Імуностимулятор та спосіб його одержання

Розробка терапевтичної вакцини на основі пухлинних клітин базується по суті на наступних принципах: існують якісні або кількісні відмінності між пухлинними і нормальними клітинами; імунна система в принципі здатна розпізнавати ці відмінності; імунна система може бути стимульована шляхом активної специфічної імунізації вакцинами таким чином, щоб на основі цього розпізнавати ці відмінності і сприяти їхньому відторгненню. Для того, щоб домогтися протипухлинної відповіді, повинні бути виконані щонайменше дві умови: поперше, пухлинні клітини повинні експресувати антигени або неоепітопи, які не існують у нормальних клітинах. По-друге, імунна система повинна бути відповідно активована, щоб реагувати на ці антигени. Істотною перешкодою при імунотерапії пухлин є їхня низька імуногенність, насамперед у людей. Цього навряд чи можна було б очікувати, тому що велика кількість генетичних змін злоякісних клітин повинна була б призводити до утворення пептидних неоепітопів, що розпізнаються в оточенні з молекулами головного комплексу гістосумісності (ГКГ-І) цитотоксичними Т-лімфоцитами. Раніше були виявлені асоційовані з пухлиною і специфічні до пухлини антигени, що являють собою такі неоепітопи, і тому повинні були б бути потенційними мішенями для атаки імунної системи. Те, що імунній системі все-таки не вдається усунути пухлини, що експресують ці епітопи , може, очевидно, відбуватися не через нестачу неоепітопів, а тому, що імунологічна відповідь на ці неоантигени недостатня. Для імунотерапії раку на клітинній основі були розроблені дві загальні стратегії: з одного боку, сприймальна імунотерапія, що служить in vitro поширенню реактивних до пухлини Т-лімфоцитів і їхньому повторному введенню хворим; з іншого боку, активна імунотерапія, що використовує пухлинні клітини з надією на те, що при цьому викликаються або нові, або посилені імунні відповіді проти пухлинних антигенів, що призводять до системної пухлинної відповіді. Протипухлинні вакцини, що складають основу активної імунотерапії, одержували різноманітними способами; прикладом цього є опромінені пухлинні клітини, які переміщають за допомогою імуностимулюючих ад'ювантів, таких, як, наприклад, Corynebacterium рап/ит або Bacillus Calmette Guerin (BCG), щоб викликати імунні реакції проти пухлинних антигенів (Oettgen і Old, 1991). У останні роки для активної протиракової імунотерапії були використані насамперед генетично модифіковані пухлинні клітини , причому введені в пухлинні клітини чужорідні гени відносяться до трьох категорій: Деякі використані для цього пухлинні клітини модифікують генетично, щоб продукувати цитокіни. Місцеве співіснування пухлинних клітин і цитокінового сигналу повинні дати стимул, що викликає протипухлинний імунітет. Огляд, що стосується застосування цієї стратегії, представили Pardoll, 1993, Zatloukal і ін., 1993, і Dranoff і Mulligan, 1995. Що стосується пухлинних клітин, які були змінені генетично, щоб секретувати цитокіни, наприклад, інтерлейкін-2. (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор, (GM-CSF) чи γінтерферон (IFN-γ), або щоб експресувати співстимулюючі молекули, на експериментальних моделях тварин було показано, що вони генерують сильний протипухлинний імунітет (Dranoff і ін., 1993; Zatloukal і ін., 1995). У людини з пухлиною, виявленою вже при огляді, і з толерантністю , що розвилася до пухлини, істотно складніше, однак, повністю охопити каскади комплексних взаємодій так, щоб могла здійснюватися ефективна протипухлинна реакція. Фактична ефективність протипухлинних вакцин, що секретують цитокін, для застосування на людях ще не доведена. Інша категорія генів, за допомогою яких змінюються пухлинні клітини, маючи на увазі їхнє використання в якості протипухлинної вакцини, кодує так звані додаткові білки; мета такої постановки задачі полягає в тому, що для того, щоб пухлинні клітини функціонували в антиген-представляючих клітинах (нео-АПК), змусити їх безпосередньо генерувати специфічні до пухлини Т-лімфоцити. Приклад подібного підходу описується в Ostrand-Rosenberg, 1994. Ідентифікація і виділення пухлинних антигенів (ПА), або похідних від них пептидів, описані, наприклад, Wölfel і ін., 1994а) і 1994б); Carrel і ін., 1993, Lehmann і ін., 1989, Tibbets і ін., 1993, або в опублікованих міжнародних публікаціях WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159, стали передумовою для того, щоб використовувати пухлинні антигени в якості імуногенів для протипухлинних вакцин як у вигляді білків, так і у вигляді пептидів. Протипухлинна вакцина у вигляді пухлинних антигенів як таких не є, однак, задовільним імуногеном, щоб викликати клітинну імунну відповідь, як це було б необхідно для елімінування пухлинних клітин, що несуть пухлинний антиген; також спільне застосування ад'ювантів надавало тільки відносну можливість для підсилення імунної відповіді (Oettgen і Old, 1991). Третя стратегія активної імунотерапії для підвищення ефективності протипухлинних вакцин базується на ксеногенізованих (таких, що перетворилися в чужорідні) аутологічних пухлинних клітинах. В основі цієї концепції лежить припущення, що імунна система реагує на пухлинні клітини, що експресують чужорідний білок, і що в ході цієї реакції викликається також імунна відповідь проти тих пухлинних антигенів (ПА), що представляються пухлинними клітинами вакцини. Огляд цих різноманітних варіантів, при яких пухлинні клітини в розрахунку на посилену імуногенність перетворюються в чужорідні шляхом введення різноманітних генів, поданий Zatloukal і ін., 1993. Центральну роль при регуляції специфічної імунної відповіді відіграє тримолекулярний комплекс, який складається з компонентів, що включають рецептор антигенів Т-лімфоцитів, молекулу ГКГ і його ліганд, що є похідним від білка пептидним фрагментом. Молекули ГКГ-І (або відповідні людські молекули, антигени лейкоцитів людини /HLA/) є пептидними рецепторами, що при строгій специфічності дозволяють здійснити зв'язування мільйонів різноманітних лігандів. Цьому сприяють специфічні до алелів пептидні мотиви, яким властиві наступні критерії специфічності: пептиди мають залежно від гаплотипу ГКГ-І певну довжину, як правило, від восьми до десяти амінокислотних залишків. Звичайно два із положень амінокислот представляють так званий "якір", вони можуть бути зайняті окремою амінокислотою або залишками амінокислот із подібними бічними ланцюгами. Точне розташування якірних амінокислот у пептиді і вимога до їхніх властивостей варіюються гаплотипами ГКГ-І. С-кінець пептидних лігандів часто є аліфатичним або зарядженим залишком. Такі специфічні до алелів мотиви пептидних лігандів для ГКГ-І на цей час відомі серед всього іншого для Н-2Kd, Kb, Кk, Kkml, Db, HLAА*0201, А*0205 і В*2705. У рамках обміну білка всередині клітини регулярні, дегенеровані і чужорідні генні продукти, наприклад, вірусні білки або пухлинні антигени, розкладаються на дрібні пептиди; при цьому одержують деякі потенційні ліганди для молекул ГКГ-І. Таким чином, є передумова для їхнього представлення молекулами ГКГ-І і, як наслідок, виникнення клітинної імунної відповіді, причому до цих пір ще окремо не вияснено, як пептиди продукуються в клітині в якості лігандів ГКГ-І. Підхід, що використовує цей механізм для відчуження пухлинних клітин, в розрахунку на посилення імунної відповіді, полягає в тому, що пухлинні клітини обробляють хімічними мутагенами, як, наприклад, Nметил-N'-нітрозогуанідин. Це повинно призвести до того, що пухлинні клітини мутованих варіантів являють собою похідні від клітинних білків неоантигени, які представляють чужорідні генні продукти (Van Pel і Boon, 1982). Однак, оскільки мутагенні явища випадково розподіляються через геном і, крім того, беручи до уваги, що окремі клітини в результаті різноманітних мутагенних явищ також представляють різноманітні неоантигени, цей спосіб важко контролювати в якісному і кількісному відношенні. При іншому підході пухлинні клітини перетворюють у чужорідні в результаті того, що їх піддають трансфекції генами одного або кількох чужорідних білків, наприклад, геном