Стійкі до грибків рослини родини solanaceae

1. Спосіб формування або підвищення стійкості рослин, що є представником родини Solanaceae, до рослинного патогену типу Oomycetes, що включає підвищення активності білка Rpi-blb2 у рослині або тканині, органі або клітині рослини або в їх частині, шляхом експресії молекули нуклеїнової кислоти, що кодує трансгенний білок Rpi-blb2, та/або підвищення числа копій молекули нуклеїнової кислоти, що кодує білок Rpiblb2, в якому вказаний білок Rpi-blb2 кодується полінуклеотидом, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з групи, яка складається з: (а) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує принаймні зрілу форму поліпептиду, представленого у SEQ ID NO: 2 або 4; (b) молекули нуклеїнової кислоти, яка включає кодувальну послідовність, як представлено у SEQ ID NO: 1 або 3, або 5, або 6, що кодує принаймні зрілу форму поліпептиду; (е) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, послідовність якого має ідентичність 85 % або більше до амінокислотної послідовності поліпептиду, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти згідно з (а) або (b); (f) молекули нуклеїнової кислоти, що включає біологічно активний фрагмент поліпептиду, що кодується молекулою нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким з підпунктів від (а) до (е); та (l) молекули нуклеїнової кислоти, комплементарний ланцюг якої гібридизується у жорстких умовах з молекулою нуклеїнової кислоти згідно з будьяким з (а) до (f) та кодує білок Rpi-blb2; або комплементарного ланцюга будь-якої з молекул нуклеїнової кислоти згідно з (а)-(l). 2. Спосіб згідно з пунктом 1, в якому активність додаткового білка резистентності є підвищеною. 3. Спосіб згідно з пунктом 1 або 2, в якому активність є підвищеною завдяки експресії de novo. UA (21) a200602627 (22) 03.08.2004 (24) 10.06.2010 (86) PCT/EP2004/008683, 03.08.2004 (31) 03018266.1 (32) 11.08.2003 (33) EP (46) 10.06.2010, Бюл.№ 11, 2010 р. (72) ВАН ДЕР ВОССЕН ЕДВІН АНДРІС ГЕРАРД, NL, АЛЛЕФС ЙОЗЕФУС ЯКОБС ХЕНРІКУС МАРІЯ, NL, МЮСКЕНС МАРИНА ВОУТЕРА МАРІЯ, NL (73) КВЕЕК-ЕН РІСЕРЧБЕДРЕЙФ АГРІКО Б.В., NL (56) WO A 9806750, 19.02.1998 EP A 1334979, 13.08.2003 ROSSI M ET AL: "The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against the potato aphid" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 95, no. 17, 18 August 1998 (1998-08-18), pages 9750-9754, MILLIGAN S B ET AL: "The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper, nucleotide binding, leucine-rich repeat family of plant genes" PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, vol. 10, no. 8, August 1998 (1998-08), pages 1307-1319, SONG J ET AL: "Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 100, no. 16, 5 August 2003 (2003-08-05), pages 9128-9133, BRADEEN J M ET AL: "CONCOMITANT REITERATIVE BAC WALKING AND FINE GENETIC MAPPING ENABLE PHYSICAL MAP DEVELOPMENT FOR THE BROAD-SPECTRUM LATE BLIGHT RESISTANCE REGION, RB" MGG MOLECULAR GENETICS AND GENOMICS, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, vol. 269, no. 5, August 2003 (2003-08), pages 603-611, VAN DER VOSSEN EDWIN ET AL: "An ancient R gene from the wild potato species Solanum 2 (19) 1 3 90849 4 4. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 1-3, в якому (е) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліендогенна активність Rpi-blb2 та/або додаткового пептид, послідовність якого має ідентичність 85 % білка резистентності є підвищеною. або більше до амінокислотної послідовності полі5. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 1-4, що пептиду, який кодується молекулою нуклеїнової включає один або більше наступних етапів: кислоти згідно з (а) або (b); а) стабілізацію білка резистентності; (f) молекули нуклеїнової кислоти, що включає біоb) стабілізацію кодувальної мРНК білка резистентлогічно активний фрагмент поліпептиду, що кодуності; ється молекулою нуклеїнової кислоти згідно з с) підвищення специфічної активності білка резисбудь-яким з підпунктів від (а) до (е); тентності; та d) експресію або підвищення експресії гомологіч(l) молекули нуклеїнової кислоти, комплементарного або штучного фактора транскрипції для ексний ланцюг якої гібридизується у жорстких умовах пресії білка резистентності; з молекулою нуклеїнової кислоти згідно з будье) стимуляцію активності білка резистентності за яким з (а) до (f) та кодує білок Rpi-blb2; допомогою екзогенних факторів індукції; або комплементарного ланцюга будь-якої з молеf) експресію гена, що кодує трансгенний білок рекул нуклеїнової кислоти згідно з (а)-(l). зистентності; та/або 9. Полінуклеотид згідно з пунктом 8, в якому марg) збільшення числа копій гена, що кодує білок кер являє собою Е40М58, СТ119 або СТ216. резистентності. 10. Полінуклеотид згідно з пунктом 8 або 9, що 6. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 1-5, що приявляє собою ДНК або РНК. водить до зниження індексу споруляції принаймні 11. Спосіб одержання трансгенної рослини, росна 30 % після інфекції за допомогою P. infestans у линної клітини або рослинної тканини, або їх часпорівнянні з диким типом. тини, який включає введення полінуклеотиду згід7. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів 1-6, в якому но з будь-яким з пунктів 8-10 або вказаного маркер являє собою Е40М58, СТ119 або СТ216; полінуклеотиду та полінуклеотиду, який кодує до8. Полінуклеотид, що кодує білок Rpi-blb2, який датковий білок резистентності у геном вказаної включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з рослини, рослинної клітини або рослинної тканини, групи, яка складається з: або у їх частину. (а) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує при12. Застосування полінуклеотиду згідно з одним з наймні зрілу форму поліпептиду, представленого у пунктів 8-10, для одержання рослини або рослинSEQ ID NO: 2 або 4; ної тканини, органа рослини або рослинної клітини (b) молекули нуклеїнової кислоти, яка включає або їх частини, резистентної до рослинного патокодувальну послідовність, як представлено у SEQ гену типу оoміцетів. ID NO: 1 або 3, або 5, або 6, що кодує принаймні зрілу форму поліпептиду; Даний винахід належить до нового способу підвищення стійкості рослини, зокрема Solanaceae, переважно картоплі та томатів, до рослинних патогенів типу Oomycetes, що включає підвищення активності поліпептиду згідно з даним винаходом. Винахід також відноситься до полінуклеотидів та векторів, що включають такі полінуклеотиди. Винахід також стосується відповідних векторів, клітин, трансгенних рослин та трансгенного матеріалу для розмноження, який походить з них, способів їх одержання та їх застосування для одержання продуктів харчування, кормів, насіння, фармацевтичних препаратів або чистих хімічних речовин. Метою рослинної біотехнологічної роботи є покоління рослин, що має сприятливі нові властивості, наприклад для підвищення сільськогосподарської продуктивності, підвищення якості у випадку продуктів харчування, або для одержання специфічних чистих хімічних речовин або фармацевтичних препаратів (Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487-96). Механізми природного захисту рослин проти патогенів часто бувають неефективними. Тільки грибкові захворювання приводять до щорічних втрат врожаю, що складають багато більйонів доларів США. Вбудовування сторонніх генів з рослинних, тваринних або мікробних дже рел може підвищити рівень цього захисту. Прикладами можуть слугувати захист тютюну від пошкодження, спричиненого поїданням комахами, шляхом експресії ендотоксинів Bacillus thuringiensis під контролем промотору 35S CaMV (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) або захист тютюну від грибкової інфекції шляхом експресії хітинази бобових під контролем промотору CaMV (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197). Проте більшість з описаних підходів пропонують стійкість до одного патогену або вузького спектру патогенів. Незважаючи на відоме стихійне лихо, що сталося з ірландською картоплею у середині 19-ого століття, фітофтороз ще й зараз продовжує залишатися одним з найбільш спустошливих серед усіх захворювань культурних рослин. Фітофтороз спричиняється грибком з групи ооміцетів Phytophthora infestans, спеціалізованим патогеном, що головним чином викликає захворювання листя та плодів у межах видів Solanaceae, зокрема, у картоплі і томатів. Ці грибки вперше були виявлені у Мексиці і тому з цих причин Мексика вважається центром походження цих грибків. Обидва схрещуваних типа А1 та А2 є постійно присутніми, наприклад, районі Толука. P. infestans також виявлено на природних видах Solanum у віддалених районах Мексики. Крім того, у Мексиці виявлено багато 5 90849 6 видів Solarium, що забезпечують одержання бульб просувається вперед. Однак, 40 інтенсивних та та мають високу ступінь резистентності до фітобезперервних досліджень та селекції так і не призфтори. Переважні способи для запобігання загивели до виходу на ринок резистентних культивабелі культур або для зниження втрат врожаю перів. Переважна маса генів, ідентифікованих останредбачають застосування фунгіцидів, які німи роками, надає лише расовоспецифічну запобігають або лікують інфекцію, спричинену P. резистентність. Більше того, досягнута резистентinfestans. Замість широкого застосування хімічних ність не є стійкою. До того ж, застосування засобів пестицидів може бути бажаним альтернативний захисту рослин є загальновизнаним навантаженпідхід до боротьби з фітофторозом. Для одержанням на навколишнє середовище. Отже, в деяких ня стійкості до фітофторозу селекціонери раніше західних країнах законодавство стало більше обконцентрували свої зусилля на інтрогресії домінамежувати, а деколи, частково забороняти застосунтних генів R, одержаних з Solanum demissum, вання певних фунгіцидів, що робить хімічну боромісцевого дикого виду картоплі, що характерний тьбу із цим захворюванням більш складною. До для Мексики. Було ідентифіковано одинадцять того ж, хімічна боротьба є більш дорогою. На затаких генів R, деякі з яких було картовано до спевершення, наступним обмеженням є розвинення у цифічних локусів на генетичній карті картоплі (розгрибків резистентності до специфічних фунгіцидів, глянуто у Gebhardt and Valkonen, 2001), а нещодатаких як металаксил, про що повідомлялося з бавно було клоновано ген R1. R1 та R2 розташовані гатьох країн світу. у хромосомах 5 та 4, відповідно. R3, R6 та R7 розВідповідно, проблема, що лежить в основі даташовані у хромосомі 11. Невідомі гени R, що наного винаходу - це створення нового засобу та дають стійкості сорту до фітофтори, було також способів для ефективного захисту рослин від фіописано у S. tuberosum ssp. andigena, S. berthaultii тофторозу та подібних захворювань. та S. pinnatisectum. Стійкість, що індукується цими Розв'язання технічної проблеми досягнуто R-генами, була (майже) повною, але, як виявилошляхом створення рішень, описаних у формулі. ся, була нетривалою у будь-якому випадку. ЗавдяТаким чином, даний винахід стосується метоки високому ступеню резистентності та простоті ду створення або підвищення резистентності росперенесення, багато культиварів мають стійкість, лин до рослинного патогену типу Oomycetes, що яка має походження від S. demissum. На жаль, включає підвищення активності протеїну Rpi-blb2 в специфічна для сорту стійкість, що має походженрослині або тканині, органі або клітині рослини, ня від S. demissum, хоча і є майже повною, не є або її частині. тривалою. Оскільки виведені колись нові культиRpi-blb2 є типом LZ-NBS-LRR гену R та має вари картоплі вирощувалися у значних масштабах гомологію послідовності до гену томатів Мі-1, який на великих площах, у Ρ. infestans виникли нові надає резистентності до трьох видів нематод, що вірулентності, які зробили патоген здатним долати утворюють кореневі нарости (Meloidogyne spp.), а інтрогресовану стійкість. Більш тривалу польову також до попелиці картоплі Macrosiphum резистентність до фітофтори, що часто є кількісeuphorbiae (Vos et 1998; Rossi et 1998, Milligan et ною по своїй природі і, як передбачається, не є 1998), також до В- та Q-бioтипів білої мушки сортоспецифічною, можна знайти в деяких мексиBemisia tabaci (Nombela et 2003). Як було відкрито канських видах Solanum та центральноамерикандля Rpi-blb, Rpi-blb2 також забезпечує повну резиських і південноамериканських видах. Проте цей стентність до усіх Ρ. infestans ізолятів, що несуть тип стійкості є складним для перенесення у кульбагато факторів вірулентності, та расова специфітивари картоплі шляхом схрещування та селекції чність не була доведена. за фенотипічними ознаками. Термін "Rpi-blb2" стосується полінуклеотиду, Диплоїдний S. bulbocastanum з Мексики та що кодує поліпептид, який має згадану тут активГватемали є одним із видів коренеплодів, який ність протеїну або поліпептид, який має згадану давно відомий своєю високою резистентністю до активність протеїну Rpi-blb2. Чи стосується настуфітофторозу. Однак, класична передача резистенпний термін "Rpi-blb2" поліпептиду або полінуклетності від диких видів Solanum до культивованої отиду буде зрозуміло з контексту, де його буде картоплі часто не вдається із-за різниці в плоідновикористано. сті та значенні ендоспермного балансу Терміном "створення" або "збільшення", або (Endosperm Balance Number) (EBN). "стимулювання" "резистентності рослини" вказуНезважаючи на ці проблеми, інтрогресія ознається на те, що резистентність рослини або її часки резистентності S. bulbocastanum була успіштини збільшена або створена або стимульована в ною. Нещодавно, було виявлено, що соматичні порівнянні із згадуваною. гібриди S. bulbocastanum та S. tuberosum та обер"Надання", "виникнення", "створення", "стимунено схрещені є високо резистентними до фітолювання" або "збільшення" резистентності до пафторозу, навіть за значного натиску хвороби тогену, означає, що захисні механізми певних ви(Helgeson et 1998). Незважаючи на повідомлення дів рослин або сортів є в більшій мірі резистентні про пригнічення рекомбінації, резистентність в до одного або більше патогенів завдяки викорисобернено схрещеному матеріалі виявляється в 8танню способу згідно з винаходом, у порівнянні з ій хромосомі в межах приблизно 6сМ від RFLPдиким типом рослини, до якого спосіб згідно з дамаркерів СР53 та СТ64. CAPS-маркер, що похоним винаходом не застосовувався, при інших ідендить із томатного RFLP-зонду СТ88 відокремлютичних умовах (наприклад, таких, як кліматичні ється разом із резистентністю. умови, умови росту, види патогенів та подібні). Таким чином, останніми роками розробка росЗбільшена резистентність проявляється переважлинної резистентності до патогенів типу Oomyceta но в зниженні проявів симптомів захворювання, 7 90849 8 симптоми захворювання включать, на додачу до ність. В прикладах, що ілюструють даний винахід, вищезгаданих шкідливих ефектів, наприклад, таіндекс споруляції був визначений як рівень спорукож ефективність проникнення патогену в рослину ляції на ушкодження. Таким чином, термін "резисабо рослинні клітини, або проліферацію в, або на тентність" також може бути визначений як 20% ній. В цьому контексті, симптоми захворювання зниження споруляції на ушкодження, порівняно із переважно знижені принаймні на 10% або принайдиким типом. Останнє визначення є переважним. мні на 20%, особливо бажано, принаймні на 40% В переважних реалізаціях, споруляція в досліабо 60%, надзвичайно особливо бажано, принайді знижена, переважно, на 30%, більш бажано, мні на 70% або 80% та найбільш бажано, принайзнижена на 50%, значно більш бажано, на 70%, ще мні на 90% або 95%. бажаніше, більш ніж на 80%, ще більш бажано, на Під терміном "збільшений", як його тут вжито, 85% та 90%. Найбільш бажаним є зниження на розуміється, що активність генного продукту є ви95% або більше. щою ніж у вихідного. Отже, термін "збільшений" Згідно з цим, в даному винаході "активність" включає той факт, що активність, наприклад, актипротеїну Rpi-blb2 означає, що експресія протеїну вність генного продукту Rpi-blb2 або іншого геннонадає згадане зниження індексу споруляції. Також го продукту, створено de novo, якщо ця активність, спостерігалося, що типовою відповіддю для роснаприклад, описана тут активність Rpi-blb2, не лин, що містили Rpi-blb2, на