Актиностійкі варіанти людської днкази i, ізольована нуклеїнова кислота, спосіб лікування пацієнтів, які страждають на легеневі захворювання

Цей винахід відносять до результатів, які одержані при дослідженні людської дезоксирибонуклеази І (ДНази І), фосфодіестерази, яка здатна гідролізувати полідезоксірибонуклеїнову кислоту. Воно відноситься головним чином до модифікованих (мутантних) форм людської дезоксирибонуклеази І (ДНази І) і їх одержанню способами рекомбінантних ДНК, до фармацевтичних композицій, за допомогою котрих їх корисні властивості можуть бути використані клінічно, і до способів використання цих варіантів ДНази l і їх композицій. Передумови винаходу ДНаза І представляє собою фосфодіестеразу, здатну гідролізувати полідезоксірибонуклеїнову кислоту. ДНаза І виділена з різних видів тварин з різним ступенем повноти. Добре вивчена у біохімічному відношенні бичача ДНаза І. Див. також Moore, in The Enzymes (Boyer, P.D., ed), pp.281-296, Academic Press, New York (1981). Відома повна амінокислотна послідовність для бичачої ДНази І (Liao, et al., J. Biol. Chem. 248:1489-1495 (1973); Oefner, et. al., J. Моl. Biol. 192:605-632 (1986); Lahm, et. al., J. Моl. Biol. 221:645-667 (1991), і ДНК що кодує бичачу ДНазу І, клонована і експресована (Worrall, et al., J. Biol. Chem. 265:21889-21895 (1990)). Структур у бичачої ДНази І вивчено за допомогою рентгенівської кристалографії. Suck, et al., EMBO J. 3:2423-2430 (1984); Suck, et al., Nature 321:620-625 (1986); Oefner, et. al., J. Моl. Biol. 192:605-632 (1986). ДНК, кодуючу людську ДНазу І, було ізольовано і секвеновано, і така ДНК була експресована у рекомбінантних клітинах "господаря", таким шляхом даючи можливість регенерації людської ДНази І у серійно використовуваних кількостях. Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990). ДНаза І має цілий ряд відомих корисних властивостей і її використують у лікувальних цілях. ї принципове терапевтичне використання до цього часу укладалось у зниженні в'язкоеластичністі легеневих виділень (слизу) при таких захворюваннях, як пневмонія і муковісцідоз (CF), що сприяє таким чином очищенню респіраторних шляхів. См. також Lourenco, et al., Arch. Intern. Med. 142:2299-2308 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Hubbard, et al., New Engl. J. Med. 326:812-815 (1992); Fuchs, et al., New Engl. J. Med. 331:637-642 (1994); Bryson, et al., Drugs 48:894-906 (1994). Слиз також підвищує ризик виникнення таких захворювань, як хронічний бронхіт, астматичний бронхіт, бронхоектаз, емфізема, гострий і хронічний сінусіт і навіть звичайна простуда. Легеневі виділення осіб, що мають такі захворювання, представляють собою складні матеріали, які містять слизисті глікопротеїни, мукополісахариди, протеазу, актин і ДНК. Деякі з матеріалів у легеневих виділеннях вивільняють з лейкоцитів (нейтрофілів), які інфільтрують легеневу тканину у відгук на появу мікробів (наприклад, штамів бактерій псевдомона, пневмокока або стафілокока) або інших подразників (наприклад, тютюнового диму, квіткового пилку). В процесі взаємодії з такими мікробами або подразниками лейкоцити можуть дегенерувати і розкладатись і додавати вагому складаючу у в'язкоеластичність легеневих виділень. Здатність ДНази І знижувати в'язкоеластичність легеневих виділень була приписдна ензіматичному розщепленню нею великої кількості ДНК, що вивільняється нейтрофілами. Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188-9192 (1990); Aitken, et al., J. Am. Med. Assoc. 267:1947-1951 (1992). Нещодавно було зроблено припущення про інший механізм муколітичного ефекту ДНази І, заснованому на дезагрегації актину. Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994). Актин - один з білків, які мають найбільш високий зміст у е укаріотичних клітинах (наприклад, у загальної кількості білків лейкоцита актин становить 10%), і які найкращим образом вивчені. Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992); Sheterline, et al., Prot. Profile 1:1-121 (1994). Актин існує у дво х формах: монорозмірній формі (G-актин) і нитчастій формі (F-актин), яка створюється з мономерів G-актина. Полімерні нитки актина володіють високою в'язкоеластичністю і надають значний вплив на в'язкість легеневих виділень . Mornet, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:3680-3684 (1984); Newman, et al., Biochemistry 24:1538-1544 (1985); Janmey, et al., Biochemistry 27:8218-8226 (1988); Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994). Оскільки ДНаза l, як відомо, пов'язує актин (Lazarides, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); Kabsch, et al., Nature 347:37-44 (1990)) і деполімеризує нитки актина (а також інгібує полімеризацію G-актина у нитки) (Manherz, et al., FEBS Lett. 60:34-38 (1975); Hitchcock, et al., Cell 7:531-542 (1976); Pinder, et al., Biochemistry 21:4886-4890 (1982); Weber, et al., Biochemistry 33:4780-4786 (1994)), було зроблено припущення, що муколітичний вплив ДНази І на харкотиння і інші легеневі виділення зумовлено скоріше дезагрегацією (деполімеризацією) актина, ніж гідролізом ДНК. Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994). Цієї точки зору відповідає той відомий факт, що у присутності актина гідролітична активність ДНази І по відношенню до ДНК інгібується. Lazarides, et al., Ргос. Nat. Acad. Sci. 71:4742-4746 (1974); (Manherz, et al., Eur. J. Biochem. 104:367379 (1980). Цієї точки зору відповідає також повідомлення, що білки, пригнічуючі актин (наприклад, гельзолін [gelsolin]) ефективно знижують в'язкоеластичність харкотиння при муковісцідозі. Vasconcellos, et al., Science 263:969-971 (1994); Stossel, et al., PCT публікація No. WO 94 /22465 (опубліковано 13.10.1994). Цей винахід частково засновано на дослідженні винахідників по визначенню біохімічної основи муколітичної активності ДНази І. Це дослідження включало конструювання і синтез різних варіантів людської ДНази І і оцінку здатності цих варіантів гідролізувати ДНК, пов'язуватись з актином і знижувати в'язкоеластичність харкотиння in vitro. Винахідники створили декілька класів варіантів людської ДНази І. Один клас варіантів (актиностійкі варіанти) мають знижену здатність пов'язувати актин, але все-таки володіють муколітичною активністю, а у деяких випадках - підвищеної муколітичною активністю в порівнянні з природною людською ДНазою І. Ці актиностійкі варіанти мають приблизно таку ж гідролітичну активність по відношенню до ДНК, як природна ДНаза І, але така активність менше чутлива до інгібування актином. Другий клас варіантів пов'язує актин з спорідненістю, яка подібна виявленої для природної людської ДНази І, але має знижену муколітичну активність і знижену ДНК-гідролітичну активність в порівнянні з природною людською ДНазою І. Ці результати показують, що лікувальна ефективність людської ДНази І у зниженні в'язкоеластичністі легеневих виділень заснована скоріше на її каталітичної, ДНК-гідролітичної активності, ніж на її здатності деполімерізувати нитки актину. Згідно з цим, варіанти людської ДНази І, які пов'язують актин з більш низькою спорідненістю, ніж природна людська ДНаза l, але все-таки володіють ДНК-гідролітичною активністю, можуть бути придатні у якості лікувальних речовин, особливо при лікуванні пацієнтів з легеневими виділеннями, включаючими відносно велику кількість актину. Оскільки такі варіанти мають знижену спорідненість до актина, їх ДНК-гідролітичної активності менше інгібуються у присутності актина, і отже, ці варіанти володіють більшою муколітичною активністю у присутності актина в порівнянні з природною людською ДНазою І. Тому метою цього винаходу є створення варіантів людської ДНази І, які володіють ДНК-гідролітичною активністю, але пов'язують актин з більш низькою спорідненістю в порівнянні з природною людською ДНазою І. Другою метою цього винаходу є створення нуклеїнових кислот, що кодують такі актиностійкі варіанті людської ДНази І, рекомбінантних векторів, включаючих такі нуклеїнових кислот, рекомбінантних клітин "господаря", трансформованих цими нуклеїновими кислотами або векторами, і способів синтезу варіантів людської ДНази І шляхом технології рекомбінантних ДНК. Винахід також направлено на створення фармацевтичних композицій, включаючих актиностійкі варіанти людської ДНази І, можливо, з фармацевтично