чужорідної молекули ГКГ-І, або білків ГКГ відмінного гаплотипу, що потім міститься появляється у певній формі на клітинній поверхні (заявка на європейський патент 0 569 678; Plautz і ін., 1993; Nabel і ін., 1993). Цей підхід ґрунтується на вищезгаданому положенні, що пухлинні клітини, коли вони вводяться у вигляді вакцини з клітинної маси, розпізнаються як чужорідні за допомогою експресованого білка, або похідних від нього пептидів, або що у випадку експресії аутологічних молекул ГКГ-І за допомогою підвищеної кількості молекул ГКГ-І на клітинній поверхні оптимізується представлення пухлинного антигену. Зміна пухлинних клітин за допомогою чужорідного білка може призвести до того, що клітини представляються в оточенні ГКГ похідними від чужорідного білка пептидами і зміна від "свого" до "чужого" відбувається в рамках розпізнавання комплексу ГКГ-пептид. Розпізнавання білка або пептида як чужорідного має наслідком те, що в ході імунного розпізнавання виробляється імунна відповідь не тільки стосовно чужорідного білка, але також і стосовно 3 пухлинних антигенів пухлинних клітин. У ході цих процесів активуються антиген-представляючі клітини (АПК), що піддають процесингу наявні в пухлинній клітині вакцини білки (включаючи ПА) у пептиди і використовують у якості лігандів для їхніх власних молекул ГКГ-І і ГКГ-ІІ. Активовані, навантажені пептидом АПК переходять у лімфатичні вузли, де декотрі з простих Т-лімфоцитів розпізнають в АПК похідні від ПА пептиди і можуть їх використовувати в якості стимулу для клонової експансії, іншими словами, для генерації специфічних до пухлини цитотоксичних Т-лімфоцитів і Т-клітин-хелперів. У основі поданого винаходу лежить задача приготування нової протипухлинної вакцини на базі перетворених у чужорідні клітин пухлини, за допомогою якої може бути викликана активна клітинна протипухлинна імунна відповідь. При розв'язанні поставленого завдання виходили з наступних міркувань: тоді, як імунна система толерантна до незлоякісних нормальних клітин організму, організм реагує імунним захистом на нормальну клітину, коли вона, наприклад, внаслідок вірусної інфекції синтезує чужорідні організмові білки. Причина цього полягає в тому, що молекули ГKГ-I представляють чужорідні пептиди, що походять від чужорідних організмові білків. І, як наслідок, імунна система відзначає, що щось небажане, стороннє відбувається з цією клітиною. Клітина ліквідується, АПК активуються і генерується новий специфічний імунітет проти клітин , що експресують чужорідні білки. Хоча пухлинні клітини і містять відповідні специфічні до пухлини пухлинні антигени, вони, проте, самі по собі недостатні вакцини, тому що через незначну імуногенність вони ігноруються імунною системою. Якщо пухлинну клітину навантажують на відміну від відомих приготувань не чужорідним білком, а чужорідним пептидом, то додатково до чужорідних пептидів власні пухлинні антигени клітини також розпізнаються цією клітиною як чужорідні. Шляхом відчуження пептидом повинно стати можливим, щоб викликана чужорідними пептидами клітинна імунна відповідь спрямовувалася проти пухлинних антигенів. Причина недостатньої імуногенності пухлинних клітин не може бути тільки якісною проблемою, але є і кількісною. Для похідного від пухлинного антигену пептида це може означати, що, хоча він і представляється молекулами ГКГ-І, проте, у такій концентрації, що занадто незначна, щоб викликати клітинну специфічну до пухлини імунну відповідь. Підвищення кількості специфічних до пухлини пептидів у пухлинній клітині повинно було, таким чином, також сприяти перетворенню пухлинної клітини в чужорідну, що призводить до виникнення клітинної імунної відповіді. На відміну від варіантів, при яких пухлинний антиген або похідний від нього пептид так представлявся на поверхні клітини, що він піддавався трансфекції за допомогою ДНК, яка кодує відповідний білок або пептид, як описано в опублікованих міжнародних публікаціях WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 і WO 95/00159, варто було б підготувати таку вакцину, що при однократному одержанні викликає ефективну імунну відповідь. Mandelboim і ін., 1994 і 1995, запропонували інкубувати клітини RMA-S з пептидами, похідними від пухлинних антигенів, щоб при цьому викликати клітинну імунну відповідь проти відповідних аутогенних пухлинних антигенів. Із запропонованих Mandelboim і ін. для вакцинування пухлини клітин приймаються позначені RMA-S (Karre і ін., 1986), щоб вони могли виконувати функції АПК. Вони характеризуються тою особливістю, що їхні молекули HLA на клітинній поверхні вільні, завдяки дефектові в клітинному механізмі транспорту антигенних пептидів (ТАП-механізм, відповідальний за процесинг пептидів і їхнє зв'язування при молекулах HLA). При цьому в розпорядженні знаходяться клітини для навантаження пептидом, вони також діють ніби в якості представленого носія для введеного ззовні пептиду. Спрямована протипухлинна дія ґрунтується на виникненні імунної відповіді проти представленого в клітинах пептида, що пропонується імунній системі без безпосереднього оточення антигенним складом пухлинної клітини. Винахід стосується протипухлинної вакцини для введення хворому, що складається з пухлинних клітин, які представляються похідними від пухлинних антигенів пептидами в оточенні HLA і, щонайменше, частина яких має, як мінімум, один гаплотип ГКГ-І хворого на клітинній поверхні, і які були навантажені одним або кількома пептидами а) і/ або б) таким чином, що пухлинні клітини в оточенні з пептидами розпізнаються як чужорідні імунною системою хворого і викликають клітинну імунну відповідь, причому пептиди а) діють як ліганди для гаплотипу ГКГ-І, однакового для хворого і пухлинних клітин вакцини, і відрізняються від пептидів, які є похідними білків, що експресуються клітинами хворого, або б) діють як ліганди для гаплотипу ГКГ-І, однакового для хворого і пухлинних клітин вакцини, і походять від пухлинних антигенів, що експресуються клітинами хворого і знаходяться в пухлинних клітинах вакцини в концентрації вищій, ніж концентрація пептиду, що походить від того ж самого пухлинного антигену, який експресувався в пухлинних клітинах хворого. Молекули ГКГ людини відповідно до міжнародних традицій надалі позначаються також "HLA" (антиген лейкоцитів людини). Під поняттям " клітинна імунна відповідь" слід розуміти опосередкований цитотоксичними Т-лімфоцитами імунітет, що внаслідок генерування специфічних до пухлини цитотоксичних позитивних до CD8 Т-лімфоцитів і позитивних до CD4 Т-хелперів спричиняє руйнування пухлинних клітин. Дія вакцини з пухлинних клітин відповідно до винаходу засновується насамперед на тому, що імуногенна дія наявного в пухлинних клітинах запасу пухлинних антигенів посилюється пептидом. Пептиди типу а) надалі позначають теж як "чужорідні пептиди" або "ксенопептиди". В одному із варіантів здійснення винаходу пухлинні клітини вакцини .