щільного живильного середовища, розлитого в чашки Петрі. У нижньому шарі використовували "голодні" не засіяні середовища (агар-агар, вода, солі). Нижній шар являв собою підкладку висотою 10 мм, на яку горизонтально встановлювали 3-6 тонкостінних циліндрів з нержавіючої сталі діаметром 8 мм і висотою 10 мм. Навколо циліндрів заливали верхній шар, що складався з живильного агаризованого середовища, розплавленого та охолодженого до 40 °С, в яке вносили відповідний стандарт добової культури тест-мікроба. Попередньо верхній шар добре перемішувався до утворення однорідної маси. Після застигання циліндри стерильним пінцетом витягали з лунки, що утворилась, вміщували випробувану речовину з урахуванням її об'єму. Об'єм середовища для верхнього шару коливався від 14 до 16 мм. Чашки підсушували 3040 хв. при кімнатній температурі та ставили в термостат на 18-24 год. При оцінці антибактеріальних властивостей олігосахаридів ламінарії враховували наступні критерії: - відсутність зон затримки росту мікроорганізмів навколо лунки, а також зони затримки до 10 мм указує на те, що мікроорганізм не чутливий до внесеного в лунку зразка; - зони затримки росту діаметром 10-15 мм указують на малу чутливість культури до випробовуваної концентрації антибактеріальної речовини; - зони затримки росту діаметром 15-25 мм характеризуються, як показник чутливості мікроорганізму до випробовуваного зразка; - зони затримки росту, діаметр яких перевищує 25 мм, свідчить про високу чутливість мікроорганізмів до досліджуваних зразків. Результати досліду наведені у таблиці 9. Таблиця 9 Вивчення антибактеріальної дії олігосахаридів ламінарії, одержаних за заявленим способом Діаметри зон затримки росту, мм (кількість повторів досліду n=3) Proteus Candida Staphylococcus Escherichia Pseudomonas Basillus Зразок дослідження vulgaris albicans aureus ATCC coli ATCC aeruginosa subtilis ATCC ATCC ATCC 26923 25922 ATCC 27853 6633 4636 885/653 17 14 16 Олігосахариди 18 17,3 15 15,0 ріст ріст 18 17,0 ріст ламінарії 17 16 17 30 35 40 45 Зона затримки росту у 17 мм для Staphylococcus aureus та Bacillus subtilis свідчить про чутливість мікроорганізмів до досліджуваного зразка. Малочутливою виявилась Escherichia coli з зоною затримки росту 15 мм. Абсолютно не чутливими до досліджуваної субстанції виявились Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris та грибів Candida albicans, що характеризувалось відсутністю зон затримки росту мікроорганізмів навколо лунки. Таким чином, заявлено спосіб комплексної переробки сланей ламінарії, який передбачає використання найдоступніших екстрагентів (вода та водно-спиртові суміші) та доступної рослинної сировини (сланей ламінарії). Спосіб є економічно доцільним, простим у використанні, не потребує спеціального обладнання або умов для здійснення і може бути відтворений на будь-якому хіміко-фармацевтичному підприємстві з використанням стандартного обладнання. Заявлений спосіб забезпечує одночасне одержання кінцевих продуктів з тиреотропною, антивірусною та антибактеріальною діями. Засоби, одержані за заявленим способом, є нетоксичними, не мають шкідливої побічної дії, і можуть бути використані як активні діючі субстанції рослинного походження при створенні ефективних препаратів у різних лікарських формах для пацієнтів різних вікових груп. Джерела інформації: 1. Вивчення антивірусної дії потенційних лікарських засобів. Щербинська A.M., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та ін. / Методичні рекомендації. - К., 2000. - 40 с. 13 UA 107846 C2 5 10 2. Возжинская В.Б., Цапко А.С. и др. Промысловые водоросли СССР. - М.: Пищевая промть, 1971. - с. 195-198. 3. Державна фармакопея України / Державне підприємство "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е видання. - X.: РИРЕГ, 2001. - 556 с. 4. Доклінічні дослідження лікарських засобів: Методичні рекомендації / За ред. О.В. Стефанова. - К.: Видавничий дім "Авіценна", 2001. - 528 с. 5. Зузук Б.М., Куцик Р.В. Ламинария сахаристая (син. Морская капуста) Laminaria saccharina (L.) Lamour (Аналитический обзор) // Провизор. - 2004. - № 9. - С. 25-31. 6. Корзун В.Н., Сагло B.I., Парац A.M. Харчування в умовах широкомасштабної аварії та її наслідків // Укр. мед. часопис. - 2002. - №11-12. - С. 99-105. 7. Патент на изобретение 2028153, Россия, МПК А61K35/8, заявл. 20.05.1991, опубл. 09.02.1995. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 Спосіб комплексної переробки сланей ламінарії з отриманням засобів з тиреотропною, противірусною та антибактеріальною дією, що включає сушіння, подрібнення сировини, екстракцію та обробку з подальшим отриманням продуктів, який відрізняється тим, що сировину екстрагують спирто-водною сумішшю (30 % спирт етиловий) при співвідношенні сировина:екстрагент 1:5 при температурі 18-20 ºС протягом 3-5 діб і відділяють шляхом фільтрації екстракт ламінарії, який відправляють на другу стадію, на якій з екстракту ламінарії проводять відгін спирту етилового, упарюють до водного залишку і відправляють на третю стадію, на якій з отриманого водного залишку при 50-60 ºС і тиску 80-87 кПа одержують водний екстракт ламінарії, частину якого використовують безпосередньо, а з іншої частини водного екстракту осаджують олігосахариди в 3-4-кратний об'єм спирту етилового, які потім відділяють шляхом фільтрації під вакуумом при 50-60 ºС і тиску 80-87 кПа і висушують на повітрі. 14 UA 107846 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 15