сприйнятним наповнювачем. Винахід також направлено на створення способу зниження у пацієнта в'язкоеластичністі або в'язкої консистенції матеріалу, що містить ДНК, включаючого введення пацієнтові терапевтично ефективної дози актиностійкого варіанту ДНази І. Винахід, зокрема, направлено на створення способу лікування пацієнтів, страждаючих такими захворювань, як муковісцідоз, хронічний бронхіт, пневмонія, бронхоектаз, емфізема, астма або системний червоний вовчак, який містить введення пацієнту терапевтично ефективної кількість актиностійкого варіанту ДНази І. Винахід також направлено на використання актиностійких варіантів людської ДНази І у діагностичних дослідженнях in vitro проб в'язкого матеріалу (тобто харкотиння) від пацієнта для визначення кількості присутнього актина і прийняття рішення, чи слід призначити даному пацієнтові лікування актиностійким варіантом ДНази І. Ці і інші мети винаходу будуть зрозумілі фахівцям по мірі розгляду опису винаходу у цілому. Короткий опис малюнків Фіг.1 показує амінокислотну послідовність людської зрілої ДНази І (SEQ. ID. N0:1). Цифри показують позиції амінокислотних залишків у послідовності. Фіг.2 показує відносну питому активність природної людської ДНази І і її варіантів. "Вуса" характеризують стандартне відхилення (при n-зважуванні). Відносна питома активність людської ДНази І Pulmozyme® (Genentech, Inc. , South San Francisco, California USA) прийнята за 1,0. Відносна питома активність природної людської ДНази І більше, ніж у Pulmozyme®, оскільки у Pulmozyme® міститься деамідірована форма людської ДНази І, володіюча зниженої ДНК-гідролітичною активністю (Frenz, et al., PCT публікація No. WO 93 /25670 (опубліковано 23.12.1993). Фіг.3 показує ДНК-гідролітичну активність у присутності актина природної людської ДНази І і варіантів людської ДНази І з мутацією одного залишку, яка визначена гіперхроматичним аналізом. "Відсоткова активність" означає відсоткову ДНК-гідролітичну активність ДНази І (природної або мутантної), розраховану, як описано у Прикладі 3; ДНК-гідролітична активність ДНази І у відсутності актина прийнята за 100-відсоткову активність. "Вуса" характеризують стандартне відхилення. Фіг.4 показує ДНК-гідролітичну активність у присутності актина природної людської ДНази І і варіантів людської ДНази І з мутаціями багатьох залишків, визначену гіперхроматичним аналізом або реакцією на метіловий зелений. "Відсоткова активність" означає відсоткову ДНК-гідролітичну активність ДНази l (природної або мутантної), розраховану, як описано у Прикладі 3; ДНК-гідролітична активність ДНази І у відсутності актина прийнята за 100-відсоткову активність. "Вуса" характеризують стандартне відхилення. Фіг.5 показує відносну спорідненість варіантів людської ДНази І до актина, що визначена при дослідженні зв'язування актина методу ELISA (як описано у Прикладі 3). Величина ЕС50 представляє собою концентрацію ДНази І (природної або мутантної), яка вимагається для одержання половини максимального відгука у аналізі. "Вуса" характеризують стандартне відхилення. Величини ЕС50 для Pulmozyme® і природної людської ДНази І становлять 72±21рМ (n=21) і 85±14рМ (n=14), відповідно. Відносна спорідненість зв'язків, показане на малюнку, представляє собою відношення величині ЕС 50, яка визначена для варіанту людської ДНази І, до величини ЕС50, яка визначена для природної людської ДНази І. Варіанти, для котрих величина ЕС 50 опинилась більше, ніж могло бути вимірено при кількісному аналізі, позначені як >35, >350, >1750, >3500 або >35 000. Фіг.6 показує муколітичну активність природної людської ДНази І і варіантів людської ДНази І у зразках харкотиння від пацієнтів, страждаючих муковісцідоза, визначену методом стиснення. "Вуса" характеризують стандартне відхилення. Фіг.7 схематично представляє дослідження зв'язування актина методом ELISA, описане у Прикладі 3. Докладний опис І. Визначення Використовувані тут терміни "людська ДНаза І", "природна людська ДНаза І" і "натуральна ДНаза l" відносяться до поліпептидів, які мають амінокислотну послідовність людської зрілої ДНази І, представлену на Фіг.1. "Варіант" або "варіант амінокислотної послідовності" людської ДНази l означає поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, відмінну від природної людської ДНази l. В основному, варіант буде володіти як мінімум 80% ідентичності послідовності (гомологічністі), переважно як мінімум 90% ідентичності послідовності, більш переважно як мінімум 95% ідентичності послідовності і найбільш переважно як мінімум 98% ідентичності послідовності з природною людською ДНазою І. Частка ідентичності послідовності визначається, наприклад, методом, запропонованим Fitch, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:1382-1386 (1983), по версії алгоритму, описаної Needleman, et al., J. Моl. Biol. 48:443-453 (1970), після суміщення послідовностей для забезпечення максимальної гомологічністі. Терміни "актиностійкий варіант людської ДНази І" і "актиностійкий варіант" відносяться до варіанту природної людської ДНази І, який має (1) ДНК-гідролітичну активність і (2) знижену спорідненість до актина. "ДНК-гідролітична активність" відносять до ензіматичної активності природної людської ДНази І у гідролізуючому (що розчіплює) субстракті ДНК з виходом кінцевих продуктів у вигляді 5'-фосфорільованих олігонуклеотидів. ДНК-гідролітична активність легені визначають по будь-якої з декількох різних методик, відомих у даної області, включаючи аналіз методом електрофореза геля поліакріламіда і агарози, гіперхроматичного аналізу (Kunitz, J. Gen. Ph ysiol. 33:349-362 (1950); (Kunitz, J. Gen. Ph ysiol. 33:363-377 (1950)) або реакцію на метіловий зелений (Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal.Biochem. 222:351-358 (1994)). "Спорідненість зв'язків" природної людської ДНази І або актиностійкого варіанту людської ДНази І до актина відносить до здатності ДНази І створювати нековалентні зв'язки з актином. Спорідненість зв'язків може бути визначено будь-яким з різних способів, відомих у даної області, наприклад, описаним у Manherz, et al., Eur. J. Biochem. 104:367-379 (1980). Як альтернатива, відносна спорідненість зв'язків різних ДНаз (наприклад, природної людської ДНази І і її варіантів) визначають шляхом кількісного аналізу зв'язування ДНаз з імобілізованим актином методом ELISA (описаним у Прикладі 3), або шляхом порівняння ДНК-гідролітичної активності ДНаз у присутності і у відсутності актині (метод також описаний у Прикладі 3). Методики, описані у Прикладах, особливо зручні при відборі варіантів людської ДНази І для швидкої ідентифікації тих варіантів, які мають знижене спорідненість зв'язків до актина. Актиностійкий варіант людської ДНази l, який має "знижену спорідненість зв'язків до актина" - такий, який має спорідненість зв'язків до актина відносно менше, ніж спорідненість, з яким природна людська ДНаза І пов'язує актин, при вимірюванні у порівнюваних умовах. Якщо для дослідження спорідненості зв'язків людської ДНази І (природної або її варіанту) до актина використовують метод ELISA, описаний у Прикладі 3, то актиностійким варіантом, що має "знижену спорідненість зв'язків до актина" буде той, який має величину ЕС50 більше, ніж ЕС50 природної людської ДНази І. В цьому методі аналізу актиностійкий варіант, як правило, буде мати величину ЕС 50 У 5-100 разів більше, ніж ЕС50 природної людської ДНази І, проте легко можуть бути одержані і актиностійкі варіанти, що мають величину ЕС 50 У 500 разів більше, ніж ЕС 50 природної людської ДНази І, зокрема, при зміненні багатьох амінокислотних залишків амінокислотної послідовності природної людської ДНази І (див., наприклад, Фіг.5). "Муколітичну активність" відносить до зниження в'язкоеластичністі (в'язкості) харкотиння або інших біологічних матеріалів, наприклад, яку спостерігають при обробці матеріалу природною людською ДНазою І. Муколітичну активність легко визначають по будь-який з декількох різних методик, відомих у даної області, включаючи аналіз методу стиснення харкотиння (РСТ публікація No.WO 94/10567, опубліковано 11.05.1994), методики, що використовують торсійний маятник (Jamney, J. Biochem. Biophys. Methods 22:41-53 (1991) або інші геологічні методики. "Реакція ланцюга полімерази" або "РЦП" звичайно відносить