аутологічні. Причому мова йде про клітини, які беруться у хворого, що проходить лікування, обробляються ex vivo пептидом(пептидами) а) і/ або б), при необхідності інактивуються і потім знову вводяться хворому. (Способи одержання аутологічних протипухлинних вакцин описуються в міжнародній публікації WO 94/21808, де посилаються на їхнє відкриття). В одному із варіантів здійснення винаходу пухлинні клітини є алогенними, тобто вони не належать хворому, що піддається лікуванню. Застосуванню алогенних клітин насамперед віддають перевагу тоді, коли відіграють роль економічні міркування; одержання індивідуальних вакцин для кожного окремого хворого вимагає затрат праці і грошей, крім того, виникають труднощі з окремими хворими при ex vivo культивуванні пухлинних клітин, тому що не одержують достатньо великої кількості пухлинних клітин, щоб можна було приготувати вакцину. У випадку алогенних пухлинних клітин слід враховувати, що вони повинні підходити підтипові HLA хворого. При використанні чужорідних пептидів категорії а) мова йде у випадку алогенних пухлинних клітин про клітини однієї або декількох клітинних ліній, із яких, як мінімум, одна лінія клітин експресує, щонайменше, один, переважно декілька пухлинних антигенів, які ідентичні пухлинним антигенам хворого, що піддається лікуванню , тобто протипухлинна вакцина відповідає ознакам пухлини хворого. Внаслідок цього забезпечується те, що викликана представленим ГКГ-І чужорідним пептидом у пухлинних клітинах вакцини клітинна імунна відповідь, що призводить до поширення специфічних до пухлини цитотоксичних Т-лімфоцитів і Т-хелперів, направляється також проти пухлинних клітин хворого, тому що вони експресують такий же пухлинний антиген, як і клітини вакцини. Наприклад, якщо потрібно піддати лікуванню протипухлинною вакциною відповідно до винаходу хвору раком молочної залози з метастазами, що виявляють мутацію Her2/neu (Ailred і ін., 1992; Peopoles і ін., 1994; Yoshino і ін., 1994 a); Stein і ін., 1994; Yoshino і ін., 1994 б); Fisk і ін., 1995; Han і ін., 1995), вводять у якості вакцини алогенні, узгоджені з гаплотипом HLA хворого пухлинні клітини, що теж експресують мутований Her2/neu у якості пухлинного антигену. Раніше виділяли численні пухлинні антигени і з'ясовували їхній зв'язок з одним або кількома раковими захворюваннями. Відомі інші приклади подібних пухлинних антигенів (Fenton і ін., 1993; Gedde Dahl і ін., 1992; Jung і ін., 1991; Morishita і ін., 1993; Peace і ін., 1991; Skipper і ін., 1993), пухлинні антигени MAGE (Boon і ін., 1994; Slingluff і ін., 1994; van der Bruggen і ін., 1994; міжнародна публікація WO 92/20356); огляд різноманітних пухлинних антигенів на додачу до цього наводить Carrel і ін., 1993. У таблиці наводиться огляд відомих, застосовуваних у рамках винаходу пухлинних антигенів і похідних від них пептидів. Пухлинні антигени хворого визначають загалом стандартними способами в ході встановлення діагнозу і плану лікування, наприклад, за допомогою аналізів на основі цитотоксичних Т-лімфоцитів із специфічністю до визначального пухлинного антигену. Такі аналізи були серед іншого описані Нérin і ін., 1987; Coulie і ін., 1993; Сох і ін., 1994; Rivoltini і ін., 1995; Kawakami і ін., 1995; а також у міжнародній публікації WO 94/14459; ці літературні джерела також включають різноманітні пухлинні антигени або похідні від них пептидні епітопи. Пухлинні антигени, що виникають на поверхні клітин, можуть бути також виявлені за допомогою імунних аналізів на основі антитіл. Коли пухлинні антигени є ферментами, наприклад, тирозиназами, вони можуть бути виявлені за допомогою ферментних аналізів. У іншому варіанті здійснення винаходу як вихідний матеріал для вакцини може бути використана суміш аутологічних і алогенних пухлинних клітин. Цей варіант здійснення винаходу знаходить, зокрема, застосування, коли експресовані хворим пухлинні антигени невідомі, або тільки неповністю охарактеризовані, і/ або коли алогенні пухлинні клітини експресують тільки частину пухлинних антигенів хворого. Шляхом домішування аутологічних, оброблених чужорідним пептидом пухлинних клітин забезпечується те, що, принаймні, частина пухлинних клітин вакцини містить по можливості велику кількість пухлинного антигену власне хворого. У випадку алогенних пухлинних клітин мова йде про такі, що в одному або кількох гаплотипах ГКГ-І збігаються з такими для хворого. Пептиди типу а) і б) відповідно до вимоги зв'язуватися з молекулою ГКГ-І визначають відповідно їхньої послідовності за допомогою підтипу HLA хворого, котрому повинна вводитися вакцина. Визначення підтипу HLA хворого представляє, таким чином, одну з найважливіших умов для вибору або побудови підхожого пептиду. При застосуванні протипухлинної вакцини відповідно до винаходу у вигляді аутологічних пухлинних клітин автоматично виникає підтип HLA через генетично детерміновану специфічність молекули HLA хворого. Підтип HLA хворого може бути визначений стандартними способами, як, наприклад, за допомогою мікротесту лімфотоксичності (MLC-тест, MLC= змішана культура лімфоцитів) (Practical Immunol., 1989). MLC-тест ґрунтується на принципі змішування виділених із крові хворого лімфоцитів спочатку з антисироваткою або моноклональним антитілом проти певної молекули HLA в присутності кролячого комплемента (С). Позитивні клітини піддають лізису і забарвлюють за допомогою індикаторного барвника, тоді як непошкоджені клітини залишаються незабарвленими. Для визначення гаплотипу HLA хворого можна також використовувати полімеразну ланцюгову реакцію зі зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) (Curr. Prot. Моl. ВІоІ. , глава 2 і 15). Для цього в хворого беруть кров і виділяють із неї РНК. Цю РНК піддають спочатку зворотній транскрипції, завдяки чому утворюється кДНК хворого. кДНК служить матрицею для ПЛР із праймерними парами, що специфічно сприяють ампліфікації фрагмента ДНК, що відноситься до певного гаплотипу HLA. Смуга ДНК, що спостерігається при електрофорезі в агарозному гелі свідчить про те, що хворий експресує відповідну молекулу HLA. Якщо смуги не спостерігають, значить хворий у цьому відношенні негативний. Для кожного хворого очікуються, щонайменше, дві смуги. При застосуванні винаходу у вигляді алогенної вакцини використовують клітини, із яких щонайменше частина узгоджується, як мінімум, з одним підтипом HLA хворого. Приймаючи до уваги по можливості широку використовуваність вакцини відповідно до винаходу, доцільно виходити із суміші різних ліній клітин, що експресують два або три різноманітні найчастіше представлені підтипи HLA, причому, зокрема, маються на увазі гаплотипи HLA-A1 і HLA-A2. За допомогою вакцини на основі суміші алогенних пухлинних клітин, що експресують ці гаплотипи, можна охопити широку популяцію хворих; таким чином, можна захистити біля 70% європейського населення (Mackiewicz і ін., 1995). Визначення застосовуваних відповідно до винаходу пептидів через підтип HLA характеризує їх щодо їхніх якірних амінокислот і їхньої довжини; певні якірні положення і довжина гарантують, що пептиди підходять один до одного в лінії зв'язування пептидів відповідних молекул HLA так, щоб бути представленими на клітинній поверхні пухлинних клітин, які утворюють вакцину, таким чином, що клітини впізнаються як чужорідні. Внаслідок цього стимулюється імунна система і викликається клітинна імунна реакція також проти пухлинних клітин хворого. Пептиди, що у рамках поданого винаходу є підхожими в якості чужорідних пептидів відповідно до категорії а), є в розпорядженні в широкому діапазоні. їхня послідовність може походити від імуногенних білків , що зустрічаються в природі, або їхніх клітинних продуктів розщеплення, наприклад, вірусних або бактеріальних пептидів, або від чужорідних хворому пухлинних антигенів. Підхожі чужорідні пептиди можуть, наприклад, бути вибрані на основі відомих у літературі пептидних послідовностей, наприклад, описаних Rammensee і ін., 1993, Falk і ін., 1991, для різноманітних мотивів HLA, на основі пептидів, похідних відімуногенних білків різноманітного походження, що підходять один до одного в лініях зв'язування молекул відповідних підтипів HLA. Для пептидів, які мають часткову послідовність білка з імуногенною дією, можна на основі уже відомої поліпептидної послідовності, або, при необхідності, поліпептидних послідовностей, що ще потребують визначення, твердо встановити шляхом регулювання послідовностей, з огляду на специфічні до HLA вимоги, які пептиди є підхожими кандидатами. Приклади підхожих пептидів зустрічаються, наприклад, у Rammensee і ін., 1993, Falk і ін., 1991, і в Rammensee і ін., 1995, а також у міжнародній публікації WO 91/09869 (ВІЛ-пептиди); похідні від пухлинних антигенів пептиди були серед інших описані в опублікованих міжнародних публікаціях WO 95/00159, WO 94/05304. Є посилання на публікації цих літературних джерел і цитовані в них статті, пов'язані з пептидами. Кращими кандидатами для ксенопептидів є пептиди, імуногенність котрих уже була продемонстрована, а також пептиди, що є похідними відомих імуногенів, наприклад, вірусних або бактеріальних білків. Подібні пептиди демонструють на основі їхньої імуногенності сильну реакцію в MLC-тесті. Замість того, щоб застосовувати справжні пептиди, а також незмінені, що походять від природних білків, можна