інфікування P. була виявлена в вихідному. Термін "збільшений" infestans є наявність малих ушкоджень, без будьтакож стосується стимуляції активності генного яких чітких споруляцій, наприкінці періоду росту. продукту. Підвищена експресія гену, тобто його Таким чином, в одній з реалізацій, активність Rpiактивація, може бути стимульована кількома шляblb2 визначена як наявність малих ушкоджень, без хами, наприклад, застосуванням хімічного або будь-яких чітких споруляцій, як описано в експебіотичного стресу організму. Наприклад, резистенриментах. Резистентність Rpi-blb2 проявляється в тність до інфікуючих паразитів, опосередкована некротичних місцях, які мають низький рівень спогеном, може бути активована інфікуванням параруляції. Експеримент, проведений на відокремлезитом, наприклад, Ρ. infestans, та полягати в збіних листках, демонструє активність Rpi-blb2. Ексльшеній резистентності до цього та/або інших паперимент описано в прикладі 17 та на Фігурі 18. тогенів. Різниця між Rpi-blb2 та іншими генами резистентОтже, в подальшому, термін "збільшений" таності до P. infestans полягає в тому що створюєтькож включає терміни "стимульований" та "створеся низький рівень споруляції (Фігура 18). Дослід з ний". відокремленим листом, в якому ушкодження при"Патогенна резистентність" вказує на зниженсутнє на Rpi-blb2-генотипі (ARD 92-1197-16) деня або ослаблення симптомів хвороби у рослини монструє низький рівень спорангіїв, у порівнянні з внаслідок інфікування патогеном. Симптоми моповною відсутністю спорангіїв на генотипі, що місжуть бути численними, але переважно охоплювати тить ген R2 S. demissum. Індекс споруляції станоті, що прямо або опосередковано мають небажавить лише 1,1% від сприйнятливого фенотипу ний вплив на якість рослин, якість врожаю, прида(cv.Bintje) (Таблиця 7 та Фігура 18). тність для використання як кормової добавки або Польові експерименти також показали, що Rpiхарчової добавки, або які також роблять посів, blb2 призводить до низького рівня інфікування. вирощування або обробляння культури ускладнеСимптоми фітофторозу розвинулися протягом ними. вегетаційного періоду на низькому рівні (Фігура 3, "Патоген" в межах даного винаходу, означає ARF87-801) або наприкінці вегетаційного періоду за допомогою прикладів але не обмежуючись ни(Фігура 2, ARF87-601; Фігура 3, ARF87-507 та ми, віруси або віроїди, бактерії, гриби, паразити ARF87-601). тварин такі, як, наприклад, комахи та нематоди. Таким чином, в одній з реалізацій, активність Термін "протеїн Rpi-blb2" вказує на протеїн Rpi-blb2 також визначена, як одержана після ексабо поліпептид, експресія якого в рослині або її пресії в некротичних регіонах рослин, які мали частині надає резистентність рослинам або частинизький рівень споруляцій, як описано в експеринам рослин до одного з описаних тут патогенів ментах. порівняно з нерезистентним штамом. Таким чином, в одній з реалізацій, спосіб даноРослина або тканина, орган або клітина росго винаходу створює рослини, які мають некротичлини або її частина, що мають підвищену активні регіони з низьким рівнем споруляцій або менше. ність протеїну Rpi-bib2 є менш сприйнятливими до Термін"вихідний" стосується організму або йоінфікування патогеном, зокрема, патогеном типу го частини, наприклад, клітини, який є суттєво, на Oomycetes, переважно P.infestans, ніж рослина скільки це можливо, подібним у геномі, протеомі або її частина, яка має ідентичну генетичну основу та/або метаболомі до релевантного організму або але не має генетичного елементу, необхідного для його частини, наприклад, клітини, наприклад, до забезпечення експресії Rpi-blb2 (зазначених тут як рослини даного винаходу. "дикий тип" або "порівнюваний"). Тести для переТаким чином, термін "вихідний" стосується вірки резистентності рослини або її частини є добприкладу організму або його частини, наприклад, ре відомими кваліфікованим фахівцям. Резистентклітини, який суттєво генетично, протеомно та/або ність до P. infestans може бути визначена як індекс метаболічно ідентичний до організму даного винаспоруляції згідно Flier, 2001. Flier описує індекс ходу або його частини, але в якому не спостерігаспоруляції як рівень споруляції на 1cм2. Таким чиється активність генетичного продукту, наприклад, ном, зниження споруляції на 1cм2 на 20% порівняRpi-bib2, що і є основною відмінністю порівнюваноно із диким типом тут визначається як резистентго геному, протеому та/або метаболому. Таким 9 90849 10 чином, порівнюваною може бути рослина або її рослин царства рослин. Термін включає дорослі частина, яка не експресує або експресує занадто рослини, насіння, пагони та саджанці, та їхні похімало діючого генетичного продукту, наприклад, дні частини, розмножувальний матеріал, рослинні вона не кодує Rpi-blb2 або не транскрибує ген, що органи, тканини, протопласти, калюс та інші кулькодує Rpi-blb2 або не транслює активну Rpi-blb2 тури, наприклад, клітинні культури, та будь-які інші мРНК. Таким чином, порівнюваний зразок не протипи угрупування рослинних клітин, які дають фунпонує модифікацію, яка створює активний генетикціональні та структурні одиниці. "Дорослі росличний продукт в достатній кількості для прояву у ни" відноситься до рослин на будь-якій бажаній фенотипі як описано. Чи є дві рослини в основностадії розвитку поза саджанцем. Саджанець відному генетично ідентичні, може бути досліджено ситься до молодої незрілої рослини на ранній стаметодами, відомими досвідченим фахівцям, надії розвитку. "Рослина" охоплює усі однорічні та приклад, за допомогою аналізу "fingerprint", наприбагаторічні однодольні та дводольні рослини. Пеклад, як описано в Roldan-Ruiz, Theor. Appl. реважними для даного винаходу є рослини, які Genet., 2001, 1138-1150. Характер експресії протевикористовуються як продукти харчування або їнів може бути досліджено як описано в літературі, корми, наприклад, роди однодольних або дводонаприклад, за допомогою гель-електрофорезу (1D, льних, зокрема види, такі як описані вище, напри2D, 3D), мас-спектральним аналізом та іншими клад, види злакових рослин, або представники методами наприклад, як описано в родини Solanaceae, найбільш бажано, картопля www.waters.com, www.proteine.orq.au, або томати. www.proteomesci.com, www.sdu.dk/Nat/CPA. МетаЯк є відомим для фахівця, спосіб згідно з даболом може бути досліджений фахівцем, як опиним винаходом включає подальшу селекцію тих сано в літературі, наприклад, за допомогою HPLC, рослин в котрих, на відміну, або порівняно з вихідGC, OPLC, LC-MS, GC-MS, LC-MS-MS, та іншими ними рослинами, існує, або збільшена резистентметодами як описано, наприклад, в www.metabolicність до принаймні одного згаданого патогенну. explorer.com, www.ki.se/icsb2002/pdf/ICSB_209.pdf, "Селекція" стосовно рослин, в котрих, на відwww.qenomics.ruq.nl/technologies.htm, Fiehn et al., міну або порівняно із вихідною рослиною, існує Nature Biotech, 18 (2000), 1157, Raamsdonk et al., або збільшена резистентність до, принаймні, одноNature Biotech, 19 (2991), 45-50, Buchholz, Anal. го патогену, означає усі методи, які є придатними Biochem, 295 (2001) 129-137, Soga et al., Anal для визначання існуючої або збільшеної резистенChem.74 (2002) 2233-2239. тності до патогенів. Це можуть бути симптоми паДля підвищення резистентності до патогену, тогенної інфекції, але вони також можуть включати вихідний організм або його частина є сприйнятлиописані тут симптоми, які відноситися до якості вими до інфікування патогеном, наприклад, паторослин, якості врожаю, придатності до викорисгеном рослин, наприклад, Ρ. infestans. тання як кормової добавки або харчової добавки Переважно, вихідним є клон того організму, в та подібне. який було введено, наприклад, відповідний полінуТаким чином, в одній з реалізацій способу, згіклеотид, наприклад, полінуклеотид винаходу, або дно з даним винаходом, протеїн Rpi-blb2 кодуєтьактиватор, наприклад, активатор відповідного генся полінуклеотидом, який включає молекулу нукного продукту, що опосередковує активність, налеїнової кислоти, вибрану з групи, що складається приклад, активатор, що підвищує експресію відпоз: відного полінуклеотиду або похідного згаданого a) молекул нуклеїнової кислоти, які кодують полінуклеотиду, або активатор відповідного поліпринаймні готову форму поліпептиду, наведеного пептиду, наприклад, поліпептиду даного винаходу, в SEQ ID NO: 2 або 4; та/або відповідний вектор, що кодує відповідний b) молекул нуклеїнової кислоти, які включають генетичний продукт. Наприклад, переважним вихікодуючу послідовність, наведену в SEQ ID NO: 1 дним для способу даного винаходу є організм або або 3, або 5 або 6, що кодують принаймні готову його частина, який є клоном організму або його форму поліпептиду; частини, наприклад, клітини, яка була трансфікоc) молекул нуклеїнової кислоти, чия нуклеотивана або трансформована полінуклеотидом або дна послідовність внаслідок виродженості генетивектором даного винаходу. чного коду вироджена у нуклеотидну послідовність Якщо клон, як описано, не може бути іденти(а) або (b); фікований, то можна розщепити, вибити або вимкd) молекул нуклеїнової кислоти, що кодують нути відомим способом ті елементи, які в основполіпептид, який походить з поліпептиду, кодованому опосередковують відповідну активність, ного полінуклеотидом (а)-(с) шляхом заміщення, наприклад, опосередковуючи підвищення активноделеції та/або додавання однієї або більше аміності Rpi-blb2, наприклад, підвищуючи експресію в кислот з(до) амінокислотної послідовності поліпепорганізмі, наприклад, рослині. Фахівцеві добре тиду, кодованого полінуклеотидом від (а) до (с); відомо, як знизити або пригнітити відповідний геe) молекул нуклеїнової кислоти, що кодує понетичний продукт, наприклад, зниженням або приліпептид, послідовність котрого має ідентичність гніченням експресії, наприклад, Rpi-blb2. Такий 70% або більше з амінокислотною послідовністю клон далі може бути порівняний із організмом, поліпептиду, кодованого молекулою нуклеїнової одержаним згідно зі способом даного винаходу, кислоти (а) або (b); наприклад, генотипом, що експресує Rpi-blb2, реf) молекул нуклеїнової кислоти, які включають зистентним до Ρ. infestans. фрагмент або епітоп-вмісну частину поліпептиду, Термін "рослина", як його використано тут, вікодованого будь-якою молекулою нуклеїнової кисдноситься до усіх родів та видів вищих та нижчих лоти від (а) до (e); 11 90849 12 g) молекул нуклеїнової кислоти, які включають вані разом. Існує стільки ж лінкерних груп, скільки полінуклеотид, який має послідовність молекули гомологічних пар у хромосомах. нуклеїнової кислоти, ампліфікованої з бібліотеки Термін "лінкерна група 6" стосується лінкерної нуклеїнових кислот за допомогою праймерів як групи картоплі або томатів, яка зв'язана із хромоприведено в табл. 3B, зокрема ARF1F та ARF1R; сомою 6, цей зв'язок було встановлено визначенh) молекул нуклеїнової кислоти, що кодують ням маркерів із відомим розташуванням в хромофрагмент, що починається амінокислотами: 1, 30, сомі, ґрунтуючись на роботі, опублікованій 50, 100, 200, 300, 500, або 1000 та закінчується Bernatzky та Tanksley (1986) та Tanksley et al. амінокислотами: 1276, 1000, 500, 300, 200, 50, 30, (1992). Лінкерна група має той самий номер, що й або 1 поліпептиду, кодованого будь-якою з (а) до хромосома, яка їй відповідає. В томатах, хромосо(g); ми нумеруються згідно з їхньою довжиною в пахіі) молекул нуклеїнової кислоти, що включають тені. Ці номери були застосовані Barton (1950), принаймні 20 нуклеотидів будь-якого з полінуклеохромосома 1 є найдовшою, хромосома 12 є найкотидів з (а) або (d); ротшою. Також, щодо довжини, то такі характерисj) молекул нуклеїнової кислоти, що кодують тики, як позиція центромерів, а також кількість та поліпептид, який розпізнається моноклональними розподіл гетеро хроматину, слугують для ідентиантитілами, які одержано до поліпептиду, кодовафікації кожної хромосоми. Коротке плече хромоного будь-якою з молекул нуклеїнової кислоти від соми позначається як "S", довге - як "L", отже "1S" (а) до (h); вказує на коротке плече хромосоми 1, як, наприk) молекул нуклеїнової кислоти, одержуваних клад, у Barton, D.W.(1950) American Journal of скринінгом відповідної бібліотеки за жорстких Botany. 37, 639-643, Bernatzky, R. and Tanksley, умов, за допомогою зонда, який має послідовність S.D.(1986) Genetics 112, 887-898, Tanksley, S.D., et будь-якої з молекул нуклеїнової кислоти від (а) до al., (1992) Genetics 132, 1141-1160. (j), або її фрагменту із щонайменше 15, переважно Термін "сумісне виділення", як його вжито тут, 30, 60, 100 або більше нуклеотидів; та стосується тенденції двох або більше рис та/або І) молекул нуклеїнової кислоти, комплементалокусів та/або генів та/або маркерів бути успадкорна послідовність котрих гібридизується за жорстваними разом. ких умов із будь-якою з молекул нуклеїнової кисНаприклад, більш конкретно, регіон хромосолоти від (а) до (k); або комплементарного ланцюга ми 6, який виділяється сумісно із Rpi-blb2 є коротбудь-якої з молекул нуклеїнової кислоти згідно з ким плечем, яке в томатах несе морфологічний (а)-(l); маркер Мі. або ті, що експресують поліпептид, кодований Також, одна з реалізацій способу згідно з дасегментом або лінкерною групою 6 Solarium ним винаходом, стосується способу даного винаbulbocastanum, який виділяється сумісно із маркеходу, в якому протеїн Rpi-blb2 кодується полінукром з таблиці 3А та який опосередковує резистенлеотидом даного винаходу, наприклад, є тність до патогенів, зокрема, до патогенів, вибракодованим полінуклеотидом, наведеним в Seq. ID. них з групи типу Oomycetes; 1 або 3 або 5 або 6 або його фрагментом. В одному з втілень, полінуклеотид способу, За допомогою пошуку BLASTX були визначені згідно винаходу, не складається з послідовності, гени із найбільшою гомологією до послідовностей зображеної в Seq. ID NO.: 7 та/або 9 та/або не Rpi-blb2, ними були гени та протеїни Mi1.1 та складається з послідовності нуклеїнової кислоти, Mi1.2; дивись Фігури з 15 по 17. Обидва гени, що що кодує протеїн, зображений в Seq. ID NO.: 8 мали високу подібність до послідовності, приведета/або 10. ної в Seq ID NO.: 1 або 3 або 5 або 6, але не надаВ одному з втілень, полінуклеотид способу, вали рослинам резистентності до патогенів типу згідно винаходу, не складається з послідовності Oomycetes. От чому активність Мі1.1 та Mi1.2 є молекули нуклеїнової кислоти Мі1.1 або Мi1.2, іншою активністю, ніж активність поліпептиду дата/або молекули нуклеїнової кислоти, що кодує ного винаходу. Послідовність ORF Mi1.1 та Mi1.2 протеїн Мі1.1 або Мі12. та кодованих протеїнів приведено в Seq. ID NO.: з Таким чином, в одному з втілень, полінуклео7 по 10. Також заявка ЕР401764.4 стосується генів тид способу, згідно винаходу, може не складатися Мі. Раніше відома послідовність генів Мi1.1 та із послідовностей, приведених Rossi et al. 1998, Мi1.2 виключена з полінуклеотидів даного винахоPNAS USA 95 9750-9754, Milligan et al., 1998. Plant ду зокрема Seq ID NO: 7 та 9 виключені. Також Cell 10:1307-1319, та/або WO98/06750. Порівняння виключеним може бути полінуклеотид, який може послідовностей Rpi-blb2, Мi1.1 та Мi1.2 показано кодувати поліпептид Seq. ID NO.: 8 або 10. Таким на Фігурах з 15 по 17. чином, з реалізації також виключені послідовності, Термін "лінкерна група", як його вжито тут, що кодують протеїни Мi1.1 та Mi1.2. Протеїни із стосується двох або більше рис та/або локусів нижчою гомологією до поліпептиду, кодованого та/або генів та/або маркерів, які мають тенденцію полінуклеотидом даного винаходу є протеїни Hero бути успадкованими разом як результат сполученResistance 1 та 2 (Genbank AccNo.: gi26190252 та ня між двома згаданими рисами та/або локусами gi26190254), Протеїни А, В, С, D та Е резистентнота/або генами та/або маркерами. Чим ближчі риси сті до Tospovirus [Genbank AccNos.:gi15418709, та/або локуси та/або гени та/або маркери, тим ді15418710, gi15418712, gi15418713, gi15418714], менша ймовірність, що вони будуть розділені під R1 [Genbank AccNo.: gi17432423] та Prf [Genbank час відновлення ДНК або процесу реплікації, такоAccNo.: gi8547237] послідовності або кодуючі посго як мітоз або мейоз у еукаріотів, й, таким чином, лідовності котрих також виключені із послідовносіснує більша вірогідність, що вони будуть успадкотей даного винаходу. 