Застосування гемоглобіну або міоглобіну, завантаженого на його ділянку зв’язування кисню монооксидом вуглецю, для зовнішньої обробки ран

Реферат: Винахід стосується композиції, яка містить гемоглобін або міоглобін, де щонайменше в 40 % вказаного гемоглобіну або міоглобіну, у якого ділянка зв'язування кисню зв'язана з монооксидом вуглецю, і щонайменше один додатковий інгредієнт, способу отримання вказаної композиції й застосування гемоглобіну або міоглобіну, завантаженого монооксидом вуглецю, для зовнішньої обробки ран. UA 113290 C2 (12) UA 113290 C2 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис Даний винахід стосується композиції, яка містить гемоглобін або міоглобін, де щонайменше в 40 % указаного гемоглобіну або міоглобіну ділянка зв'язування кисню зв'язана некисневим лігандом, і щонайменше один додатковий інгредієнт, способу отримання вказаної композиції й застосування гемоглобіну або міоглобіну, завантаженого некисневим лігандом, для зовнішньої обробки ран. Застосовуються різні способи лікування ран, залежно від їх стану. Спочатку рана, яка ще є відкритою, переважно повинна бути дезінфікована й за допомогою цього захищена від несприятливих зовнішніх впливів. Це може бути здійснено за допомогою придатних дезінфікуючих розчинів або пов'язок із нанесеними на них аерозольними засобами або також шляхом нанесення розчину йоду. Дійсне загоювання рани повинно потім відбуватися зсередини. Це означає, що збережені кровоносні судини повинні забезпечувати зруйновану тканину достатньою кількістю субстратів для того, щоби міг запуститися механізм репарації тканини. Рани можуть бути викликані різними чинниками, такими, як, наприклад, пошкодження, оперативні втручання або травматичні впливи. З іншого боку відомо, що утворення ран, зокрема також хронічних ран, може бути також викликане захворюваннями, за яких відбувається дегенерація і/або скорочення великих і/або дрібних кровоносних судин. Це може відбуватися, наприклад, у немолодих пацієнтів, під час тривалого постільного режиму (пролежні) або при цукровому діабеті, який може призвести до дегенерації й артеріосклерозу (P. Carpenter, A. Franco, Atlas der Kapillaroskopie [Atlas of Capillaroscopy], 1983, Abbott, Max-Planck-lnst. 2, D-Wiesbaden) великих і дрібних кровоносних судин (макроангіопатії й мікроангіопатії артерій). Було також показано, що в зоні рани присутня киснева недостатність (гіпоксія). Критичною величиною вважається 40 мм рт. ст. (C. D. Miiller et al., Hartmann Wund [Wound] Forum 1 (1999), 17-25). Кров тече до тканин, включаючи шкіру, через артерії й забезпечує клітини субстратами, необхідними для життя. Будь-яка дегенерація кровоносних судин призводить до недостатнього постачання субстратами клітин, що призводить до їх загибелі. Субстрати повинні проходити останній, що здається незначним, проміжок розміром приблизно 20 мкм від найдрібніших кровоносних судин (капілярів) до клітин шляхом дифузії; у зв'язку з цим кисень відіграє особливу роль, тому що організму важко маніпулювати цим субстратом. Існують три основні релевантні проблеми: (1) Кисень дійсно абсолютно незамінний для життя (якщо мозок людини не отримує кисень, то він умирає вже приблизно через п'ять хвилин), але в той самий час кисень є високотоксичним (новонароджений, який отримує лікування у вигляді штучної вентиляції легенів чистим киснем, помре вже через декілька днів). (2) Кисень має дуже низьку розчинність у водному середовищі. Згідно з першим законом Фіка це призводить до низької швидкості дифузії кисню. Окрім того, існує фундаментальний закон дифузії, а саме закон Смолучовського й Ейнштейна, який указує, що швидкість дифузії (кисню) зменшується зі збільшенням відстані дифузії. Тепер константа дифузії кисню настільки низька, що швидкість дифузії при відстані дифузії вже 20 мкм становить тільки 5 % первинної величини. Водний шар товщиною, наприклад, 50 мкм утворює майже повну кисневу ізоляцію клітин. Кисень транспортується в організмі з кровотоком по каналах від легенів до кінчиків пальців стоп у зв'язаному гемоглобіном стані і тільки таким чином здатний долати довгі відстані придатним для організму способом. (3) Для кисню, наприклад, на відміну від глюкози, в організмі немає ділянки зберігання, і тому даний субстрат повинен бути доступний для клітин постійно й швидко, у достатній кількості; кисень являє собою субстрат, безпосередньо необхідний для життя. В інтактному організмі ці проблеми вирішуються шляхом використання кількох механізмів. Токсичні ефекти кисню усуваються тим, що останній зв'язується під час транспорту з гемоглобіном і таким чином залишається нешкідливим. У той самий час вільний кисень знаходиться в розчиненому вигляді й завдяки цьому додатково втрачає свій пошкоджувальний окислювальний потенціал. Проте, він миттєво доступний у достатній кількості, тому що зв'язування з гемоглобіном є зворотним. Проблема низького дифузійного діапазону вирішується тим, що в організмі розвинена сітка дуже дрібно розгалужених кровоносних судин (капілярна сітка), яка забезпечує те, що в середньому кожна клітина знаходиться на відстані не більше ніж 25 мкм від капіляра; таким чином, канал дифузії кисню в організмі залишається нижче критичної довжини 50 мкм. Окрім того, клітина може завдяки дифузії забезпечуватися киснем із декількох боків; це є механізмом безпеки. В організмі досягається негайний доступ кисню відповідно до потреби (у кисню немає можливості бути доступним у надлишку, інакше це буде мати шкідливий 1 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вплив) за допомогою судинної регуляції потоку в кровоносних судинах, який регулює перфузію й таким чином оптимізує постачання киснем. Якщо є відкрита поверхня рани, то постачання клітин киснем переривається. Постачання киснем із зовнішнього повітря є недостатнім, оскільки на (тканинному) шарі клітин лежить плівка водної рідини, і, як з'ясовується, ця плівка утворює бар'єр для дифузії кисню. Свіжі рани в нормальній тканині можуть загоюватися за декілька днів, якщо постачання киснем із нижчележачих структур, іншими словами, зсередини, є достатнім. Однак у експериментах на тваринах було показано, що навіть свіжі рани загоюються краще, якщо збільшується концентрація кисню в навколишньому повітрі (M. P. Pai et al., Surg. Gyn. Obstet. 135 (1972), 756758). Відомо, що старіші, зокрема хронічні рани загоюються дуже повільно, якщо взагалі загоюються, внаслідок їх кисневої недостатності. Для кращого загоювання хронічних ран використовували так звану гіпербаричну оксигенотерапію (HBO). Під час цього лікування пацієнтів поміщують у камери, які знаходяться під надмірним тиском, де їх піддають впливу чистого кисню під надмірним тиском приблизно 3 бар протягом певного періоду часу (C. D. Muller et al., Hartmann Wund Forum 1 (1999), 17-25). Загоювання ран дійсно можна збільшити цим способом. Однак ефект зменшується відповідно до підвищення кількості лікувальних впливів. У патенті США 2527210 описаний розчин гемоглобіну, який, як стверджують, можна використати для лікування ран, як внутрішньовенно, так і місцево, наприклад, аерозольним розпиленням. У даному описі гемоглобін отримують зі свіжих еритроцитів, які піддають шоку заморожування після центрифугування й відсмоктування плазмової фракції. Це призводить до лізису клітин й вивільняється гемоглобін. У продукті також присутні зруйновані клітинні стінки. Цей склад являє собою концентрований клітинний детрит (клітинні фрагменти). Таким чином, передбачається ефект антисептичного покриття, такий, який інакше досягається йодним розчином, після додання 5 % сульфіду натрію. Іншими словами, рана просто закривається. Транспорт кисню в цьому випадку не відбувається. У WO 97/15313 описано лікувальне застосування