на підставі указаних мінімальних вимог до послідовності справжнього пептиду стосовно якірних положень і довжини використовувати будь-які варіанти, у цьому випадку застосовуються також синтетичні пептиди відповідно до винаходу, котрі одержують відповідно до вимог до ліганда ГКГ-І. Так , наприклад, виходячи з ліганда для типу Н1-Кd Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lie (LFEAIEGFI), можуть бути змінені амінокислоти, що не є якірними амінокислотами, щоб одержати пептид із послідовністю Phe Phe He Gly Ala Leu Glu Glu lle (FFIGALEEI); крім того, якірна амінокислота llе у положенні 9 може бути заміщена Leu. Пептиди, що походять від пухлинних антигенів, а також від білків, що експресуються в пухлинній клітині і які не містяться у відповідній нетрансформованій клітині, або містяться в значно зменшеній концентрації, можуть застосовуватися в рамках поданого винаходу як пептиди типу а) і/ або типу б). Довжина пептиду відповідає переважно у відношенні зв'язування на молекулі ГКГ-І необхідній мінімальній послідовності від 8 до 10 амінокислот із необхідними якірними амінокислотами. При необхідності пептид може бути подовжений також по С- і/або N-кінцю, якщо це подовження не завдає шкоди зв'язувальній здатності, або подовжений на мінімальну послідовність пептид може брати участь у клітинному процесингу. У одному із варіантів здійснення винаходу пептид може бути подовжений за допомогою негативно заряджених амінокислот, або можна вставити негативно заряджені амінокислоти в пептид і по інших положеннях, ніж положення якірних амінокислот, щоб досягти електростатичного зв'язування пептиду на полікатіоні, наприклад, полілізині. Під поняття "пептиди" у рамках поданого винаходу підпадають відповідно до визначення також довші фрагменти білків, або повні білки, для яких гарантовано, що після застосування АПК вони перетворюються в пептиди, що підходять молекулі ГКГ. У цьому варіанті здійснення винаходу антиген, таким чином, вставляється не у вигляді пептиду, а у вигляді білка, або фрагмента білка, або у вигляді суміші білків, або фрагментів білків. Білок представляє антиген, або пухлинний антиген, від якого походять отримані після процесингу фрагменти. Білки або фрагменти білків, що відносяться до клітин, піддаються процесингу і можуть після цього в оточенні ГКГ представляти імуноефекторні клітини і, таким чином, викликати або посилювати імунну відповідь (Вгасіаіе і Вгасіаіе, 1991; Kovacsovics Bankowski і Rock, 1995; York і Rock, 1996). У випадку застосування білків або білкових фрагментів можна підтвердити ідентичність кінцевих продуктів після процесингу за допомогою хімічного аналізу (деградація по Едману або мас-спектрометрія фрагментів після процесингу; порівняйте оглядову статтю Rammensee і ін., 1995, а також цитовані в ній оригінальні джерела), або біологічних аналізів (здатність АПК до стимуляції Т-лімфоцитів, специфічних до процесованих фрагментів). Вибір кандидатів у пептиди з огляду на їхню придатність в якості чужорідних пептидів здійснюється в принципі в декілька етапів: загалом, доцільно для серійних досліджень спочатку перевірити кандидатів в тесті по зв'язуванню пептиду на здатність зв'язуватися з молекулою ГКГ-І. Підхожим способом дослідження є, наприклад, заснований на проточній цитометрії аналіз, що використовує установку для сортування клітин зі збудженнямфлуоресценції (FACS-аналіз) (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage™ User's Guide, 1994; CELL Quest™ User's Guide, 1994). Причому пептид мітять флуоресцентним барвником, наприклад, флуоресцеїнізотіоціанатом (ФІТЦ) і вносять у пухлинні клітини, що експресують відповідну молекулу ГКГ-І. При протіканні окремі клітини піддаються впливові лазерного променя певної довжини хвилі; вимірюють випромінювану флуоресценцію, вона залежить від кількості зв'язаного клітиною пептиду. Іншим способом визначення зв'язаної кількості пептиду є Скетчард-блот. Для цього використовують пептид, мічений 125J або іонами рідкісноземельних металів (наприклад, європієм). Клітини навантажують при 4°С різноманітними певними концентраціями пептиду від 30 до 240 хвилин. Для визначення неспецифічної обмінної взаємодії пептиду з клітинами додають до окремих проб надлишок неміченого пептиду, що перешкоджає специфічній взаємодії міченого пептиду. Потім клітини промивають, при цьому усувається неспецифічний асоційований із клітинами матеріал. Кількість зв'язаного клітиною пептиду встановлюють або в сцинтиляційному лічильнику на підставі виміряної радіоактивності, або в придатному для вимірювання довгоживучої флуоресценції фотометрі. Обробку отриманих у такий спосіб даних здійснюють стандартними способами. При другому підході кандидати з підхожими властивостями для зв'язування випробовуються на їхню імуногенність. Імуногенність ксенопептидів, що походять від білків, чия імуногенна дія невідома, може, наприклад, бути досліджена за допомогою MLC-тесту, пептиди, використовувані в цьому тесті, який також доцільно проводити в серії з різноманітними пептидами, причому в якості стандарту доцільно застосовувати пептид із відомою імуногенною дією, викликають особливо сильну реакцію і придатні для розглянутого винаходу. Інша можливість випробування пептидних кандидатів, що зв'язують ГКГ-І на їхню імуногенність полягає в тому, щоб досліджувати зв'язування пептидів при Т2-лімфоцитах. Подібний тест ґрунтується на характерній рисі Т2-лімфоцитів (Alexander і ін., 1989) або клітин RMA-S (Kärre і ін., 1986) брати участь у недостатній кількості в механізмі транспорту антигенний пептид - пептид і спочатку, крім того, представляти стабільні молекули ГКГ-І, коли на них наносять пептиди, що представляються в оточенні ГКГ-І. Для тесту використовують, наприклад, Т2-лімфоцити або клітини RMA-S, що стабільно піддаються трансфекції за допомогою гена HLA, наприклад, генів HLA-A1 і/або HLA-A2. Якщо клітини навантажують пептидами, які є добрими лігандами ГКГ-І, тому що вони таким чином представляються в оточенні ГКГ-І, що можуть розпізнаватися імунною системою як чужорідні, то такі пептиди сприяють тому, що молекули HLA виявляються в значній кількості на клітинній поверхні. Доказ наявності антигенів лімфоцитів людини на клітинній поверхні, наприклад, за допомогою моноклональних антитіл, дозволяє ідентифікувати підхожі пептиди (Malnati і ін., 1995; Sykulev і ін., 1994). У цьому випадку також доцільно застосувати стандартний пептид із відомою хорошою здатністю до зв'язування HLA або ГКГ. В одному варіанті здійснення винаходу аутологічна або алогенна пухлинна клітина вакцини може мати декілька ксенопептидів із різними послідовностями. Застосовані пептиди можуть у даному випадку, з одного боку, так відрізнятися, що вони зв'язуються при різних підтипах HLA. Цим може досягатися те, що охоплюються деякі або всі підтипи HLA хворого або великої групи хворих. Вакцину вводять у формі, отриманій після опромінення. Інша, при необхідності додаткова мінливість стосовно представлених у пухлинній клітині ксенопептидів, може полягати в тому, що пептиди, зв'язані з певним підтипом HLA, відрізняються щодо їхньої не важливої для зв'язування HLA послідовності тим, що вони, наприклад, походять від Ділків різного походження, наприклад, вірусних і/ або бактеріальних білків. Від однієї такої мінливості, що надає вакцинованому організмові великий діапазон при відчуженні, можна очікувати посилення стимуляції імунної відповіді. У варіанті здійснення винаходу, коли протипухлинна вакцина складається із суміші алогенних пухлинних клітин різних клітинних ліній, а також при необхідності додатково з аутологічних пухлинних клітин, всі без винятку пухлинні клітини можуть бути оброблені однаковим/однаковими пептидом/пептидами або пухлинні клітини різноманітного походження можуть також мати в кожному випадку різноманітні ксенопептиди. У рамках проведених досліджень по представленому винаходу в якості чужорідного пептиду типу а) застосовували вірусний пептид із послідовністю Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe llе, що походить від гемаглютиніну вірусу грипу і є лігандом для типу Н2-Kd; якірні