13 90849 14 Терміни "ген(и)", "полінуклеотид", "послідовe) 6Х SSC, 0.5% SDS, 100mg/ml денатурованої ність нуклеїнової кислоти", "нуклеотидна послідовфрагментованої ДНК сперми лосося, 50% форманість", або "молекула(и) нуклеїнової кислоти", як мід при 42°С, вони вжиті тут, відносяться до полімерних форм f) 50% формамід, 4Х SSC при 42°С, нуклеотидів будь-якої довжини, та рибонуклеотиg) 50% (vol/vol) формамід, 0.1% коров'ячий сидів або дезоксирибонуклеотидів. Терміни стосуроватковий альбумін, 0.1% Ficoll, 0.1% полівінілпіються лише первинної структури молекули. ролідон, 50mМ натрієво-фосфатний буфер рН 6.5, Таким чином, цей термін включає дволанцю750mM NaCI, 75mМ цитрат натрію при 42°С, гові та одноланцюгові ДНК, та РНК. Він також h) 2Х або 4Х SSC при 50°С (умови низької жовключає відомі типи модифікацій, наприклад, мерсткості), або тилування, "caps''-заміщення одного або більшої і) 30 to 40% формамід, 2Х або 4Х SSC при кількості природних нуклеотидів аналогами. Пере42°С (умови низької жорсткості). важно, послідовність ДНК згідно даного винаходу (2) Етапи відмивання можуть бути обрані севключає кодуючу послідовність, що кодує визнаред, наприклад, наступних умов: чений тут поліпептид. а) 0.015Μ NaCI/0.0015Μ цитрат натрію/0.1% "Кодуюча послідовність" є нуклеотидною посSDS при 50°С. лідовністю, яка транскрибована в мРНК та або b) 0.1XSSC при 65°C. трансльована в поліпептид, коли поміщена під c) 0.1Х SSC, 0.5% SDS при 68°С. керування відповідних регуляторних послідовносd) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50% формамід при тей. Межі кодуючої послідовності визначені старт42°С. кодоном трансляції на 5'-кінці та стоп-кодоном с) 0.2Х SSC, 0.1% SDS при 42°С. трансляції на 3'-кінці. Кодуюча послідовність може f) 2X SSC при 65СС (умови низької жорсткості). включати, але не обмежуючись ними, мРНК, кДНК, В одній з реалізацій способу даного винаходу, рекомбінантні нуклеотидні послідовності або генополінуклеотид даного винаходу включає полінукмну ДНК, причому також можуть бути присутні в леотид, який гібридизує до молекули нуклеїнової певних випадках інтрони. кислоти, яка включає або складається із молекули За допомогою "гібридизації", означає, що такі нуклеїнової кислоти, яка має послідовність, привемолекули нуклеїнової кислоти гібридизуються за дену в Seq ID No. 1 або 3 або 5 або 6 або її фрагзвичайних умов гібридизації, переважно за жорстмент. Фрагмент включає або складається, переких умов, як це описано, наприклад, в Sambrook важно, із 15, 20, 30, 40, 70, 100, 300, 500, 700, 1000 (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd або більше залишків Seq ID No 1 або 3 або 5 або Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 6. Spring Harbor, NY (1989)). Прикладом одних з таВ переважній реалізації, полінуклеотид даного ких жорстких умов гібридизації є гібридизація в винаходу включає полінуклеотид, який гібридизу4XSSC при 65°С, із наступним відмиванням в ється за "жорстких" умов гібридизації із молекулою 0.1XSSC при 65°С протягом однієї години. Іншими, нуклеїнової кислоти, яка включає або складається характерними жорсткими умовами є гібридизація в із молекули нуклеїнової кислоти, яка має послідо50% формаміді, 4XSSC при 42°С. Також, умови на вність, наведену в Seq ID No.1 або 3 або 5 або 6 етапі відмивання можуть бути вибрані серед умов, або її фрагмент. обмежених умовами низької жорсткості (приблизТермін "за жорстких умов гібридизації", як його но 2Х SSC при 50°С) та умовами високої жорстковжито тут, вказує на будь-які зі згаданих тут жорстсті (приблизно 0.2Х SSC при 50°С, переважно при ких умов гібридизації. В наступній реалізації, тер65°С) (20Х SSC: 0.3M цитрату натрію, 3М NaCI, pH мін "за жорстких умов гібридизації" вказує на умо7.0). Також, температура на етапі відмивання мови гібридизації, згадані в прикладах або же зростати від умов низької жорсткості при кімнавикористані в Sambrook (Molecular Cloning; A тній температурі, приблизно при 22°С, до умов Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor високої жорсткості, приблизно при 65°С. Обидва Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). параметри, концентрація солі та температура, В одній з переважних реалізацій, термін "за можуть бути змінені одночасно, або один з двох жорстких умов гібридизації", як його вжито тут, параметрів може підтримуватися постійним, коли вказує на усі зі згаданих тут жорстких умов гібритільки інший змінюється. Денатуруючі засоби, надизації і означає, що полінуклеотид гібридизується приклад, формамід або SDS, також можуть викоза усіх згаданих жорстких умов. ристовуватися під час гібридизації. В присутності Rpi-blb2, одержаний із інших організмів, може 50% формаміду, гібридизація переважно відбувабути кодований іншими послідовностями ДНК, які ється при 42°С. Деякі наступні приклади умов для гібридизуються із послідовностями, наведеними в гібридизації та етапу відмивання приведені нижче: Seq ID No.1 або 3 або 5 або 6 за послаблених (1) Умови гібридизації можуть бути обрані сеумов гібридизації, та які кодують експресію пептиред, наприклад, наступних умов: дів, що мають активність Rpi-blb2. Також, деякі a) 4Х SSC при 65°С, застосування можуть бути виконані за умов низьb) 6X SSC при 45°С, кої жорсткості без будь-яких наслідків щодо спеc) 6Х SSC, 100mg/ml денатурованої фрагменцифічності гібридизації. Наприклад, аналіз тованої ДНК сперми риби при 68°С, «Southern blot» загальної ДНК може бути проведеd) 6Х SSC, 0 5% SDS, 100mg/ml денатурованої ний із полінуклеотидом даного винаходу та відмиДНК сперми лосося при 68°С, тий за низької жорсткості (55°С в 2xSSPE, 0,1% SDS). Гібридизаційний аналіз може виявити лише просту структуру генів, що кодують Rpi-blb2. На 15 90849 16 ступним прикладом таких умов низької жорсткості Фахівцеві зрозуміло, що усі імуногени (наприклад, є 4XSSC при 50°С або гібридизація із від 30-40% речовини, здатні підвищувати імунну відповідь) є формаміду при 42°С. Такі молекули включають антигенами, однак, деякі антигени, такі як гаптени, фрагменти, аналоги або похідні Rpi-blb2 даного не є імуногенами, але можуть бути імуногенними винаходу та відрізняються, наприклад, амінокисприєднуючись до молекули носія. Термін "антиген" лотною та/або нуклеотидною делецією(ями), вставключає посилання на речовину, до якої можуть вкою(ами), заміною(ами), приєднанням(ями) бути утворені антитіла та/або до котрих антитіла є та/або рекомбінацією(ями) або будь-якою(ими) специфічно імунореактивними. В одній з реалізаіншою(ими) модифікацією(ями), відомою(ими) з цій, даний винахід стосується епітопу Rpi-blb2. рівня техніки окремо, або в комбінації з вищеопиТермін "одна або декілька амінокислот" стосусаними амінокислотними послідовностями або ється принаймні однієї амінокислоти, але не більш нуклеотидною(ими) послідовністю(остями), що їм ніж такої кількості амінокислот, яка може призвесвідповідає(ють). Тим не менш, бажано використоти до гомології менше 70%. Переважно, подібність вувати жорсткі умови гібридизації. є більшою за 75% або 80%, більш бажано, більш Термін "гомологія" означає, що відповідні моніж 85%, 90% або 95%, ще більш бажано, більшою лекули нуклеїнової кислоти або кодовані протеїни ніж 96%, 97%, 98%, або 99% подібності. є функціонально та/або структурно еквівалентниТерміни "полінуклеотид" та "молекула нуклеїми. Молекули нуклеїнової кислоти, які гомологічні нової кислоти" також стосується "виділених" полідо молекул нуклеїнової кислоти, описаних вище, нуклеотидів та молекул нуклеїнової кислоти. "Вита які є похідними згаданих молекул нуклеїнової ділена" молекула нуклеїнової кислоти є кислоти є, наприклад, варіаціями згаданих молевідокремленою від інших молекул нуклеїнової кискул нуклеїнової кислоти, які представляють модилоти, які є присутніми в природних джерелах нукфікації, які мають таку саму біологічну функцію, леїнової кислоти. Переважно, "виділена" нуклеїнозокрема, кодування протеїнів із такою ж або в знава кислота не має послідовностей, які зазвичай чній мірі такою ж самою біологічною функцією. Це фланкують нуклеїнову кислоту (наприклад, посліможуть бути природні варіації такі, як послідовносдовності розташовані на 5' та 3' кінцях нуклеїнової ті із інших сортів рослин або видів або мутації. Ці кислоти) в геномній ДНК організму, з котрого одемутації можуть бути природними або можуть бути ржано нуклеїнову кислоту. Наприклад, при різних одержані методами мутагенезу. Алельні варіації реалізаціях полінуклеотид даного винаходу може можуть бути природними алельними варіаціями, мати менш ніж 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb або так само, як і штучно отриманими або генно0.1kb або менше нуклеотидів послідовності, що інженерними варіантами. Структурні еквіваленти природно фланкує молекулу нуклеїнової кислоти в можуть бути, наприклад, визначені дослідженням геномній ДНК клітини, з якої походить нуклеїнова зв'язування згаданого поліпептиду з антитілами. кислота. Крім того, полінуклеотиди даного винахоСтруктурний еквівалент має подібні імунологічні ду, зокрема, "виділена" молекула нуклеїнової кисхарактеристики, наприклад, включає подібні епітолоти така, як молекула кДНК, може бути в значній пи. мірі відокремлена від клітинного матеріалу або Терміни "фрагмент", "фрагмент послідовності" культурального середовища, у випадку одержання або "частина послідовності" означають вкорочену за допомогою методів рекомбінації, або відокремпослідовність, порівняно із оригінальною послідолена від хімічних попередників або інших хімічних вністю. Вкорочена послідовність (послідовність речовин, у випадку хімічного синтезу. нуклеїнової кислоти або протеїну) може значно Також, полінуклеотиди даного винаходу вклюзмінюватися по довжині; мінімальним розміром є чають молекулу нуклеїнової кислоти, яка є компослідовність довжини, достатньої для забезпеплементарною до однієї з нуклеотидних послідовчення послідовності, принаймні, порівняно подібностей вищезгаданих полінуклеотидів або їхньої ної функції та/або активності оригінальної послідочастини. Молекула нуклеїнової кислоти, яка є комвності, тоді як максимум розміру не є критичним. плементарною до однієї з нуклеотидних послідовПри деяких застосуваннях, максимальний розмір, ностей наведених в SEQ ID No:1 або 3 або 5 або 6 зазвичай не є значно більшим, ніж того потребує є суттєво комплементарною до однієї з нуклеотидзабезпечення бажаної активності та/або функції(й) них послідовностей наведених в SEQ ID No: 1 або оригінальної послідовності. 3 або 5 або 6 та здатна гібридизуватися з однієї з Типово, довжина вкороченої амінокислотної нуклеотидних послідовностей наведених в SEQ ID послідовності знаходиться в межах від 5 до більш No: 1 або 3 або 5 або 6, утворюючи стабільний ніж 1260 амінокислот. Більш типово, однак, довдуплекс. жина складатиме максимум 1000 амінокислот, Полінуклеотид даного винаходу, являє собою переважно, максимум від 500 до 100 амінокислот. нуклеотидну послідовність, яка принаймні на 70%, Зазвичай, бажано обирати послідовності, із припереважно, принаймні на 75%, більш бажано, принаймні близько 10, 12 або 15 амінокислот, до макнаймні на 80%, 90%, або 95%, та ще більш бажасимум близько 20 або 25 амінокислот. но, принаймні на 96%, 97%, 98%, 99% або більше Термін "епітоп" вказує на специфічні імунореагомологічна до нуклеотидної послідовності, навективні сайти в середині антигену, також відомі, як деної в SEQ ID No: 1 або 3 або 5 або 6, або її часантигенні детермінанти. Ці епітопи можуть бути тини. Полінуклеотид даного винаходу є нуклеотилінійними ділянками мономерів в полімерній комдною послідовністю, яка гібридизує, переважно позиції, такі як амінокислоти в протеїні, або склагібридизує за жорстких умов, як визначено тут, до датися, або бути представленими більш складниоднієї з нуклеотидних послідовностей, наведених ми вторинними або третинними структурами. в SEQ ID No 1 або 3 або 5 або 6, або її частини. 17 90849 18 Крім того, полінуклеотид даного винаходу моучасть в резистентності рослин до вказаних патоже містити лише частину кодуючого регіону однієї генів. Приклади активності протеїну Rpi-blb2 опиз послідовностей в SEQ ID No: 1 або 3 або 5 або 6, сані тут. Отже, функція протеїну Rpi-blb2 надає наприклад, фрагменту, який може бути використапрямо чи опосередковано резистентність до росний як зонд або праймер, або фрагмент кодуючої линних патогенів, переважно до згадуваних тут послідовності гену, що кодує протеїн Rpi-blb2. Нупатогенів, більш переважно до P. infestans. клеотидні послідовності, визначені клонуванням Протеїн принаймні на 70%, переважно пригену, що кодує даний протеїн Rpi-blb2, дозволяють наймні на 75%, більш переважно принаймні на створювати зонди та праймери для визначення 80%, 90%, або 95%, та ще більш переважно прита/або клонування його гомологів в інших типах наймні на 96%, 97%, 98%, 99% або більше гомолоклітин та організмах. Зонд/праймер, як правило, гічний до повної амінокислотної послідовності SEQ містить в значній мірі очищені олігонуклеотиди. ID No: 2 або 4. Олігонуклеотид, як правило, включає ділянку нукЧастини протеїну, що кодуються полінуклеолеотидної послідовності, яка гібридизується за тидом даного винаходу є, переважно, біологічно жорстких умов із, принаймні, майже 12, 15, переактивними. важно майже з 20 або 25, більш переважно, майже Як, зазначалося тут, термін "біологічно активз 40, 50 або 75 послідовними нуклеотидами смисна частина" призначений для позначення частини, лового ланцюга однієї із послідовностей, напринаприклад, домену/фрагменту, який надає резисклад, наведених в SEQ ID No: 1 або 3 або 5 або 6, тентність до ооміцетного патогену рослини та/або антисмислової послідовності однієї із послідовносBemisia tabaci та/або афід, або має імунологічну тей, наприклад, наведених в SEQ ID No 1 або 3 активність, таку, що вони зв'язуються із антитілом або 5 або 6, або її природних мутантів. Праймери, специфічним до протеїну Rpi-blb2, або вони мають що базуються на нуклеотидах даного винаходу активність як пояснюється в прикладах, або як можуть бути використані у реакціях PLR для клоописано тут. нування гомологів Rpi-blb2, наприклад, такі прайІнші фрагменти нуклеїнової кислоти, що кодумери, як описано в прикладах даного винаходу, ють біологічно активні частини поліпептиду даного наприклад, наведені в табл. 3А або 3B, переважвинаходу можуть бути отримані виділенням частино, використовують праймери ARF1F та ARF1R. ни однієї з послідовностей SEQ ID No: 1 або 3 або PLR із праймерами univ24R та univT4L давали в 5 або 6, які експресують кодовану частину протеїрезультаті фрагмент Rpi-blb2, який може бути вину або пептиду Rpi-blb2 (наприклад, рекомбінанткористаний як описано тут. Ці набори праймерів є ною експресією in vitro) та визначенням активності рівноцінними. Фахівцям відомо, як скомбінувати кодованої частини протеїну. праймери для одержання бажаного продукту, наТакож винахід охоплює полінуклеотиди, які віприклад клону повної довжини або частини послідрізняються від однієї з нуклеотидних послідовнодовності. Зонди, що базуються на нуклеотидних стей, приведених в SEQ ID No:1 або 3 або 5 або 6 послідовностях Rpi-blb2, можуть бути використані (або їх частин), завдяки виродженості генетичного для визначення транскриптів або геномних послікоду, й таким чином кодують поліпептид Rpi-blb2, довностей, які їх кодують, або гомологічних протеяк такий, що кодується послідовностями, приведеїнів. Зонди також, можуть включати приєднану ними в Seq ID No.: 2 або 4. Полінуклеотид даного мічену групу, наприклад, мічена група може бути винаходу, являє собою нуклеотидну послідовність, радіоізотопом, флуоресцентною сполукою, феряка кодує протеїн, що має амінокислотну послідоментом або кофактором ферменту. Такі зонди вність, приведену в SEQ ID No: 2 або 4. В наступможуть бути використані як частини геномних марній реалізації, полінуклеотид даного винаходу, керних тестів для визначання клітин, які експресукодує протеїн повної довжини, який в значній мірі ють Rpi-blb2, наприклад, для визначення рівня гомологічний до амінокислотної послідовності намолекул нуклеїнової кислоти, що кодують Rpi-blb2 веденої в SEQ ID No: 2 або 4. в досліджуваних клітинах, наприклад, для визнаТакож, фахівцю буде зрозуміло, що