до способу збільшення бажаної послідовності нуклеотидів in vitro, як описано, наприклад, у патенті США No.4, 683, 195. Як правило, спосіб РЦП містить повторні цикли синтезу розширень праймерів, що використовують олігонуклеотидних праймерів, здатні до гібридизації переважно з матричною нуклеїновою кислотою. "Клітка", "клітка "господаря"", "клітчаста лінія" та "клітчаста культура" використують тут взаємозамінювано, і всі ці терміни слід розуміти як потомство, одержане при вирощуванні або культивуванні клітки. "Трансформація" та "трансфекція" використовують взаємозамінювано та означають процес введення ДНК у клітку. "Оперативно пов'язані" відносить до ковалентних сполук двох або більш послідовностей ДНК шляхом ензіматичного легування або інших зв'язків, у деяку конфігурацію відносно один одного, так, що може здійснюватись нормальне функціонування послідовностей. Наприклад, ДНК, відповідаюча за препослідовність або секреторний лідер, оперативно пов'язана з ДНК, відповідаючої за поліпептид, якщо вона виражена як препротеїн, який бере участь у секреції поліпептида; ген-підсилювач або промотор оперативно пов'язаний з кодувальною послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; ділянка зв'язування у рибосомі оперативно пов'язана з кодувальною послідовністю, якщо він розташований так, щоб полегшувати трансляцію. У цілому, "оперативно пов'язані" означає, що пов'язувані послідовності ДНК є суміжними і, на випадок секреторного лідера, суміжними і, що знаходяться у фазі зчитування. Зв'язування виконують шляхом легування у зручних обмежувальних ділянках. Якщо таких дільниць не існує, використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптери або зв'язуючі речовини, згідно з стандартними методиками рекомбінантних ДНК. Амінокислоти ідентифікують тут такими трьохлітерними або однолітерними позначеннями: Asp D аспарагінова кислота lle І ізолейцин Тhг Τ треонін Leu L лейцин Ser S серии Туг Υ тирозін Gly E глутамінова кислота Phe F фенілаланін Pro P пролін His Η гістидін Gly G гліцин Lys K лізин Ala А аланін Arg R аргінін Cys С цістеін Trp W триптофан Val V валін Gin Q глутамін Met Μ метіонін Asn N аспарагін ll. Вибір актиностійких варіантів Цей винахід засновано на вивченні споруди, актиноз'вязуючих властивостей, ДНК-гідролітичної активності і муколітичної активності варіантів амінокислотних послідовностей людської ДНази І. Актиностійкі варіанти у цьому винаході володіють ДНК-гідролітичною активністю, але пов'язують актин з меншою спорідненістю, ніж природна людська ДНаза І. Зменшення зв'язування актина переважно досягають здійсненням мутацій тих (та/або навкруги ти х) амінокислотних залишків усередині природної людської ДНази І, які мабуть, впливають на зв'язування актина, включаючи, наприклад, залишки Glu13, His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, Tyr65, Val67, Glu69 і Ala114 природної людської ДНази І (цифри, після літерного позначенням амінокислот, позначають конкретну позицію амінокислотного залишку у послідовності Фіг.1). Існує багато способів створення актиностійких варіантів людської ДНази І. В одному варіанті здійснення даного винаходу актиностійкий варіант створюють шляхом введення одиноких або множинних амінокислотних заступників, вставок та/або делецій у районі тих амінокислотних залишків природної людської ДНази І, які впливають на зв'язування актина, або поруч з ними (тобто у лімітах п'яти суміжних амінокислотних залишків). Деякі наочні приклади таких мутацій:D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R:Y65A, D53R:E69R, H44A:D53R:Y65A, H44A:Y65A:E69R (див. Фіг.2-6). В другом варіанті здійснення даного винаходу актиностійкий варіант створюють шляхом введення мутації (мутацій), яка створює нову ділянку глікозилації у районі тих амінокислотних залишків природної людської ДНази І, які впливають на зв'язування актина, або поруч з ними (тобто у лімітах п'яти суміжних амінокислотних залишків). Наприклад, для введення однієї з трипептидних послідовностей, аспарагіна-Х-серин або аспарагінХ-треонін (де X - будь-яка амінокислота, окрім проліна), які є розпізнавальними послідовностями для ензіматичного приєднання вуглеводної частини до бокового ланцюга аспарагіна, використовують сайтспецифічного метагенезу. Creighton, Proteins, pp. 76-78 (W. H. Freeman, 1984). Стеричні перешкоди, виникаючі між вуглеводною частиною результуючий N-гликозилированого варіанта ДНази I та актином, можуть знижувати або взагалі не допускати зв'язування з актином і, отже, інгібування ДНК-гідролітичної активності ДНази І в порівнянні з природною людською ДНазою І. Деякі наочні приклади таких мутацій з метою введення нової ділянки глікозилації:Н44N, D58S, D58T, H64N:V66S, V67N.E69S, V67N;E69T. Допускають, у зв'язку з такими мутаціями, створюючими нову ділянку глікозилації, знищення природних дільниць глікозилації у позиціях 18 та/або 106 у середині амінокислотної послідовності природної людської ДНази І, залежно від бажаного ступеня глікозилації у актиностійкому варіанті. В наступному варіанті здійснення винаходу сайт-специфічний метагенез використовують для введення у районі тих амінокислотних залишків природної людської ДНази І, які беруть участь у зв'язуванні актина, або поруч з ними (тобто у лімітах п'яти суміжних амінокислотних залишків), залишків, які зручні для посттрансляційних модифікацій біологічно або хімічно (див. нижче). Means, et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer, et al., Chemical Modification of Proteins:Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, pp. 76-78 (W. H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). За допомогою таких пост-трансляційних модифікацій можна вводити у ДНазу І стеричні перешкоди або змінювати її електростатичні властивості, що знижує або повністю запобігає зв'язування з актином і, отже, інгібування ДНК-гідролітичної активності ДНази І в порівнянні з природною людською ДНазою І. Наприклад, на місці залишку природної ДНази І, що бере участь у зв'язуванні актина, або поруч з ним, може бути введений залишок цістеіна. Вільний тіол цистеїнового залишку може утворити міжмолекулярний дисульфід ний зв'язок з іншим таким ж варіантом ДНази I з створенням димера ДНази І, або може бути модифікований, наприклад, тіол-специфічним алкілуючим агентом. Деякі наочні приклади таких мутацій: Н44С, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, Е69С, А114С. Для зручності, заміщення, вставки та/або делеції у амінокислотної послідовності природної людської ДНази I звичайно здійснюють шляхом введення мутацій у відповідну н уклеотидну послідовність ДНК, кодувальну природну людську ДНазу І, наприклад, шляхом сайт-специфічного мутагенеза. Потім у результаті експресії мутованої ДНК походить виробку мутантної людської ДНази І, що. має бажану (неприродну) амінокислотну послідовність. Оскільки для виконання сайт-специфічного мутагенеза може бути використана будь-яка технологія, відома у даної області, наприклад, як описано у Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), переважним способом одержання варіантів людської ДНази I у даному винаході є олігонуклеотид-специфічний мутагенез. Цей спосіб, добре відомий у даної області (Zoller, et al., Meth. Enz. 100:4668-500 (1983); Zoller, et al., Meth. En z. 154:329-350 (1987); Carter Meth. En z. 154:382-403 (1987); Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987); Horwitz, et al., Meth. En z. 185:599-611 (1990)), особливо зручний для створення заміщених варіантів, хоч він може також використатись і для створення варіантів, одержуваних шля хом делецій і вставок. Технологія сайт-специфічного мутагенеза звичайно залучаєвектор фага, який існує як у одноланцюговій, так і у дво хланцюговій формі. Типові вектори, придатні для сайт-специфічні мутагенези, містять такі вектори, як фаг Μ13, а також вектори плазмидів, які містить одноланцюгове фагове джерело реплікації (Messing, et al., Meth. En zyrnol. 