гемоглобіну для поліпшення загоювання ран. Із цією метою пацієнтам внутрішньовенно вводять позбавлений строми й пірогенів гемоглобін, зокрема після операцій і травматичних пошкоджень, для підвищення артеріального тиску. Зокрема, із цією метою використовують гемоглобін, поперечно-зшитий із діаспірином. У WO 2003/077941 мова йде про лікування відкритих ран розчином гемоглобіну, що містить ізольований і необов'язково поперечно-зшитий гемоглобін. Розчини були свіжоприготовленими з гемоглобіном зі свинячої крові, і їх наносили на хронічні рани. Під час отримання й зберігання переносників кисню на основі гемоглобіну або міоглобіну вони можуть частково або повністю втратити свою функціональну здатність. Для запобігання цьому бажано стабілізувати переносники кисню, щоб вони залишалися застосовуваними й здатними транспортувати кисень. Як правило, існують різні підходи до отримання штучних переносників кисню; один із них полягає в отриманні відповідних розчинів нативних або хімічно модифікованих гемоглобінів (див. "Issues from Vth International Symposium on Blood Substitutes, San Diego, Calif., USA, March 1993", Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnology 22 (1994), vol. 2-vol. 4). Одна проблема при маніпулюванні такими фармацевтичними препаратами як штучними переносниками кисню полягає в їх збільшуваній інактивації спонтанним окисленням у метгемоглобін, який більше не здатний транспортувати кисень. Це зазвичай відбувається під час виробництва й подальшого зберігання. Описано декілька підходів для розв'язання цієї проблеми. Робляться спроби або мінімізувати ступінь окислення гемоглобіну, або знову відновити окислений гемоглобін. Однією можливістю запобігання спонтанному окисленню є деоксигенація гемоглобіну (тобто повне видалення кисню з препарату), оскільки деоксигемоглобін набагато повільніше окислюється в метгемоглобін, ніж оксигемоглобін. Окрім того, можна мінімізувати кількість окислення зберіганням і/або отриманням при наскільки можливо низькій температурі (для водних розчинів приблизно при 4C). Окрім того, швидкість окислення гемоглобіну залежить від концентрації іона водню, тобто pH. Наприклад, для нативного людського гемоглобіну існує мінімум у інтервалі pH від 7,5 до 9,5. Додання певних спиртів також може зменшити окислення гемоглобіну. Деякі з них працюють навіть при низькій концентрації. Однією проблемою є токсичність цих спиртів. + + Іони певних металів (Cu2 , Fe3 тощо) каталізують спонтанне окислення гемоглобіну. Їм може бути надана неефективність шляхом утворення комплексів з EDTA (етилендіамінтетраоцтовою кислотою), хоча сама EDTA сприяє спонтанному окисленню гемоглобіну. 2 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Захист штучних переносників кисню проти окислення може бути додатково досягнутий додаванням оновлювальних речовин. У певних умовах вони навіть призводять до реактивації окисленого гемоглобіну. У Європейському патенті EP 0857733 указано, що гемоглобін може бути стабілізований зв'язуванням ліганду, зокрема монооксиду вуглецю, із ділянкою зв'язування кисню. Було виявлено, що такий карбонілгемоглобін можна вводити в організм без делігандування, і він придатний як переносник кисню всередині потоку крові. Завданням даного винаходу є отримання продукту для зовнішнього лікування ран, який прискорює загоювання ран, легкий у застосуванні й придатний для зберігання. Ця завдання вирішується згідно з винаходом композицією, що містить (a) переносник кисню, переважно гемоглобін або міоглобін, де щонайменше у 40 % вказаного переносника кисню, у якого ділянка зв'язування кисню зв'язана з некисневим лігандом, і (b) щонайменше один додатковий інгредієнт, вибраний з одного або більше електролітів, консервантів, стабілізаторів, антифлокулянтів, антикоагулянтів, буферуючих pH-агентів, розчинників, антиоксидантів, агентів, які утворюють плівку, і поперечно-зшивальних агентів, і застосування переносника кисню, переважно гемоглобіну або міоглобіну, завантаженого на його ділянку зв'язування кисню, зв'язану з некисневим лігандом, для отримання засобу або композиції для зовнішнього лікування ран. Згідно з винаходом, переважно використовують природний (нативний) переносник кисню, зокрема гемоглобін або міоглобін або їх модифіковане похідне. Гемоглобін або міоглобін людського або тваринного походження, зокрема конячого, бичачого або переважно свинячого походження, зокрема придатні для даного винаходу. Людський або свинячий гемоглобін, який є природним або модифікованим, як описано нижче, є, зокрема, переважним як переносник кисню. Переносник кисню може бути свіжовиділеним із крові людини або тварин або може бути отриманий штучно. Можна також використати суміші природних і модифікованих переносників кисню, такі, як, наприклад, із співвідношенням від 20:1 до 1:20 в перерахунку на масу. Окрім того, суміші гемоглобіну й міоглобіну або їх модифіковані похідні можна використати в указаних вище співвідношеннях від 20:1 до 1:20. У додатковому варіанті здійснення переносник кисню може бути модифікований. Модифікація може являти собою внутрішньомолекулярне поперечне зшиття, полімеризацію (міжмолекулярне поперечне зшиття), пегілювання (ковалентне зв'язування з поліалкіленоксидами), модифікацію хімічно реакційноздатними чинниками, такими, як піридоксал-5'-фосфат або 2-нор-2-формілпіридоксал-5'-фосфат, або також із хімічно нереакційноздатними ефекторами кисневого зв'язку, такими, як 2,3-бісфосфогліцерат, інозитгексафосфат, інозитгексасульфат або мелітова кислота, або їх комбінація. Такі модифікації відомі й описані, наприклад, у DE-A 10031744, DE-A 10031742 і DE-A 10031740. Поперечне зшиття переносників кисню також описане в DE 1970137, EP 971000790, DE 4418937, DE 3841105, DE 3714351, DE 3576651. Прикладами модифікованих переносників кисню є гемоглобіни, що мають молекулярну масу від 65000 до 15000000, такі, як внутрішньомолекулярно поперечно-зшиті молекули відповідно до WO 97/15313, зокрема полімерні продукти, а також міжмолекулярно поперечно-зшиті продукти, які мають середню молекулярну масу від 80000 до 10000000 г/моль, зокрема від 100000 до 5000000, або аналогічно отримані міоглобіни, що мають молекулярну масу від 16000 до 5000000, зокрема від 100000 до 3000000, переважно, 1000000 г/моль. Можуть використовуватися такі переносники кисню, які полімеризовані, наприклад, із використанням поперечно-зшивальних агентів, відомих для міжмолекулярної модифікації, таких, як біфункціональні поперечно-зшивальні агенти, подібно до діепоксибутадієну, дивінілсульфону, діізоціанату, зокрема гексаметилендіізіоціанату, циклогексилдіізіоціанату і 2,5бісізоціанатбензолсульфонової кислоти, складному ди-N-гідроксисукцинімідиловий ефіру, складному діімідоефіру або діальдегіду, зокрема гліоксалю, глікольальдегіду, який реагує аналогічно, або глутаральдегіду. Окрім того, можна використовувати продукти, які полімеризовані таким чином і пегильовані поліетиленгліколем, або придатні його похідні. Вони включають, наприклад, поліетиленоксид, поліпропіленоксид або співполімер етиленоксиду й пропіленоксиду або їх складний ефір, простий ефір або складний ефірамід. Може бути придатним, якщо ковалентно зв'язаний поліалкіленоксид має молярну масу від 200 до 5000 г/моль. Для ковалентного зв'язування поліалкіленоксидів можуть бути придатні такі похідні поліалкіленоксиду, які містять зв'язувальний агент, уже ковалентно зв'язаний із функціональною 3 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 групою, завдяки чому забезпечується можливість безпосередньої хімічної взаємодії з аміно-, спиртовими або сульфгідрильними групами гемоглобінів, причому утворення ковалентних зв'язків поліалкіленоксидів може бути придатне, наприклад, для поліалкіленоксидів