в популячення рівнів мРНК Rpi-blb2, або для визначення ціях може існувати поліморфізм послідовності геномної мутації або делеци гену Rpi-blb2. ДНК, який призводить до змін в амінокислотних Полінуклеотид даного винаходу кодує поліпепослідовностях (наприклад, в популяції S. птид або його частину, яка включає амінокислотну bulbocastanum). Такий генетичний поліморфізм в послідовність, яка достатньо гомологічна до амігені Rpi-blb2 може мати місце серед особин попунокислотної послідовності SEQ ID No 2 або 4 так, ляції завдяки природній мінливості. Як використащо протеїн або його частина зберігає здатність но тут, термін "ген" та "рекомбінантний ген" вказує брати участь в резистентності до патогенів, зокрена молекули нуклеїнової кислоти, які мають відкма, активності протеїну Rpi-blb2, як описано в досриті рамки зчитування, що кодують Rpi-blb2, перелідах на рослинах. Як використано тут, термін "доважно Rpi-blb2i із S. bulbocastanum. Такі природні статньо гомологічний" вказує на протеїн або його варіації звичайно можуть давати мінливість 1-5% в частину, яка має амінокислотні послідовності, які нуклеотидній послідовності гену Rpi-blb2. Будь-яка включають мінімальну кількість подібних або еквіта всі такі нуклеотидні варіації та одержані аміновалентних (наприклад, залишок амінокислоти, кислотні поліморфізми в Rpi-blb2, які є результаякий має такий самий бічний ланцюг, як залишок том природної мінливості та не змінюють функціоамінокислоти однієї з послідовностей поліпептиду нальну активність Rpi-blb2 необхідно розуміти як даного винаходу), до амінокислотних залишків такі, що знаходяться в межах даного винаходу. амінокислотної послідовності Seq ID No.: 2 або 4 Полінуклеотиди, які відповідають природним так, що протеїн або його частина здатна брати варіантам та гомологам кДНК Rpi-blb2 даного ви 19 90849 20 находу не з S. Bulbocastanum, можуть бути видіТаким чином, винахід стосується полінуклеолені на основі їхньої гомології до полінуклеотидів тидів, що кодують Rpi-blb2, які містять зміни в аміRpi-blb2 із S. Bulbocastanum, розкритих тут за донокислотних залишках, які не є важливими для помогою полінуклеотиду даного винаходу, або активності Rpi-blb2. Такі Rpi-blb2-и відрізняються його частини, як гібридизаційного зонда, відповідамінокислотною послідовністю від послідовності, но до стандартної схеми гібридизації за жорстких що міститься в SEQ ID No: 2 або 4 але зберігають умов. При цьому, при іншій реалізації, полінуклеоописану тут активність Rpi-blb2. Полінуклеотид тид винаходу має довжину приблизно 20 нуклеоможе містити нуклеотидну послідовність, що кодує тидів. Переважно, він гібридизується за жорстких поліпептид, причому поліпептид містить амінокисумов із молекулою нуклеїнової кислоти, яка вклюлотну послідовність, яка принаймні на 70% подібчає нуклеотидну послідовність полінуклеотиду на до амінокислотної послідовності, наведеної в даного винаходу, наприклад, SEQ ID No: 1 або 3 SEQ ID No: 2 або 4 та здатна брати участь в резиабо 5 або 6. При інших реалізаціях, нуклеїнова стентності до рослинного патогену. Переважно, кислота має довжину, принаймні, 20, 30, 50, 100, протеїн, кодований молекулою нуклеїнової кисло250 або більше нуклеотидів. Термін "гібридизуєтьти, є принаймні на 70% подібний до амінокислотся за жорстких умов" як визначено вище, признаної послідовності SEQ ID No: 2 або 4, більш бажачено для опису умов гібридизації та відмивання, за но, принаймні на 75% подібний до амінокислотної котрих нуклеотидна послідовність, принаймні, на послідовності SEQ ID No: 2 або 4, ще більш бажа65% подібна до кожної іншої послідовності, та які но, принаймні на 80%, 90%, або 95% подібний до переважно залишаються гібридизованими одна з амінокислотної послідовності SEQ ID No: 2 або 4, одною. Переважно, умови є такими, що послідовта ще більш бажано, принаймні на 96%, 97%, 98%, ності, принаймні на 70%, більш бажано, принаймні 99% подібний до амінокислотної послідовності на 75%, 80%, ще більш бажано, принаймні на 85%, SEQ ID No: 2 або 4. 90%, або 95%, або більше є ідентичними одна з Для визначення відсотку гомології двох аміноодною і залишається гібридизованими одна з одкислотних послідовностей (наприклад, однієї із ною. Переважно, полінуклеотид даного винаходу, Seq ID No.. 2 або 4 та її мутантної форми) або який гібридизується за жорстких умов до послідодвох нуклеїнових кислот, послідовності суміщавності приведеної в SEQ ID No" 1 або 3 або 5 або ються для досягнення оптимального порівняння 6, відповідає природним молекулам нуклеїнової (наприклад, можуть бути введені проміжки в поскислоти. лідовності одного протеїну або нуклеїнової кислоЯк тут вжито, "природна" молекула нуклеїнової ти для оптимального суміщення з іншим протеїном кислоти відповідає молекулі РНК або ДНК, яка має або нуклеїновою кислотою). Потім порівнюються нуклеотидну послідовність, що зустрічається в амінокислотні залишки або нуклеотиди у відповідприроді (наприклад, кодує природний протеїн). них амінокислотних положеннях або нуклеотидних Переважно, вона кодує полінуклеотид природного положеннях. Коли положення в одній послідовносRpi-blb2 S. bulbocastanum. ті (наприклад, однієї з послідовностей SEQ ID No: На додачу до природних варіантів послідовно2 або 4) зайнято таким самим амінокислотним застей Rpi-blb2, що можуть існувати в популяції, фалишком або нуклеотидом, як у відповідній позиції в хівець може також визнати, що зміни можуть бути іншій послідовності (наприклад, в мутантній формі введені за допомогою мутації в нуклеотидну посвибраної послідовності), тоді молекули є гомологілідовність полінуклеотиду, що кодує Rpi-blb2, й чними в цій позиції (наприклад, як використано тут, таким чином призвести до змін в амінокислотній амінокислотна або нуклеіновокислотна "гомологія" послідовності кодованого Rpi-blb2 без зміни функє еквівалентом до амінокислотної або нуклеіновоціональної здатності Rpi-blb2. Наприклад, нуклеокислотної "ідентичності", "подібності"). Відсоток тидні заміни, що призводять до амінокислотних гомології між двома послідовностями є функцією замін в "неважливих" амінокислотних залишках, кількості спільних ідентичних позицій в послідовможуть бути зроблені в послідовності полінуклеоностях (тобто, % гомології=кількість ідентичних тиду, що кодує Rpi-blb2, наприклад, SEQ ID No 1 позицій/загальна кількість позицій 100). або 3 або 5 або 6. "Неважливі" амінокислотні заГомологія може бути обрахована порівнянням лишки є залишками, які можуть бути змінені в посза допомогою програмного алгоритму GAP лідовності дикого типу протеїну Rpi-blb2 без зміни (Wisconsin Package Version 10 0, University of активності згаданого протеїну Rpi-blb2, тоді як Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), "важливі" амінокислотні залишки є залишками, Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids необхідними для активності протеїну Rpi-blb2. Інші Res.25:3389 et seq.), при встановленні наступних амінокислотні залишки, однак, (наприклад, ті, що параметрів: не є консервативними або є лише напівконсерваGap weight: 50 Length weight: 3 тивними в домені, що несе активність Rpi-blb2) Average match: 10 Average mismatch: 0 можуть не бути важливими для активності, й, таНаприклад, послідовність, яка має, принаймні ким чином, скоріше відповідати змінам без зміни 80% гомології із послідовністю SEQ ID NO: 1 на активності Rpi-blb2. нуклеїновокислотному рівні означає, що послідовВідповідно, фахівцю є відомими кодони, які ність, яка при порівнянні з SEQ ID NO: 1 при порівможуть бути змінені при переході від організму до нянні вище згаданою програмою із вказаними організму. От чому ми будемо пристосовувати установками параметрів, має принаймні 80% говикористання кодонів в полінуклеотиді даного вимології. находу, до застосування організму, в якому поліГомологія між двома поліпептидами означає, нуклеотид або поліпептид експресується. що ідентичність амінокислотної послідовності в 21 90849 22 кожному випадку є на повну довжину послідовносМолекула нуклеїнової кислоти, що кодує Rpiті, й може бути обрахована порівнянням за допоblb2 гомологи протеїнової послідовності SEQ ID могою програмного алгоритму GAP (Wisconsin No: 2 або 4, може бути створена введенням однієї Package Version 10.0, University of Wisconsin, або більше нуклеотидних замін, вставок або делеGenetics Computer Group (GCG), Madison, USA), цій до нуклеотидної послідовності полінуклеотиду при встановленні наступних параметрів: даного винаходу, зокрема SEQ ID No: 1 або 3 або Gap weight: 8 Length weight: 2 5 або 6 таким чином, що одна або більше нуклеоAverage match: 2,912 Average mismatch: -2,003 тидних замін, вставок або делецій введені в кодоНаприклад, послідовність, яка має, принаймні ваний протеїн. Мутації можуть бути введені в пос80% гомології із послідовністю SEQ ID NO: 2 на лідовності, наприклад, SEQ ID No: 1 або 3 або 5 протеїновому рівні, розуміється як значення того, або 6 за допомогою стандартних методів, таких як що послідовність, яка при порівнянні з SEQ ID NO: сайт-спрямований мутагенез та PLR2 при порівнянні вище згаданою програмою із вкаопосередкований мутагенез. Переважно, консерзаними установками параметрів, має принаймні вативні заміни зроблені в одному або більше роз80% гомології. рахованих неосновних амінокислотних залишках. В даній заявці, гомологія може бути визначена "Консервативна амінокислотна заміна" це заміна, за допомогою програми clustalW, яка може бути при якій амінокислотний залишок заміщено амінознайдена на www.ebi.ac.uk/tools, потрібно вибрати кислотним залишком, який має подібний бічний аналіз послідовностей та вибрати опцію clustalW ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, які (множинне суміщення послідовностей). Усі опції мають подібний бічний ланцюг, зазначено в літевиконувалися за стандартних умов, які є наступратурі. Ці сімейства включають амінокислоти з ними: основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, alignment: full; output format: aln w/numbers; аргінін, гістидин), кислотним бічним ланцюгом (наoutput order: aligned; color alignment: no; ktup (word приклад, аспарагінова кислота, глютамінова кисsize): def; window length: def; score type: percent; лота), незарядженими бічними ланцюгами (наприtopdiag: def; pairgap: def; matrix: def; gap open: def; клад, гліцин, аспарагін, глютамін, серин, треонін, end gaps: def; gap extension: def; gap distances: def; тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгаcpu mode: single; tree graph/type: cladogram; tree ми (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, graph/distances: hide; phyloge-netic tree/tree type: пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), з бетаnone; phylogenetic tree/correct dist.: off; phylogenetic розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, tree/ignore gaps: off. Однак, бажано гомологію обтреонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічничислювати за допомогою clustalW. ми ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, Функціональні еквіваленти, одержані з поліпетриптофан, гістидин). Отже, розрахований неосноптидів, наведених в SEQ ID NO: 2 або 4 згідно вивний амінокислотний залишок в Rpi-blb2, переважнаходу, шляхом заміщень, вставок, або делецій но заміщений іншим амінокислотним залишком мають, принаймні, 70%, переважно, принаймні, того самого сімейства. Також, при іншій реалізації 80%, більш бажано, принаймні, 90%, особливо мутації можуть бути введені випадково, впродовж бажано, принаймні, 95%, надзвичайно бажано, усієї або в частині кодуючої послідовності Rpi-blb2, принаймні 98% гомології з одним із поліпептидів, як наприклад насичувальним мутагенезом, та наведених в SEQ ID NO: 2 або 4 відповідно до одержані мутанти можуть бути перевірені на опиданого винаходу, та відрізняються тими самими сану тут активність Rpi-blb2 для визначення мутавластивостями, що й поліпептиди, наведені в SEQ нтів, які зберегли активність Rpi-blb2. За мутагенеID NO: 2 або 4. зом однієї з послідовностей SEQ ID No 1 або З або Функціональні еквіваленти, одержані з нуклео5 або 6, кодований протеїн може бути експресоватидних послідовностей, приведених в SEQ ID NO: ний рекомбінантно та активність протеїну може 1 або 3 або 5 або 6 згідно винаходу, шляхом замібути визначена, за допомогою, наприклад, описащень, вставок, або делецій мають, принаймні, ного тут методу (дивись Приклади). 70%, переважно, принаймні, 80%, більш бажано, В іншій реалізації в способі даного винаходу принаймні, 90%, особливо бажано, принаймні, активність протеїну Rpi-blb2, та іншого протеїну 95%, надзвичайно бажано, принаймні, 98% гоморезистентності підвищено. логії з одним із поліпептидів, наведених в SEQ ID Очікувалося, що в польових умовах присутNO: 2 або 4 відповідно до даного винаходу, та маність більш ніж одного гену резистентності є виють по суті ті самі властивості, що й поліпептиди, грашною, зокрема генів, що несуть резистентність наведені в SEQ ID NO: 2 або 4. до такого самого патогенну. У випадку якщо при"По суті ті самі властивості" функціонального сутній ізолят патогену, наприклад, раси Ρ. еквіваленту є усі що розуміються в плані внесення infestans, який здатен подолати резистентність до у фенотип резистентності до патогену або внесенодного із R-генів, інші один або більше R-ген(и) ня або збільшення резистентності до, принаймні залишається(ються) функціональними, й роодного патогену, при збільшенні кількості протеїну, бить(лять) неможливим інфікування рослини. Приактивності або функції згаданого функціонального сутні два нездолані R-гени значно знижують шанси еквіваленту Rpi-blb2 в рослині або тканині, частині цього патогену, зокрема раси Ρ. infestans, яка рослини або її клітини. Більш того, споруляція та зможе мутувати в расу яка здолає два або більше ушкодження фенотипу після інфікування в поєдR-генів. нанні зі згаданим підвищенням кількості протеїну, В подальшому "поліпептид резистентності" активності або функції згаданого функціонального або "протеїн резистентності" стосується поліпепеквіваленту, розуміється як важлива властивість. тиду, активність котрого (збільшена) несе резисте 23 90849 24 нтність до придатного генотипу ("дикого типу" або заним із NBS-LRR-протеїнами та підпадає під се"вихідного"). Відповідно, Rpi-blb2 є протеїном релекційний відбір. Однак, накопичується свідчення зистентності, так само як і, наприклад, Rpi-blb (або того, що LRR-и також роблять внесок в сигнальну RB або Sbu1). "Інший протеїн резистентності" стофункцію через негативну регуляцію, включаючись сується іншого протеїну резистентності, який є у можливі внутрішньоклітинні взаємодії. Тепер протеїном даного винаходу, причому термін "пробуло клоновано п'ять R-генів з картоплі, включаютеїн резистентності" включає поліпептид даного чи два R-гени, що несуть резистентність до фітовинаходу, а також один або більше інший(і) протефторозу, та усі вони належать до класу CC/LZїн(и) резистентності. Також зрозуміло, що термін NBS-LRR рослинних R-генів. Тоді як R1-ген одер"та інший протеїн резистентності" стосується одножаний із S. demissum, несе расову специфічність го або більше інших протеїнів резистентності. Тадо фітофторозу, нещодавно клонований ген Rpiким чином, може бути підвищена активність одноblb (або RB або Sbu1) із S. bulbocastanum несе го або більше додаткових протеїнів повну резистентність до спектру ізолятів P. резистентності. Інші протеїни резистентності опиinfestans, що мають багато вірулентних факторів, сані далі. Однак, в загалі, будь-який протеїн резиста не проявляв жодної расової специфічності. Татентності може бути сумісно експресований із покож, як описано раніше, покоління рослин із сомаліпептидом даного винаходу або його активність тичних гібридів, що містять Rpi-blb, були невразможе бути підвищена будь-яким з описаних тут ливі фітофторою під час польових експериментів у методів для Rpi-blb2. Мексиці, де були знайдені майже усі раси грибів. В переважній реалізації, інший протеїн може Було показано, за допомогою комплементації включати домен LRR та Р-петлю. Клонування та сприйнятливого фенотипу в культивованій картопопис характеристик більш ніж 30 (R) генів резистелі та томатах потенціал міжвидового трансферу нтності до хвороб рослин, які несуть резистентрезистентності