101:20-78 (1983); Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3-11 (1987); Short, et al., Nuc. Acids. Res. 16:7583-7600 (1988)). Реплікація цих векторів у придатних клітках "господаря" зумовлює синтез одноланцюговий ДНК, яка може бути використана для сайт-специфічного мутагенеза. У короткому викладенні, при проведенні сайті-специфічного мутагенезу ДНК, кодувальній природну людську ДНазу І (або її варіанти), ДНК змінюється спочатку шляхом гібридизації олігонуклеотида, кодувальної бажаної мутації, з однією ниткою ДНК. Після гібридизації ДНК-полімераза використовують для синтезу повної другої нитки, з використанням гибридизованого олігонуклеотида у якості ініціатора, а першої нитки ДНК у якості матриці. Таким чином, олігонуклеотид, кодуючий бажану мутацію, вбудовувається у результуючу двохланцюгову ДНК. Олігонуклеотиди для використання у якості гібридизаційних зразків або ініціаторів можуть бути одержані будь-яким придатним способом, таким як очищення природної ДНК або синтез in vitro. Наприклад, олігонуклеотиди легко синтезуються з використанням різних технологій органічної хімії, наприклад, описаних Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-98 (1979); Brown, et al., Meth. En zymol. 68:109-151 (1979); Caruthers, et al., Meth. Enzymol. 154:287-313 (1985). Загальний підхід до вибору придатного гібридизаційного зразку або ініціатора добре відомий. Keller, et al., DNA Probes, pp. 11-18 (Stockton Press, 1989). Як правило, гібридизаційний зразок або ініціатор містить 10-25 або більш нуклеотидів і містить як мінімум 5 нуклеотидів з кожної сторони послідовності, кодувальної бажаної мутації, щоб гарантувати гібридизацію олігонуклеотида з матричною молекулою одноланцюгової ДНК переважно у бажаному місці. Звичайно, для введення множинних заміщень, вставок або делецією у початкову ДНК може бути використаний сайт-специфічний мутагенез. Якщо ділянки, що піддаються мутація, розташовані близько один до одного, мутації можуть проводитись одночасно з використанням одного олігонуклеотида, який кодує всі бажані мутації. Якщо, але, ділянки, що мутуються, розташовані на деякому відстані один від одного (поділені більше ніж десятьма нуклеотидами), стає важкіше генерувати один олігонуклеотид, який кодує всі бажані змінення. Замість цього можуть бути задіяні один або два альтернативних способи. В першому способі генерується окремий олігонуклеотид для кожної бажаної мутації. Потім олігонуклеотиди одночасно гибридизують з одноланцюговий матричний ДНК, і друга нитка ДНК, яка синтезується з матриці, кодує всі бажані амінокислотні заміщення. Альтернативний спосіб для одержання бажаного варіанту містить два або більш циклів мутагенеза. Перший цикл проводять також, як описано для проведення одинокої мутації. Др угий цикл мутагенеза використовує мутантн у ДНК, одержану у першому циклі мутагенезу, у якості матриці. Таким чином, ця матриця вже містить одну або більш мутацій. Олігонуклеотид, кодуючий додаткове бажане амінокислотне заміщення (заміщень) потім гибридизують з цією матрицею, а результуюча нитка ДНК тепер кодує мутації з першого та другого циклів мутагенезу. Ця результуюча ДНК може бути використана у якості матриці у третьому циклі мутагенеза, і т. д. Мутагенез методом РЦП (Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette, et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)) також придатний для одержання варіантів людської ДНази І. В короткому викладенні, коли мала кількості матричної ДНК використовують у якості початкового матеріалу у РЦП, ініціатори, які декілька відрізняються у послідовності від відповідної ділянки у матричної ДНК, можуть бути використані для генерування відносно великих кількостей специфічного фрагмента ДНК, який відрізняється від матричної послідовності тільки у тих позиціях, де ініціатори відрізняються від матриці. Для введення мутації у ДНК плазміда, наприклад, послідовність одного з ініціаторів містить бажану мутацію і побудована так, щоб гібридизуватись з однією ниткою ДНК плазміда у позиції мутації; послідовність іншого ініціатора повинна бути ідентичною нуклеотидної послідовності усередині протилежної нитки ДНК плазміда, але ця послідовність може бути розташована у будь-якому місці уздовж ДНК плазміда. Переважно, проте, щоб послідовність другого ініціатора розміщувалась у лімітах н уклеотидів від послідовності першого ініціатора, так, щоб потім мігла легко секвенірована вся подовжувана ділянка ДНК, межуючої з ініціаторами. Таке подовження методом РЦП з використанням пари ініціаторів у результаті приводить до одержання популяції фрагментів ДНК, які відрізняються у позиції мутації, що визначає ініціатора, і, можливо, у інших позиціях, оскільки матричне копіювання декілька підвладно помилкам. Wagner, et al., in PCR Topics, pp.69-71 (Springer- Verlag, 1991). Якщо співвідношення матриці і кінцевої подовженої ДНК вкрай низько, більша частина фрагментів кінцевої ДНК містить бажану мутацію (мутації). Цю кінцеву ДНК використують для заміни відповідної ділянки у плазміді, який слугує у якості матриці РЦП, з застосуванням стандартної методики рекомбінантних ДНК. Мутації у окремих позиціях можуть проводитись одночасно, або з використанням другого мутантного ініціатора, або з виконанням другий РЦП з різними мутантними ініціаторами, з подальшим одночасним лигуванням двох результуючних фрагментів РЦПОМ з фрагментом плазміда за допомогою тристоронньої (або з великим числом сторін) зшиття. Другий спосіб одержання варіантів, касетний мутагенез, заснований на технології, описаної Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985). Початковим матеріалом є плазмід (або другий вектор), що містить послідовність ДНК, що піддається мутації. Кодон (и) у початковій ДНК, що піддається мутації, ідентифікується. На кожній стороні ідентифікованої ділянки (дільниць) мутації має бути унікальна обмежувальна ділянка ендонуклеази. Якщо таких обмежувальних дільниць не існує, їх можна генерувати з використанням вищеописаного способу олігонуклеотид-опосередкованого мутагенезу, щоб ввести їх у відповідні місця у ДНК. ДНК плазміда у цих місцях розрізають для лінеаризації. З використанням стандартних технологій синтезується двохланцюговий олігонуклеотид, кодувальна послідовність ДНК між обмежувальними ділянками, але, що містить бажану мутацію (мутації), причому дві нитки олігонуклеотида синтезують окремо, а потім гибридизують разом з використанням стандартних те хнологій. Цей двохланцюговий олігонуклеотид і називається касетою. Ця касета сконструйована таким чином, що вона містить кінці 5' та 3', сумісні з кінцями лінеаризованого плазміду, так що її можна безпосередньо зшивати з плазмідом. Результуючий плазмід містить мутантну послідовність ДНК. Наявність мутації (мутацій) у ДНК визначається способами, добре відомими у даної області, включаючи обмежувальне картування та/або секвенювання ДНК. Переважним способом секвенювання ДНК є методика дідезоксі - обриву ланцюга Sanger, et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72:3918-3921 (1979). ДНК, кодувальний варіант людської ДНази І, вставляється у відтворюваний вектор для подальшого клонування або експресії. "Вектори" - це плазміди та інші ДНК, здатні до реплікації у клітці "господаря" і у зв'язку з цим придатні для виконання двох функцій у з'єднанні з сумісними клітками "господаря" (система вектор - "господар"). Одна функція - забезпечувати клонування нуклеїнової кислоти, яка кодує варіант людської ДНази І, тобто випрацьовувати необхідні кількості нуклеїнової кислоти. Інша функція - керувати експресією варіанту людської ДНази І. Одна або обидві ці функції виконуються вектором у визначеної клітці "господаря", яку використовують для клонрання або експресії. Вектори будуть утримувати різні компоненти залежно від функції, яку вони повинні виконувати. Щоб створити варіант людської ДНази І, вектор експресії буде містити ДНК, кодувальний варіант, як описано вище, оперативно пов'язану з промотором і ділянкою зв'язування рибосоми. Тоді варіант виражається безпосередньо у рекомбінантній клітчастій культурі або у вигляді злиттю з гетерологічним поліпептидом, переважно сигнальною послідовністю або з іншим поліпептидом, що має специфічну ділянку розщеплення у місці переходу між гетерологічним поліпептидом і варіантом людською ДНазою І. Переважними клітками - "господарями" для початкового етапу клонування по даному винаходу є прокаріоти (наприклад, Е. соli і інші бактерії). Вони особливо зручні для швидкого виробництва великих кількостей ДНК, для виробництва одноланцюгових матриц ДНК, використовуваних для сайт-специфічного мутагенеза, і для секвенювання ДНК, варіантів