із реакційноздатним складним N-гідроксисукцинімідиловим ефіром, простим епокси(гліцидиловим ефіром), альдегідом, ізоціанатом, вінілсульфоном, йодацетамідом, імідазолілформіатом, тресилатними групами та іншими. Багато таких багатофункціонально активованих поліетиленгліколів комерційно доступні. Якщо використовують модифіковані переносники кисню, то переважні модифіковані поперечно-зшиті (внутрішньомолекулярні або міжмолекулярні) або поперечно-зшиті й пегильовані продукти гемоглобіну, які мають середню молекулярну масу від 250000 до 750000 г/моль, або продукти міоглобіну, які мають середню молекулярну масу від 50000 до 750000 г/моль. Згідно з особливо переважним варіантом здійснення для отримання композиції за винаходом використовують свіжовиділений гемоглобін або міоглобін людського або тваринного походження, зокрема свинячого походження. Згідно з даним винаходом щонайменше 40 % ділянок зв'язування кисню переносника кисню зв'язані з некисневим лігандом. Переважно щонайменше 50 %, переважно щонайменше 60 %, переважніше щонайменше 70 %, ще переважніше щонайменше 80 %, зокрема переважно щонайменше 90 % або 95 % гемоглобіну або міоглобіну надано в завантаженій лігандом формі. Це завантаження може бути вже застосоване під час виділення носія або після його додаткового очищення, однак, особливо переважно виділення переносника кисню в його захищеній формі, що означає забезпечення ліганду або контакту його з переносником кисню під час виділення або очищення. Некисневий ліганд переважно являє собою монооксид вуглецю (CO) або моноксид азоту (NO), або їх суміш. Обидва ліганди мають високу афінність відносно ділянки(ок) зв'язування O 2 3+ гемоглобіну/міоглобіну й слугують як захисний агент проти окислення центрального іона Fe гему. Завантажені переносники кисню переважно розчинені у водному або органічному середовищі, де переважний водний розчин у кількості від 0,1 до 35 % мас., переважно від 0,1 до 20 % мас., переважніше від 0,1 до 15 % мас., для готовності до застосування. Композиція згідно з даним винаходом додатково містить щонайменше одну додаткову добавку, переважно вибрану з групи, яка включає електроліти, стабілізатори, антифлокулянти, консерванти, буферуючі pH-агенти, розчинники, антиоксиданти й агенти, які утворюють плівку, переважніше вибрану з електролітів, стабілізаторів, антифлокулянтів, консервантів, буферуючих pH-агентів. Найбільш прийнятна композиція подана у формі розчину й містить щонайменше один електроліт і, необов'язково, стабілізатор. Розчин може містити фізіологічно сумісні електроліти, такі, як солі, у придатних або бажаних кількостях. Електроліти можуть бути присутніми у кількостях від 0,1 до 30 % мас., переважно від 0,1 до 10 %, але переважно присутні відповідно в фізіологічній концентрації. Переважно, композиція містить сіль у вказаних вище кількостях, подібно до, наприклад, NaCl, KCl, NH 4Cl, CaCO3, Na2CO3, K2CO3, MgSO4, Na2SO4, CaCl2, MgCl2, цитрату натрію, лактату натрію або суміші вказаних або подібних солей, але без обмеження цими прикладами. Найбільш прийнятною сіллю є NaCl, зокрема у концентрації 0,9 % (ізотонічний розчин). Згідно з винаходом зокрема прийнятно, щоб композиція містила сполуку, яка діє як стабілізатор і/або антифлокулянт для білків, зокрема для гемоглобіну/міоглобіну, таку, як Nацетилцистеїн, цистеїн, N-ацетилметіонін, метіонін, нехаотропні солі, поліоли, подібне до цукру, переважно дицукри, і амінокислоти, переважно, кожні в кількості від 0,001 % мас. до 20 % мас. Поліоли, які можуть бути використані, являють собою переважно поліоли з низькою молекулярною масою, хоча можуть використовуватися полімерні похідні. Такі поліоли включають етиленгліколь, гліцерин, еритрит і маніт. Циклічні поліоли, які можуть бути використані, включають одне або більше аліциклічних кілець і можуть мати щонайменше один бічний ланцюг. Переважні поліоли включають дисахариди й цукрові спирти, наприклад, лактит, сорбіт і інозит. Переважні сполуки, що мають 2-10 гідроксильних груп. Кількість поліолу може знаходитися в переважному діапазоні від 0,001 до 20 %, переважніше від 1 до 15 %, найбільш переважно від 2 до 10 % мас./об. Додатково, добавка білкового стабілізатора може бути вибрана з тріс(гідроксиметил)метилової сполуки формули 1: (HOCH 2)3C-R (1), де R являє собою C 1C4алкіл, заміщений C1-C4алкіл, NH2, NHC(CH2OH)3, C1-C4гідроксіалкіл, C1-C4алкілкарбоксилат, 1 2 2 NR R (де R і R можуть незалежно являти собою Н, C1-C4алкіл, C1-C4алкілсульфонат, C1C4гідроксіалкілсульфонат). Приклади переважних сполук формули (1) включають: 4 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тріс(гідроксиметил)етан; 1,1',1"-тріс(гідроксиметил)пропан; тріс(гідроксиметил)амінометан або їх солі, наприклад, хлорид, малеат, фосфат, сукцинат; 1,3 біс[тріс(гідроксиметил)метиламіно]пропан; біс(2-гідроксіетил)амінотріс(гідроксиметил)метан; N[тріс(гідроксиметил)метил]-2-аміноетансульфонат; N-[тріс(гідроксиметил)метил]-3амінопропансульфонат; N-[тріс(гідроксиметил)метил]-3-аміно-2-гідроксипропансульфонат; N[тріс(гідроксиметил)метил]гліцин. Указані сполуки також можуть додаватися в переважному діапазоні від 0,001 до 20 %, переважніше від 1 до 15 %, найпереважніше від 2 до 10 % мас./об. Додатковий білковий стабілізатор може бути вибраний із поліелектроліту. Поліелектроліт може являти собою катіонний або аніонний поліелектроліт. Також можуть бути використані амфотерні поліелектроліти. Катіонний поліелектроліт являє собою переважно полімер із катіонними групами, розподіленими вздовж молекулярного ланцюга. Катіонні групи, які являють собою переважно функціональні групи, що виникли з четвертинного амонію, можуть бути розташовані в бічних групах, які звисають із ланцюга, або можуть бути включені в нього. Приклади катіонних поліелектролітів включають: співполімери вінілпіролідону й четвертинного метилметакрилату, наприклад, серії Gafquat (755N, 734, HS100), отримані від компанії ISP; заміщені поліакриламіди; поліетиленімін, поліпропіленімін і заміщені похідні; гомополімери поліамінів (Golchem CL118); співполімери поліамінів (наприклад, конденсати епіхлоргідрину й моно- або диметиламіну); полідіалілдиметиламонійхлорид (polyDADMAC); заміщені декстрани; модифікований кизельгур (заміщений гідроксипропіламонійхлоридом); заміщені білки (наприклад, четвертинні групи, заміщені на соєвому білку, і гідролізований колаген); поліамінокислоти (наприклад, полілізин); поліаміносполуки з низькою молекулярною масою (наприклад, спермін і спермідин). Можуть використовуватися природні або штучні полімери. Можуть бути використані катіонні поліелектроліти з молекулярною масою від 150 до 5000000, переважно від 5000 до 500000, переважніше від 5000 до 100000. Переважно кількість від 0,01 до 10 %, переважніше від 0,1 до 2 %, зокрема від 0,05 до 5 % мас./об. Аніонний поліелектроліт являє собою переважно полімер з аніонними групами, розподіленими вздовж молекулярного ланцюга. Аніонні групи, які можуть включати карбоксилат, сульфонат, сульфат або інші негативно заряджені групи, які іонізуються, можуть бути розташовані на групах, що звисають із ланцюга, або безпосередньо зв'язаних з основним ланцюгом полімеру. Можуть використовуватися природні або штучні полімери. Приклади аніонних поліелектролітів включають: Gantrez (Sseries, AN-series); альгінову кислоту й солі; карбоксиметилцелюлозу й солі; заміщені поліакриламіди (наприклад, заміщені групами карбонової кислоти); поліакрилові кислоти й солі; полістиролсульфонові кислоти й солі; декстрансульфати; заміщені сахариди, наприклад, октосульфат сахарози; гепарин. Можуть використовуватися аніонні поліелектроліти з молекулярною масою від 150 до 5000000, переважно від 5000 до 500000, переважніше від 5000 до 100000. Переважна