широкого спектру дії до фітофтори ність до бактерій, грибів, ооміцетів, вірусів, немав культивованих Solanaceae із статево несумісних тод або комах дозволило їх класифікувати по специфічних до хазяїна видів за допомогою транструктурних класах залежно від специфіки патогесформації єдиними клонованими R-генами US ну (огляд за Dangl and Jones, 2001). Найбільшим 6,127,607 описує протеїни резистентності із LRRкласом описаних R генів, який містить майже 0.5 доменами та Р-петлями. Зміст US 6,127,607 повніпроцента розрахункових генів в геномі Arabidopsis, стю включено через посилання. Зокрема, колонки передбачається, що вони кодують внутрішньокліз 6 по 8 та 11 описує LRR-домени та Р-петлі. Крім тинні протеїни, які несуть багатий на лейцин потого в Song, 2003, PNAS 100 (16), 9128-9133 привтор (LRR) та домени сайту зв'язування нуклеотиведено порівняння Rpi-blb LRR фрагментів на Фіг.4 ду (NBS), фрагменти також знайдені в інших приведено на сторінці 9132 огляд LRR-доменів. рецепторних протеїнах та протеїнах передачі сигДомени поліпептиду даного винаходу приведено налу. R-протеїни NBS-LRR переважно відрізняна Фіг.14 а також на Фіг.15. ються N-кінцем, який має послідовність подібну до Переважно активність одного або більше проToll-протеїну Drosophila та рецепторного домену теїну(ів) резистентності вибраних із групи І, що інтерлейкіну-1 ссавців (TIR-NBS-LRR), або кодує включає Rpi-blb (синонім RB або Sbu1), Rpiсупер-спіралізовану структуру (CC-NBS-LRR), іноді ABPT1, Rpi-bib3, Rpi-mcd, R1, fiber (синонім R12), у формі лейцинової "застіжки-блискавки" (LZ-NBSRpi1, R2, R3a, R3b, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, LRR). Також може бути мембранно-зв'язаним, проR11, Ph-1, Ph-2 та Ph-3 є підвищеною. Переважно, теїном NBS-LRR, який за розрахунками є цитоплащоб додатково до Rpi-blb2 також, принаймні, збізматичним. На відміну від цього, два інші класи Rльшеною є активність Rpi-blb. протеїнів можуть нести LRR-и які за розрахунками В іншій реалізації способу даного винаходу, є трансмембранними, із зовнішньоклітинним доекспресія, наприклад трансгенного, протеїну Rpiменом LRR: LRR-трансмембранні (LRR-TM) Cfblb2 є збільшеною, та іншого трансгенного гену протеїни та LRR-TM-кіназний Ха21-протеїн. Опирезистентності є збільшеною. Протеїн резистентсані R-протеїни які не мають LRRs, є Pto-ген томаності експресується разом із Rpi-blb2 (або RB або тів, ген Hs1pro-1 буряків, ген mlo ячменю, гени Sbu1), який переважно є згадуваним тут протеїRpw8 з Arabidopsis та ген Rpg1 ячменю. ном, зокрема Rpi-blb, Rpi-ABPT1, Rpi-bib3, R1, Згідно гіпотези "ген-проти-гену", резистентRpi1, R-ber, Rpi-mcd, R2, R3a, R3b, R6, R7, Ph-1, ність до захворювання супроводжується сприйнятPh-2 або Phi 3, але може також бути один з інших тям рослинними R-протеїнами ефекторних молепротеїнів, що несуть резистентність до рослинних кул із антивірусною функцією(Ауr), й таким чином патогенів, відомих фахівцям. запуску деяких комплексів розпізнавання еліситоЯк вжито тут, термін "підвищена експресія" згіру, шляхів передачі сигналу, що ведуть до гіперчудно даного винаходу також включає de novoтливої відповіді (HR). Вважається, що разом з інекспресію полінуклеотиду або поліпептиду. Найшими рецепторами протеїни NBS-LRR R мають більш переважним, є підвищення резистентності модульну структуру із окремими розпізнавальними через сумісну експресію поліпептиду даного вината сигнальними доменами, згідно із чим LRR є ходу із Rpi-blb. Rpi-blb та Rpi-blb2 разом надають можливим розпізнавальним доменом, а N-кінцевий повну резистентність в дослідах на відокремленорегіон включає NBS, основний сигнальний доменю му листі з ізолятами P. infestans як описано в приФункціональний аналіз рекомбінантних LRRкладах, та в Song 2003, PNAS 100 (16), 9128. протеїнів, показує, що розпізнавальна специфічЗгадані гени, що несуть резистентність, наприність дійсно знаходиться в LRR. Більш того, LRR і клад, описані в є найбільш варіабельним регіоном, щільно пов'я 25 90849 26 RB або Sbu1 (синоним Rpi-blb): AY336128 [gi: поліпептиду Rpi-blb (або RB- або Sbu1-), пере32693280], (Song et al., 2003). ВАС клони 177 013 важно такого, що кодується послідовністю, привета СВ3А14 які мають ген Rpi-blb депоновані в деною за вхідним номером GenBank: AY336128 [gi: GenBank із вхідними номерами AY303171 та 32693280]; AY303170. поліпептиду Рі1, переважно такого, що кодуR1: AF447489 [gi: 9117432422], (Ballvora et al., ється послідовністю, приведеною за вхідним но2002) мером GenBank: AF447489 [gi 9117432422]; Rpi1: Kuhl, J.C., Hanneman, R.E., and Havey, полінуклеотид Rpi-bib3, Rpi-ABPT1 ат/або RpiM.J., (2201) Characterization and mapping of Rpi1, a mcd, переважно такий, що кодується послідовнісlate blight resistance locus from diploid (1EBN) тю або похідною з неї за інформацією приведеною Mexican Solanum pinnatisectum.Molecular в Park, Т.Н., Van der Vossen, E., Vleeshouwers, genet.Genomics 265: 977-985.R7ber: Ewing, E.E., V.G.A.A., Tan, Α., Visser, R.G.F.and Van Eck, Simko, I., Smart, CD., Bonierbale, M.W., Mizubuti, H.J.2004. Major resistance genes for tuber and leaf E.S.G., May, G.D., and Fry, W.E., (2000) Genetic resistance to Phytophthora infestans in potato: An mapping from field tests of qualitative and quantitative outline of a PhD project. Crop Functional Genomics resistance to Phytophthora infestans in a population 2004, July 2004, Jeju, Korea, page 93; derived from Solanum tuberosum and Solanum поліпептид R3a та/або R3b, переважно такий, berthaultii.Molecular breeding 6:25-36.R2: Li, X., що кодується послідовністю або похідною з неї за vanEck, H.J., vanderVoort, J.NAM., Huigen, D.J., інформацією приведеною в Huang, S., Stam, P., and Jacobsen, E.(1998) Autotetraploids and Vleeshouwers, V.G.A.A., Werij, J.S., Hutten, R.C.B., genetic mapping using common AFLP markers: the Van Eck, H.J., Visser, R.G.F, and Jacobsen, R2 allele conferring resistance to Phytophthora E.(2004). infestans mapped on potato chromosome Р3-резистентність до Phytophthora infestans в 4.Theoretical and Applied Genetics 96 (8): 1121-112. картоплі, що несуть два тісно зв'язані R-гени із R3, R6, R7: Elkharbotly, Α., Palominosanchez, C, значною специфічністю. МРМІ 17 (4), 428-435. Salamini, F., Jacobsen, E., and Gebhardt, C.(1996) Резистентність протеїн, що несе резистентR6 and R7 alleles of potato conferring race-specific ність до патогену, переважно P. infestans, картоваresistance to Phytophthora infestans (Mont) de Вагу ний та описаний як приведені, як, наприклад, для identified genetic loci clustering with the R3 locus on для Rpi1 в Kuhl, J.C., Hanneman, R.E., and chromosome XI.Theoretical and Applied.Genetics 92 Havey, M.J., (2001) Characterization and mapping of (7): 880-884.Ph-1: Bonde and Murphy (1952) Main Rpi1, a late blight resistance locus from diploid Agric.Exp.Stn.Bull.No 497. (1EBN) Mexican Solanum pmnatisectum.Molecular Ph-2: Moreau, P., Thoquet, P., Olivier, J., genet.Genomics 265. 977-985; Laterrot, H., and Grimsley, N.H. (1998) Genetic для R-ber в Ewing, E.E., Simko, I., Smart, CD., mapping of Ph-2, a single locus controlling partial Bonierbale, M.W., Mizubuti, E.S.G., May, G.D., and resistance to Phytophthora infestans in tomato. Fry, W.E., (2000) Genetic mapping from field tests of Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4): 259-269. qualitative and quantitative resistance to Ph-3: Chunwongse, J., Chunwongse, C, Black, L, Phytophthora infestans in a population derived from and Hanson, P.(2002) Molecular mapping of the Ph-3 Solanum tuberosum and Solanum berthaultii. gene for late blight resistance in tomato. Journal of Molecular breeding 6:25-36; Horticultural Science & Biotechnology 77 (3): 281для R2 в Li, X., vanEck, H.J., vanderVoort, 286. J.NAM., Huigen, D.J., Stanri, P., and Jacobsen, Rpi-bib3, Rpi-ABPT1 and Rpi-mcd: Park, Т.Н., E.(1998) Autotetraploids and genetic mapping using Van der Vossen, E., Vleeshouwers, V.G.A.A., Tan, common AFLP markers: the R2 allele conferring Α., Visser, R.G.F.and Van Eck, H.J.2004. Major resistance to Phytophthora infestans mapped on resistance genes for tuber and leaf resistance to potato chromosome 4. Theoretical and Applied Phytophthora infestans in potato: An outline of a PhD Genetics 96 (8): 1121-1128; project.Crop Functional Genomics 2004, July 2004, для R3, R6, R7 в Elkharbotly, Α., Jeju, Korea, page 93. Palominosanchez, С, Salamini, F., Jacobsen, E., and R3a and R3b: Huang, S., Vleeshouwers, Gebhardt, C.(1996) R6 and R7 alleles of potato V.G.A.A., Werij, J.S., Hutten, R.C.B., Van Eck, H.J., conferring race-specific resistance to Phytophthora Visser, R.G.F, and Jacobsen, E.(2004). The R3 infestans (Mont) de Вагу identified genetic loci resistance to Phytophthora infestans in potato is clustering with the R3 locus on chromosome conferred by two closely linked R-genes with distinct Xl.Theoretical and Applied.Genetics 92 (7): 880-884; specificities. MPMI 17 (4),428-435. для Ph-1 в Bonde and Murphy (1952) Main В одній з реалізацій, активність Rpi-blb2 збіAgric.Exp.Stn.Bull.No 497; або льшені, згідно даного винаходу, наприклад, збільдля Ph-2 в Moreau, P., Thoquet, P., Olivier, J., шена експресія полінуклеотиду, даного винаходу Laterrot, H., and Gnmsley, N.H.(1998) Genetic та збільшено експресію, принаймні однієї нуклеїmapping of Ph-2, a single locus controlling partial нової кислоти, що кодує Rpi-blb, Rpi-ABPT1, Rpiresistance to Phytophthora infestans in bib3, Rpi-mcd R1, R-ber, Rpi1, R2, R3a, R3b, R6, tomato.Molecular Plant Microbe Interactions 11 (4): R7, Ph-1, Ph-2 та/або Ph-3 при чому молекула нук259-269; та/або леїнової кислоти, вибрана з групи, що складається для Ph-3 в Chunwongse, J., Chunwongse, C, з: Black, L, and Hanson, P.(2002) Molecular mapping of (а) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує, the Ph-3 gene for late blight resistance in принаймні, зрілу форму 27 90849 28 tomato.Journal of Horticultural Science & рожеву гниль картоплі), Plasmopara viticola (яка Biotechnology 77 (3): 281-286; спричиняє несправжню мучнисту росу винограду), або поліпептид, що несе резистентність до паBremia lactuca (яка спричиняє несправжню мучнитогену, переважно P. infestans отриманий зі згадасту росу салату-латук) або Peronospora tabaci (яка них публікацій; спричиняє синю плісень тютюну). b) молекули нуклеїнової кислоти, нуклеотидна Активність Rpi-blb2 в рослинах, рослинних кліпослідовність яких є результатом виродження гетинах, рослинних тканинах, рослинних органах або нетичного нуклеотидної послідовності (а); їхніх частинах, згідно даного винаходу, можу бути c) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує попідвищена, створена або стимульована за дополіпептид, який одержаний з поліпептиду, що кодумогою методу, які є відомими фахівцям та описані, ється полінуклеотидом (а) або (b), шляхом заміни, наприклад, в Sambrook et al., Cold Spring Harbor делеци та/або додання однієї або декількох аміноLaboratory Press, NY, 1989. кислот амінокислотної послідовності поліпептиду, Отже, в переважній реалізації, даний винахід що кодується полінуклеотидом (а) або (b); стосується способу даного винаходу, в якому ексd) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує попресія є «de nоуо»-експресією. Термін "de novoліпептид, послідовність якого має ідентичність експресія" в клітині, тканині або в організмі або 70% або більше до амінокислотної послідовності його частині як вона розуміється тут, вказує на поліпептиду, який кодується молекулою нуклеїноекспресію генетичного продукту після невої кислоти (а); визначуваності згаданого генетичного продукту e) молекул нуклеїнової кислоти, які включають або активності згаданого генетичного продукту, фрагмент або епітоп-несучу частину поліпептиду, зокрема відповідного поліпептиду або полінуклеокодованого будь-якою молекулою нуклеїнової кистиду в клітині, тканині або в організмі або його часлоти від (а) по (d); тині. Переважно, щоб ген, що кодує поліпептид f) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує або полінуклеотид в клітині, тканині або в організмі фрагмент, який починається з амінокислоти 1, 30, або його частині та який має бути de novo50, 100, 200, 300, 500 або 1000, та закінчується експресований, не був присутнім в геномі клітини, амінокислотою 1276, 1000, 500, 300, 200, 50, або 1 тканини або організму або його частин. Якщо експоліпептиду, що кодується будь-якою молекулою пресія генетичного продукту не визначається в нуклеїнової кислоти згідно з (а)-(e) та однією зі клітині, тканині або в організмі або його частинах, згаданих активностей, звичайно робиться висновок про те, що експресія g) молекули нуклеїнової кислоти, що включає, не відбувається в клітині, тканині або в організмі принаймні, 20 нуклеотидів будь-якого з полінуклеабо його частині. Відповідно, якщо активність не отидів (а) або (b); можу бути виявлена, звичайно робиться висновок h) молекули нуклеїнової кислоти, що кодує попро те, що відповідна активність не існує, фахівцю ліпептид, який упізнається моноклональним антиє відомими способи виявлення та засоби досягтілом, що утворене проти поліпептиду, який кодунення більшої чутливості. Отже, в переважній реється молекулою нуклеїнової кислоти згідно з алізації, термін "de novo-експресія", вказує на нову будь-яким з підпунктів (а)-(h); або додаткову експресію в системах, де рівень i) молекули нуклеїнової кислоти, одержуваної активності, наприклад, із-за низького рівня експрешляхом скринінгу прийнятної бібліотеки при жорссії або експресії (майже) неактивного генетичного тких умовах з зондом, який має послідовність мопродукту є надто малою щоб нести резистентність лекули нуклеїнової кислоти до рослинного патогену, зокрема P. infestans. Позгідно з будь-яким з підпунктів (а)-(h) або її рівняння "knock out"-штамів із низько та/або висофрагменту розміром, принаймні, 20; та, переважно ко-експресуючими фенотипами можу показати, чи 30 або більше нуклеотидів; та є різниця в резистентності до будь-якого згадуваj) молекули нуклеїнової кислоти, комплеменного тут патогену є оглядовим. тарний ланцюг якої гібридизується у жорстких Відповідно, в іншій реалізації даного винаходу, умовах з молекулою нуклеїнової кислоти згідно з є збільшеною ендогенна активність Rpi-blb2 та/або будь-яким з (а) або (і), іншого протеїну резистентності. Рівень експресії в або комплементарного ланцюга будь-якої з клітині можу бути підвищений способами відомими молекул нуклеїнової кислоти згідно (а)-(j). фахівцям. Декілька методик описані тут, наприВідповідно, спосіб даного винаходу, несе реклад, трансгенна експресія полінуклеотиду або зистентність однієї із згаданих рослин, рослинної поліпептиду даного винаходу. Полінуклеотид або тканини або рослинної клітини даного винаходу до поліпептид можуть бути зовнішнього походження. рослинного патогену типу Oomycetes, переважно Переважно, щоб полінуклеотид, що вводиться, був патогену порядку Pythiales або Peronosperales, того самого генетичного походження, що і клітина більш переважно сімейства Pythiaceae або хазяїн, рослинна клітина, рослинна тканина або Peronosporaceae, більш переважно роду рослина. Phytophthora або Вrеmіа або Peronospera або Активність, зокрема, ендогенна активність, а Plasmopara, найбільш переважно де патогеном є також активність трансгенно експресованого Rpiодин з видів Phytophthora parasitica var.nicotianae blb2 може бути підвищена декількома способами. (яка спричиняє крім іншого "чорної ніжки" тютюну), Відповідно, в переважній реалізації, активність Phytophthora sojae (яка спричиняє Phytophthora-ну описаних тут протеїнів резистентності є підвищекореневу гниль в бобах сої), Phytophthora capsici ною одним або більше наступними етапами: (яка спричиняє гниль у перцю та кабачку та томаa) стабілізація білка резистентності; тів), Phytophthora erythroseptica (яка спричиняє 29 90849 30 b) стабілізація кодуючої мРНК білка резистенБудь-які порівняння переважно проводяться за тності; аналогічних умов. "Аналогічні умови" означає, що c) підвищення специфічної активності білка всі умови, такі як наприклад, умови культивування резистентності; або вирощування, умови аналізів (такі як, буфер, d) експресію або підвищення експресії гомолотемпература, субстрати, концентрація патогену