що генеруються. Прокаріотичні клітки - "господаря" можуть також бути використані для експресії ДНК, кодувального варіанту людської ДНази І. Поліпептиди, яки продуцують прокаріотични клітки, звичайно не глікозильовані. Крім того, варіанти людської ДНази І по даному винаходу можуть бути виражені у еукаріотичних клітках "господарях", включаючи еукаріотичні мікроби (наприклад, дріжджові) або клітки, виведені з тваринних або інших багатоклітчастих організмів (наприклад, клітки яєчників китайського ховраха і інші клітки ссавців) або у живих ссавців (наприклад, коровах, козах, ві вцях). Методики клонування і експресії добре відомі у даної області. Приклади прокаріотичних і еукаріотичних кліток - "господарів" і векторів експресії, придатних для використання у продукуванні варіантів людської ДНази І по даному винаходу описані, наприклад, у Shak, PCT п ублікація No. WO 90/07572 (опуликовано 12.07.1990). Якщо у якості кліток - "господар" використовують прокаріотичні клітки або клітки, які мають міцну структуру клітчастої стінки, переважні способи трансфекція кліток ДНК є метод кальційова обробка, описаний Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69:2110-2114 (1972) або поліетиленгліколь метод Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16:3580 (1988). Якщо у якості "господаря" використовують дріжджі, трансфекції звичайно виконують з використанням поліетиленгліколю, по Hinnen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 75:1929-1933 (1978). Якщо у якості "господаря" використовують клітки ссавців, трансфекці звичайно проводять по методиці осідання фосфатом кальція, Graham, et al., Virology 52:546 (1978), Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990). Проте, для використання у даному винаході придатні також інші відомі методики введення ДНК у прокаріотичні і еукаріотичні клітки, такі як ядерна інжекція, електропорація або злиття протопласти. Особливо корисні для даного винаходу вектори експресії, які забезпечують транзитну експресію у клітках ссавців ДНК, кодувальних варіантів людської ДНази І. Як правило, транзитна експресія містить використання вектора експресії, здатного до ефективної реплікації у клітці "господаря", так що клітка "господаря" накопичує багато копій вектора експресії і, в свою чергу, синтезує високі рівні бажаного поліпептида, кодуючого вектора експресії. Системи транзитної експресії, включаючі придатний вектора експресії і клітки "господаря", надають можливість зручній достовірній ідентифікації поліпептидів, які кодуються клонуємимі ДНК, а також швидкого відбору таких поліпептидів по бажаним біологічним або фізиологічним властивостям. Wong, et al., Science 228:810-815 (1985); Lee, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985); Yang, et al., Cell 47:3-10 (1986). Таким чином, системи транзитної експресії зручно використати для експресії ДНК, кодувальних варіантів амінокислотної послідовності природної людської ДНази І, у сполученні з методами аналізу, ідентифікуючими ті варіанти, які пов'язують актин з меншою спорідненістю, ніж природна людська ДНаза І, а також з методами аналізу, що визначають ДНК-гідролітичну активність варіантів. Варіант людської ДНази І переважно секреТуєтся з клітками "господаря", у якій він виражений, і у цьому випадку варіант вилучають з живильного середовища, у якій вирощують клітки "господаря". При цьому може бути бажано вирощувати клітки у безсироватковому живильному середовищі, оскільки відсутність сироваткових білків та інших компонентів сироватки у середовищі може полегшити очищення варіанту. Якщо він не секретуєтся, тоді варіант людської ДНази І вилучають з лізатів кліток "господаря". Якщо варіант виражений у клітках "господаря", відмінних від кліток і людських походжень, варіант буде абсолютно чистий від білків людського походження. В будь-якому випадку необхідне очищення варіанту від рекомбінантних клітчастих білків для одержання практично гомогенних препаратів варіанту людської ДНази І. Для терапевтичного використання варіант переважно має бути очищений більше ніж на 99% (тобто будь-які інші білки мають становити менше 1% загального білкового вмісту у очи щеної композиції). Як правило, очищення варіанту людської ДНази І виконують шляхом використання тієї переваги, що фізико-хімічні властивості варіанту і сторонніх речовин, які можуть бути з ним пов'язані, розрізнюють. Наприклад, на першому етапі живильне середовище або лізат клітки "господаря" центріфугують для віддалення часток зруйнованих кліток. Потім варіант людської ДНази І очищають від сторонніх розчинених білків і поліпептидів, наприклад, шляхом осідання сульфата амонія або етанола, геля-фільтрації (молекулярною ексклюзійною хроматографією), іонообмінною хроматографією, гідрофобною хроматографією, імуноафінною хроматографією (тобто, що використовує стовпець, що містить антитіла проти людської ДНази І, розташовані на Sepharose), щупальцевою катіонообмінною хроматографією (Frenz, et al., PCT публікація No.WO 93/25670 (опубліковано 23.12.1993), HPLC з зверненої фазою та/або електрофорезом у гелі. Звичайно, фахівцеві буде зрозуміло, що способи очищення, використовувані для природної людської ДНази І, можуть зажадати деякої модифікації для очищення варіанту людської ДНази І, з урахуванням структурних та інши х розбіжностей між природним і мутантними білками. Наприклад, у деяких клітках "господаря" (особливо бактеріальних клітках "господаря") варіант людської ДНази І може бути початково виражений у нерозчиненої, агрегованої формі (званими тільцями включень або вірусними включеннями), і у цьому випадку по ходу очищення варіанту людської ДНази І виникає необхідність солюбілізувати і ренатурувати його. Способи солюбілізації і ренатурації рекомбінантних білкових тілець включень відомі у даної області (див., наприклад, Builder, et al., патент США No.4,511,502). В іншому варіанті здійснення даного винаходу варіанти людської ДНази І одержують шляхом створення ковалентних модифікацій безпосередньо у природному або мутантному білку людської ДНази І. Такі модифікації здійснюють для змінення здібності пов'язувати актин або інші властивості білка (наприклад, сталості, біологічного півперіоду існування, імуногенності) і можуть бути проведені замість або на доповнення до заміщень, вставкам або делеціям у амінокислотній послідовності, описаним вище. Ковалентні модифікації можуть здійснюватись за допомогою реакцій цільових амінокислотних залишків природної або мутантної людської ДНази І з органічним деріватизуючим агентом, здатним реагувати з обраними амінокислотними боковими ланцюгами або N- або С-кінцевими залишками. Придатні деріватизуючі агенти і способи добре відомі у даної області. Наприклад, цистеінільні залишки звичайно реагують з a-галоацетатами (і відповідними амінами), такими як хлороцтова кислота або хлорацетамід, з створенням карбоксіметильних або карбоксіамідометилових похідних. Цистеінільні залишки також дериватизують реакцією з бромтрифторацетоном, a-бром-b-(5 имидозоил) пропіоновою кислотою, хлорацетілфосфатом, N-алкілмалеімідами, 3-нитро-2пиридиддисульфидом, р-хлормеркурібензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом або хлор-7-нитробензо-2окса-1,3-диазолом. Гистидильні залишки дериватизують реакцією з диетілпірокарбонатом при рН 5,5-7,0, оскільки цей реагент відносно специфичен для бокового ланцюга гістиділа. Також придатний пара-бромфенацилбромід; реакцію переважно проводить у 0,1Μ розчині какоділата натрія при рН 6,0. Лізинільні і амінокінцеві залишки реагують з сукциновими або іншими ангідрідами карбонових кислот. В результаті деріватизації цими реагентами відбувається змінення заряду лізинільних залишків на зворотний. Інші придатні реагенти для деріватизації a-аміномістящіх залишків містять складні імідоефіри, такі як метилпіколінімідат, піридоксалфосфат, пиридоксал, хлорборгідрид, тринітробензолсульфонова кислота, прометилізосечовину, 2, 4-пентандион, а також реакція з гліоксилатом, що каналізують трансаміназою. Аргінільні залишки модифікують реакцією з одним або декількома звичайними реагентами, такими як фенілгліоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион, нінгідрин. Деріватизація аргининових залишків вимагає, щоб реакція проводилась у лужних умовах із-за високої рКа функціональної