Спосіб лікування ветеринарних захворювань

1 Спосіб лікування ветеринарних захворювань у тварин, включаючи вторинні інфекції, викликані зростанням ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, причому вказане ветеринарне захворювання пов'язане з інфекцією, викликаною бактерією, вибраною з групи, яка включає Serpulma pilosicoh, Lawsoma mtracellulans, Pasteurella multocida, Pasterella haemolytica та їх суміші, який відрізняється тим, що вказаний спосіб включає введення тварині терапевтично ефективної КІЛЬКОСТІ сполуки формули І сн. н 3 с" (І) у формі вільної основи або ветеринарно прийнятної солі 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І вводять свиням, які потребують такого лікування 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І вводять разом з принаймні одним ветеринарно прийнятним носієм чи розчинником 4 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І у формі вільної основи або у ветеринарно прийнятній формі вводять свиням для лікування свиного коліту, пов'язаного з інфекцією Serpulma pilosicoh 5 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І у формі вільної основи або у ветеринарно прийнятній формі вводять свиням для лікування ілеїту, пов'язаного з інфекцією Lawsoma mtracellulans 6 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І у формі вільної основи або у ветеринарно прийнятній формі вводять свиням для лікування ветеринарного захворювання, пов'язаного з інфекцією Pasteurella multocida 7 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І у формі вільної основи або у ветеринарно прийнятній формі вводять ягнятам, вівцям або великій рогатій худобі для лікування пневмонії, пов'язаною з інфекцією Pasterella haemolytica 8 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що сполуку формули І вводять у формі солі, утвореної додаванням соляної кислоти 9 Спосіб одержання лікарського засобу для ліку О CO (О Ю 56173 вання ветеринарних захворювань у тварин, включаючи вторинні інфекції, викликані зростанням ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, причому вказане ветеринарне захворювання пов'язане з інфекцією, викликаною бактерією, вибраною з групи, яка включає Serpulma pilosicoh, Lawsoma mtracellulans, Pasteurella multocida, Pasterella haemolytica та їх суміші, який відрізняється тим, що вказаний спосіб включає сполучення терапевтично ефективної КІЛЬКОСТІ сполуки формули І сн, (І), у формі вільної основи або у ветеринарно прийнятній формі з принаймні одним ветеринарно прийнятним носієм або розчинником 10 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що захворюванням є свиний коліт 11 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що захворюванням є ілеїт у свиней Даний винахід стосується до похідних плевромулліну Він стосується способу використання у ветеринарії сполуки формули І сн о а саме, 14-О-[1-[(Р)-2-аміно-3-метилбутириламшо]2-метилпропан-2-ілтюацетил]мутіліну в формі вільної основи або придатної для ветеринарії солі, в терапії ветеринарних захворювань, прояв яких посилюється при зростанні ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, який тут і надалі називають "використання винаходу" Сполуку формули І у формі вільної основи або придатної у ветеринарії солі (Есопог®) тут і надалі коротко називають "сполукою винаходу" Вона переважно знаходиться у формі солі, головним чином, пдрохлориду У цій формі вона відома під родовою назвою пдрохлорид вальнемуліну Під терміном "терапія" слід розуміти використання як з профілактичною, так і лікувальною метою Сполука формули і у формі вільної основи або у формі хемотерапевтичної чи придатної у ветеринари солі відома, наприклад, з Європейського, Патенту 153 277 та його аналогів, наприклад, патенту США 4 675 330, особливо приклад 12 З цих патентів відомо, що цій сполуці прита манна - шпбіторна активність по відношенню до різноманітних бактерій в концентраціях приблизно від 0,008 до 25мкг/мл, - шпбіторна активність in vitro по відношенню до всіх мікоплазм та хламідій в концентраціях приблизно від 0,008 до 0,5мкг/мл, - шпбіторна активність in vivo у мишей при використанні різноманітних бактеріальних штамів, та у курей при використанні штамів мікоплазм в концентраціях приблизно від 12 до 50мг/кг ваги тіла, - антипаразитарна активність, особливо m vivo, проти кокцидій у домашньої птиці в концентраціях 20 - 150мг/кг їжі, та - стимулююча ріст активність у курей та свиней in vivo в дозах 10 - 50мг/кг корму, що, таким чином, робить дану сполуку корисною як активний бактеріальний антибіотик взагалі та, як ветеринарний засіб, особливо