кількість від 0,01 % до 10 %, зокрема від 0,05 до 5 %, конкретніше від 0,1 до 2 % мас./об. Особливо переважним стабілізатором є N-ацетилцистеїн у кількості від 0 до 10 %, переважно 0,01-5 %. Додатково композиція може містити будь-який консервант, такий, як, наприклад, феноксіетанол, ізотіазолін, сорбінова кислота або інший придатний консервант, відомий фахівцям у даній галузі техніки. Композиція може додатково переважно містити будь-який буферуючий агент. Можуть бути використані будь-які із загальновідомих буферуючих агентів, таких, як Тріс/HCl, K2HPO4/KH2PO4, Na2HPO4/NaH2PO4, MOPS (3-(N-морфоліно)пропансульфонова кислота), HEPES (4-2гідроксіетил-1-піперазинетансульфонова кислота), TAPS (3{[тріс(гідроксиметил)метил]аміно}пропансульфонова кислота), біцин (N, N-біс(2гідроксіетил)гліцин), трицин (N-тріс(гідроксиметил)метилгліцин), TES (2{[тріс(гідроксиметил)метил]аміно}етансульфонова кислота), PIPES (піперазин-N, N-біс(2етансульфонова кислота)), SSC (сольовий цитрат натрію), MES (2-(Nморфоліно)етансульфонова кислота), але не обмежуючись ними. Придатними розчинниками в композиції згідно з винаходом переважно є вода або водні розчини, органічні розчинники, такі, як спирт, переважно етанол або поліетиленгліколь (PEG). Також можуть використовуватися суміші вказаних розчинників. Додаткові природні олії можуть бути використані як розчинник для деяких з інгредієнтів, і композиція може бути подана у вигляді емульсії. Особливо переважним розчинником є вода або водний розчинник. Антиоксиданти, корисні для композиції за даним винаходом, можуть являти собою, наприклад, вітамін С, вітамін Є, флавоноїди, каротиноїди або їх солі або похідні. 5 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважні агенти, які утворюють плівку, являють собою такі агенти, які зазвичай використовуються в косметології, такі, як, наприклад, акриламід/натрій, акрилатний співполімер, співполімер акрилатів/акриламіду, складний бутиловий ефір співполімеру PVM/MA, карбоксиметилхітин, хітозан, гідроксипропілцелюлоза, полікватерній-36, PVP, співполімер PVP/VA, співполімер VA/кротонатів або співполімер вінілкапролактаму/PCP/диметиламіноктилметакрилату. Якщо не вказано інше, то всі вказані вище добавки можуть бути присутні в кількості від 0 до 20, переважно від 0,001, 0,01, 0,05 або 0,1-10, переважніше від 0,5 до 5 % (мас./об.). Якщо бажано, то можуть бути присутні додаткові добавки, зокрема у кількість від 0 до 20, переважно від 0,1 до 20, переважно від 0,2 до 15, зокрема від 0,5 до 10 % мас. Переважні добавки являють собою поживні речовини для клітин. Вони можуть бути вибрані з глюкози, наприклад, у кількостях від 0,1 до 5 % мас., інсуліну в кількостях до 25 МО/мл, природних амінокислот, зокрема, цистеїну, наприклад, від 0,1 до 5 % мас., або тканинні чинники, такі, як інтерлейкіни в фізіологічних кількостях аж до 10-кратних. Переважно композиція являє водний розчин, що містить (a) переносник кисню, переважно гемоглобін або міоглобін, де щонайменше в 40 % указаного переносника кисню ділянка зв'язування кисню, зв'язана з некисневим лігандом), і (b) щонайменше один додатковий інгредієнт, вибраний з електролітів, консервантів, стабілізаторів, антифлокулянтів, антикоагулянтів, буферуючих pH-агентів, антиоксидантів, органічного розчинника, агентів, які утворюють плівку, і поперечно-зшивальних агентів. У переважному варіанті здійснення даного винаходу композиція містить переносник кисню, який виділений із цільної крові людини або тварини, переважно свиней. Відповідно додатковий аспект винаходу стосується способу очищення з цільної крові переносника кисню, застосовного для композиції за даним винаходом. Для отримання композиції в переважному варіанті здійснення переносник кисню виділяють із цільної крові людини або тварини й додатково очищають для по суті повного видалення плазми й компонентів клітинних мембран. Під терміном "по суті повного видалення" розуміють, що дана сполука або композиція не містить більше ніж 20 %, переважно не більше ніж 10 %, ще переважніше не більше ніж 5 % і, зокрема, переважно не більше ніж 2 % або менше ніж 1 % вказаних небажаних сполук. Очищення може включати будь-які придатні засоби або стадії способу, такі, як, наприклад, селективний лізис або осадження, центрифугування, ультрацентрифугування, фракціоноване центрифугування, способи хроматографії, такі, як аніонообмінна хроматографія, ексклюзійна хроматографія, афінна або адсорбційна хроматографія, гельфільтруюча або молекулярноситова хроматографія, або діаліз, але без обмеження цими прикладами, поки застосовувані способи наскільки можливо мало денатурують переносник кисню. Переважно під час виділення й очищення переносник кисню залишається по суті в розчині. Коли переносник кисню виділяють із цільної крові, то переважно, щоб або клітини, що містять переносник кисню, відокремлювались від інших компонентів крові, або вказані клітини були селективно лізовані для доставки (розчинного) переносника кисню в розчин і потім відокремлені нерозчинні компоненти. Підходить також комбінація двох способів. Лізис клітин, які містить переносник кисню, можна здійснювати будь-яким придатним способом лізису, наприклад, хімічним лізисом, осмотичним лізисом, механічним лізисом, термічним лізисом або подібним. Клітинні уламки можна відокремити будь-яким придатним засобом або способом. Це включає, наприклад, центрифугування, фільтрацію, осадження й декантацію, діаліз або будьякий подібний спосіб. Для відокремлення нелізованих клітин або клітинних уламків від розчиненого переносника кисню звичайний спосіб являє собою гранулювання твердого матеріалу. Наприклад, можна здійснити стадію центрифугування. Центрифугування при 2-5000g зазвичай достатньо для гранулювання клітин і клітинних уламків. Для гранулювання додаткових нерозчинених компонентів, наприклад, будь-якого осаду, що утворився під час процесу очищення, у будь-який час під час процесу очищення можна здійснити стадії центрифугування, зокрема стадії центрифугування з використанням вищих сил 6 до ультрацентрифугування в режимі до 10 g. Очищення розчину, що містить переносник кисню, додатково або альтернативно, будь-якої стадії центрифугування, може включати щонайменше одну стадію фільтрації, переважно щонайменше дві, три або більше стадій фільтрації. Це можна здійснювати або використовуючи щонайменше один, переважно щонайменше два, переважніше щонайменше три фільтри (якщо 6 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 в даному застосуванні використовується декілька фільтрів, то автори використовують термін "каскад фільтрів"), або одну, дві, три або більше окремих стадій фільтрації. Указаний каскад фільтрів або різні стадії фільтрації можуть включати два, три, чотири, п'ять або більше фільтрів різного типу, із різного матеріалу і/або з різним розміром пор. Окрім того, можна використати глибокошаровий фільтр, такий, як, наприклад, скловата або подібний, переважно як матеріал першого фільтра, для затримки великих клітинних уламків. Використовуючи декілька фільтрів, переважно застосування фільтрів, які забезпечують різні діаметри пор в порядку зменшення. Наприклад, якщо використовують три різні фільтри, то перший фільтр (після глибокошарового фільтра) може мати розмір пор від 1 до 0,5 мкм, другий фільтр може мати розмір пор від 0,7 до 0,3 мкм, і третій може мати розмір пор від 0,4 до 0,1 мкм, де незалежно від діапазонів, що перекриваються, указаних вище, наступний фільтр у будьякому випадку має менший розмір пор, ніж фільтр перед ним. За допомогою вказаних стадій фільтрації по суті видаляється твердий і осаджений матеріал, що має більший розмір, ніж розмір пор використовуваних фільтрів. Окрім того, стадія ультрафільтрації може бути включена в