групи гуанідіна. Крім того, ці реагенти можуть вступати у реакцію з групами лізина, а також з епсілон - аміногрупою аргініна. Карбоксильні бокові групи (аспартіл або глутаміл) вибірково модифікують реакцією з карбодиімідами (R'N=C=N-R'), де R і R' - різні алкільні групи, такі як 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-етил) карбоімід або 1-етил3-(4-азоний-4,4-диметилпентил) карбодиімід. Крім того, залишки аспартіла і глутаміла перетворюють у залишки аспарагініла і глутамініла шляхом реакції з іонами амонію. Ковалентні з'єднання глікозидів з амінокислотними залишками білка можуть бути використані для модифікації або збільшення числа або профіл вуглеводних заступників, особливо у районі тих залишків, які беруть участь у зв'язуванні актину, або поруч з ними. Залежно від використовуваного режиму з'єднання, цукор (а) може (можуть) приєднуватись до (а) аргініну та гістидіну, (b) вільним карбоксильним групам, (с) вільним сульфогідрільним групам, таким як сульфогідрільні групи цістеіну, (d) вільним гідроксильним групам, таким як гідроксильні групи серину, треоніну або гідроксипроліну, (е) ароматичним залишкам, таким як ароматичні залишки фенілаланіну, тирозіну або триптофана або (f) амідогрупі глутаміну. Придатні методики описані, наприклад, у РСТ публікації No.WO 87/05330 (опубліковано 11.09.1987), і у Aplin, et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 (1981). Ковалентне приєднання реагентів, таких як поліетиленгліколь (ПЕГ) або альбуміна людської сироватки до варіантів людськоїДНази І може знижувати імуногенність та/або токсичність варіанту та/або подовжувати його півперіод існування, як спостерігалось у інших білках. Abuchowski, et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Poznansky, et al., FEBS Letters 239:18-22 (1988); Goodson, et al., Biotechnology 8:343-346 (1990); Katre, J. Immunol. 144:209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992). Крім того, модифікація природної людської ДНази І або її варіанту цими агентами у районі тих залишків, які беруть участь у зв'язуванні актина, або поруч з ними (тобто у лімітах п'яти амінокислотних залишків) може привести до створення актиностійкого варіанту. У іншому варіанті здійснення винаходу актиностійкий варіант людської ДНази І може містити мутацію у районі залишку Asn, який розташований у позиції 74 амінокислотної послідовності природної людської ДНази І (наприклад, мутацію N74D, N74K або N74S), щоб знизити або повністю запобігти деамідування варіанту ДНази І. Frenz, et al., РСТ публікація No.WO 93/25670 (опубліковано 23.12.1993). В якості іншого прикладу, актиностійкий варіант людської ДНази І може містити мутацію амінокислотної послідовності або іншої ковалентної модифікації, знижаючу сприйнятливость варіанту до деградації протеазами (наприклад, нейтрофілеластазою), які можуть бути у харкотинні та іншим біологічних матеріалах. ДНК-гідролітична активність і спорідненість зв'язків до актина варіантів людської ДНази І, одержані, як описано вище, легко визначають з використанням методів аналізу, відомих у даної області і описаних тут. Будь-який з таких варіантів, володіючий ДНК-гідролітичною активністю і знижених спорідненістю зв'язків до актина (згідно з приведеними вище визначеннями), є актиностійким варіантом по даному винаходу. Актиностійкі варіанти людської ДНази І по даному винаходу використовують для зниження в'язкоеластичністі матеріалів що містять ДНК-, таких як харкотиння, слиз або інші легеневі виділення. Такі варіанти особливо корисні для лікування пацієнтів з легеневими захворюваннями, які мають аномально в'язкі або згущені виділення і такі стан, як гострі або хронічні бронхіально-легеневі розлади, включаючи інфекційну пневмонію, бронхіт або трахеобронхіт, бронхоектази, муковісцідоз, астма, туберкульоз і грибкові інфекції. Для їх лікування розчин або тонкоподрібнений сухий препарат актиностійкого варіанту вводять по краплях звичайним способом у дихальні шляхи (тобто, бронхи) або у легені пацієнта, наприклад, аерозольний спосіб. Актиностійкі варіанти також корисні у якості допоміжного засобу при лікуванні абсцесів або тяжких інфекцій закритих дільниць у таких станах, як емпієма, менінгіт, абсцес, перітоніт, сінусіт, отіт, періодонтіт, перікардіт, панкреатіт, холелітіаз, ендокардіт і септичний артріт, а також при місцевому лікуванні різних запальних і інфікованих органів, таких як інфіковані ділянки шкір і слизистої оболонки, хірургічних ран, язви та опікі. Актиностійкі варіанти можуть підвищити ефективність антибіотиків, використовуваних при лікуванні таких інфекцій (наприклад, активність гентаміцина помітно знижують при створенні зворотних зв'язків з непошкодженими ДНК). Природна людська ДНаза І і її варіанти також можуть бути корисні при лікуванні системного червоного вовчака (СЧВ), небезпечних для життя аутоімунних захворювань, що характеризують продукуванням різних антитіл. ДНК представляють собою основний антигенний компонент імунних комплексів. У цьому випадку людська ДНаза І (природна або мутантна) може вводитись пацієнтові систематично, наприклад, шляхом внутрішньовенних, підшкірних, внутрішньооболонкових або внутрішньом'язових ін'єкцій. Природна людська ДНаза І і її актиностійкі варіанти також можуть застосовуватись для запобігання нового розвитку та/або загострення респіраторних інфекцій, яке може відбутись у пацієнтів, страждаючих муковісцідоза, хронічного бронхіту, астмою, пневмонією або іншими легеневими захворюваннями, або у пацієнтів, дихання яких підтримують вентилятором або іншим медичним приладом, або у інших пацієнтів з ризиком розвитку респіраторних інфекцій, наприклад, післяопераційних хворих. Препарати актиностійких варіантів можуть бути приготовлені згідно з відомими способами приготування лікувальних композицій. Переважна лікувальна композиція представляє собою розчин актиностійкого варіанту у буферізованому або небуферізованому водному розчині і переважно представляє собою ізотонічний сольовий розчин, такий як 150мМ розчин хлоріда натрія, що містить 1,0мМ хлоріда кальція при рН 7. Ці розчини особливо підходять для використання серійно, випускаючих аерозольних упаковках, включаючи струмінні і ультразвукові розпилювачі, придатні для введення препарату безпосередньо у дихальні шляхи або легені пацієнта. В іншому варіанті здійснення винаходу, лікувальна композиція містить сухий порошок актиностійкого варіанту, переважно приготовлений шляхом розпилювальної сушки розчину актиностійкого варіанту, згідно з заявкою США No.08/206,020 від 04.03.1994. В іншому варіанті здійснення лікувальна композиція містить, активно продукуючі актиностійкого варіанту людської ДНази І. Такі клітки можуть безпосередньо вводитись у тканину пацієнта або можуть бути включені у капсули з пористою оболонкою, які потім імплантують пацієнтові, у цьому випадку забезпечуючи подачу актиностійкого варіанту у ті області усередині тіла пацієнта, де вимагаються підвищені концентрації ДНКгідролітичної активності. Наприклад, можуть бути трансформовані власні клітки пацієнта, як in vivo, так і ex vi vo, ДНК, кодувального актиностійкого варіанту людської ДНази І, і потім використані для продукування ДНази І безпосередньо усередині пацієнта. Терапевтично ефективна кількість актиностійкого варіанту людської ДНази І буде залежати, наприклад, від кількості ДНК і актину у, матеріалі що обробляється , терапевтичних цілей, курсу застосування і стану пацієнта. Керуючись цими факторами, терапевт повинен встановити титр дозування і відповідним чином модифікувати курс лікування для одержання оптимального лікувального ефекту. Ввиду зниженої спорідненості до актину та, отже, підвищеної ДНК-гідролітичної активності у присутності актина в порівнянні з природною людською ДНазою І, кількість актиностійкого варіанту, потрібне для досягнення лікувального ефекту, може бути менше, ніж кількість природної людської ДНази І, необхідного для досягнення такого ж ефекту у таких ж умовах. У загальному випадку, терапевтично ефективна кількість актиностійкого варіанту буде забезпечувати доз ування приблизно від 0,1мкг до 5мг варіанту на кілограм ваги тіла пацієнта, при прийманні у складі фармацевтичних композицій, описаних тут. Актиностійкий варіант ДНази І може сполучатись або прийматись в злагоді з одним