для хемотерапевтичного лікування КОКЦИДІОЗІВ у домашньої птиці, а також як стимулятора росту курей та свиней Несподівано було виявлено, що сполука винаходу є особливо ефективною при терапії ветеринарних захворювань, прояв яких посилюється при зростанні ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, таких як ензоотична пневмонія свиней, що викликана інфекцією Mycoplasma hyopneumomae, дизентерія свиней, що викликана інфекцією Serpulma (раніше Treponema) hyodysentenae, коліт свиней (запалення ободової кішки), пов'язаний з інфекцією Serpulma pilosicoh, ілеїт свиней (свинна проліферативна ентеропатія, кишковий аденоматоз свиней), пов'язаний з інфікуванням Lawsoma mtracellulans, хронічне респіраторне захворювання та артрит домашньої птиці, пов'язані з інфікуванням Mycoplasma galhsepticum, вторинна пневмонія у свиней, пов'язана з інфікуванням Pasteureha multocida, Actmobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae та/або Haemophilus parasuis, пневмонія ягнят, овець та корів (овеча лихоманка, транзитна лихоманка, телячий респіраторний комплекс, бичачий ревматоїдний пастерельоз), пов'язані з інфі 56173 куванням Pasteureha haemolytica, та поліартрит у свиней, пов'язаний з інфікуванням Mycoplasma hyosynoviae Надалі, несподівано було виявлено, що індукція резистентності до цих ЛІКІВ дуже мала Таким чином, даний винахід стосується використання у ветеринари, як це означено вище Він також стосується використання сполуки винаходу для виробництва медикаментів для використання при терапії ветеринарних захворювань, прояв яких посилюється при зростанні ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби Він надалі стосується способу лікування ветеринарних захворювань, прояв яких посилюється при зростанні ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, який включає уведення терапевтичне ефективної КІЛЬКОСТІ сполуки винаходу тварині, яка потребує лікування Він надалі торкається ветеринарної сполуки для використання в терапії ветеринарних захворювань, прояв яких посилюється при зростанні ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, включаючи сполуку формули І у формі вільної основи або у формі прийнятної для ветеринарії солі разом з, принаймні, одним придатним для ветеринарії носієм або розчинником Він надалі стосується способу одержання медикаментів для використання, описаного вище, яке включає змішування сполуки винаходу з, принаймні, одним придатним для ветеринарії носієм або розчинником Тварину, що страждає на ветеринарні захворювання, прояв яких посилюється при зростанні ЩІЛЬНОСТІ популяції худоби, можливо, наприклад, ще не лікували антибактеріальне сполукою винаходу або їй ще не уводили сполуку винаходу для стимуляції росту А) інфекція Mycoplasma hyopneumoniae Інфекцію Mycoplasma hyopneumoniae можна діагностувати традиційним способом, як, наприклад, описано у ветеринарних довідниках, наприклад, Taylor D J , в Pig diseases, 6 th Ed (1995), Publ DJ Taylor, Glasgow, U К на crop 164 - 165 Цілющу активність агенту винаходу досліджують, наприклад, як описано нижче 1 Активність in vitro В дослід включали десять польових ІЗОЛЯТІВ ІЗ спалахів ензоотичної пневмонії в різних стадах та типовий штам "J" Проби тонували на фільтрі, ідентифікували дисковим тестом інгібування росту та використовували з 7-го по 1О-ий переноси Тест по визначенню мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) проводили в рідкому середовищі (Fms, N F et al , Acta Vet Scand 32 [1991] 425 - 429) в пробірках 1,8мл, які містили 2-кратну концентрацію вальнемуліну та пдрофумарату тіамуліну Мікоплазму інокулювали у 10-кратних розведеннях, та проглядали культури візуально на ріст, використовуючи пробірки з 102 - 104 одиницями утворення забарвлення Початкову реєстрацію аналізу робили через 2 - 4 дні, а кінцеву - через 10 - 14 днів, коли вже не відбувалась зміна кольору МІК визначали як найнижчу концентрацію тестової сполуки, яка показувала інгібування росту порівняно з контролем (Fms, N F and Szancer J , Acta Vet Scand 35 [1994] 389-394) Результати наведені в Таблиці 1 Таблиця 1 МІК (мкг/мл) Номер Вальнемулін (гх) Тіамулін (гф) штаму Початковий Кінцевий Початковий Кінцевий 1 0,0010 0,0025 0,025 0,050 1 0,0010 0,0025 0,025 0,100 3 0,0010 0,0025 0,050 0,100 5* 0,0025 0,0025 0,050 0,100 1 0,0025 0,0025 0,100 0,100 * - включаючи типовий штам, гх - пдрохлорид, гф пдрофумарат Всі штами М Hyopneumoniae, що досліджувались, є високочутливими до дії вальнемуліну з величинами МІК в 10 - 40 разів меншими, ніж для тіамуліну, як при початкових, так і при кінцевих визначеннях, що