спосіб очищення для очищення переносників кисню. За допомогою такої стадії ультрафільтрації можна відокремити небажані розчинені макромолекули. Переважно межу виключення за розміром вибирають для відокремлення макромолекул, які більші (крупніші, мають вищу молекулярну масу), ніж бажані переносники кисню, відповідно указані макромолекули затримуються фільтром. У зв'язку з молекулярною масою гемоглобіну, що становить приблизно 64000 Дальтон, межа виключення за розміром ультрафільтраційного фільтра повинна бути вищою. Для того, щоб пересвідчитися в тому, що вихід гемоглобіну не зменшується стадією ультрафільтрації, переважно вибрати виключення розміру фільтра на рівні приблизно 100000 Дальтон, переважно на рівні приблизно 200000 Дальтон, переважніше на рівні приблизно 300000 Дальтон, але без обмеження цими величинами. Додатково або як альтернативу можна здійснювати будь-яку відповідну стадію хроматографії. Особливо переважним типом хроматографії є іонообмінна або ексклюзійна хроматографія. Такий самий результат може бути отриманий стадією діалізу з використанням діалізної мембрани, що забезпечує вказані вище межі виключення за розміром Т, які дозволяють проходити переноснику кисню, але затримують макромолекули, що мають більший молекулярний розмір. Для зниження кількості сполук із невеликою молекулярною масою в розчині додаткову стадію діалізу можна здійснювати з використанням діалізної мембрани, яка має межу виключення за розміром приблизно 50000 Дальтон, що забезпечує можливість проходження менших молекул, але затримує переносник кисню. Для зменшення зараження композиції вірусами і/або мікроорганізмами особливо переважно включення стадії зниження вмісту вірусу в спосіб очищення. Вміст вірусу зменшується цією стадією, переважно до вірусного вантажу менше ніж 10, переважно менше ніж 5, переважніше менше ніж 2 вірусних частинок на 1 мл, і ще переважніше до 0. На цій стадії переважно, щоб розчин, який містить переносник кисню, проходив через фільтр, що знижує вміст вірусу ("вірусний фільтр"). Такі фільтри загальновідомі й комерційно доступні. Прикладами є Sartorius Virosart® CPV, Planova® 15N, 20N, Millipore Viresolve® NFP або PALL Pegasus® Grade LV6, але не обмежуючись ними. Альтернативно або додатково, переважно після проходження через фільтри можна застосовувати обробку УФ-світлом, зокрема УФ-світлом із довжиною хвиль 245 нм, для знищення будь-яких вірусів, що залишаються. Необов'язково на будь-якій стадії протягом процесу виділення переносника кисню можна здійснювати щонайменше одну стадію нагрівання. Ця стадія включає нагрівання суспензії або розчину, що містить переносник кисню, під час процедури виділення до температури в діапазоні від 40 до 85C, переважно від 60 до 80C, переважніше у діапазоні від 65 до 75C. Стадію нагрівання переважно проводять протягом періоду від 10 хв до 6 годин, переважно протягом від 20 хв. до 4 годин і найпереважніше протягом від 30 хв до 3 годин, і може включати декілька різних температур у межах указаного вище діапазону. Згідно зі способом за даним винаходом переважно, щоб переносник кисню залишався в розчині протягом всього процесу очищення. Окрім того, переважно, щоб переносник кисню залишався в розчині протягом всього процесу очищення й протягом отримання композиції за даним винаходом. Це означає, що переносник кисню переважно не осідає в способі за даним винаходом і, відповідно, залишається в своїй природній тривимірній структурі, у якій він присутній в природному середовищі. 7 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У особливо переважному способі згідно з даним винаходом, спосіб очищення переносника кисню з цільної крові включає щонайменше стадії: (a) відокремлення плазми цільної крові, (b) лізису еритроцитів, (с) завантаження переносника кисню лігандом, (d) нагрівання зразка до температури в діапазоні від 40 до 85C, (е) відокремлення переносника кисню від будь-яких небажаних компонентів крові. За допомогою цих стадій можна отримати розчин, що містить переносник кисню, який можна використовувати для отримання композиції за даним винаходом. Зокрема, розчин, що містить переносник кисню, який можна отримати за допомогою цих стадій, може бути концентрований до бажаної кількості переносника кисню, і до цього розчину доданий щонайменше один додатковий інгредієнт(и) з отриманням композиції за даним винаходом. Стадію (a) даного способу можна здійснювати будь-яким із зазвичай використовуваних способів для відокремлення плазми від цільної крові, переважно центрифугуванням або фільтрацією. Шляхом центрифугування протягом приблизно 30 хв. при швидкості приблизно від 2000 до 5000 об./хв., наприклад, 4000 об./хв., еритроцити осідають, у той час, як розчинні сполуки й лейкоцити переважно залишаються в супернатанті. Шляхом ресуспендування й осадження еритроцитів, наприклад, від 2 до 5 разів, можна поліпшити відокремлення еритроцитів від небажаних сполук крові. Стадію (b) переважно здійснюють додаванням води, переважно дистильованої води або придатного субізотонічного буфера, переважно фосфатного буфера до загущеної крові стадії (a). Після лізису еритроцитів водою або субізотонічним буфером до розчину/суспензії переважно додають сіль з отриманням фізіологічної концентрації вказаної солі в розчині. Переважно NaCl додають у кількості 0,9 % у розчині. Стадію (с) можна здійснювати після стадії (a), після стадії (b), після стадії (d) або після стадії (е), але переважно її проводять щонайменше після стадії (b). Зокрема, потрібно зазначити, що стадію (с) не обов'язково здійснювати відразу як наступну стадію після стадії (b), але її можна також здійснювати або повторювати після стадії (d), після стадії (е) або будь-яких наступних стадій обробки. Завантаження переносника кисню в розчин/суспензію можна здійснювати введенням газу в розчин/суспензію, переважно газу CO або NO або їх суміші. У переважному варіанті здійснення газ CO вводять у розчин/суспензію протягом періоду часу, достатньо тривалого для отримання насичення в розчині/суспензії >90 %, переважно насичення >95 %. Стадія (d) може бути здійснена після стадії (a), після стадії (b), після стадії (с) або після стадії (е), але переважно її здійснюють після стадії (с). Додатково нагрівання можна повторювати під час процедури виділення. Ця стадія включає нагрівання суспензії або розчину, що містить переносник кисню, під час процедури виділення до температури в діапазоні від 40 до 85C, переважно від 60 до 80C, переважніше у діапазоні від 65 до 75C. Стадію нагрівання здійснюють переважно протягом періоду від 10 хв. до 6 годин, переважно протягом періоду від 20 хв до 4 годин, і найпереважніше протягом періоду від 30 хв. до 3 годин, і може включати декілька різних температур у межах указаного вище діапазону. На стадії (е) переносник кисню очищають від інших небажаних інгредієнтів, які ще містяться в розчині, таких, як нелізовані клітини, клітинні уламки, будь-який осад або інші нерозчинні інгредієнти. Додатковий переносник кисню може бути додатково очищений щонайменше частковим відокремленням небажаних розчинних сполук, подібно до, наприклад, розчинних макромолекул або розчинних сполук, що мають низьку молекулярну масу. Відповідно, указана стадія (е) може включати декілька поодиноких стадій, таких, як фільтрація, ультрафільтрація, центрифугування, ультрацентрифугування, хроматографія, діаліз із використанням різних типів діалізних мембран, які забезпечують різні межі виключення за розміром, стадії промивання, концентрації вмісту переносника кисню тощо. Будь-який із вказаних вище способів може бути включений у цю стадію очищення. Переважно щонайменше одна стадія центрифугування і/або щонайменше одна стадія фільтрації включена в стадію (е). Наприклад, лізат