та гічного або штучного фактора транскрипції для подібне) підтримуються ідентичними між експериекспресії білка резистентності, ментами, для порівняння та відрізняються лише e) стимуляцію активності білка резистентності послідовністю порівнюваних поліпептидів Rpi-blb2, за допомогою екзогенних факторів індукції, їхнім організмом походження та, якщо можливо, f) експресію гена, що кодує трансгенний білок патогеном. При виборі патогену береться до уваги резистентності; та/або видова специфічність, оскільки кожне порівняння g) збільшення числа копій гена, що кодує білок потребує того щоб патоген, який є найбільш подірезистентності. бний до іншого еквіваленту. В загальному випадку, активність організму, Завдяки збільшеній активності Rpi-blb2, зросзокрема рослинної клітини, рослини, або рослинтає резистентність рослини або її частини. В переної тканини можу бути збільшена збільшенням важній реалізації, спосіб даного винаходу призвокількості специфічного протеїну, наприклад, протедить до зниження індексу споруляції принаймні на їну резистентності у вказаному організмі. "Кількість 30%, після інфікування Ρ. infestans, порівняно із протеїну" розуміється у значення кількості поліпедиким типом, більш переважно зниження на 50%, птиду, переважно Rpi-blb2, в організмі, тканині, значно переважно на 70%, більш значно переважклітині, або клітинному компартменті. "Збільшенно більш ніж на 80%, більш переважно на 85% та ня" кількості протеїну означає кількісне збільшення 90%. Найбільш переважно на 95% або більше. маси протеїну в організмі, тканині, клітині, або кліВідповідно, даний винахід також стосується тинному компартменті, наприклад, одним із описазгаданого полінуклеотиду даного винаходу, як виних нижче способів, порівняно із диким типом цьозначено вище, що кодує білок Rpi-blb2, який вклюго самого роду або виду, до котрого цей метод не чає молекулу нуклеїнової кислоти, вибрану з грубув застосований, за однакових усіх інших умов пи, яка складається з: (таких як, наприклад, культуральних умов, віку a) молекул нуклеїнової кислоти, які кодують, рослин, та інше). Збільшення кількості, принаймні принаймні готову форму поліпептиду, приведеного на 10%, переважно принаймні 20%, або принаймні на SEQ ID NO: 2 або 4; 50% особливо переважно принаймні 70% або 90% b) молекул нуклеїнової кислоти, які включають дуже особливо переважно принаймні 100%, найкодуючу послідовність приведену на SEQ ID NO: 1 більш переважно принаймні 200% та більше. або 3, або 5 або 6, що кодують, принаймні готову "Збільшення" активності означає збільшення форму поліпептиду; загальної активності протеїну в організмі, тканині, c) молекул нуклеїнової кислоти, чия нуклеотиклітині, або клітинному компартменті, порівняно із дна послідовність внаслідок виродженості генетидиким типом цього самого роду або виду, до котчного коду вироджена у нуклеотидну послідовність рого цей метод не був застосований, за однакових (а) або (b); усіх інших умов (таких як, наприклад, культуральd) молекул нуклеїнової кислоти, які кодують них умов, віку рослин, та інше). Збільшення кількополіпептид, що походить з поліпептиду, кодованості, принаймні на 10%, переважно принаймні 20%, го полінуклеотидом шляхом заміщення, делеції або принаймні 50% особливо переважно принаймта/або додавання однієї або більше амінокислот ні 70% або 90% дуже особливо переважно приз(до) амінокислотної послідовності поліпептиду, наймні 100%, найбільш переважно принаймні кодованого полінуклеотидом від (а) до (с); 200% та більше. e) молекул нуклеїнової кислоти, що кодує поВ контексті цього, ефективність резистентності ліпептид, послідовність котрого має ідентичність до патогену може коливатися я більший або мен70% або більше до амінокислотної послідовності ший бік порівняно із значенням отриманим, коли поліпептиду, кодованого молекулою нуклеїнової збільшувався один із протеїнів Rpi-blb2 приведекислоти (а) або (b); них на SEQ ID NO: 2 або 4. Переважні функціонаf) молекул нуклеїнової кислоти, які включають льні еквіваленти є такими, в котрих ефективність фрагмент або епітоп-несучу частину поліпептиду, патогенної резистентності, вимірювана, наприкодованого будь-якою молекулою нуклеїнової кисклад, ефективністю пенетрацм патогену або як лоти від (а) по (e); описано тут, відрізняється але не більш ніж на (g) молекули нуклеїнової кислоти, що включає 50%, переважно на 25%, особливо переважно на полінуклеотид, який має послідовність молекули 10% порівняно зі значеннями отриманими відновнуклеїнової кислоти, що є ампліфікованою з бібліленням протеїну Rpi-blb2 приведеного на SEQ ID отеки нуклеїнової кислоти при використанні прайNO: 2 або 4. Особливо переважними є такі послімера, як представлено у Таблиці 3B; 3B, переваждовності, де підвищення підвищує ефективність но ARF1F або ARF1R, патогенної резистентності, більш ніж на 50%, пеh) молекул нуклеїнової кислоти, що кодують реважно на 100%, особливо переважно на 500% фрагмент, що починається амінокислотами: 1, 30, дуже особливо переважно на 1000% порівняно зі 50, 100, 200, 300, 500, або 1000 та закінчується значеннями отриманими відновленням одного із амінокислотами: 1276, 1000, 500, 300, 200, 50, 30, протеїну Rpi-blb2 приведеного на SEQ ID NO: 2 або 1 поліпептиду, кодованого будь-якою із від (а) або 4. до (g); 31 90849 32 і) молекул нуклеїнової кислоти, що включають Найбільш переважним джерелом є S. принаймні 20 нуклеотидів будь-якого з полінуклеоbulbocastanum. тидів від (а) до (d); Rpi-blb2 був виділений із матеріалу S. j) молекул нуклеїнової кислоти, що кодує поліtuberosum одержаного в АВРТ. Таким чином, з пептид, який розпізнається моноклональними анточки зору таксономії описаний Rpi-blb2 має також титілами, які одержано до поліпептиду кодованого походження із S. tuberosum. Однак, ген був присубудь-якою з молекул нуклеїнової кислоти від (а) до тнім на інтрогресійному фрагменті, який ймовірно (h); походить із S. bulbocastanum. Багато сортів S. k) молекул нуклеїнової кислоти, одержуваних tuberosum мають інтрогресійні фрагменти із видів скринінгом відповідної бібліотеки за жорстких Solanum, а не лише S. tuberosum. Тому, S. умов, за допомогою зонда, який має послідовність tuberosum може, згідно таксономічної системи табудь-якої з молекул нуклеїнової кислоти від (а) до кож бути джерелом полінуклеотидів даного вина(j) або його фрагменту із 15, переважно 30, 60, 90 ходу, зокрема тих, що походять з АВРТ S. або більше нуклеотидів, та tuberosum, а також інших різновидів видів Solarium І) молекул нуклеїнової кислоти, комплементаодержаних подібним чином. рна послідовність котрих гібридизується за жорстВідповідно, в іншій реалізації, полінуклеотид ких умов із будь-якою з молекул нуклеїнової кисвинаходу одержаний з S. tuberosum. лоти від (а) до (k); Полінуклеотид даного винаходу, наприклад, або комплементарного ланцюга будь-якої з молекула нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидмолекул нуклеїнової кислоти згідно з (а)-(l); ну послідовність Seq ID NO: 1 або 3 або 5 або 6, або ті, що кодують поліпептид кодований сегабо її частину, можу бути виділена стандартними ментом або лінкерною групою 6 Solarium молекулярно-біологічними методиками та наведеbulbocastanum який виділяється сумісно із маркена тут інформація про послідовність. Наприклад, ром з таблиці 3А або 3B та який опосередковує Rpi-blb2 кДНК може бути виділена з бібліотеки, за резистентність до патогенів, зокрема, до патогенів допомогою всієї або частини однієї із послідовносвибраних з групи типу Oomycetes; тей полінуклеотиду даного винаходу, в якості гібВ одному з втілень, полінуклеотид способу, ридизаційного зонду та стандартними методиками згідно винаходу не складається з послідовності гібридизації (наприклад, як описано в Sambrook et зображеної в Seq ID NO.: 7 та/або 9 та/або не al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., складається з послідовності нуклеїнової кислоти, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor що кодує протеїн зображений в Seq ID NO.: 8 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). та/або 10. Більш того, полінуклеотид охоплює цілу або часВ одному з втілень, полінуклеотид способу, тину послідовностей полінуклеотиду даного виназгідно винаходу не складається з послідовності ходу, які можуть бути виділені за допомогою реакмолекули нуклеїнової кислоти МіІ.1 або Mil.2 ції полімеразного ланцюга з використанням та/або молекули нуклеїнової кислоти, що кодує праймерів виготовлених на основі цієї послідовнопротеїн МіІ.1 або Mil.2. сті (наприклад, молекула нуклеїнової кислоти, які Таким чином, в одному з втілень, полінуклеовключає цілу послідовностей полінуклеотиду датид способу, згідно винаходу може не складатися ного винаходу). Наприклад, мРНК може бути видііз послідовностей приведених Rossi et al. 1998, лена з клітин, наприклад, S. bulbocastanum або PNAS USA 95:9750-9754, Milligan et al., 1998. Plant іншої рослини (наприклад, методом гуанідінCell 10:1307-1319; та/або WO98/06750. тіоцианатної екстракції за Chirgwin et al.(1979) В наступній реалізації, полінуклеотид даного Biochemistry 18: 5294-5299) та кДНК може бути винаходу походить або виділений із геному органіодержана з використанням реверсної транскрипзму обраного із групи, що складається із, тази (наприклад, Moloney MLV реверсна транскриMenyanthaceae, Solanaceae, Sclerophylacaceae, птаза, виробництва Gibco/BRL, Bethesda, MD; або Duckeodendraceae, Goetzeaceae, Convolvulaceae, AMV реверсна транскриптаза, виробництва Cuscutaceae, Polemoniaceae, та Hydrophyllaceae Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). згідно Systema Naturae 2000, Brands, S.J., Синтетичний олінуклеотид даного винаходу, Amsterdam або має походження з них, більш переявляє собою нуклеотидну послідовність, яка гібриважно вони вибрані з групи, що складається з, дизує, переважно гібридизує за жорстких умов, як Atropa, Browallia, Brunfelsia, Capsicum, Cestrum, визначено тут, до однієї з нуклеотидних послідовCyphomandra, Datura, Fabiana, Franciscea, ностей приведених в SEQ ID No: 1 або 3 або 5 або Hyoscyamus, Lycium, Mandragora, Nicandra, 6, або її частини. Полінуклеотид даного винаходу Nicotiana, Petunia, Physalis, Schizanthus та Solanum може бути ампліфікований з використанням кДНК, згідно Systema Naturae 2000, Brands, S.J., або геномної ДНК як шаблону та відповідних оліAmsterdam або має походження з них, ще більш гонуклеотидних праймерів згідно стандартної амппереважно вони вибрані з групи, що складається з ліфікаційної методики PLR. Ампліфікований таким сімейства Solanaceae, переважно S. чином нуклеотид може бути клонований у відповіbulbocastanum, картоплі (S. tuberosum), помідорів дний вектор та описаний за допомогою аналізу (S. lycopersicum), петунії, томатного дерева (S. послідовності ДНК. Крім того, олігонуклеотиди, що betaceum), динна груша (S. muncatum) та баклавідповідають нуклеотидній послідовності Rpi-blb2 жан (S. melongena). Ще більш переважними є поможуть бути одержані стандартною методикою мідор або картопля або S. bulbocastanum як джесинтезу, наприклад, з використанням автоматизорело полінуклеотидів для даного винаходу. ваного синтезатора ДНК. 33 90849 34 В реалізації даного винаходу, протеїн Rpi-blb2 Більш того, певні вектори здатні спрямовувати кодується сегментом хромосоми 6 або лінкерної експресію генів, з котрими вони функціонально групи 6 Solanum bulbocastanum або S. tuberosum: зв'язані. Такі вектори тут називаються "експресійні Також даний винахід включає сегмент хромовектори". В загальному випадку, "експресійні вексоми 6 або лінкерної групи 6 Solanum тори", що використовуються в методах рекомбінаbulbocastanum або S. tuberosum. В одній з перевантної ДНК часто є плазмідами. В даному описі, жних реалізацій способу даного винаходу, експре"плазміда" та "вектор" можуть використовуватися сований протеїн Rpi-blb2 кодується полінуклеотивзаємозамінно, оскільки плазміда, є найбільш задом, який включає сегмент хромосоми 6 або стосовною формою вектора. Однак, винахід вклюлінкерної групи 6 Solanum bulbocastanum. Перевачає й наступні форми експресійних векторів, такі жно, згаданий сегмент є групою, яка включає інші як вірусні вектори, (наприклад, реплікація дефектcis-активний елемент, наприклад, промотори, енних ретровірусів, аденовіруси та аденохансери, сайти зв'язування, та ін. або trans-активні асоційовані віруси), які слугують еквіваклентним елементи, такі як кофактори або інші протеїни рефункціям. зистентності, які несуть підвищену резистентність. Даний винахід, також стосується космід, віруГеномні фрагменти, які включають ген Rpi-blb2 та сів, бактеріофагів та інших векторів, які звичайно інші регуляторні елементи приведено на ID NO: 5 використовуються в генетичній інженерії, які міста 6. тять молекулу нуклеїнової кислоти, згідно даного Фахівцю відомо, як можна одержати хромосовинаходу. Методи, які відомі фахівцям можуть мний сегмент, наприклад, клонуванням хромосомбути використані для конструювання різноманітних них фрагментів у BACs, як наприклад, у Song, плазмід та векторів; дивись наприклад, методики 2003, PNAS 100 (16), 9128 або описано тут та в описані в Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory цитованих тут посиланнях. Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y та Відповідно, до наступної реалізації, полінуклеAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, отид даного винаходу, або полінуклеотид, який Green Publishing Associates and Wiley Interscience, кодує протеїн Rpi-blb2 косегрегує з маркером, вибN.Y. (1989). Також, молекули нуклеїнової кислоти раним з Таблиці 3А, або включає сайт реплікації та вектори винаходу можуть бути введені в ліпоабо сайт гібридизації для вказаного маркера. Як соми для доставки в клітини мішені. докладно описано в прикладах, резистентність до В іншій реалізації, вектор даного винаходу або Ρ. infestans може бути картована за допомогою спосіб даного винаходу відрізняється тим, що помаркерів приведених в Таблиці 3А або 3B. Чим лінуклеотид, що кодує білок Rpi-blb2, або додаткоближче розташований маркер до гену, тим вищий вий білок резистентності, є функціонально зв'язавідсоток ліній, наприклад, похідних клонів, в котрих ним з послідовностями контролю експресії, та/або ген косегрегує із вказаним маркером. Відповідно, в є функціонально зв'язаним з послідовністю нуклеїпереважній реалізації, полінуклеотид даного винанової кислоти, яка кодує трансгенний сигнал регуходу косегрегує з маркером Е40М58, СТ119 та/або ляції експресії, що дозволяє здійснювати експреСТ216. сію в прокаріотичних або еукаріотичних хазяйських В іншій реалізації даний винахід стосується клітинах. способу одержання рекомбінантного вектора, що В переважній реалізації, даний винахід стосувключає інсерцію полінуклеотиду згідно даного ється вектору даного винаходу або способу даного винаходу у вектор або інсерцію вказаного полінуквинаходу, в якому полінуклеотид, що кодує протелеотиду та додаткового білка резистентності у їн Rpi-blb2, та/або такий, що кодує додатковий вектор. білок резистентності, є функціонально зв'язаним з Відповідно, в іншій реалізації даного винаходу, послідовностями контролю експресії, що мають даний винахід стосується вектора, що включає походження від тих самих видів, що й полінуклеополінуклеотид даного винаходу або вказаний потид, який кодує протеїн Rpi-blb2, та/або додатколінуклеотиду та додатковий ген резистентності вий білок резистентності. одержаний за способом даного винаходу. В цьому випадку, молекула нуклеїнової кислоЯк вжито тут, термін "вектор" вказує на молети, згідно винаходу експресується в клітині, й кулу нуклеїнової кислоти, здатну транспортувати принципово можливо таким чином модифікувати полінуклеотид до якої він був приєднаний. кодуючу послідовність, що протеїн знаходитиОдним з типів векторів є "плазміда", яка є двометься в будь-якому компартменті рослинної кліланцюговою кільцевою ДНК в котру може бути тини. Вони включають ядро, ендоплазматичний ліговано додатковий сегмент ДНК. ретикулум, вакуоль, мітохондрії, пластиди, такі як Іншим типом вектору є вірусний вектор, в якоамілопласти, хлоропласти, хромопласти, апопласму додаткові сегменти ДНК або РНК можуть бути ти, позаклітинне середовище, олійні тільця, перокліговані у вірусний геном. сисоми та інші компартменти рослинної клітини Певні вектори є здатними до самостійної реп(для довідки дивись Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. лікації в клітині хазяїні в котру вони введені (на15, 4 (1996), 285-423 та цитовані там посилання). приклад, бактеріальні вектори, які мають бактеріаПолінуклеотид може бути функціонально злитий із льне походження реплікації та епісомальні вектори придатним полінуклеотидом, наприклад, вектором, ссавців). що кодує сигнал для транспорту в бажаний компаІнші вектори (такі як, не-епісомальні вектори ртмент. ссавців) інтегровані в геном клітини хазяїна при В іншій переважній реалізіцп, даний винахід введені до геному хазяїна, й таким чином реплікустосується вектору в якому полінуклеотид, даного ються в усьому геномі хазяїна. винаходу є функціонально зв'язаним з послідовно 35 90849 36 стями контролю експресії, що дозволяє здійснюваIn: Plant Molecular Biology Manual. Однак, інші ти експресію в прокаріотичних або еукаріотичних послідовності які, наприклад, діють як лінкер із хазяйських клітинах. Природа цих регуляторних специфічними сайтами розщеплення ферментів послідовностей різниться залежно від організму рестрикції, або сигнальні пептиди, також можуть хазяїна. В прокаріотах, регуляторні послідовності бути розташовані між двома послідовностями. звичайно включають промотор, рибосомальний Вставка послідовностей може вести також до екссайт зв'язування та термінатори. В прокаріотах, пресії злитих протеїнів. Переважно, експресійна регуляторні послідовності звичайно включають касета, що складається із зв'язаних промотору та промотори, термінатори, та в деяких випадках послідовності нуклеїнової кислоти, що має експреенхансери, трансактиватори або фактори трансксуватися, може існувати у вормі інтегрованій у рипції. вектор та бути вставденою в частину рослинного Термін "регуляторна послідовність" повинен геному, наприклад, трансформацією. включати, як мінімум компоненти, присутність котТакі регуляторні послідовності описані, напририх є необхідною для експресії, та можуть також клад, в Goeddel; Gene Expression Technology: включати додаткові корисні компоненти. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Термін "функціонально зв'язаний" стосується Diego, CA (1990) or see: Gruber and Crosby, in: безпосередньої близькості розташування, при якій Methods in Plant Molecular Biology and компоненти, як вони описані знаходяться в зв'язку, Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, що дозволяє їм функціонувати певним чином. Реeds.:Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108 вклюгуляторна послідовність "функціонально зв'язана" чаючи посилання в них. Регуляторні послідовності, із кодуючої послідовністю є приєднаною до неї включають ті, що є напряму визначальними для таким чином, що експресія кодуючої послідовності експресії нуклеотидної послідовності в багатьох досягається за умов сумісних із регуляторною потипах клітин хазяїнів та ті, що прямо експресують слідовністю. Якщо регуляторна послідовність є нуклеотидну послідовність лише в октемих типах промотором, є очевидним для фахівця, що викоклітин за песних умов. Фахівцями може бути виристовується дволанцюгова нуклеїнова кислота. значено, що створення експресійного вектору моФункціональне зв'язування розуміється в знаже залежати від таких факторів як вибір для транченні, наприклад, послідовного розташування сформації клітини хазяїна, рівень експресії промотору послідовності нуклеїнової кислоти для бажаного протеїну та інше. Експресійні вектори експресування, якщо можливо, наступного регулявинаходу можуть бути введені в клітину хазяїна, й торного елементу, як наприклад, термінатору татаким чином продукувати протеїни або пептиди, ким чином, що кожні регуляторні елементи можуть включаючи злиті протеїни або пептиди, кодовані задовольняти свою функцію коли рекомбінантно полінуклеотидами, як тут описано. експресується послідовність нуклеїнової кислоти, Рекомбінантні вектори експресії даного виназалежно від розташування послідовності нуклеїноходу можуть бути сконструйовані для експресії вої кислоти, по відношенню до смислової та антизгаданих протеїнів резистентності, переважно Rpiсмислової РНК. В цьому випадку, прямий зв'язок в blb2, в прокаріотичних та еукаріотичних клітинах. хімічному сенсі обов'язково не потрібен. Генетичні Наприклад, гени, що кодують полінуклеотид данорегуляторні послідовності, такі як, наприклад, енго винаходу можу бути експресований в бактеріахансерні послідовності, також спрямовують свою льних клітинах, таких як E. coli, C. glutamicum, функцію на цільову послідовність з місця, що знаAgrobactenum tumefaciens, клітинах комах (із заходиться досить далеко або спрямовується з інстосуванням бакуловірусного вектору експресії), ших молекул ДНК. Переважне розташування є клітинах дріжджів або інших грибів (дивись таким, якщо послідовність нуклеїнової кислоти, яка Romanos, (1992), Yeast 8: 423-488; van den Hondel, повинна експресуватися рекомбінантно, розташо(1991) J.W.Bennet & LLLasure, eds., p.396-428 вана після послідовності, що діє як промотор, таAcademic Press: San Diego; and van den Hondel, ким чином, що дві послідовності зв'язані ковалент(1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, но між собою. Відстань між промоторною Peberdy, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: послідовністю та послідовністю нуклеїнової кислоCambridge), algae (Falciatore et al., 1999, Marine ти, що має експресуватися рекомбінантно,переBiotechnology 1, 3:239-251), та клітинах багатокліважно менша за 200 пар основ, особливо переватинних рослин (дивись Schmidt, R.(1988), Plant Cell жно менша за 100 пар основ, дуже особливо Rep.: 583-586); Plant Molecular Biology and переважно менша за 50 пар основ. Biotechnology, С Press, Boca Raton, Florida, chapter Функціональний зв'язок, та експресійна касета, 6/7, S. 71-119 (1993); F.F.White, B.Jenes et al., можуть бути одержані звичайною рекомбінацією та Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, клонувальними методиками, як описано, наприVol. 1, Engineering and Utilization, eds.:Kung und клад, в Maniatis Τ, Fritsch EF and Sambrook J R.Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), (1991), 205-225 (та посилання на процитовані в in Silhavy TJ, Berman ML and Enquist LW (1984) них) або кітинах ссавців. Також, придатні клітини Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor хазяїни обговорені в Goeddel, Gene Expression Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM Technology: Methods in Enzymology 185, Academic et al.(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Press, San Diego, CA (1990). Також, рекомбінантGreene Publishing Assoc, and Wiley Interscience and ний вектор експресії може бути тринскрибований in Gelvin et al.(1990). та трансльований in vitro, наприклад, з викорис 37 90849 38 танням регуляторних послідовностей промотору послідовності здатні керувати генною експресією в Т7 та полімерази Т7. рослинних клітинах, та функціонально зв'язані Експресія протеїнів в прокаріотах часто протаким чином, що кожна послідовність задовольняє водиться із векторами, що містять визначальні або своїй функції, такій як термінація транскрипції, ідуковні промотори, які спрямовують експресію як наприклад, сигнали поліаденілування. Переважні злитих так незлитих протеїнів. Злиті вектори досигнали поліаденілування мають походження із дають число амінокислот до протеїну, що ними тДНК Agrobacterium tumefaciens такої як ген 3, вікодуються, звичайно до амінного кінця рекомбінадомий як октопін-синтаза Ті-плазміди рТіАСН5 нтного протеїну але також і до С-кінця або злиті із (Gielen et al., ЕМВО J.3 (1984), 835 ff) або її функпридатною ланкою в протеїні. Такі злиті вектори ціональні еквіваленти але також є придатними усі звичайно слугують трьом цілям: 1) збільшення функціонально активні в рослинах термінатори. експресії рекомбінантного протеїну; 2) збільшення Так як експресія гену рослини дуже часто не розчинності рекомбінантного протеїну; та 3) сприобмежена рівнями транскрипції то й рослинна ексяти очищенню рекомбінантного протеїну, діючи як пресійна касета переважно містить інші функціоліганд у афінній очистці. Також, злитий вектор монально зв'язані послідовності, такі як енхансери же кодувати додаткові протеїни, які які експресутрансляції, такі як overdrive-послідовність, яка має ють підтримку та збільшення активності Rpi-blb2 5'-нетрансльовну лідерну послідовність з вірусу або резистентності рослини до рослинних патогемозаїки тютюну, яка посилює співвідношення пронів, наприклад, інших протеїнів резистентності. теїну до РНК (Gal-lie et al. 1987, Nucl. Acids Часто, у злитих експресійних векторах, сайт катаResearch 15:8693-8711). літичного розщеплення введено до злитої частини Також, описаний тут полінуклеотид може бути та рекомбінантного протеїну для можливості розфункціонально зв'язаний із відповідним промотоділення рекомбінантного протеїну від злитої часром, що несе ген експресії специфічного за часотини, наступним очищенням злитого протеїну. Такі вою, клітинною або тканинною ознакою. Переважферменти, та їхні сдочірні розпізнавальні послідоними є промотори, що керують конститутивною вності, включають Фактор Ха, тромбін та ентерокіекспресією (Benfey et al., ЕМВО J.8 (1989) 2195назу/ 2202) як в одержаних із рослинних вірусів, таких як Тапові злиті експресійні вектори включають 35S CAMV (Franck et al., Cell 21(1980) 285-294), pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. В. and 19S CaMV (також дивись US5352605 та Johnson, K.S.(1988) Gene 67 31-40), pMAL (New WO8402913) або рослинні промотори такі як малі England Biolabs, Beverly, MA) та pRIT5 (Pharmacia, субодиниці Rubisco описані в US4962028. Piscataway, NJ). Термін рослинно-специфічні промотори розуПриклади, придатних індуковних незлитих міється в значенні, в принципі, як будь-який проекспресійних векторів E. coli включають pTrc мотор, здатний спрямовувати експресію генів, зок(Amann (1988) Gene 69:301-315) and pET 11d рема чужорідних генів, в рослинах або частинах (Studier et al., Gene Expression Technology: рослин, рослинних клітинах, рослинних тканинах Methods in Enzymology 185, Academic Press, San або рослинних культурах. В цьому контексті, ексDiego, California (1990) 60-89. пресія може бути, наприклад, конститутивною, Одним з підходів до максималізації експресії індуковною або залежною від розвитку. рекомбінантного протеїну є експресування протеїНаступне є переважним: ну в бактерії хазяїні із неповною здатністю до проа) Конститутивні промотори теолітичного розщеплення рекомбінантного протеПереважні вектори, які роблять можливим їну(Gottesman, S., Gene Expression Technology конститутивну експресію в рослинах (Benfey et Methods in Enzymology 185, Academic Press, San al.(1989) ЕМВО J 8:2195-2202). "Конститутивний" Diego, California (1990) 119-128). Іншим підходом є промотор розуміється в значенні, що цей промозміна послідовності нуклеїнової кислоти, нуклеїнотор забезпечує експресію у великій кількості, певої кислоти, що буде вставлена в експресійний реважно, в усіх тканинах протягом значного періовектор, так щоб окремі кодони кожної амінокислоду розвитку рослини, переважно на всіх стадіях ти, тули такими як переважно застосовуються у розвитку рослини. вибраній для експресії бактерії, тікій як E. coli або Зокрема, переважно застосовується, рослинC. glutamicum (Wada et al (1992) Nucleic Acids ний промотор або промотор одержаний із рослинRes.20 2111-2118). Така зміна послідовностей нукного вірусу. Зокрема, переважним є промотор 35Sлеїнової кислоти даного винаходу може бути викотранскрипт вірусу мозаїки цвітної капусти CaMV нана стандартною методикою синтезу ДНК. (Franck et al.(1980) Cell 21:285-294; Odell et Також, вектор може бути дріжджовим експреal.(1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et сійним вектором. Приклади векторів для експресії al.(1985) Virology 140:281-288; Gardner et al.(1986) у дріжджах S. cenvisae включають pYepSed Plant Mol Biol 6:221-228) або 19S CaMV промотор (Baldari, et al., (1987) Embo J.6:229-234), pMFa (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al.(1989) (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), EMBO J 8:2195-2202). pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), та Іншим придатним конститутивним промотором pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). є промотор "мала субодиниця Rubisco (SSU)" (US Переважно, полінуклеотид даного винаходу 4,962,028), промотор легумін В (GenBank Ace. або описаний тут є функціонально зв'язаний із No.X03677), промотор нопалін синтази рослинною послідовністю керування експресією, Agrobacterium, подвійний промотор TR, наприклад, експресійними касетами. Рослинні ексAgrobacterium OCS (котопін-синтази) промотор, пресійні касети, переважно, містять регуляторні промотор убіквітину (Holtorf S et al.(1995) Plant Mol 39 90849 40 Biol 29:637-649), промотор убіквітину-1 c) Хімічно індуковні промотори (Christensen et al.(1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Експресійна касета також може включати хіміBruce et al.(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692чно індуковні промотори (дивись статтю: Gatz et 9696), промотор Smas, промотор циннамілal.(1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol алкоголь-дегідрогенази (US5683439), промотори 48:89-108), за допомогою котрих може керуватися вакуолярних субодиниць АТФ-ази або промотор експресія ендогенного гену в рослині в певний багатого на пролін білку пшениці (WO91/13991), та момент часу. Такі промотори як, наприклад, проінші промотори генів, конститутивна експресія котмотор PRP1 (Ward et al.(1993) Plant Mol Biol рих відома фахівцям. 22:361-366), промотор індуковний саліциловою b) Тканинно-специфічні промотори кислотою (WO 95/19443), промотор індуковний Переважними також є промотори зі специфічбензолсульфонамідом (ЕР 0388186), промотор ністю до пильників, зав'язі, квітів, листя, пагонів, індуковний тетрацикліном (Gatz et al.(1992) Plant J коренів та насіння. 2:397-404), промотор індуковний абсцизовою кисНасіннєво-специфічні промотори, такі як, налотою (ЕР 0335528) або промотор індуковний етаприклад, промотор фазеоліну (US 5,504,200; нол- або циклогексаноном (WO 93/21334) можуть Bustos MM et al.(1989) Plant Cell 1(9):839-53), провикористовуватися й подібнії. мотор гену 2S альбуміну (Joseffson LG et al.(1987) d) Промотори індуковні стресом або патогеном J.Biol.Chem 262:12196-12201), промотор легуміну Наступні переважні промотори, це індуковні (Shirsat A et al.(1989) Mol Gen.Genet 215(2): 326біотичним або абіотичним стресом, такий як, на331), промотор USP (невідомий промотор насіння) приклад, індуковний патогеном промотор гену (Baumlein Η et al.(1991) Mol Gen Genet 225(3):459PRP1 (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), 67), промотор гену напіну (US 5,608,152;Stalberg K промотор індуковний високою температурою et al.(1996) L Planta 199:515-519), промотор протеhsp70 або hsp80 (US 5,187,267), альфа-амілазний їну зв'язування сахарози (WO 00/26388) або пропромотор індуковний низькою температурою (WO мотор легуміну В4 (LeB4; BSumlein Η et al.(1991) 96/12814), промотор індуковний світлом PPDK, або Mol Gen.Genet 225: 121-128; Baeumlein et al.(1992) промотор індуковний пораненням pinll (ЕР375091). Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al.(1995) Промотори індуковні патогеном охоплюють ті, Biotechnology (NY) 13(10):1090f), промотор олеощо індукуються внаслідок інфікування патогеном, зину Arabidopsis (WO 98/45461), промотор Все4 такі як, наприклад, гени протеїнів PR, SAR протеїBrassica (WO 91/13980). Інші придатні насіннєвонів, р-1,3-глюканази, хітінази та подібні (for специфічні промотори, які є промоторами генів, які example Redolfi et al.(1983) Neth J Plant Pathol кодують глютенін високої молекулярної маси 89:245-254; Uknes, et al.(1992) The Plant Cell 4:645(HMWG), гліадін, галуджуючий фермент, АДФ глю656; Van Loon (1985) Plant Mol Virol 4:111-116; коза-пірофосфатаза (АГФ-аза) або крохмальMarineau et al.(1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matсинтаза. ton et al.(1987) Molecular Plant-Microbe Interactions Іншими переважними є промотори, які дозво2:325-342; Somssich et al.