робить цю сполуку особливо цікавою для використання при лікуванні КЛІНІЧНИХ випадків інфікованих стад 2 Активність in vitro Проби тканин брали з легенів свиней з різних стад, уражених ензоотичною пневмонією свиней (ЕРР) Проби транспортували в сухому льоді для культивування М hyopneumoniae виділяли із свіжо-отриманої тканини легенів шляхом нанесення культури на агар для визначення мікоплазм (Mycoplasma Experience agar) Ця методика дозволяє розпізнати та швидко ВІДДІЛИТИ ВІД такої мікоплазми, як Mycoplasma hyorhims, часто присутньої в пробах ЕРР легенів, яка росте більш швидко, характерні колонії М hyopneumoniae шляхом тонування Виділені мікроорганізми субтонували та ідентифікували по дисковому інгібуванню росту, використовуючи специфічну антисироватку кролів, одержану до М hyopneumoniae NCTC 10110 Культури для обробки антибіотиками готували в бульйоні Mycoplasma Experience, шкубували аеробно при 36°С Для виділення М hyopneumoniae з тканини легенів використовували доступне на ринку тверде середовище Mycoplasma Experience Ltd Для ДОСЛІДІВ по МІК використовували рідке середовище (Mycoplasma Experience Ltd ), що містило феноловий червоний та глюкозу (рН 7,6) ВИХІДНІ розчини сполук, що вивчали, готували в концентрації 1 мг/мл в деюнізованій воді, стерилізованій фільтрацією через мембранний фільтр з розміром пор 0,2мкм (Sartonus Minisart, N), та зберігали при -20°С Для використання в дослідах МІК ВИХІДНІ розчини розводили в рідкому середовищі до подвійної кінцевої концентрації Досліди МІК проводили згідно зі способом Tanner & Wu, Avian Diseases 36 (1992) 714-717 ДОСЛІДНІ культури, що активно ростуть, готували або з аліквот по 1мл культурального бульйону, який зберігають при 70°С, або з культур, що зберігаються в агарі при 70°С Культури для ДОСЛІДІВ розводили до одержання кінцевого титру 103 - 10 змінюючих забарвлення одиниць/мл Аліквоти шокуляту по 0,1 мл для досліду змішували з аліквотами розведеного антибіотика по 0,1 мл в лунках для мікротитрацм Кожен планшет для мікротитрацм містив неінфіковане середовище при рН 6,8 (М hyopneumoniae) (контроль кінцевої точки) та інокульовані контролі 56173 8 вали в концентрації 1000мкг/мл в деюнізованій воді Після перемішування розчини стерилізували фільтрацією через мембранний фільтр з розміром пор 0,2мкм (Sartonus Minisart, N) Для використання в дослідах по МІК ВИХІДНІ розчини розводили в бульйоні для мікоплазми до подвійної кінцевої концентрації При вивченні звикання ВИХІДНІ розчини розподіляли по 1мл аліквотах та заморожували при -20°С їх розморожували та використовували з інтервалом 5 - 7 днів для створення границь концентрацій препарату (в двох серіях) в Таблиця 2 MEGB, в 1,9мкл аліквотах, що охоплюють МІК проти обох ЛІНІЙ М hyopneumoniae Окситетрацикліну Чутливість 10 польових ІЗОЛЯТІВ hyopneumoniae пдрохлорид готували свіжим кожного разу Границі in vitro розведення поступово змінювались від пасивування до пасивування, роблячи поправку на розвиток Типовий антибіотик МІК (мкг/мл) резистентності мікоплазм штам J Процедура тестування польові штами (п=10) Тести МІК проводили способом Tanner & Wu, (NCTC 50% 90% діапазон Avian Diseases 36 (1992) 714 - 717 до проведення 10110) тесту по звиканню (нижче) та після 10-го пасиву0,0025 вальнемулін 0,0005 0,001 0,0025 вання 0,1мл аліквоти розведеної сполуки змішува0,001 ли з 0,1мл аліквотами дослідного шокуляту, що тіамулін 0,025 0,05 0,01 -0,05 0,01 містив між 103 та 105 змінюючих забарвлення оди0,0025 енрофлоксацін 0,025 0,01 0,025 ниць (ззо) в мл, в лунках для мікротитрацм Кожний 0,025 планшет для мікротитрацм містив нешокульоване середовище, середовище при рН 6,8 (контроль Було знайдено, що всі штами чутливі до валькінцевої точки) та контроль дослідного шокуляту немуліну БІЛЬШІСТЬ ІЗ штамів показали дуже висобез сполуки Всі планшети вкривали плівкою та ку чутливість до енрофлоксаціну, але що стосушкубували аеробно при 36°С МІК визначали тоді, ється окремих штамів, МІК вальнемуліну була коли зміна кольору в контрольних лунках досягала принаймні у 5 разів нижчою, навіть з штамами, значення контролю при рН 6,8 (оранжево-жовтий) чутливими до 0,0025мкг/мл енрофлоксаціну Ці МІК дорівнювала самій низькій концентрації, яка результати підтверджують, що польові ізоляти є не давала зміни кольору надзвичайно чутливими до вальнемуліну Вивчення звикання В ДОСЛІДІ З первинним паЗ Розвиток резистентності сивуванням 1,9 мл розчину антибіотиків в конценКонтрольний штам Mycoplasma hyopneumoтраціях, охоплюючих МІК штаму М hyopneumoniae niae NCTC 10110 (одержаний з Національної колев