амінокислоти підкреслені. За допомогою цього вірусного пептиду, що зустрічається в природі, у якості чужорідного пептиду була отримана протипухлинна вакцина і випробувана на тваринній моделі (модель меланоми і модель раку товстого кишечника). Інший вірусний пептид із послідовністю Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met, що походить від нуклеопротеїну вірусу грипу і є лігандом гаплотипу HLA-1 H2-Kb (Rammensee і ін., 1993; якірні амінокислоти підкреслені), був використаний для одержання протипухлинної вакцини; захисну дію вакцини було підтверджено на іншій моделі меланоми. Була отримана інша вакцина таким чином, що пухлинні клітини перетворювалися в чужорідні за допомогою чужорідного пептиду з послідовністю Phe Phe lle Gly Ala Leu Glu Glu lle (FFIGALEEI). При цьому мова йде про синтетичний, раніше невідомий в природі пептид. Тому при виборі послідовності було важливо, щоб виконувалися вимоги щодо придатності в якості ліганда для молекули ГКГ-І типу H2-Kd. Придатність пептиду для того, щоб викликати протипухлинний імунітет відповідно до концепції активної імунотерапії, була підтверджена на ракові товстого кишечника миші СТ-26 (сингеннии для мишиного штаму Balb/c). У іншому варіанті здійснення винаходу протипухлинна вакцина може містити, крім того, аутологічні і/ або алогенні пухлинні клітини і/ або фібробласти, що піддаються трансфекції за допомогою цитокінових генів. У міжнародній публікації WO 94/21808, а також у роботі Schmidt і ін., 1995 (на цю публікацію посилаються) описуються ефективні протипухлинні вакцини, що були отримані за способом транспорту ДНК, позначеному як "трансферин-трансфекція", за допомогою IL-2-експресуючого вектора (цей спосіб ґрунтується на опосередкованому рецептором ендоцитозі і використовує клітинний ліганд, кон'югований із полікатіоном, таким, як, наприклад, полілізин, зокрема, трансферин, для утворення комплексу з ДНК, а також ендосомолітично ефективний реагент, наприклад, аденовірус). Переважно змішують оброблені пептидом пухлинні клітини і клітини, що експресують цитокін, в співвідношенні 1:1. Коли, наприклад, змішують вакцину, що секретує IL-2, яка продукує 4.000 одиниць IL-2 на 1х106 клітин, із 1х106 оброблених пептидом пухлинних клітин, можна отриману в такий спосіб вакцину використовувати для двох обробок, причому припускається оптимальне дозування від 1.000 до 2.000 одиниць IL-2(Schmidt і ін., 1995). При комбінації цитокінової вакцини з обробленими пептидом пухлинними клітинами може бути вигідно об'єднана дія обох типів вакцини. Обробку клітин, а також приготування готової лікарської форми вакцини відповідно до винаходу здійснюють звичайним способом, як, наприклад, описано в роботі "Біологічна терапія раку", 1991, або в міжнародній публікації WO 94/21808. У іншому аспекті винахід стосується способу одержання протипухлинної вакцини, що складається з пухлинних клітин, для введення хворому. Спосіб відповідно до винаходу відрізняється тим, що пухлинні клітини, що представляються похідними від пухлинних антигенів пептидами в оточенні HLA і, щонайменше, частина яких експресує, як мінімум, один гаплотип ГКГ-І хворого, оброблюють одним або кількома пептидами, які а) діють у якості лігандів для гаплотипу ГКГ-І, однакового для хворого і пухлинних клітин вакцини, і відрізняються від пептидів - похідних білків, що експресуються клітинами хворого, або котрі б) діють у якості лігандів для гаплотипу ГКГ-І, однакового для хворого і пухлинних клітин вакцини, і походять від пухлинних антигенів, експресованих клітинами хворого, причому пухлинні клітини інкубують з одним або декількома пептидами а) і/або б) доти і у такій кількості в присутності органічного полікатіона, поки пептиди зв'яжуться на пухлинних клітинах таким чином, що вони в оточенні з пухлинними клітинами розпізнаются імунною системою хворого як чужорідні і викликають клітинну імунну відповідь. Кількість пептиду складає переважно від приблизно 50мкг до приблизно 160мкг на 1x105 до 2x107 клітин. У випадку використання пептиду категорії б) концентрація може також бути вищою. Для цих пептидів важливо, щоб їхня концентрація в пухлинних клітинах вакцини відносно концентрації пептиду - похідного того ж самого пухлинного антигену у пухлинних клітинах хворого до такого ступеня збільшувалась, щоб пухлинні клітини вакцини розпізнавались як чужорідні і викликали клітинну імунну відповідь. Підхожими полікатіонами вважаються гомологічні органічні полікатіони, як, наприклад, полілізин, поліаргінін, поліорнітин, або гетерологічні полікатіони з двома або декількома різними позитивно зарядженими амінокислотами, причому ці полікатіони можуть мати різну довжину ланцюгів, далі непептидні синтетичні полікатіони, як поліетиленімін, природні білки полікатіонного характеру, що зв'язують ДНК , наприклад, гістони або протаміни, або їхні аналоги, або їхні фрагменти, а також спермін або спермідини. Підхожими органічними полікатіонами в рамках поданого винаходу вважаються також ліпіди у вигляді полікатіонів (Feigner і ін., 1994; Loeffler і ін., 1993; Remy і ін., 1994; Behr, 1994), що, серед іншого, є в продажі - такі, як трансфектам, ліпофектамін або ліпофектин. У якості полікатіона вводять переважно полілізин (пЛ), довжина ланцюга якого складає від приблизно ЗО до приблизно 300 залишків лізину. Необхідна кількість полікатіону відносно пептиду може бути визначена, зокрема, емпірично. У випадку використання полілізину і ксенопептидів категорії а) співвідношення мас пЛ : пептид складає переважно приблизно від 1:4 до приблизно 1:12. Тривалість інкубування складає загалом від 30 хвилин до 4 годин. Вона ще регулюється залежно від того, на який момент часу досягається максимальне навантаження пептидом; за ступенем навантаження можна стежити за допомогою аналізу, що використовує установку для сортування клітин із збудженням флуоресценції (FACS-аналіз), і таким чином визначають необхідну тривалість інкубування. У іншому варіанті здійснення винаходу вводять полілізин у, як мінімум, частково кон'югованій формі. Переважно частина полілізину використовується в кон'югованій із трансферином (ТФ) формі (кон'югат трансферина-полілізину, ТФпЛ, сюди також відносяться дані, на які посилаються в міжнародній публікації WO 94/21808), причому масове співвідношення пЛ : ТФпЛ становить приблизно 1:1. Замість трансферину полілізин може бути кон'югований з іншими білками, наприклад, з описаними в міжнародній публікації WO 94/21808 у якості факторів інтерналізації клітинними лігандами. При необхідності обробку пухлинних клітин проводять ще в присутності ДНК. Доцільно, щоб ДНК існувала у виді плазміди, переважно плазміди, незалежної від послідовностей, що кодують функціональні еукаріотні білки, а також у вигляді контрольного вектора. Як ДНК може бути використана в принципі кожна звичайно застосовувана функціонально отримана плазміда. Співвідношення кількості ДНК і полікатіона, при необхідності частково кон'югованого з білком, наприклад, пЛ, ТФпЛ або суміші пЛ і ТФпЛ, становить переважно приблизно від 1:2 до приблизно 1:5. Тривалість інкубування, кількість і вид полікатіона відносно кількості пухлинних клітин і/ або кількості пептида або, вірніше, яка частина полікатіона або з яким білком вигідно кон'югується, перевага присутності ДНК або її кількість можуть бути визначені емпірично. Для цього варіюють окремі параметри способу і пептиди в ідентичних умовах доставляють у пухлинні клітини і контролюють, наскільки ефективно пептиди зв'язуються на пухлинних клітинах. Для цього придатним способом є FACS-аналіз. Спосіб згідно винаходу придатний, окрім обробки пухлинних клітин, також і для обробки інших клітин. Замість пухлинних клітин аутологічні, а також власні фібробласти хворого або клітини ліній клітин фібробластів, що або узгоджуються з підтипом HLA хворого, або піддаються трансфекції відповідним геном ГКГ-І, можуть бути навантажені відповідно до способу згідно винаходу одним або кількома пептидами похідними пухлинних антигенів, що експресуються пухлинними клітинами хворого. Оброблені в такий спосіб і опромінені фібробласти можуть самі по собі, або в суміші з обробленими пептидом пухлинними клітинами, бути застосовані в якості протипухлинної вакцини. У іншому варіанті здійснення винаходу замість фібробластів способом відповідно до винаходу можуть бути оброблені дендритні клітини . Дендритні клітини є АПК шкіри, вони можуть бути на вибір навантажені in vitro, тобто, виділені в хворого клітини змішують in vitro з одним або кількома пептидами, причому пептиди походять від пухлинних антигенів хворого і зв'язуються на молекулі ГКГ-І або ГКГ-І І хворого. У іншому варіанті здійснення винаходу ці клітини також in vivo можуть бути навантажені пептидом. Для цього вводять шляхом ін'єкції комплекси з пептиду, полікатіона і, за необхідності, ДНК переважно внутрішньошкірно, оскільки дендритні клітини особливо часто виявляються в шкірі. У рамках поданого винаходу одержували комплекс із пептиду з ТФпЛ або пЛ для переносу в клітини СТ-26 і з ТФпЛ і нефункціональною плазмідою (контрольний вектор) для переносу в клітини М-3. У системі СТ-26 було твердо встановлено, що піддана відчуженню за допомогою пептида опромінена протипухлинна вакцина генерувала ефективний імунітет проти пухлини: 75% вакцинованих мишей могли елімінувати симптоматику пухлини, що у всіх контрольованих тварин, які або не отримували вакцини, або отримували вакцину без ксенопептиду, призводила до утворення пухлини. У системі М-3 такий же ксенопептид в умовах, що виявляють ще вищу ймовірність утворення пухлини для організму, випробовували в експерименті, що повторював ситуацію для людей. Мишей із метастазами вакцинували опроміненими клітинами М-3 із ксенопептидом. У 87,5% вакцинованих у такий спосіб мишей змогли зникнути метастази, у той же час усім необробленим мишам і 7 із 8 мишей із пухлинами вводили вакцину без ксенопептида. Крім того, було твердо встановлено, що величина системної імунної відповіді при використанні протипухлинної вакцини залежить від способу, за допомогою якого пептид доставляється в пухлинні клітини. Коли пептид постачали клітинам за допомогою полілізину/ трансферину, ефект був чітко виражений, ніж тоді, коли клітини інкубували 24 години з пептидом ("імпульси"). Також мало ефективним було ад'ювантне додавання пептиду до опромінених вакцин. При трансферин-трансфекції може бути гарантоване або ефективне надходження пептиду в клітини, або це ще сприяє такому навантаженню полілізином/ трансферином, щоб пептид залишався прикріпленим на клітинній мембрані таким чином, щоб фізично знаходився близько до молекули ГКГ-І і щоб він потім міг із нею зв'язатися, причому, щоб він міг на основі його сильної спорідненості витиснути більш слабко зв'язані клітинні пептиди. Опис фігур Фіг.1а-в: FACS-аналіз клітин М-3, оброблених чужорідним пептидом Фіг.1г: Мікрофотографії оброблених ФІТЦ-пептидом клітин М-3 Фіг.2а,б: Виліковування мишей DBA/2 із метастазами М-3-меланоми за допомогою вакцини з навантажених чужорідним пептидом клітин М-3 Фіг.3а: Титрування чужорідного пептиду для одержання протипухлинної вакцини Фіг.3б: Порівняння протипухлинної вакцини з навантажених чужорідним пептидом пухлинних клітин із протипухлинною вакциною, що секретує IL-2 Фіг.4а: Захист мишей Balb/c шляхом попередньої імунізації вакциною з навантажених чужорідним пептидом клітин раку товстого кишечника Фіг.4б: Вивчення участі Т-лімфоцитів у системному імунітеті Фіг.5: Захист мишей C57BL/6J шляхом попередньої імунізації вакциною з навантажених чужорідним пептидом клітин меланоми У нижченаведених прикладах застосовували, якщо не вказано інакше, наступні матеріали і способи: Лінія клітин мишиної меланоми Cloudman S91 (клон М-3; Американська колекція типових культур /АКТК/ № CCL 53.1) була придбана в АКТК. Лінія клітин меланоми B16-F10 (Fidler і ін., 1975) була придбана в депозитарії пухлин Діагностичного Центру Пухлин (ДЦО) Національного Інституту Здоров'я США (НІЗ США). Одержання кон'югатів трансферин-полілізин, що містять ДНК трансфекційних комплексів було проведено, як описано в міжнародній публікації WO 94/21808. Пептиди LFEAIEGFI, FFIGALEEI, LPEAIEGFG і ASNENMETM були синтезовані в синтезаторі для пептидів (модель 433 А з монітором зворотного зв'язку, фірма Епплайд Байесистемс, Фостер Сіті, Канада) при використанні тентагеля S РНВ (Рапп, Тюбінген) у якості твердої фази згідно способу з використанням 9флуоренілметилоксикарбонільного (Fmoc) захисту (активація HBTU, фастмок™, масштаб 0:25ммолів). Пептиди розчиняли в 1М триетиламонійацетаті (ТЕАА), рН 7,3, і очищали за допомогою обернено-фазової хроматографії на колонці Відак С-18. Послідовності встановлювали за допомогою мас-спектрометрії по часу прольоту на приладі "Лазермат" фірми МАТ (Фінніган, Сан-Хосе, Канада). Випробування ефективності протиракової вакцини на її захисну дію стосовно утворення метастазів ("Терапевтична мишина модель"), а також випробування на профілактичній мишиній моделі проводили відповідно до описаного в міжнародній публікації WO 94/21808 протоколу, причому в якості мишиної моделі використовували модель DBA/2 і модель Baib/c. Приклад 1 Порівняльний FACS-аналіз клітин М-3, що були оброблені різними способами за допомогою чужорідного пептиду Для цього дослідження, представленого на фіг.1, ксенопептид LFEAIEGFI доставляли в клітини М-3 один раз із комплексами ТФпЛ/ДНК ("транснавантаження"; фіг.1а), один раз клітини інкубували з пептидом ("імпульси"; фіг.16) і один раз пептид ад'ювантно домішували до клітин (фіг.1в). Для транснавантаження змішували 160мкг міченого ФІТЦ ксенопептиду LFEAIEGFI або неміченого контрольного пептиду з 3мкг ТФ-пЛ, 10мкг пЛ і 6мкг psp65 (фірма Бьорінгер Маннхайм, безліпополісахаридів /ЛПС/) у 500мкл буфера, який є збалансованим сольовим розчином Хенкса (ЗСРХ-буфер). Через 30 хвилин при кімнатній температурі вищезгаданий розчин додавали в посудину з клітинною культурою Τ 75 із 1,5x106 клітинами М-3 у 20мл модифікованого по Дюльбекко середовища Ігла (МДСІ) (10% навколоплідна сироватка теляти /НСТ/, 20мМ глюкоза) і інкубували при 37°С. Через З години клітини двічі промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином (ЗФР), розчиняли в ЗФР/2мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти(ЕДТК) і повторно суспендували для FACS-аналізу в 1мл ЗФР/5% НСТ. Пульсацію клітин із пептидом проводили з 1-2x10s клітинами в 20 мл МДСІ з 450 мкг пептиду (міченого ФІТЦ або неміченого) протягом 3 годин при 37°С. Для ад'ювантного домішування перед FACS-аналізом 106 розчинених у посудині для культури клітин інкубували з 100мкг міченого ФІТЦ пептиду в 1мл ЗФР/5% НСТ 30 хвилин при кімнатній температурі. Клітини після обміну промивали ЗФР/5% НСТ і ще раз аналізували. FACS-аналіз проводили з використанням приладу "FACS Vantage" (Бектон Дікінсон), оснащеного аргоновим лазером потужністю 5Вт, встановленим на 100мВт при 488нм, відповідно до інструкції виробника. Результат FACS-аналізу поданий на фіг.1а-в. На фіг.1г показані мікрофотографії цитоцентрифугованих клітин М-3: верхній малюнок представляє клітини, що одержували пептид за допомогою комплексу ("транснавантаження"), на нижньому малюнку представлено клітини, що були проінкубовані з пептидом ("імпульси"). Для контрастного забарвлення ядра застосовували 4,6-діаміно-2феніліндол (ДАФІ). Клітини М-3, що були навантажені за допомогою пептид-вмісного комплексу, показали зсув флуоресценції майже на 20% у порівнянні з необробленими або обробленими тільки полілізином клітинами, що вказує на ефективне перенесення пептиду в клітини за допомогою комплексу ТФпЛ/ДНК (фіг.1а). Інкубування з пептидом (імпульси) було менш ефективним, що проявилося у зсуві вбік зменшення флуоресценції тільки на 10%, що практично не виявляли при флуоресцентній мікроскопії (фіг.1г). У випадку ад'ювантного домішування пептид витрачався після стадії промивання (фіг.1в), тому це означає, що зв'язування пептиду було, у крайньому випадку, незначним. Приклад 2 Лікування мишей DBA/2 із метастазами меланоми вакциною з навантажених чужорідним пептидом клітин меланоми ("терапевтична мишина модель") а) Одержання протипухлинної вакцини з клітин М-3 160мкг ксенопептиду LFEAIEGFI змішували з 3мкг ТФпЛ, 10мкг пЛ і 6мкг psp65 (без ЛПС) у 500мкл ЗСРХбуфера. Через 30 хвилин витримування при кімнатній температурі вищезгаданий розчин додавали в посудину з клітинною культурою Τ 75 із 1,5x106 клітинами М-3 у 20 мл МДСІ (10% НСТ, 20м глюкоза) і інкубували при 37°С. Через 3 години клітини поміщали в 15мл свіжого середовища і інкубували протягом ночі при 37°С у 5% вуглекислому газі. За 4 години до застосування клітини опромінювали дозою в 20 грей. Обробку вакцини здійснювали, як описано в міжнародній публікації WO 94/21808. б) Ефективність протипухлинної вакцини Мишей DBA/2 у віці'6 -12 тижнів із п'ятиденним метастазом (набутим у результаті підшкірної ін'єкції 104 живих клітин М-3) обробляли двічі протягом тижня протипухлинною вакциною шляхом підшкірної ін'єкції (доза: 105 клітин/ на тварину). У експерименті брало участь 8 мишей. Результат дослідження поданий на фіг. 2а; показано, що 7 із 8 тварин після введення вакцини, що містила в пухлинних клітинах завантажений за допомогою комплексів ТФпЛ/ДНК пептид, були вилікувані. У порівняльних дослідженнях застосовувалася вакцина, у якій пептид LFEAIEGFI (400мкг або 4мг) вводився в клітини шляхом інкубування (3год. при 37°С; "імпульси"). Із тварин, що одержували вакцину з 400 мкг пептида, у трьох із восьми не виявили пухлини, вакцина з клітин, оброблених 4 мг пептида, вилікувала тільки одну з восьми тварин. Контролем слугували одні опромінені клітини М-3, а також клітини, що навантажувалися комплексами без пептиду (у кожному випадку в 1/8 тварин пухлини не спостерігалися). У групі контрольних тварин, де не проводили ніякої обробки, в усіх тварин розвинулися пухлини. Щоб, з одного боку, дослідити актуальність способу одержання вакцини, а, з іншого боку, вивчити пептидну послідовність, було проведено іншу серію досліджень; у цих експериментах використовували високоонкогенний варіант клітин М-3. У випробуваннях, де вивчали значення способу обробки, одержували вакцину, у якій пептид навантажували в клітини не за допомогою полілізину-трансферину, а лише ад'ювантно підмішували до клітин. Для контролю пептидної послідовності якірні амінокислоти пептиду в положеннях 2 і 9, а саме, фенілаланін і ізолейцин, заміщували проліном або гліцином, що призводило до пептиду Leu Pro Glu Ala lle Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG); цьому пептидові не вистачало здатності до зв'язування Н2·Kd. Утворення метастазів контролювали, як мінімум, один раз у тиждень. Результат цього дослідження можна спостерігати на фіг.2б. Вакцина, отримана шляхом навантаження клітин LFEAIEGFI за допомогою комплексів ТФпЛ/ДНК, виліковувала 6 із 8 тварин. Навпаки, пухлини розвилися у 7 із 8 тварин, що одержували вакцину, для якої до клітин домішували винятково пептид LFEAIEGFI або яка складалася з клітин, що навантажувалися за допомогою комплексів ТФпЛ/ДНК зміненим пептидом LPEA1EGFG, що не зв'язується при HLA-мотиві. У контрольній групі, де обробка велася тільки опроміненими клітинами М-3 або взагалі не проводили ніякої обробки, в усіх тварин розвинулися пухлини. в) Вивчення впливу кількості пептиду у вакцині Було отримано, як описано в а), пептид-вмісні комплекси, що містили 50, 5, або 0,5мкг активного пептиду LFEAIEGFI, і ними навантажували клітини М-3. Для порівнянням слугувала IL-2 - секретуюча вакцина, що секретувала оптимальну дозу IL-2 (див. г)). Цю вакцину вводили мишам DBA/2 із п'ятиденним метастазом. Вакцина з 50мкг пептиду виліковувала 6 із 8 мишей, із 5 мкг виліковувала 4 із 8 тварин, так само, як IL-2 секретуюча вакцина, у той час, як вакцина, що містить 0,5мкг, виліковувала тільки двох із 8 тварин. Це дослідження подане на фіг.3а. Приклад 3 Порівняння вакцини, що містить чужорідний пептид, із протипухлинною вакциною з пухлинних клітин, що секретують IL-2, на профілактичній мишиній моделі У порівняльних випробуваннях дві групи досліджуваних тварин (по 8 мишей у кожній) були попередньо двічі імунізовані протягом одного тижня, з одного боку, описаною в прикладі 2а вакциною, з іншого боку, вакциною з клітин М-3, що секретують IL-2, (отриманою відповідно до протоколу, описаного в міжнародній публікації WO 94/21808, доза IL-2 становить 2.000 одиниць на тварину). Через тиждень після останньої вакцинації, судячи з підвищеної кількості пухлинних клітин, були встановлені контралатеральні пухлини ("контрольне зараження"; доза подана на фіг.3б). Виявилося, що попередня імунізація протипухлинною вакциною відповідно до винаходу перевершувала обробку вакциною, що секретує IL-2 : прості миші, вакциновані вакциною, що секретує IL-2 , були захищені тільки проти однієї дози в 105 живих, високоонкогенних клітин (M-3-W). Ефективність цієї вакцини була, проте, вичерпана при контрольному зараженні 3x105 клітинами, у той час, як пухлинні навантаження такого масштабу були успішно переборені тваринами, що попередньо піддавалися імунізації вакциною з навантажених чужорідним пептидом пухлинних клітин. Приклад 4 Захист мишей Balb/c шляхом попередньої імунізації вакциною з навантажених чужорідним пептидом клітин раку товстого кишечника ("профілактична мишина модель") а) Одержання вакцини СТ-26 160мкг ксенопептиду LFEAIEGFI або FFIGALEEI змішували з 12мкг пЛ або з 3мкг ТФпЛ і 10мкг пЛ і піддавали реакції комплексоутворення протягом 30 хвилин при кімнатній температурі в 500мкл ЗСРХ-буфера, потім переносили в посудину з клітинною культурою Τ 75 із 1,5x106 клітинами СТ-26 у 4мл МДСІ (10% НСТ, 20мМ глюкоза), потім інкубували при 37°С у 5% вуглекислому газі. Через 4 години клітини промивали ЗФР, змішували з 15мл свіжого середовища і інкубували протягом ночі при 37°С у 5% вуглекислому газі. За 4 години до застосування клітини опромінювали дозою в 100грей. Обробку вакцини здійснювали, як описано в міжнародній публікації WO 94/21808. б) Випробування активності протиракової вакцини на її захисну дію проти контрольного зараження СТ-26 Мишей Balb/c у віці 6-12 тижнів двічі протягом тижня вакцинували шляхом підшкірних ін'єкцій (доза клітин: 105/мишу). У експерименті в кожну групу входило 8 мишей (або 7 мишей при дослідженні, коли для навантаження клітин використовували пЛ). Через тиждень після останньої вакцинації в контралатеральні пухлини вводили 5x104 батьківських клітин СТ-26. Порівняльні дослідження, у яких вакцину одержували іншим способом, ніж за допомогою комплексів із ТФпЛ/ДНК, проводили, так само, як і контрольні, як описано в прикладі 2. Розвиток пухлини контролювали, як мінімум, раз на тиждень. Результат для пептиду LFEAIEGFI можна побачити на фіг.4а; шість із восьми тварин були захищені. У випадку пептиду FFIGALEEI (не показано на фіг.4а, були захищені 4 із 8 тварин). в) Участь Т-лімфоцитів у дії протипухлинної вакцини Щоб виявити участь Т-лімфоцитів у викликаному СТ-26 - вакциною системному імунітеті, в іншому досліді за 24 години до вакцинування видаляли клітини CD4+ шляхом внутрішньовенної ін'єкції 500мкг моноклонального антитіла GK1.5 (АКТКТІВ 207), клітини CD8+ видаляли шляхом внутрішньовенної ін'єкції 500мкг моноклонального антитіла 2.43 (АКТК TIB 210). Позитивна контрольна група одержувала вакцину без видалення клітин CD4+ і клітин CD8+. Результат випробування поданий на фіг.4б: участь Т-лімфоцитів проявляється в тому, що в усіх тварин, чиї Т-лімфоцити були видалені, розвилися пухлини. Приклад 5 Захист мишей C57BL/6J шляхом попередньої імунізації вакциною з навантажених чужорідним білком меланомних клітин ("профілактична Мишина модель") У цьому прикладі в якості досліджуваних мишей використовували мишей штаму C57BL/6J (кожного разу по 8 тварин у групі). У якості меланомних клітин були використані сингенні для використовуваного мишиного штаму клітини B16-F10 (НІЗ США, ДЦО, депозитарій пухлин; Fidler і ін., 1975). Тварин усіх досліджуваних груп двічі за період у тиждень вакцинували шляхом підшкірних ін'єкцій 105 клітинами B16-F10 на мишу. У серії досліджень одержували вакцину таким чином, що опромінені клітини В16-F10 навантажували пептидом із послідовністю ASNENMETM, як описано в прикладі 2 для вакцини з клітин М-3. У паралельних дослідженнях застосовувалися клітини B16-F10, що секретують IL-2 або GM-CSF, (отримані