або декількома іншими лікарськими засобами, використовуваними для лікування зазначених вище станів, такими як антибіотики, бронхолітичні засоби, протизапальні засоби, муколитіки (наприклад, п-ацетил-цістеіном), які пов'язують або пригнічують актин білками (наприклад, гельзолін; Matsudaira et al., Cell 54:139-140 (1988); Stossel, et al., PCT публікація No.WO 94/22465 (опубліковано 13.10.1994)), інгібіторами протеази або продуктів генної терапії (наприклад, що містять ген регулювання трансмембранної проводимості муковісцідоза (CFTR), Riordan, et al., Science 245:1066-1073 (1989)). Наступні приклади приводять тільки для ілюстрації і ні в якому разі не обмежують даний винахід. Всі згадані патенти і літературні джерела, на які існують посилання, ясно включені. Приклад 1 Мутагенез людської ДНази І Штам Е. соlі CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, California USA) трансформували плазмідом pRK.DNase.3 з використанням методу Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16:3580 (1988). Використання плазміда pRK.DNase.3 у даному винаході аналогічно опису у РСТ публікації No. WO 90/07572 (опубліковано 12.07.1990), за вийнятком того, що нуклеотидна послідовність, кодуюча людську ДНазу І, відповідає показаної на Фіг.1. Трансформовані клітки висіяли на LB-агарові платівки, що містять 50мкг/мл карбеніцилліна, і вирощували протягом ночі при 37°С. В 2YT - бульйон (5мл), що містить 50мкг/мл карбеніцилліна і 10мкл фага-помічника VCSM13 (Stratagene, La Jolla, California USA), внесли окрему колонію з агарової платівки і вирощували протягом ночі при 37°С при струшуванні. З цієї культури ізолювали одноланцюгову ДНК і використали у якості матриці для подальшого мутагенеза. Сайт-специфічний мутагенез виконували з використанням синтетичних олігонуклеотидів згідно з методикою Kunkel, et al., Meth. Enzymol. 154:367-382 (1987). Мутагенні олігонуклеотиди представляли собою 21-міри або 24-міри, що містять 9 або 12 точних основних співпадінь 5' з неспівпадаючим кодоном і 9 точних основних співпадінь 3' з неспівпадаючим кодоном. Після мутагенеза одноланцюгову ДНК з окремих клонів піддали дідезоксі-секвенуванню (Sanger, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)). ДНК, що має мутантну н уклеотидну послідовність, потім трансформували, як описано вище, у штам Е. coli XL1 Blue MRF (Stratagene). Після висівки і ізолювання окремих колоній, як раніше, окремі колонії використали для внесення у 0,5л LB бульйона, що містить 50мкг/мл карбеніцилліна. Після вирощування протягом ночі з струшуванням при 37°С клітки були зібрані за допомогою центрифугування, і мутантну ДНК (у векторі експресії) очистили з використанням стовпців Qiagen tip-500 (Qiagen Inc., Chatsworth, California USA). Фіг.2-6 ідентифікують різні варіанти людської ДНази І, які були одержані. На малюнках та у всьому описі винаході мутація або мутації, які маються у варіанті ДНазі І, позначають абревіатурами, у яких перша літера відповідає однолітерному позначенню амінокислотного залишку у природній людській зрілій ДНазі І (нумерація - як показано на Фіг. 1), а друга літера відповідає однолітерному позначенню амінокислотного залишку у цієї позиції у варіанті Днази І. Наприклад, у варіанті ДНази І, що містить мутацію D53R, залишок аспарагінової кислоти (D) у позиції 53 у природній (натуральній) людській зрілій ДНазі І був замінений залишком аргініна (R). Множинні мутації у одному варіанті позначають подібним чином, з двокрапкою (:), що відділяє кожну з різних мутацій, що маються у варіанті. Наприклад, позначення D53R:Y65A означає, що варіант містить мутацію D53R і мутацію Y65 A. Приклад 2 Експресія варіантів людської ДНази І Клітки людської зародкової нирки 293 (АТСС CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) вирощували у середовищі, що містить сироватку у 150мМ пластикових чашках Петрі. В логарифмічній фазі клітки були піддані спільній транзитній трансфекції 22,5мкг очищеного варіанту ДНК (одержаного, як описано вище) та 17мкг аденовірусної ДНК, з використанням методики осідання фосфатом кальція (Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). Приблизно через 16 годин після трансфекції клітки промили 15мл фосфатного буферізованого сольового розчину і змінили середовище на безсиркову. З кожної чашки, зняли два врожаю клітчастої культури, перший - через 24 або 72 години, а остання - через 96 годин після заміни сироваткового середовища. Таким чином одержали супернатант клітчастої культури, що містить варіант ДНази І, загальною кількістю близько 50мл. Пул суттернатанта культури, зібраного з кожної чашки, піддали концентруванню у 5-50 разів з використанням концентраторів Centriprep 10, та піддали концентрати аналізу для визначення різних біохімічних і біологічних активностей варіантів ДНази І. Концентрати, що містять природну людську ДНазу І, одержували таким же способом, з тим відрізненням, що клітки 293 було піддано транзитній трансфекції плазмідом pRK.DNase.3. Приклад 3 Біохімічні та біологічні активності варіантів людської ДНази І 1. Відносна питома активність Відносна питома активність варіантів ДНази І оцінювалась шляхом порівняння активності варіанту з активністю природної людської ДНази І у двох різних методах аналізу. Зокрема, відносну питому активність варіантів характеризують відношенням концентрації варіанту (ункт/мл), визначеної реакцією на метіловий зелений (Sinicropi, et al., Anal.Biochem. 222:351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)) до концентрації варіанту (у мкг/мл), визначеної аналізом ДНази І по методу ELISA (описаному нижче). В обох методах аналізу активності (реакція на метіловий зелений і ELISA) стандартні криві будували з використанням людської ДНази І Pulmozyme®. Відносні питомі активності природної людської ДНази І і варіантів показані на Фіг.2. Реакція на метіловий зелений (Sinicropi, et al., Anal.Biochem. 222:351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950)) використовує барвник метіловий зелений, який впроваджується приблизно у кожних 10 основ у ДНК, утворюючи зелений субстрат. По мірі того як ДНК розщепляється ДНазою І, барвник метіловий зелений вивільняється і окислюється у безколірну форму. Таким чином, втрата зеленого кольору пропорційна кількості ДНази І, що додають до, зразку який аналізують. Кількість ДНази І, присутня у зразку, оцінюють потім кількісно шляхом порівняння з стандартною кривою, яку будують за результатами реакції з відомими кількостями ДНази І. Аналіз активності ДНази l ELlSA містить покриття пластин мікротітратора козячим поліклональним антитілом анті-ДНази І, додавання зразка, що досліджується, і виявлення будь-якої результуючої пов'язаної ДНази І за допомогою кролячого поліклонального антитіла анті-ДНази І, кон'ъюгованого з пероксидазою хріна (HRP). При додаванні субстрату HRP і кольорового реагента колір проявляється пропорційно кількості ДНази І, присутній у зразку. Потім кількість ДНази І, присутньої у зразку, оцінюєть шляхом порівняння з стандартною кривою, яку будують за результатами взаємодії з відомими кількостями ДНази l. По обом методиках досліджувалась велика кількість розведених розчинів зразків, і по тим величинам, які попали у середній діапазон стандартної кривої, було розраховано середнє значення і потім вираховані стандартні відхилення. Крім того, концентрація ДНази І, визначена по методу ELISA, використалась для стандартизації концентрацій ДНази І в інших методах аналізу, у яких досліджувались варіанти ДНази І (наприклад, у дослідженнях по інгібуванню актином, описаних нижче). II. Інгібування актином гідролітичної активності ДНази І G-актин (Kabsch, et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21:49-76 (1992) був приготовлений менше ніж за 10 днів до використання шляхом діаліза протягом ночі 1мг/мл розчину препарата актина, що випускається серійно, (Sigma, St. Louis, Missouri USA) на 5мМ HEPES, pH 7,2, 0,2мМ СаСІ2, 0,5мМ АТР, 0,5мМ βмеркаптоетанола при 4°С. Після центрифугування при 13000g протягом 5 хвилин кількість G-актина визначалась шляхом вимірювання захоплення при 290нм; 1мг/мл розчину мав захоплення 0,66 оптичної щільності. Кількість препарату G-актину, потрібного для істотного (>50% інгібування), але не повного інгібування ДНК-гідролітичної активності природної людської ДНази І, визначалась у попередніх експериментах у одних і тих ж умовах для всіх аналізів. Чутливість до інгібування актином оцінювали шляхом вимірювання ДНК-гідролітичної активності варіантів у присутності або у відсутності актина одним з двох різних методів аналізом, реакцією на метіловий зелений, описаної вище, і гіперхроматичним аналізом, який заснований на збільшенні абсорбції при 260нм після денатурації і деполімеризації ДНК (Kunitz, J. Gen. Ph ysiol. 