тесті, шкубували з 0,1 мл бульйонної культури, кції культур, Лондон, UK) та польовий ізолят що містила між 103 до 105ззо/мл Контроль росту, (MEVT G23) вирощували аеробно при 36°С в бущо складався з бульйону без сполуки, шокульвальйоні з глюкозою для мікоплазми, що містив феного М hyopneumoniae, та контроль з середовиноловий червоний, до тих пір, поки внаслідок закищем без шокуляту, включали в кожний експерислення не змінювався колір Після додавання стемент по пасивуванню Після 7 днів інкубації (36°С) рильного гліцерину (5% об/об) культури розділяли дві найвищі концентрації бульйону зі сполукою, що на аліквоти по 1 мл та заморожували при -70 °С показали кислотну зміну кольору, об'єднували та Ці культури використовували в майбутньому для використовували для інокуляції свіжих серій розініціації бульйонних культур, які титрували, для ведень препаратів в мікоплазмовому бульйоні одержання ряду змінюючих забарвлення одиниць (0,1мл культури в 1,9мл бульйону з препаратом) (ззо) в планшетах для мікротитрацм після інкубації Цю процедуру повторювали кожні 5 - 7 днів до 10 (36°С) Повторне проведення експерименту допасивувань Коли штами мікоплазми ставали резволяє проводити тестування розведень антибіозистентними до певних антибіотиків, або на 10-му тиків заданою КІЛЬКІСТЮ ЗЗО В дослідах по визнапасивуванні, кожен штам вирощували ще раз на ченню мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) та бульйоні з препаратом та визначали МІК в первинному пасивуванні в дослідах по звиканню Результати МІК штаму "J" M hyopneumoniae Використовували доступне на ринку середота польових ІЗОЛЯТІВ ДО та після обробки антибіовище (Mycoplasma Experience Ltd), яке містило тиками показані в Табл З глюкозу та феноловий червоний при рН 7,6 без антибіотиків Всі планшети покривали липкою плівкою та шкубували аеробно при 36°С МІК визначали, коли зміна кольору в контрольних лунках відповідала рН контрольної кінцевої точки МІК була найменшою концентрацією, що не змінювала колір Результати зведені в Таблиці 2 для вальнемуліну та двох еталонних сполук - тіамуліну та енрофлоксаціну ВИХІДНІ розчини сполук, що аналізували, готу 56173 10 Таблиця З Розвиток резистентності in vitro у двох штамів М hyopneumoniae Сполука Вальнемулін (гх) Штам NCTC 10110 ПОЛЬОВИЙ ІЗОЛЯТ Тілозинутартрат NCTC 10110 ПОЛЬОВИЙ ІЗОЛЯТ Препасивування МІК Постпасивування МІК Ріст резистентно(мкг/мл) доР10/Р11 1 | (мкг/мл) сті (кратність) 0,0025 0,005 2 0,001 0,0025 2,5 0,25 >2000 >5оо" 0,125 500 62,5'' 0,25 4 1,0 0,25 4 1,0 Окситетрациклін NCTC 10110 пдрохлорид ПОЛЬОВИЙ ІЗОЛЯТ - рівень пасивування in vitro 2)- МІК після 8 пасивувань в мікоплазмовому бульйоні, який містив тілозин Було знайдено, що перед експозицією обидва штама були дуже чутливими до вальнемуліну з МІК 0,0025мкг/мл для контрольного штаму та 0,001 мкг/мл для польового ізоляту Ці рівні активності були у 50 - 100 разів вищими, ніж для тілозину та окситетрацикліну Ці результати МІК використовували для вибору діапазону розведень для препаратів в ДОСЛІДІ ПО звиканню Після 10 циклів експозиції вальнемуліну розвиток резистентності був мінімальним в обох штамах М hyopneumoniae, причому МІК виростала з 0,0025мкг/мл до 0,005мкг/мл та від 0,001 мкг/мл до 0,0025мкг/мл для, ВІДПОВІДНО, контрольного штаму та польового ізоляту При використанні тартрату тілозину та окситетрацикліну, навпаки, розвивалась значна резистентність в обох штамах М hyopneumoniae У контрольного штама резистентність вперше спостерігали на 4-5 пасивуванні в бульйоні з тілозином та до 8 пасивування МІК досягала >500мкг/мл, відображаючи >2000 кратне зростання резистентності до даного антибіотика (Табл 3) Значна резистентність до тілозину розвивалась у польового ізоляту протягом 8 пасивуваннь, причому МІК виросла в 500 разів до 62,5мкг/мл Такий рівень резистентності зберігався після 1 0 - 1 1 пасивувань в бульйоні з тілозином 4кратне зростання резистентності до окситетрацикліну мало місце в обох штамах М hyopneumoniae протягом 10 циклів експозиції, причому МІК зросла від 0,25мкг/мл до 1 мкг/мл Ці результати показують, що вальнемулін є значно більш активним проти М hyopneumoniae, ніж тілозин та окситетрациклін, та що він не викликає значного звикання у штамів М hyopneumoniae 4 Профілактика експериментально індукованої ензоотичної пневмонії in vivo Застосовували експериментальну модель ензоотичної пневмонії, використовуючи пасований матеріал легенів, що спершу одержують інфікуванням гнотобютичних свиней М hyopneumoniae, для оцінки здатності вальнемуліну запобігати цій інфекції Проводили три експерименти