може бути прокручений у центрифузі для відокремлення клітин, що залишилися, й клітинних уламків або профільтрований, наприклад, каскадом фільтрів, як описано вище. Лізат також може бути спочатку центрифугований і потім профільтрований, або він може бути профільтрований на першій стадії через глибокошаровий фільтр і потім щонайменше через один фільтр або каскад фільтрів. Шляхом центрифугування або фільтрування через глибокошаровий фільтр полегшується маніпулювання під час будь-яких наступних стадій фільтрації внаслідок меншого осідання матеріалу на фільтрах і запобігання їх закупорці. Якщо використовується не каскад фільтрів, то переважно використати щонайменше один фільтр, що забезпечує можливість затримки по суті всіх твердих матеріалів, які містяться в 8 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 суспензії, і що дозволяє проходити всім розчиненим компонентам. У переважному варіанті здійснення щонайменше один із використовуваних фільтрів здатний затримувати також мікроорганізми, діючи як стерилізуючий фільтр. Додатково можна здійснювати переважну стадію ультрафільтрації і/або стадію зменшення вмісту вірусів і/або мікроорганізмів у розчині. Відповідно, переважно, щоб після стадії (е) розчин, що містить переносник кисню, по суті не містив яких-небудь нерозчинених частинок, згустків або осаду. На стадії (е) у доповнення до будь-якої зі вказаних вище стадій/способів розчин, що містить переносник кисню, може бути промитий і/або концентрований. Під "промиванням" мається на увазі, що молекули, менші, ніж бажаний переносник кисню (що має нищу молекулярну масу), відокремлюють переважно додаванням такої самої або у багато разів більшої (наприклад, у 510 разів) кількості ізотонічного розчину в розчин, що містить переносник кисню, й потім фільтрують отриманий (розведений) розчин через фільтр, що затримує переносник кисню й забезпечує можливість проходження дрібніших молекул. Для промивного розчину переважно використовують 0,9 % розчин NaCl. Стадію промивання можна повторювати 2 або 3, або 4, або 5, або до 10 разів. Переважний варіант здійснення проілюстрований використанням фільтра, який має межу виключення за розміром 5000 Дальтон, 10000 Дальтон або 20000 Дальтон, що забезпечує можливість проходження дрібніших молекул. На даній стадії розчин, що містить переносник кисню (переважно, після промивання), може бути концентрований до бажаної концентрації переносника кисню, наприклад, до концентрації 50 г/л, 100 г/л або 200 г/л, але без обмеження цими кількостями. Будь-яка бажана концентрація може бути отримана або концентруванням за допомогою фільтрації, або додаванням 0,9 % NaCl або подібного ізотонічного розчину. Отриманий таким чином розчин, що містить переносник кисню, може бути використаний для отримання композиції за даним винаходом додаванням щонайменше одного додаткового інгредієнта, описаного вище, до розчину в бажаній кількості. У переважному варіанті здійснення композицію за даним винаходом отримують додаванням до розчину, що містить переносник кисню, щонайменше консерванту, переважно фармацевтично прийнятного консерванту, такого, як, наприклад, феноксіетанол, парабени, бензоат натрію, бензиловий спирт, гексахлорофен, і антиоксиданту і/або стабілізатора, такого, як, наприклад, N-ацетилцистеїн, октаноат натрію, N-ацетил-l-триптофанат, N-ацетилметіонінат, вітамін Е, вітамін С, метилпреднізолон або маніт. Додатково можна додавати будь-який із додаткових інгредієнтів, описаних вище. За бажанням готова композиція може бути знову стерилізована, наприклад, нагріванням, фільтрацією, центрифугуванням, додаванням консервантів, застосуванням пари, застосуванням газу або застосуванням УФ-світла або комбінацією щонайменше двох із них, переважно додатковою стадією стерильної фільтрації, і переважно нею наповнюють стерильні контейнери або стерильні мішки для зберігання. Згідно з переважним варіантом здійснення стерильні мішки вміщують у аерозольний контейнер для подальшого застосування. Одним прикладом може бути пристрій "мішок із клапаном", що включає мішок, наприклад, ламінований алюмінієвий мішок або жерстяний аерозольний контейнер. У зв'язку з розділенням продукту й пропеленту можна використовувати мішок із клапаном зі стиснутим повітрям при тиску, наприклад, від 2 до 9 бар. Згідно з винаходом композицію переважно використовують для обробки відкритих ран, переважно хронічних ран людей і тварин, причому переважне використання для лікування людей. Переважне використання здійснюють місцевою обробкою ран описаними завантаженими переносниками кисню носіями. На диво, було виявлено, що можна ефективно лікувати відкриті рани вказаними завантаженими переносниками кисню. Як описано вище, загоювання хронічних ран часто уповільнюється внаслідок зменшеної доставки кисню. Тому є логічним, що лікування ран вимагає завантажених киснем переносників кисню для обробки. Однак згідно з даним винаходом, було виявлено, що можливо отримання позитивного загоювання зовнішніх ран нанесенням переносника кисню, завантаженого CO або NO. Без зв'язку з теорією, це викликане тим, що завдяки парціальному тиску кисню в повітрі ліганд може замінюватися киснем нанесенням на рану й внаслідок цього підтримується загоювання ран. Композиція за даним винаходом має явну перевагу підвищеної стабільності переносника кисню в зв'язку з його неокисленим станом на основі завантаження лігандом CO або NO, що покращує отримання й стабільність при зберіганні. Окрім того, композицію легко наносити й маніпулювати нею, і вона забезпечує безпечний і ефективний підхід до підвищеного загоювання ран полегшеною дифузією, опосередкованою переносником кисню. 9 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Композицію за даним винаходом наносять зовнішньо. Залежно від стану рани її наносять переважно розпиленням на ділянку рани як дрібно розпилений аерозоль. Згідно з винаходом було показано, що можна лікувати відкриті рани, зокрема також хронічні рани, які мають найрізноманітніші причини. Це можуть бути рани після операцій, після травми, після пошкоджень, рани, що погано загоюються або гіпоксичні рани, або також рани, спричинені дегенеративними змінами в тканині. У зв'язку з цим вони можуть являти собою рани, спричинені дегенеративними змінами артеріальних кровоносних судин, і рани, що виникли внаслідок хронічної венозної недостатності. Вони, зокрема, включають пролежні, а також хронічні рани, зокрема рани, що розвинулися внаслідок цукрового діабету. Окрім того, можна ефективно лікувати рани, спричинені опіками (або термічним впливом, хімічними речовинами або обмороженням) або киплячою рідиною або парою. Фігури На фіг. 1 показана крива насичення O2 гемоглобіну, залежного від навколишнього парціального тиску O2. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Гемоглобін виділяли з цільної крові свиней відокремленням еритроцитів від сироватки, лізисом зібраних еритроцитів, осадженням клітинних уламків, завантаженням гемоглобіну CO уведенням газу CO до насичення рідкого зразка, нагріванням розчину, здійсненням декількох стадій фільтрації, включаючи стадію фільтрації вірусів, і промиванням отриманого розчину гемоглобіну додаванням двічі двократного об'єму 0,9 % сольового розчину й фільтрацією розчину. Отримували готову до застосування композицію для обробки ран, яка містить 10 % очищеного й стабілізованого гемоглобіну, 0,05 % N-ацетилцистеїну й 0,7 % феноксіетанолу в 0,9 % NaCl. Композицію знову завантажували газом CO, розділяли на 10 порцій і упаковували в аерозольний балончик, відповідно. Приклад 2 Першу порцію композиції прикладу 1 використали відразу після отримання для лікування пацієнтки (діагноз: цукровий діабет, гіпертонічна хвороба) із хронічною раною правої стопи (72 см). Рану обробляли один раз на день розпиленням композиції на поверхню рани. Після 3 тижнів обробки спостерігалися перші ознаки загоювання. У наступні тижні процес загоювання був виражений, і повне закриття рани було отримано після 18 тижнів лікування. Приклад 3 Другу порцію композиції прикладу 1 зберігали при 4C протягом 2 років після отримання й потім використали для лікування хронічної рани у чоловіка, хворого на цукровий діабет II типу. Композицію наносили на хронічну поверхневу виразку (43 см) на лівій гомілці пацієнта в ділянці великогомілкової кістки. Рану обробляли один раз на день. Після двох тижнів лікування з'являлися ознаки загоювання, після 4 тижнів рана загоїлася більше, ніж на 50 % порівняно з початковим станом. На наступних тижнях спостерігали швидке загоювання, і повне загоювання рани було досягнуте після 8 тижнів лікування. Приклад 4 Третю частину композиції прикладу 1 зберігали при 10C протягом 2 років. Потім її використали для лікування хронічної поверхневої виразки (42 см) на правій нижній кінцівці чоловіка, хворого на цукровий діабет II типу. Рану обробляли один раз на день. Після 2,5 тижнів обробки спостерігалися ознаки загоювання. На наступному тижні спостерігали швидке загоювання, і повне закриття рани було отримане після 12 тижнів лікування. Приклад 5 Частину композиції прикладу 1 використали для лікування чоловіка, який отримав опік киплячою водою й парою. У нього були діагностовані опіки обличчя 1-го і 2-го ступенів. Первинне лікування прохолодним гелем і неоспорином протягом одного тижня не виявило поліпшення, і лікуючий лікар запропонував накладення на ніс і інші частини обличчя, такі, як очні повіки, шкірних трансплантатів. Замість цього пацієнта лікували композицією прикладу 1 протягом 7 тижнів. Композицію наносили на шкіру розпиленням три або чотири рази на день. Спостерігали швидке поліпшення й загоювання шкіри, і пацієнта виписали зі стаціонару після семи тижнів лікування. Трансплантати шкіри не знадобилися. Приклад 6 Порівняння завантаженого/незавантаженого гемоглобіну A) Аерозоль завантаженого гемоглобіну отримували згідно з прикладом 1 10 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Отримували готову до застосування композицію для лікування ран, яка містить 10 % очищеного й стабілізованого гемоглобіну, 0,05 % N-ацетилцистеїну й 0,7 % феноксиетанолу в 0,9 % NaCl. Композицію знову завантажували газом CO, розділяли на 20 порцій і упаковували в аерозольний балончик відповідно. Композицію можна було зберігати при температурі від 4C до кімнатної температури протягом періоду від декількох місяців до декількох років. B) Другу порцію свинячої цільної крові обробляли як у прикладі 1, за винятком того, що не проводили завантаження CO. Під час стадії нагрівання відбувалося осідання значної кількості гемоглобіну. Наступні стадії фільтрації здійснювати було важко. Вихід очищеного гемоглобіну на літр цільної крові зменшився до рівня менше, ніж 30 % виходу, коли перед нагріванням здійснювали завантаження CO. Це показує, що завантаження зразків CO під час отримання стабілізує гемоглобін таким чином, що під час стадії нагрівання осідає значно менше гемоглобіну. Отримували готову до застосування композицію для лікування ран, яка містить 10 % очищеного гемоглобіну, 0,05 % N-ацетилцистеїну й 0,7 % феноксиетанолу в 0,9 % NaCl. Композицію розділяли на порції й упаковували в аерозольні балончики відповідно. C) Додаткову порцію гемоглобіну виділяли з цільної крові свиней способом, описаним у прикладі 1 WO2003/077941, без завантаження гемоглобіну під час отримання: гемоглобін звільняли від плазми й компонентів клітинних мембран без нагрівання за допомогою центрифугування й ультрафільтрації, й очищували. Отримували готову до застосування композицію для лікування ран, яка містить 10 % очищеного гемоглобіну, 0,05 % N-ацетилцистеїну й 0,7 % феноксіетанолу в 0,9 % NaCl. Композицію розділяли на порції й упаковували в аерозольні балончики відповідно. Отриманий таким чином свіжий аерозоль незавантаженого гемоглобіну отримували протягом періоду лікування з необхідною частотою (всі три дні) і зберігали при 4C максимум протягом одного дня перед застосуванням. Лікування пацієнтів: Декількох пацієнтів-чоловіків (у віці від 65 до 75 років) із діабетичною виразкою стоп лікували протягом трьох місяців аерозолем гемоглобіну відповідно до А) (що зберігався при 10C протягом періоду до 6 місяців) або свіжоприготованим аерозолем гемоглобіну відповідно до С) (зберігання при 4C протягом максимум 3 днів, тобто всі три дні використовували свіжу композицію) до отримання повного загоювання ран у всіх пацієнтів. За спостереженнями лікуючих дерматологів, загоювання ран, отримане під час застосовування композицій відповідно до А), відбувалося з меншою секрецією, меншим утворенням струпа і/або меншим нагноєнням, порівняно з ранами, обробленими аерозолем гемоглобіну відповідно до С), і, зокрема, порівняно з ранами, які лікували звичайними способами. У зв'язку з незначними проблемами при лікуванні ран композицією завантаженого гемоглобіну відповідно до А), спостерігали 2 швидше загоювання на см поверхні рани, ніж ран, оброблених аерозолем незавантаженого гемоглобіну за С), і набагато швидше загоювання, ніж ран, оброблених звичайним способом. Окрім того, пацієнти, що отримували лікування композицією А), помічали менший дискомфорт. Приклад 7 Зразки композицій, отриманих за прикладом 6A), прикладом 6B) або прикладом 6C), досліджували відносно завантаження зразків O2, а також продукції метгемоглобіну, виду, який нездатний зв'язувати O2. Окрім того, метгемоглобін впливає на молекули гемоглобіну в безпосередній близькості таким чином, що вони ще можуть зв'язувати O 2, але більше не можуть вивільняти його. Усі зразки, подані в таблиці 1, розводили 1:1 0,9 % розчином NaCl для імітації умов обробки рани. Зразки 7.1-7.8 вимірювали безпосередньо після розбавлення (перед розведенням зразки 7.5-7.8 зберігали при кімнатній температурі). Обробку газом проводили таким способом: 6 мл кожного з указаних розведених розчинів переносили в скляну колбу місткістю 30 мл. Обробку газом проводили повним заповненням скляної колби відповідним газом, закривали колбу й змішували зразок обертанням протягом 30 сек. Усі зразки зберігали протягом указаного періоду часу при 30C. Зразки обробляли згідно з умовами, описаними в таблиці 1, і вимірювали загальну кількість гемоглобіну (гемоглобін+метгемоглобін), вміст кисню, вміст метгемоглобіну й, необов'язково, вміст CO. 11 UA 113290 C2 Таблиця 1 Приклад 7.1 7.2 7.3 7.4 Зразок Свіжоприготована композиція відповідно до прикладу 6А) Свіжоприготована композиція відповідно до прикладу 6В) Свіжоприготована композиція відповідно до прикладу 6С) Композиція прикладу 6A, що зберігалася протягом 3 місяців (10C) 7.5 7.6 Композиція прикладу 7.2 7.7 Композиція прикладу 7.3 7.8 Композиція прикладу 7.3 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 7.14 7.15 7.16 7.17 7.18 7.19 7.20 7.21 7.22 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 Композиція прикладу 7.4 7.23 Композиція прикладу 7.4 7.24 Композиція прикладу 7.4 7.25 Композиція прикладу 7.4 7.26 Композиція прикладу 7.4 7.27 Композиція прикладу 7.4 7.28 Композиція прикладу 7.4 7.29 5 Композиція прикладу 7.2 Композиція прикладу 7.4 Обробка Загальний Hb г/дл О2 % СО % MetHb % Немає 5,5 1,7 96,3 3,9 Немає 5,7 26,8 5,1 Немає 5,6 27,0 4,7 Немає 5,9 1,8 5,6 26,9 11,2 5,5 27,0 17,0 5,7 26,5 10,5 5,6 26,7 16,2 5,8 5,7 5,8 5,9 5,7 5,8 5,7 5,8 5,7 5,9 5,7 5,6 5,8 5,7 13,7 19,6 25,7 30,7 33,5 32,5 31,7 4,0 6,0 9,2 9,6 4,9 8,2 9,4 84,7 79,1 73,1 68,1 59,6 55,9 55,8 91,8 90,0 86,7 85,1 77,5 68,2 65,9 4,4 4,2 4,3 4,2 9,8 15,5 16,0 5,7 5,7 5,8 6,9 19,7 27,4 28,3 5,8 9,2 89,0 4,5 5,7 12,4 85,9 4,4 5,9 18,0 80,5 4,3 5,6 20,7 77,9 4,3 5,8 24,3 69,3 9,1 5,7 25,4 64,3 13,9 5,7 26,8 62,2 14,3 Зберігання протягом 24 годин Зберігання протягом 48 годин Зберігання протягом 24 годин Зберігання протягом 48 годин 0,5 год. О2 1 год. О2 2 год. О2 3 год. О2 24 год. О2 48 год. О2 72 год. О2 0,5 год. О2 1 год. СО2 2 год. СО2 3 год. СО2 24 год. СО2 48 год. СО2 72 год. СО2 0,5 год. повітрям 1 год. повітрям 2 год. повітрям 3 год. повітрям 24 год. повітрям 48 год. повітрям 72 год. повітрям 96,5 3,8 Як видно з результатів, наданих у таблиці 1, композиції за винаходом, де переносник кисню завантажений CO, не тільки можуть зберігатися протягом тривалого часу без утворення метгемоглобіну, але, окрім того, здатні замінити зв'язаний CO O2, коли він наданий завантаженому переноснику кисню. Під час впливу 100 % O2 (приклади 7.9-7.15), насичення гемоглобіну O2 збільшується дуже швидко. 