відповідно до протоколу, описаного в міжнародній публікації WO 94/21808,) у якості вакцини для попередньої імунізації; вакцина продукувала 1.000 одиниць IL-2 або 200нг GM-CSF на тварину. Контрольна група одержувала для попередньої імунізації опромінені і необроблені у всьому іншому клітини B16-F10. Через тиждень після останньої вакцинації піддослідним тваринам прищеплювали пухлину за допомогою 1x104 живих, опромінених клітин B16-F10 і потім стежили за ростом пухлини. Результат дослідження поданий на фіг.5; навантажені чужорідним пептидом пухлинні клітини продемонстрували найкращу захисну дію по відношенню до утворення пухлини. Таблиця Пептидна послідовність SPSYVYHQF FEQNTAQA FEQNTAQP SYFPEITHI EADPTGHSY EVDPIGHLY YMNGTMSQW MLLALLYCL AAGIGILTV YLEPGPVTA 1LDGTATLRL SYLDSGIHF AINNYAQKL CKGVNKEYL QGINNLDNL NLDNLRDYL EEKLiWLF ACDPHSGHFV AYGLDFYIL KTWGQYWQV YLEPGPVTA HMTEWRHC KYICNSSCM GLAPPQHEI LLGRNSEEM LLPENNVLSPL RMPEAAPPV LLGRNSFEV LLGRDSFEV Гаплотип ГКГ d L Kb Kb Kd HLA-A1 HLA-A1 HLA-A2+ HLA-AО201 HLA-AO201 HLA-AO201 HLA-AO201 HLA-AO201 HLA-A24 Db Антиген Посилання gp70, ендогенний MuLV Конексин 37 Конексин 37 JAK1 MAGE-1 MAGE-3 Тирозиназа Huang і Pardoli, 1996 Mandelboim і ін., 1994 Mandelboim і ін., 1994 Rammensee і ін., 1995 Rammensee і ін., 1995 Rammensee і ін., 1995 Rammensee і ін., 1995 Тирозиназа Мелан A/Mart1 pmel17/gp100 pmel17/gp100 β-катенін SV-40 крупний Т-антиген Rammensee і ін., 1995 Rammensee і ін., 1995 Rammensee і ін., 1995 Rammensee і ін., 1995 Robbins і ін.,1996 Lill I iн., 1992 Couiie i ін.,1995 Wolfel і ін., 1995 Robbins і ін., 1995 HLA-A2 MUM-1 мутований CDK4 p15, невідома функція Gp100 HLA-A2 Kd HLA-A2 мутований р53 мутований р53 мутований р53 Kawakami і Rosenberg, 1995 Houbiers і ін., 1993 Nogushi і ін., 1994 Stuberi ін., 1994 HLA-A2 дикий тип р53 Theobald і ін., 1995 HLA-A2 мутований p53 Theobald і ін 1395 HLA-B44 HLA-A2 HLA-A24 Література Alexander, J. і ін., 1989, Imrftunogenetics 29,380 Allred, D. С. і ін., 1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599-605 Behr, J. P., 1994, Bioconjug-Chem. , вересень-жовтень, 5 (5), 382-9 Biologic Therapy of Cancer, Редактори: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., видавництво J. B. Lippincott Company, Філадельфія, Нью-Йорк, Лондон, Хагерстаун Boon, Т., 1993, Spektrum der Wissenschaft (травень), 58-66 Boon, Т. і ін., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12,33765 Braciale. T. J., і Braciale, V. L, 1991, Immunol. Today 12,124-129 Carrel, S. і Johnson, J. P., 1993, Current Opinion in Oncology 5,383-389 Coligan, J. E., Kruisbeek, A. ML, Margulies, D. H., Shevach, Falk, K. і ін., 1991, Nature 351, 290-296 Coulie.P. G. і ін., 1992, Int. J. Cancer, 50, 289-297 Coulie, P. G., Lehmann, F., Lethe, В., Herman, J., Lurquin, С , Andrawiss, M. і Boon, T. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7976-80 Cox, A. L. і ін., 1994, Science 264, 5159, 716-9 Current Protocols im Molecular Biology, 1995, відповідальний редактор: Ausubel F. M. і ін., John Wiley & Sons, Inc. Dranoff, G. і ін., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543 Dranoff, G. і Mulligan, R. C, 1995, Advances in Immunology 58, 417 Falk, K. і ін., 1991, Nature 351, 290-296 Feigner, J. H. і ін., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 Fenton, R. G. і ін., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302 Fisk, В. і ін., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117 Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, том 33, відповідальні редактори: Darzynkiewicz, Ζ. і Crissman, Η. Α. Gedde Dahl, Τ. і ін., 1992, Hum. Immunol. 33, 4, 266-274 Guarini, А. і ін., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64 Han, X. K. і ін., 1995, PNAS 92, 9747-9751 Довідник: FACS Vantage™ User's Guide, квітень 1994, Бектон Дікінсон Довідник: CELL Quest™ Software User's Guide, червень 1994, Бектон Дікінсон Herin Μ, і ін., 1987, Int. J. Cancer, 39, 390 Hock, Η. і ін., 1993, Cancer Research 53, 714-716 Houbiers, J. G., Nijman, H. W., van der Burg, S. H., Drijfhout, J. W., Kenemans, P., van de Velde, С J., Brand, Α., Momburg, F., Kast, W. M. і Melief, С J. (1993). Eur. J. Immunol. 23,2072-7 Huang, A.Y.C. і Pardoll, D. M. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-5 Jung, S. і ін., 1991, J. Exp. Med. 173, 1, 273-6 Kawakami, Y. і ін., 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968 Karre, K. і ін., 1986, Nature 319, 20. лютий, 675 Kovacsovics Bankowski, M. і Rock, K. L, 1995, Science 267, 243-246 Lehmann, J. M. і ін., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895 Lethe, В. і ін., 1992, Eur. J. Immunol. 22, 2283-2288 Lill, N. L, Tevethia, M. J., Hendrickson, W. G. і Tevethia, S. S. (1992). J. Exp. Med. 176, 449-57 Loeffler, J. -P. і ін., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618 Mackiewicz. А. і ін., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811 Malnati, M. S. і ін., 1995, Science 267, 1016-1018 Mandelboim, О. і ін., 1994, Nature 369, 5. травень, 67-71 Mandelboim.O. і ін., 1995, Nature Medicine 1,11, 1179-1183 Morishita, R. і ін., 1993, J. Clin. Invest. 91, 6, 2580-5 Nabel, G. J. і ін., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311 Noguchi.Y., Chen, Y. T. і Old, L. J. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3171-3175 Oettgen, H. F. і Old, L. J. ,1991, Biologic Therapy of Cancer, за редакцією: DeVita, V. Т. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. Α., видавництво J. В. Lippincott Company, Філадельфія, Нью-Йорк, Лондон, Хагерстаун, 87-119 Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727 Pardoll, D. Μ., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, редактори: Leslie Hudson і Frank С Hay, наукові публікації Blackwell, Оксфорд, Лондон, Единбург, Бостон, Мельбурн Peace, D. J. і ін., 1991, J. Immunol. 146, 6, 2059-65 Peoples, G. Ε. і ін., 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-9 Plautz, G. E. і ін., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649 Rammensee, H. G. і ін., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35-44 Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96 Rammensee, H. G., Friede, T. і Stepvanovic, S. (1995).Immunogenetics 41, 178-228 Remy, J. S. і ін., 1994, Bioconjug-Chem., листопад-грудень, 5(6), 647-54 Rivoltini. L, і ін., 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265 Robbins, P. F., el Gamil, M., Li, Y. F., Topalian, S. L, Rivoltini, L, Sakaguchi, K., Appella, E., Kawakami, Y. і Rosenberg, S. A. (1995). J. Immunol. 154, 5944-50 Robbins і Rosenberg. (1996). J. EXP. MED. 183, 1185-92. Schmidt, W. і ін., травень 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4711-4714 Skipper, J. і Stauss. H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8 Slingluff, C. L. і ін., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740 Stein, D. і ін., 1994, EMBO-Joumal, 13, 6, 1331-40 Stuber, G., Leder, G. H., Storkus, W. Т., Lotze, M. Т., Modrow, S., Szekely, L, Wolf, H., Klein, E., Karre, K. і Klein, G. (1994). Eur. J. Immunol. 24, 765-768 Sykuiev, Y. і ін., 1994, Immunity 1, 15-22 Theobald, M., Levine, A. J. і Sherman, L. A. (1995) PNAS 92, 11993-7 Tibbets. L M. і ін., 1993, Cancer, січень 15., том 71, 2, 315-321 van der Bruggen, P. і ін., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 9, 2134-40, міжнародний стандартний серійний номер: 0014-2980 Van Pel, A. i Boon, Т., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722 Wolfel, T. і ін., 1994 a), Int. J. Cancer 57, 413-418 Wolfe!, Т. і ін., 1994 б), Eur. j. Immunol. 24, 759-764 Wolfel, Т., Hauer, Μ., Schneider, J., Serrano, M., Wolfel, C, Klehmann Hieb, E., De Plaen, E., Hankein, Т., Meyer zum Buschenfelde, К. Н. і Beach, D. (1995). Science 269, 1281-4 York, І. А. і Rock, K. L, 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396 Yoshino, І. і ін., 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400 Yoshino. І і ін., 1994 б). Cancer Res., 54,13, 3387-90 Zatloukal, K. і ін., 1993, Gene 135,199-20 Zatloukal, K. і ін., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419