Тести 1 та 2 були дослідами по титруванню доз даної нової сполуки, використовуючи стандартний контрольний штам М hyopneumoniae, а в Тесті 3 була досягнута ефективність даної сполуки при 200 чим (часток на м л н ) в їжі при зараженні другим штамом Використовували хряків породи Великих Білих свиней Landrace, віком 6 - 7 тижнів, з стад, не заражених М hyopneumoniae Матеріал для зараження - пневмонійні легені, які містили М hyopneumoniae, що уводили у вигляді гомогенату штраназально протягом трьох днів Мінімальною інгібуючою концентрацією (МІК) вальнемуліну проти штаму, присутнього в даному матеріалі, що використовували в Тестах 1 та 2, була 0,016мкг/мл, та для штаму, виділеного з матеріалу, що використовували в Тесті 3, була 0,0078мкг/мл Матеріал для уведення спершу одержували при інфікуванні гнотобютичних свиней М hyopneumoniae та наступному пасивуванні в SPF (свині, ЩО не містять специфічного патогену), та зберігали нижче -70°С Тест 1 Введення пдрохлориду вальнемуліну через зонд один раз на день в дозах 0 (контроль), 2,5, 5, 7,5 чи 10мг/кг ваги тіла на добу Шість свиней в групі Тест 2 Введення пдрохлориду вальнемуліну з кормом в дозах 0, 100, 200, 300 або 400чнм (еквівалент 0, 5, 10, 15 та 20мг/кг/доба) Шість свиней в групі Тест 3 Введення пдрохлориду вальнемуліну з кормом в дозах 0 та 200чнм (еквівалент 0 та 10мг/кг/доба) ВІСІМ свиней в кожній групі Препарат давали з першого дня зараження до розтину приблизно через 3 тижні після зараження Захворювання оцінювали шляхом визначення КІЛЬКОСТІ уражень легенів (Система визначення КІЛЬКОСТІ пошкоджень легенів Cambnge, (Goodwin, R F W , and Whittlestone P J Hyg 69 (1971) 391-397), в якій показник є приблизним відсотком легенів, пошкоджених пневмонією), шляхом встановлення співвідношення вага легенівліла та виділенням М hyopneumoniae з легенів Результати показані в Табл 4 11 56173 12 Таблиця 4 Тесті Уведення препарату через зонд, МІК 0,016мкг/мл'' Доза препарату Показник пошкодження легенів 0 13,2 10мкг/кг/доба и 7,5мкг/кг/доба 3,8 5мкг/кг/доба 11,1 2,5мкг/кг/доба 7,7 Тест 2 Уведення препарату з кормом, МІК 0,016мкг/мл'' Доза препарату Показник пошкодження легенів 0 22,1 400чнм(20мг/кг)^' 6,3 300чнм(15мг/кг) 12,7 200чнм(10мг/кг) 12 100чнм(5мг/кг) 25 Тест 3 Уведення препарату з кормом, МІК 0,0078мкг/мл Доза препарату Показник пошкодження легенів 0 10,8 200чнм (Юмг/кг) 2,3 - МІК пдрохлориду вальнемуліну в мкг/мл відносно М hyopneumomae, ня 2) Приблизна добова доза вальнемуліну пдрохлориду на свиню В Тесті 1 заражені свині, яким не уводили препарат, мали середній коефіцієнт пошкоджень 13,2 Вальнемулін знизив пошкодження на 71% та 87% при дозах 7,5 та Юмг/кг, ВІДПОВІДНО, В ТОЙ час як в дозах 2,5 та 5мг/кг/доба він був дещо менш ефективним при зниженні ураження М hyopneumomae виділяли повторно з меншої КІЛЬКОСТІ свиней, яким уводили Юмг/кг, порівняно з свинями, яким уводили 2,5мг/кг (1 проти 4 свиней) В Тесті 2 заражені свині, яким не уводили препарат, мали середній коефіцієнт пошкоджень 22,1 Свині, ЯКИМ уводили вальнемулін у дозі 200, 300 або 400чнм, показали зниження уражень на 46%, 43% та 71%, ВІДПОВІДНО Вага легенів, яка, можливо, відображає мікроскопічні, а також макроскопічні ураження, виявила більш значний ефект з суттєвим зменшенням при рівні 200чнм Не спостерігали зниження уражень у свиней, яким уводили по ЮОчнм М hyopneumomae повторно виділили з всіх свиней, яким не уводили препарат, при розтині, але не виділили з свиней, яким уводили 400чнм або ЗООчнм вальнемуліну Мікроорганізми виділили з 3 та 4 свиней, яким уводили 200чнм та ЮОчнм, ВІДПОВІДНО В Тесті 3 свині, яким не уводили препарат, мали середній коефіцієнт 10,8, уведення препарату з вальнемуліном при 200чнм з їжею знижувало показник ураження на 79% Не було розбіжностей в рівні М hyopneumomae, що спостерігали при розтині, між свинями з уведенням та без уведення Таким чином, показано, що вальнемулін є ефективним при профілактиці експериментальне викликаної ензоотичної пневмонії свиней в окремих експериментах при використанні матеріалу для зараження, який містить два різних штама М hyopneumomae Таким чином, сполука винаходу є корисною в терапії ензоотичної пневмонії у свиней, викликаної інфекцією Mycoplasma hyopneumomae Для цих цілей ефективна доза буде, звісно, змінюватись в Співвідношення вага легешвлпла 1,35 1,08 1,21 1,31 1,21 Співвідношення вага легешвлпла 1,61 1 24 1,27 1,29 1,53 Співвідношення ваги легешвлпла 1,32 1,21 виділених з матеріалу для уведен залежності від солі, яку застосовують, способу уведення, розміру та віку тварини та бажаного