12 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо композиція піддається впливу CO2, що показує ситуацію всередині тканини ссавця з активними шляхами обміну, то утворюється збільшена кількість метгемоглобіну (приклади 7.167.22). Парціальний тиск O2 у повітрі становить тільки приблизно 21 %, таким чином, відповідно до кривої насичення гемоглобіну O2, показаної на фіг. 1, максимальне можливе насичення гемоглобіну киснем (O2) у повітряній атмосфері становить приблизно 29 %. Під час розгляду прикладів 7.23-7.29 можна стверджувати, що дивовижний результат полягає в тому, що в межах 3 годин композиція, піддана впливу повітря, завантажується 20,7 % кисню, але все ж має дуже низький вміст метгемоглобіну. Під час лікування зовнішніх ран композицію розпилюють на (очищену) поверхню рани і залишають контактувати з повітрям. Ці результати показують, що композиція згідно з винаходом містить стабілізований переносник кисню, який після декількох місяців зберігання забезпечує високий транспорт кисню, коли він контактує з повітрям. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Композиція для зовнішньої обробки ран, яка містить: (a) переносник кисню, вибраний із гемоглобіну і міоглобіну, де щонайменше у 40 % вказаного переносника кисню ділянка зв'язування кисню завантажена монооксидом вуглецю, і (b) щонайменше один додатковий інгредієнт, вибраний з електроліту(ів), консерванту(ів), стабілізатора(ів), антифлокулянта(ів), антикоагулянта(ів), буферуючого(их) рН-агента(ів), розчинника(ів), антиоксиданта(ів), агента(ів), який (які) утворює(ють) плівку, і поперечнозшивального(их) агента(ів). 2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що композиція являє собою водний або органічний розчин. 3. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що щонайменше 50 %, переважно щонайменше 60 %, переважніше щонайменше 70 %, ще переважніше щонайменше 80 %, зокрема, переважно щонайменше 90 % переносника кисню представлено в завантаженій монооксидом вуглецю. 4. Композиція за будь-яким із пп. 1-3, яка відрізняється тим, що переносник кисню вибраний з гемоглобіну або міоглобіну людського або тваринного походження, що зустрічається в природі, або являє собою штучно оброблений, поперечнозшитий або модифікований гемоглобін або міоглобін людського або тваринного походження. 5. Композиція за будь-яким із пп. 1-4, представлена в стерилізованій формі. 6. Композиція за будь-яким із пп. 1-5, представлена в аерозольному резервуарі, переважно в аерозольному балончику, який знаходиться під надмірним тиском. 7. Композиція за будь-яким із пп. 1-6, яка відрізняється тим, що рани, які підлягають лікуванню, являють собою хронічні рани, операційні рани, рани внаслідок пошкоджень, рани після травми, відкриті рани, хронічні рани, рани з незадовільним загоєнням або гіпоксичні рани, рани, спричинені дегенеративними змінами або стенозом артеріальних кровоносних судин, рани, які виникли в результаті діабетичного захворювання, рани, які виникли внаслідок хронічної венозної недостатності, або пов'язані з пролежнями виразкові рани, або опікові рани, спричинені термічним впливом, хімічними речовинами або обмороженням, або киплячою рідиною, або парою. 8. Застосування композиції за будь-яким із пп. 1-7 для зовнішньої обробки ран. 9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що рани, які підлягають лікуванню, являють собою хронічні рани, операційні рани, рани внаслідок пошкоджень, рани після травми, відкриті рани, хронічні рани, рани з незадовільним загоєнням або гіпоксичні рани, рани, спричинені дегенеративними змінами або стенозом артеріальних кровоносних судин, рани, які виникли в результаті діабетичного захворювання, рани, що виникли внаслідок хронічної венозної недостатності, або пов'язані з пролежнями виразкові рани, або опікові рани, спричинені термічним впливом, хімічними речовинами або обмороженням, або киплячою рідиною, або парою. 10. Спосіб отримання композиції за будь-яким із пп. 1-7, де (і) переносник кисню завантажують моно оксидом вуглецю під час або після виділення з його природного середовища, (іі) додають щонайменше один додатковий інгредієнт (b), (ііі) композицію необов'язково стерилізують і (iv) композицію упаковують, переважно в аерозольний балончик. 11. Спосіб за п. 10, де композицію стерилізують на стадії (ііі) нагріванням, фільтрацією, центрифугуванням, додаванням консервантів, застосуванням пари, застосуванням газу або застосуванням УФ-опромінення, або комбінацією щонайменше двох із них. 13 UA 113290 C2 5 10 15 20 25 30 12. Застосування гемоглобіну або міоглобіну, завантаженого на його ділянку зв'язування кисню монооксидом вуглецю, для отримання засобу або композиції для зовнішньої обробки ран. 13. Застосування за п. 12, яке відрізняється тим, що рани, які підлягають лікуванню, являють собою хронічні рани, операційні рани, рани внаслідок пошкоджень, рани після травми, відкриті рани, хронічні рани, рани з незадовільним загоєнням або гіпоксичні рани, рани, спричинені дегенеративними змінами або стенозом артеріальних кровоносних судин, рани, які виникли в результаті діабетичного захворювання, рани, які виникли внаслідок хронічної венозної недостатності, або пов'язані з пролежнями виразкові рани, або опікові рани, спричинені термічним впливом, хімічними речовинами або обмороженням, або киплячою рідиною, або парою. 14. Застосування переносника кисню, вибраного з гемоглобіну і міоглобіну, завантаженого на його ділянку зв'язування кисню монооксидом вуглецю, в способі зовнішньої обробки ран. 15. Застосування за п. 14, яке відрізняється тим, що рани, які підлягають лікуванню, являють собою хронічні рани, операційні рани, рани внаслідок пошкоджень, рани після травми, відкриті рани, хронічні рани, рани з незадовільним загоєнням або гіпоксичні рани, рани, спричинені дегенеративними змінами або стенозом артеріальних кровоносних судин, рани, які виникли в результаті діабетичного захворювання, рани, які виникли внаслідок хронічної венозної недостатності, або пов'язані з пролежнями виразкові рани, або опікові рани, спричинені термічним впливом, хімічними речовинами або обмороженням, або киплячою рідиною, або парою. 16. Спосіб очищення переносника кисню, вибраного з гемоглобіну і міоглобіну з цільної крові, для приготування композиції за пп. 1-7, що включає стадії: a) відділення плазми цільної крові, b) лізису еритроцитів, с) завантаження переносника кисню моно оксидом вуглецю, d) нагрівання зразка до температури в діапазоні від 40 до 85 °C, e) відділення переносника кисню від будь-яких небажаних компонентів крові, де стадія (e) включає щонайменше одну стадію фільтрації. 17. Спосіб за п. 16, де фільтрація на стадії (e) включає застосування стерильного фільтра і/або вірусного фільтра. 14 UA 113290 C2 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 15