33:349-362 (1950); (Kunitz, J. Gen. Ph ysiol. 33:363-377 (1950)). Відсотковий вираз інгібування обраних варіантів у ци х аналізах показано на Фіг.3 та 4. В гіперхроматичному аналізі концентровані супернатанти культури (приготовлені як описано вище, що містять варіанти ДНази l) інкубували без додавання або з додаванням 2-3-кратного молярного надлишку актину у буфері А (25мМ HEPES, рН 7,5, 4мМ СаСl2, 4мМ MgCl 2, 0,1% BSA) протягом години при кімнатній температурі перед додаванням у кювету, що містить 40мкг ДНК у загальному об'ємі для аналізу 1,0мл. Кінцева концентрація варіанту ДНази І у зразку склала приблизно 26нм, за результатами аналізу ELISA. Були вимірені ступені гідролізу ДНК варіантами ДНази І у присутності і у відсутності актина. Відсотковий вираз активності, показаний на Фіг.3 та 4, розраховувалось шляхом визначення відношення ДНК-гідролітичної активності людської ДНази І (природної або мутантної) у присутності актину до її ДНК-гідролітичної активності у відсутності актину і множення на 100. При дослідженні реакцією на метілові зелені концентровані супернатанти культури (приготовлені як описано вище, що містять варіанти ДНази І) інкубували без додавання або з додаванням 1000-кратного молярного надлишку актина у буфері В (25мМ HEPES, рН 7.5, 4мМ СаСІ2, 4мМ MgCl2, 0,1% BSA, 0,01% тимеросала) протягом 16 годин при кімнатній температурі. Концентрацію активного ензима у кожному випадку оцінювали шляхом порівняння з стандартною кривою Pulmozyme. "Відсоток активності" залишеного варіанту прийняли як 100 одиниць відношення активності у присутності актина до активності у відсутності актина. Як показано на Фіг.3 та 4, ДНК-гідролітична активність природної людської ДНази І істотно знижується у присутності актина. Різні варіанти природної людської ДНази І з мутаціями одного і багатьох залишків при порівнянні надаються відносно стійкими до інгібування актинами, оскільки володіють більшою ДНКгідролітичною активністю у присутності актина в порівнянні з природною людською ДНазою І. lll. Аналіз зв'язування актина методом ELISA Метод аналізу, який використовує мікротітратор, був розроблений для вимірювання здатності природної людської ДНази І і варіантів ДНази І пов'язуватись з імобілізованим актином. Спочатку лунки пластини Ma xiSorp (Nunc, Inc. , Naperville, Illinois, USA) покрили 100мкл на лунку людського GC-глобуліна (Calbiochem, La Jolla, California USA), білка, що пов'язує актин (Goldschmidt-Clermont, et al., Biochem. J. 228:471-477 91985), McLeod, et al., J. Biol. Chem. 264:1260-1267 (1989), Houmeida, et al., Eur. J. Biochem. 203:499-503 (1992)), з концентрацією 10мкг/мл у 25мМ HEPES, 4мМ MgCl2, 4мМ СаСl2, рН 7,2, при 4°С, на 16-24 години. Після віддалення GC-глобуліна надмірні реактивні ділянки блокували шляхом додавання 200мкл на лунку буфера С (буфер С аналогічний вищеописаному буфер у В, з добавкою 0,5мМ аденозинтрифосфата; буфер С використовувся у якості розріджувача, зразка що аналізують у всі х подальших етапах, якщо не вказано інше) і інкубували пластину на шейкері протягом 1-2 години при кімнатній температурі. Кожен подальший етап інкубації проводився при кімнатній температурі протягом 1 години на шейкері Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Vineland, New Jersey USA); між всіма етапами пластину спустошували і промивали 6 раз фосфа тним буферізованим сольовим розчином, що містить 0,05% Tween 20 за допомогою устрою промивання пластин Microwash II (Skatron A/S, Norway). Далі, G-актин, приготовлений, як описано вище,розбавили до 50мкг/мл у буфері С, та 100мкл додали у кожну лунку; пластини інкубували і промили, і 100мкл різних розведених розчинів Pulmozyme і середовища клітчастих культур, що містять природні людсьі ДНази І або її варіанти, додавали у лунки і потім пластини інкубували і промивали. Нарешті, 100мкл розведеного 1/25000 розчину кон'югату кролячого поліклонального антитіла проти людської ДНази І з пероксидазою хріна (початкова концентрація штаму становила 465мкг/мл) додали у кожну лунку. Після інкубації і промивання ініціювали проявлення кольору шляхом додавання 100мкл кольорового реагента (профенілендиамін і таблетку січовини/Н2О2 Sigma Fast, розчинними згідно з рекомендаціями виробника) і потім зупинили його шляхом додавання 100мкл 4,5 N H2SO4 Абсорбцію при 492нм записали і побудували криву залежності від концентрації ДНази l, початково доданої у лунку. Для природної людської ДНази ї та тих варіантів, які пов'язувались з актином, були одержані сигмоїдні криві; ці криві шляхом регресивного аналізу привели у відповідність з рівнянням з чотирма параметрами (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11:431-441 (1963); концентрацію кожної ДНази І (природної або мутантної), потрібну для досягнення половини максимального відгук у у аналізі, розрахували по кривим і результат прийняли як величину ЕС 50. Передбачувана молекулярна маса природної людської ДНази І і варіантів склала 37,000Да. Відносна спорідненість зв'язків до актина кожного варіанту ДНази І розраховували шляхом поділення величини ЕС50 варіанту на величину ЕС50 природної людської ДНази І, визначену методом ELISA; результати представлені на Фіг.5. Наприклад, якщо розрахована відносна спорідненість до актину варіанту людської ДНази І дорівнює 5, ця величина означає, що ЕС 50 варіанту у 5 раз більше, ніж ЕС 50 природної людської ДНази І, або, іншими словами, що варіант має спорідненість до актину у 5 раз менше, ніж спорідненість природної людської ДНази І до актину у аналізі ELISA. IV. Дослідження методом стиснення харкотиння Метод стиснення харкотиння (РСТ публікація No. WO 94/10567, опубліковано 11.05.1994) використали для вимірювання відносної в'язкоеластичності харкотиння від пацієнтів, страждаючих муковісцідоза ("CFхаркотиння") до і після інкубації з природною людською ДНазою І і різними варіантами ДНази І. Після змішування CF-харкотиння з зразком ДНази І і інкубації протягом 20 хвилин при кімнатній температурі напівстверджені розчини завантажили у капілярні трубки, які потім центрифугували при 12000об/хв протягом 20 хвилин. Після центрифугування висоту гранул вимірили і порівняли з висотою розчину разом з гранулою. Ці вимірювання потім використали для розрахунку відсотка стиснення харкотиння, яке корелює з в’язкоеластичністю харкотиння. Відсоток стиснення, визначений після обробки CF-харкотиння природної людської ДНази І і актиностійкими варіантами людської ДНази І, представлений на Фіг.6. Ці результати показують, актиностійкі варіанти людської ДНази І більш ефективні, ніж природна людська ДНаза І, у зниженні в'язкоеластичністі CFхаркотиння, визначеної методу стиснення харкотиння. Список послідовностей (1) загальна інформація (і) Заявник: Джінентех, Інк. Лазарус, Роберт А. Шак, Стівен Улмер, Яна С (іі) Назва винаходу: Варіанти людської ДНази 1 (ііі) Кількість послідовностей: 1 (iv) Почтова адреса: (A) Адресат: Джінентех, Інк. (B) Вулиця: 460 Поінт Сан Бруно Бульвар (C) Місто: Сауз Сан Франціско (D) Штат: Калі форнія (E) Країна: США (F) Поштовий код ZIP 94080 (ν) Форма комп'ютерного зчитування: (A) Тип носія: флоппі-диск 5,25 дюймов, 360 Кб (B) Комп'ютер: IBM РС-сумісний (C) Операційна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програмне забезпечення: patin (Genentech) (vi) Дані цій заявки: (A) Номер заявки: (B) Дата заповнення: (C) Класифікація: (vii) Дані пріоритетної заявки: (A) Номер заявки: (B) Дата заповнення: (viii) Інформація о повіреном, агенті: (A) Ім'я: Джонстон, Сін А. (B) Регістраційний номер: 35,910 (C) Діло №Р925 (іх) Ін формація про зв'язок: (A) Телефон: 415/225-3562 (B) Телефакс 415/952-9881 (C) Телекс 910/371-7168 (2) Інформація про послідовність № 1 (і) Характеристика послідовності: (А) До вжина: 260 амінокислот (В)Тип: амінокислота (D) Топологія: лінейна (xi) Опис послідовності №1