ефекту, наприклад, з профілактичними цілями відносно низькі дози уводяться протягом довгого часу Однак, загалом задовільні результати одержують тоді, коли препарат уводять в добовій дозі від приблизно 5мг/кг до приблизно 15мг/кг ваги тіла тварини, яку зручно уводити порціями по два чотири рази на добу, або у формі з пролонгованою дією Для більшості тварин загальна добова доза складає приблизно від ЮОмг до приблизно ЮООмг, переважно, від приблизно ЮОмг до приблизно 500мг, що дають один раз або ДВІЧІ на добу Препарат можна успішно застосовувати як монотерапію Переважними дозами у питній воді є від 0,01 до 0,05% ваг/об, особливо, від 0,01 до 0,025%, та у їжі від 100 до 400чнм (г^она), особливо 100 200чнм (г^она) В) Інфекція Serpulma hyodysentenae Інфекцію Serpulma hyodysentenae можна діагностувати традиційним способом, як, описано в довідниках по ветеринари, наприклад, у Taylor D J , в Pig Diseases, 6 th Ed (1995), Publ D J Taylor, Glasgow, U K pp 143 - 144 Цілющу активність сполуки винаходу в даному використанні досліджували наступним чином 1 Визначення МІК Використовували дев'ять польових ІЗОЛЯТІВ S hyodysentenae із спалахів свинної дизентерії та типові штами АТСС 31212 та АТСС 29796 (Serpulma mnocens, група 3, Fellstrom, С , Res Vet Sei 52 (1995) 1 - 4) Ідентифікація була основана на пробах гемолізису на TSA (соєвий агар Tryticase) з 5%-оі бичачої крові, та на тесті по виробленню індолу та гідролізі ппурату (Rosco Diagnostic Tables, Taastrup, DK) Бактерії переносили з агарових чашок у 0,9% фізрозчин та доводили мутність до 1,0 по шкалі McFerland до того, як Юмкл кожного ізоляту наносили на агарові чашки з двократними 13 56173 концентраціями вальнемуліну пдрохлориду, тіамуліну пдрофумарату, диметрідазолу, лінкоміцину пдрохлориду та тілозину Ріст та гемоліз реєстрували після 4 днів анаеробного росту, а МІК визна 14 чали як найбільш низьку концентрацію антибютика, при якій не росли спірохети Результати визначення МІК для S hyodysenteпае показані в Табл 5 Таблиця 5 Мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) для 10 штамів S hyodysentenae Бактерицидний засіб МІК (мкг/мл) 0,0156 0,0312 0,0625 0,125 0,250 0,500 1 2 4 8 16 32 64 128 >128 гх - пдрохлорид Вальнему-лш (гх) 2 4 3 1 Тіамулін (гф) Диметрідазол ЛІНКОМІЦИН Тілозин 6 1 1 2 2 2 1 1 1 3 1 3 6 1 9 гф - пдрофумарат Всі штами S hyodysentenae були високо чутливими до вальнемуліну, показуючи значення МІК у 2 - 32 рази нижчі, ніж для тіамуліну Висока ефективність вальнемуліну відносно S hyodysentenae робить цю сполуку цікавою для використання при лікуванні КЛІНІЧНИХ випадків в інфікованих стадах 2 Визначення МІК Мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) визначали для 10 штамів S hyodysentenae, виділених з фекалій свиней, способом розведення на агарі Штами NCTC (Національна колекція типових культур) або референтні штами використовували як контроль в усіх МІК тестах Агарове середовище для S hyodysentenae складається з ВАВ2 (Umpath СМ271), що містить цільну 7% дефібрильовану стерильну кров ВІВЦІ Всі антимікробні сполуки аналізували двохкратними розведеннями Одержані розведення антибіотиків додавали до ВІДПОВІДНОГО об'єму агара МН, завчасно охолодженого до 50°С, змішували та розливали по 20мл Всі інкубації S hyodysentenae проводили в анаеробному інкубаторі при 37°С (+/-0,5°С) (Don Whitley Scientific), який був забезпечений стійкою анаеробною атмосферою, що включала 80% азоту, 10% водню та 10% диоксиду вуглецю Всі ІНШІ інкубації проводили при 37°С Всі штами інкубували в аеробній атмосфері при 37°С протягом 24 годин КІЛЬКІСТЬ організмів підводили до оптичної густини (ОГ), еквівалентної 1 х10 8 колонія-утворюючих одиниць в мл, використовуючи бульйон МН як контроль Чашки з антибіотиками заражали в двох паралелях, використовуючи багатоканальний інокулятор (Denley instruments), який подавав в чашку приблизно 1мкл шокуляту, що містив 10 4 - 10 5 колонія-утворюючих одиниць на пляму, для всіх штамів (Amon, J Antimicrob Chemother 21 [1988] 701 - 710, Ericsson et al , Acta Pathol Microbiol Et Immunol Scand 217 [1971] (B) Suppl , 1 - 9 0 ) Контрольні чашки інкубували при тих самих умовах, що і ДОСЛІДНІ МІК визначали через 24 та 48 годин, при чому останнє вимірювання було визначальним МІК розраховували як мінімальну концентрацію антибіотика, при якій не було росту, не звертаючи увагу на одиничну колонію та блідий туман, викликаний інокуляцією (National Committee for Clinical Laboratory Standards, [1989], Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLC Publications SC3, Villanova, PA, USA) МІК (мкг/мл) по відношенню до Serpulma hyodysentenae були для вальнемуліну (0,1), тіамуліну (0,3), лінкоміцину (50,0), тілозину (200,00) та диметридазолу (30,0) Всі штами S hyodysentenae були чутливими до вальнемуліну, який був активніше всіх інших препаратів у 3 - 600 разів З Досліди ПО зараженню Проводили два випробовування, в яких вальнемулін, яким в різних дозах годували тварин, порівнювали з тіамуліном для профілактики дизентерії у свиней Важкість захворювання оцінювали за наявністю КЛІНІЧНОГО захворювання, що визначали по КЛІНІЧНІЙ шкалі стану тіла, консистенції та складу фекалій Визначали екскрецію Serpulma hyodysentenae з фекаліями, ураження за даними розтину, швидкість росту та рівень перетравлювання їжі В першому ДОСЛІДІ пдрохлорид вальнемуліну згодовували в КІЛЬКОСТІ 20, ЗО та 40чнм в порівнянні з фумаратом тімуліну (ЗОчнм) та контролем без антибіотика Використовували п'ять груп по 9 (віком ВІД 5 до 6 тижнів) традиційно утримуваних свиней в групі Свиней годували кормом без препаратів протягом 14 днів, потім заражали стандартним штамом S hyodysentenae (P18A) Зараження проводили орально протягом двох послідовних 15 днів Корм з препаратами давали наступного дня після другого зараження В другому ДОСЛІДІ дотримувались такої самої процедури, за виключенням того, що використовували 4 групи приблизно по 9 свиней Тварин годували пдрохлоридом вальнемуліну при 5, 10 та 20чнм та порівнювали з контролем без антибіотиків В цьому експерименті використовували свиней із безстійловим утриманням, та заражали їх штамом S hyodysentenae, що виділяли з таких стад, який, як показано раніше, здатний викликати дизентерію свиней В обох дослідах наявність КЛІНІЧНОГО захворювання визначали кожного дня та визначали КЛІНІЧНИЙ показник, ДВІЧІ на тиждень робили ректальні змивина S hyodysentenae та всіх свиней зважували через певні проміжки часу Крім того реєстрували споживання корму Через 21 день після зараження проводили розтин та вивчали товстий кишечник на наявність пошкоджень Робили також зскрібки слизової з 4 ВІДДІЛІВ товстого кишечника та робили посів на S hyodysentenae В першому ДОСЛІДІ клінічна дизентерія свиней спочатку була відмічена у контрольній групі без призначення через 8 днів після зараження, 8 з 9 свиней були уражені Клінічне захворювання також спостерігали у 1 свині з групи, яку годували вальнемуліном в КІЛЬКОСТІ ЗОчнм та у 2 з 9 тварин в тіамуліновій групі Наявність захворювання не відмічали в вальнемулінових групах при 20 та 40чнм Середній КЛІНІЧНИЙ показник на свиню складав 36 для контрольної групи порівняно з показником 6 для тіамулінової групи Різниця між показниками, відміченими для всіх дослідних груп, та контрольною групою була статистичне вірогідною (р128 7 '' Цифра є КІЛЬКІСТЮ слабких бета-гемолітичних спірохет, визначених як тих, що мають дану МІК гх - пдрохлорид гф - пдрофумарат Отже, сполука винаходу є корисною в терапії коліту свиней, пов'язаним з інфекцією Serpulma pilosicoh Для цього ефективна доза, звісно, буде різною залежно від солі, що використовується, способу уведення, розміру та віку тварини та бажаного ефекту, наприклад, для профілактичних цілей можна уводити відносно низькі дози протягом довгого часу Однак, загалом, задовільних результатів досягають, якщо препарат уводять в добовій дозі приблизно 1мг/кг - 5мг/кг ваги тіла тварини, що зручно уводити окремими дозами від двох до чотирьох раз на день, або ad libitum з кормом та водою, або у пролонгованій формі Для більшості тварин загальна добова доза складає від приблизно Юмг до приблизно 400мг, наприклад, від приблизно Юмг до приблизно 200мг для запобігання та від 20мг до приблизно 400мг для лікування хвороби, уведених ad libitum з кормом або водою раз чи ДВІЧІ на день Переважними дозами у питній воді є від 0,001 до 0,05% ваг/об, особливо від 0,001 до 0,005%, та у кормі від 20 до ЮОг/метрична тона, особливо від 20 до 75г/метрична тона D Ілеїт свиней, пов'язаний з інфекцією Lawsoma mtracellulans Інфекцію Lawsonia mtracellulans можна діагностувати традиційним способом, так як описано в довідниках по ветеринари, наприклад, у Taylor 22 21 56173 th D J , in Pig Diseases, 6 Ed (1995), Publ D J Tayмістило антибіотик в різних концентраціях, який lor, Glasgow, UK на crop 154 - 157 Цілющу активдодавали безпосередньо перед додаванням до ність сполуки винаходу в даному використанні доклітин сліджували так, наприклад, як описано нижче Для групи 1 (контроль) та 2 (внутрішньоклітинна активність) інокулят готували в культуральному 1 Активність in vitro середовищі, вільному від антибіотиків, та додаваВ цілому дотримувались способу Lawson ли до клітин Культуральні флакони (Tracs) з кліG N K etal J Clm Microbiol 31 (1993)1136-1142 тинами, до яких додавали інокулят (+/- антибіотик) з деякими модифікаціями (стандартний дискв загальному об'ємі 0,5мл середовища, вміщували метод Kirby-Bauer не використовують для внутрів стальні посудини, в яких створювали 40% вакуум шньоклітинних бактерій) (8% Ог), залишали на 2хв, заповнювали воднем Клітини одержували моношари клітинних та, остаточно, 10% СС^-Флакони потім виймали з культур ІЕС-18 ентероцитів щурів (АТСС CRL посудин та вміщували в інкубатор, встановлений 1589) та культивували їх стандартними для кульна забезпечення вологої атмосфери з 8% Ог, 8,8% тур клітин способами Моношари одноденних кліСОгта решта азоту, при 37°С тин, що діляться, (приблизно 30% зливання) готували на накрівному склі у маленьких культуральНа 1 та 2 день всі флакони виймали та залиних флаконах (Tracs) для інфекції на 0 день вали свіжим середовищем, що або містило антибіотики, групи 2 та 4, або не містило, групи 1 та 3, та Інокулят Проби з трьох штамів Lawsoma mзнову вміщували в інкубатор На 5 день видаляли tracellulans використовували як інокулят Вони поусі накрівні скельця та проводили забарвлення на ходили з свиней, що страждали на проліферативLawsoma mtracelluians непрямим імунопероксидану ентеропатію форми проліферативної геморагічзним способом, використовуючи специфічні мононої ентеропатм (РНЕ) та свиного кишкового адеклональні антитіла КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН на кожному номатозу (РІА), одержаних з кишечника свиней, та склі, інфікованому Lawsoma mtracellularis з висовирощуваних в культурі клітин так, як описано викою множиною (>30 на клітину, "тяжко заражена ще в способі за Lawson Два штами РНЕ частково клггина"=ТЗК), використовували як основну міру аналізували на патогенність на свинях так, як опиінфекції Також відмічали КІЛЬКІСТЬ фокусів ТЗК та сано McOnstS etal , Infect Immun 61 (1993) 4286 та загальне обстеження клітин ТЗК в контролі - 4292 Серії шокулятів збирали після кількох клі(група 1), ДОСЛІДІ по внутрішньоклітинній дії антитинних пасивувань та зберігали в замороженому біотика (група 2), ДОСЛІДІ по зовнішньоклітинній дії стані при -70°С в 1мл пробірках Попередні випроантибіотика (група 3) та подовженому ДОСЛІДІ (грубування встановили ПІДХОДЯЩІ розведення матеріпа 4) порівнювали в трьох паралелях для 3 штаалу з відтанувших пробірок, що призводять до клімів Деякі досліди повторювали для інокулятів різтинної інфекції, що добре розпізнається при 5ної сили ВІДСОТКОВІ величини підраховували після денному ДОСЛІДІ розрахунку середніх ТЗК контролів, що відповідаАнтибіотики готували як 100-кратні ВИХІДНІ ють ДОСЛІДНІЙ групі Середнє значення контроля розчини для кожного використання Активність ТЗК є загальною КІЛЬКІСТЮ ТЗК в контрольних флакожної серії антибіотиків підтверджували в станконах, розділеною на КІЛЬКІСТЬ інфікованих контродартному дисковому способі Кірбі-Бауера з лабольних флаконів Потім розраховували відсоткове раторним штамом Eschenchia coll відношення дослідних флаконів шляхом розділенІнфікування для використання в чотирьох груня величини їх ТЗК на середній контрольний ТЗК, пах 1 - 4 на 0 день пробірку з кожним штамом розпомножений на 100 для одержання значення у морожували, розводили 1/8 - 1/32 культуральним відсотках Тобто, ДОСЛІДНІ флакони, де антибіотики середовищем не мали впливу, мали б відсоткове відношення Для груп 4 (подовжене випробовування) даний близько 100, а де антибіотики повністю інгібували інокулят спершу шкубували протягом 1 години при ріст, відношення буде 0 37°С в культуральному середовищі, що містило антибіотик в різних концентраціях, перед додаванОдержані результати для вальнемуліну пдроням до клітин хлориду є такими, як представлено в таблиці 7, яка показує відсоток клітин, які залишаються неінДля групи 3 (позаклітинна активність) цей інофікованими після зараження кулят готували в культуральному середовищі, яке Таблиця 7 ВІДСОТКОВІ відношення інфекції Lawsoma mtracellularis в культурах клітин з додаванням вальнемуліну Концентрація Вальнемуліну (гх) (мкг/мл) 8 група штамів група штамів 2 3 4 2 3 4 0 0 0 0 0 0 0,86 0 0,2 0 0,5 1,4 Таблиця 7 (продовження) Концентрація Вальнемуліну (гх) (мкг/мл) 8 4 група штамів 2 0 3 0 група штамів 4 0 2 0 0 3 1,4 0 4 0,2 0,8 23 24 56173 0 1,7 2 0 0 0 0 0 0,83 1,7 2,5 2,5 0 0 28 гх-пдрохлорид Ці дані свідчать, що мінімальна концентрація пдрохлориду вальнемуліну, що призводить до значного інгібування росту Lawsoma mtracellulans (