(1986) Proc Natl Acad Sci ляють насіннєво-специфічну експресію в однодоUSA 83:2427-2430; Somssich et al.(1988) Mol Gen льних, таких як кукурудза, ячмінь, пшениця, жито, Genetics 2:93-98; Chen et al.(1996) Plant J 10:955рис та подібні. Наступне може бути переважним: 966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sci USA промотор гену Ipt2 або Ipt1 (WO 95/15389, WO 91:2507-2511; Warner, etal.(1993) Plant J 3:191-201; 95/23230) або промотор описаний в WO 99/16890 Siebertz et al.(1989) Plant Cell 1:961-968(1989). (промотори гордеїну, гену глютеїну, гену оризину, Також охоплюються промотори індуковний погену проламіну, гену гліадіну, гену глютеліну, гену раненням такияк гену pinll (Ryan (1990) Ann Rev зеїну, гену казіріну або гену секаліну). Phytopath 28:425-449; Duan et al.(1996) Nat Biotech Клубеневі-, коренеплодні-, або корене14:494-498), of the wunl and wun2 gene (US специфічні промотори, наприклад, палатиновий 5,428,148), або гену winl та win2 (Stanford et промотор класу І (В33), промотор інгібітору кутепal.(1989) Mol Gen Genet 215:200-208), системіну сину D картоплі. (McGurl et al.(1992) Science 225:1570-1573), або Промотори специфічні до листя гену WIP1 (Rohmeieret al.(1993) Plant Mol Biol такий як цитозольний промотор FBPase карто22:783-792; Eckelkamp et al.(1993) FEBS Letters плі (WO 97/05900), промотор Rubisco (ribulose-1,5323:73-76), гену МРІ (Corderok et al. (1994) The bisphosphate carboxylase) SSU (small subunit) або Plant J 6(2): 141-150) та подібні. промотор ST-LSI із картоплі (Stockhaus et al.(1989) Промотори залежні від розвитку EMBO J 8:2445-2451). Дуже особливо переважниІнші придатні промоторами є, наприклад, проми є епідерміс-специфічні промотори, наприклад, мотори специфічні до дозрівання плодів, такі як промотор гену OXLP (оксалат-оксилаза-подібний наприклад, промотор помідорів специфічний до протеїн) (Wei et al.(1998) Plant Mol. Biol. 36:101дозрівання плодів (WO 94/21794, ЕР 409625). 112). Промотори залежні від розвитку включають частПромотори специфічні до квітів ково тканинно-специфічні промотори, оскільки такі як, наприклад, промотор фітоен-синтази певні тканини за природою є залежними від розви(WO 92/16635) або промотор гену Р-rr (WO тку типами. 98/22593). Може бути бажаним, щоб поліпептид даного Інші специфічні промотори винаходу був лише активним або мав лише підтакий як промотор 5126 (US 5,689,049, US вищену активність в тканинах, які є трансфікова5,689,051), промотор glob-l та ними або пенетрованими згадуваним тут патогепромотор у-зеїну. ном. Особливо переважними є конститутивні 41 90849 42 промотори та листо- та/або пагоно-специфічні та al.(1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) та подібні. епідерміс-специфічні промотори, найбільш переТакож вони можуть сприяти тканинній специфічноважними є індуковні патогеном та епідерміссті (Rouster J et al.(1998) Plant J 15-435-440). специфічні промотори. Також переважними є приЕкспресійна касета переважно може включати родні промотори, які наприклад включають геномні одну або більше відомих енхансерних послідовнофрагменти, приведені на ID NO: 5 та 6. стей, функціонально зв'язаних із промотором, який Також, інші промотори можуть бути функціоробить можливою підвищену рекомбінантну екснально зв'язані з послідовністю нуклеїнової кислопресію послідовності нуклеїнової кислоти. Інші ти, що має експресуватися, які промотори роблять переважні послідовності, такі як додаткові регуляможливою експресію в інших тканинах або в інших торні елементи або термінатори, можуть бути організмах, таких як бактерія Е. coli. Придатними вставлені до 3' кінця послідовності нуклеїнової рослинними промоторами є, в принципі, усі описакислоти, що має рекомбінантно експресуватися. ні вище промотори. Одна або більше копій послідовності нуклеїнової Термін "послідовності генетичного контролю" кислоти можуть бути представлені в генетичному розуміється в широкому значенні та вказує також конструкті для рекомбінантної експресії. на всі ті послідовності, які мають вплив на матеріВ іншій реалізації природна термінаторна посалізацію або функцію експресійної касети, згідно лідовність представлена геномним фрагментом, даного винаходу. Наприклад, послідовності генеприведеним на ID NO.: 5 та/або 6. тичного контролю модифікують транскрипцію та Сигнали поліаденілування, які є придатними трансляцію в прокаріотичних або еукаріотичних на роль керуючих послідовностей є рослинними організмах. Переважно, експресійні касети, згідно сигналами поліаденілування, переважно ті, які в даного винаходу, охоплюють промотори зі специосновному відносяться до сигналів поліаденілуфічністю до ембріонального епідермісу та/або квівання Т-ДНК із Agrobactenum tumefaciens, зокрема тів, 5'-вище послідовності нуклеїнової кислоти для 3' гену Т-ДНК (октопінсинтази) плазміди Ті рекомбінантної експресії та 3'-нижче термінальної pTiACHS (Gielen et al.(1984) EMBO J 3:835 et seq.) послідовності, як додаткової послідовності генетиабо його функціонального еквівалентів. Приклади чного контролю, якщо можливо, інших додаткових термінаторних послідовностей, які є особливо регуляторних елементів, в кожному випадку функпридатними є термінатор OCS (октопінсинтази) та ціонально зв'язаному до послідовності нуклеїнової термінатор NOS (нопалін-синтази). кислоти, що має рекомбінантно експресуватися. Керуючі послідовності, також можуть розумітиПослідовності генетичного контролю також ся як такі, що роблять можливою гомологічну реохоплюють інші промотори, промоторні елементи комбінацію або інсерцію в геном організму хазяїна або мінімальні промотори, усі з яких можуть моабо який дозволяє видалення з геному. У випадку дифікувати властивості, що спрямовують експрегомологічної рекомбінації, наприклад, природний сію Таким чином, наприклад, тканинно-специфічна промотор певного гену може бути замінений на експресія може додатково залежати від певних промотор зі специфічністю до ембріонального епістресорних чинників, що належать до послідовнодермісу та/або квітів. Методи, таю як технологія сті генетичного контролю. Такі елементи було опиcre/Ιοχ дозволяють тканево-специфічне, якщо мосано, як наприклад, водний стрес, абсцизова кисжливо, індуцибельне, видалення експресійної калота (Lam Ε and Chua NH, J Biol Chem 1991, сети з геному організму хазяїна (Sauer В (1998) 266(26) 17131-17135) та тепловий стрес (Schoffl F Methods. 14(4)·381-92). В цьому методі, специфічні et al., Molecular & General Genetics 217(2-3) 246-53, фланкуючі послідовності (Іох послідовності), які 1989). пізніше дозволяють видалення за допомогою creІншими переважними керуючими послідовносрекомбінази, приєднані до цільового гену. тями є, наприклад, Грам-позитивні промотори аmу Експресійна касета та вектори, що походять з та SP02, та дріжджові або грибові промотори неї можуть включати інші функціональні елементи. ADC1, MFa, АС, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, Термін "функціональний елемент" повинен розуміADH. тися в широкому сенсі й вказувати на всі елеменВ принципі, усі природні промотори зі своїми ти, які мають вплив на генерацію, ампліфікацію регуляторними послідовностями, такими як згадані або функцію експресійних касет, векторів або травище, можуть використовуватися в способі згідно нсгенних організмів, згідно даного винаходу. Наданого винаходу. Також, переважно можуть викоступне можу бути прийняте, як приклади, але не ристовуватися синтетичні промотори. обмеження: Послідовності генетичного контролю крім того а) Селекційні маркери, які несуть резистентможуть охоплювати нетрансльовні 5'-регіони, інність до інгібітору метаболізму, такого як 2трони або некодуючі 3'-регіон генів, такий як, надезоксиглюкоза-6-фосфат (WO 98/45456), антибіоприклад, інтрон актину-1, або інтрони 1, 2, та 6 тики або біоциди, переважно гербіциди, такі як, Adh1-S (для довідки: The Maize Handbook, Chapter наприклад, канаміцин, G 418, блеоміцин або гігро116, Freehng and Walbot, Eds., Springer, New York міцин, або фосфінотріцин та подібні. Особливо (1994)). Також було показано, що вони можуть переважними селекційними маркерами є ті, що грати значну роль в регуляції генної експресії. Віднесуть резистентність до гербіцидів. Як приклади повідно, було показано, що нетрансльовні 5'можуть бути приведені наступні: послідовності послідовності можуть посилювати тимчасову ексДНК, що кодують фосфінотріцинові ацетилпресію гетерологічних генів. Прикладами енхансетрансферази (PAT) та які інактивують інгібітори рів трансляції які можуть згаданий є 5'-лідерна глютамін-трансферази (гени bar та pat), гени 5послідовність вірусу мозаїки тютюну (Gallie et енол-пірувілшикімат-3-фосфат синтази (гени 43 90849 44 EPSP-синтази), які несуть резистентність до маркер, який несе резистентність до біоциду (наGlyphosater (N-(фосфонометил)гліцину), ген gох, приклад, гербіциду), інгібітор метаболізму, такий який кодує ферменти розщеплення Glyphosater як, 2-дезоксиглюкоза-6-фосфат (WO 98/45456) або (гліфозат-оксиредуктаза), ген deh (який кодує деаантибіотик, для клітин, які успішно пройшли рекологеназу, яка інактивує далапон), сульфонілсечомбінацію. Селективні маркери дозволяють провесвина- та імідазолінон-інактивуючі ацетолактатти відокремлення трансформованих клітин від синтази, та гени bxn, які кодують бромоксинілнетрансформованих (McCormick et al.(1986) Plant розщеплюючий нітриладний фермент, ген aasa, Cell Reports 5:81-84). який несе резистентність до антибіотику апектіноВведення в експресійну касету, згідно даного міцину, ген стрептоміцинової фосфотрансферази винаходу, в організм або клітини, органи, тканини, (SPT), який робить можливою резистентність до частини або їхнє насіння (переважно в рослини стрептоміцину, ген неоміцинової фосфотрансфеабо рослинні клітини,органи, тканини, частини або рази (NPTII), який несе резистентність до канамінасіння) може переважно бути виконане за допоцину або генецетидіну, ген гігроміцинової фосфотмогою векторів які включають експресійні касети. рансферази (НРТ), який опосередковує Експресійна касета, може бути введена у вектор резистентність до проміцину, ген ацетолактазної (наприклад, плазміду) за допомогою прийнятного синтази (ALS), який несе резистентність до сульсайту розщеплення. Отримана плазміда, спочатку фонілсечовинних гербіцидів (наприклад мутованих вводиться у Е. coli. Коректно трансформовані Ε. варіантів ALS із, наприклад, мутацією S4 та/або coli селектують, вирощують та одержують рекомНrа). бінантні плазміди способами відомими досвідчеРепортерні гени, які кодують добре визначуному фахівцеві. Рестрикційний аналіз та секвенувані протеїни та, завдяки своїй кольоровій або вання може служити перевіркою етапу ферментативній активності, роблять можливим клонування. визначення ефективності трансформації, сайту Іншими промоторами для експресії у специфіекспресії або часу експресії. Дуже особливо перечних рослинах є, наприклад, промотор гену напіну важними в цьому контексті є гени, що кодують реіз насіння рапсу (US5608152), USP-промотор із портерні протеїни (Schenborn Ε, Groskreutz D.Mol Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, Βiο-technol.1999; 13(1):29-44) такі як зелений флу225 (3):459-67), олеозиновий промотор із оресцентний протеїн (GFP) (Sheen et al.(1995) Arabidopsis (W09845461), фазеоліновий промотор Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff et al.(1997) Proc із Phaseolus vulgans (US5504200), Все4-промотор Natl Acad Sci USA 94(6) 2122-2127, Reichel et із Brassica (W09113980) або легуміновий промотор al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893, В4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 Tian et al.(1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO (2)'233-9), а також інша промотори, що несуть на97/41228; Chui WL et al.(1996) Curr Biol 6.325-330; сінє-специфічну експресію в однодольних рослиLeffel SM et al.(1997) Biotechniques.23(5):912-8), нах, таких як, кукурудза, ячмінь, пшениця, рис та хлорамфеніколтрансферазу, люциферазу (Ow et інші. Придатними промоторами є промотор гену al.(1986) Science 234.856-859; Millar et al.(1992) Ipt2 або Ipt1 із ячменю (WO 95/15389 та WO Plant Mol Biol Rep 10-324-414), ген екворину 95/23230) або промотор описаний в WO 99/16890 (Prasheret al.(1985) Biochem Biophys Res Commun (промотори із ячменю гену гордеіну, рисового гену 126(3): 1259-1268), B-галактозидазу, ген локусу R глютеїну, рисового гену оризину, рисового гену (що кодує протеїн, який регулює вироблення пігпроламіну, пшеничного гену гліадіну, пшеничного ментів антроцианіну (червоного забарвлення) в гену глютеліну, кукурудзяного гену зеїну, вівсяного рослинних тканинах, й таким чином робить можгену глютеліну, гену казіріну із сорго або житнього ливим прямий аналіз промоторної активності без гену секаліну). додавання інших додаткових речовин або хромоТакож, полінуклеотид даного винаходу може генних субстратів) Dellaporta et al., In: Chromosome бути клонований в експресійний вектор в антисмиStructure and Function: Impact of New Concepts, словій орієнтації. Тобто, молекула ДНК є функціо18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, нально зв'язана з регуляторною послідовністю, 1988), (3-глюкоуронідаза є дуже особливо переватаким чином, який забезпечує експресію (через жною (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907). транскрипцію молекули ДНК) молекули РНК, яка є c) Походження реплікації, яке забезпечує ампантисмисловою до мРНК, кодованої полінуклеотиліфікацію експресійних касет або векторів, згідно дом даного винаходу. Регуляторні послідовності, винаходу в, наприклад, Ε. coli. Прикладами, які функціонально зв'язані з нуклеїновою кислотою, беруться до уваги є ORI (походження реплікації кпонованою в антисмисловій орієнтації, може бути ДНК), pBR322 on або Р15А ori (Sambrook et al.: вибраний, як такий, що забезпечує постійну ексMolecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. пресію молекули антисмислової РНК в різних тиCold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring пах клітин, наприклад, вірусні промотори та/або Harbor, NY, 1989). енхансери або регуляторні послідовності можуть d) Елементи, які є необхідними для рослинної бути вибрані які спрямовують конститутивну, ткатрансформації, опосередкованої Agrobactenum, нинно-специфічну або клітинно-специфічну екстакі як наприклад, права та ліва границя Т-ДНК пресію антисмислової РНК. Вектор антисмислової або vir-регіону. експресії може бути у вигляді рекомбінантної плаДля селектування клітин, які успішно пройшли зміди, плазміди або ослабленого вірусу, в котрих гомологічну рекомбінацію, або іншими словами продукуються молекули антисмислової нуклеїнодля селектування трансформованих клітин, як вої кислоти під контролем високоефективного реправило, необхідно додатково ввести селективний гуляторного регіону, активність котрого може бути 45 90849 46 визначена типом клітини в який введено вектор. Переважно, введена молекула нуклеїнової киОбговорення регуляції генетичної експресії за дослоти є чужорідною для даної клітини хазяїна. помогою антисмислових генів дивись, Weintraub, Під "чужорідною" розуміють, що ця молекула H.et al., Antisense RNA as a molecular tool for нуклеїнової кислоти є або гетерологічною по відgenetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol ношенню до клітини хазяїна, це означає, що вона 1(1) 1986 and Mol et al., 1990, FEBS Letters одержана з клітини або організму із відмінною ге268:427-430. нетичною основою або є гомологічною по відноВ іншій реалізації даний винахід стосується шенню до клітини хазяїна, але розташована в інспособу одержання рекомбінантної клітини хазяїшому геномному середовищі, від того яке на, що включає введення вектору або полінуклеоприродно оточує таку молекулу нуклеїнової кислотиду даного винаходу або вказаного вектору або ти. Це означає, що якщо молекула нуклеїнової вказаного полінуклеотиду та вектору для експресії кислоти є гомологічною по відношенню до клітини додаткового протеїну резистентності в клітину хахазяїна, вона не розташована в своєму природнозяїна. му місці в геномі вказаної клітини хазяїна, зокрема, Векторна ДНК може бути введена в прокаріовона є оточена іншими генами. В цьому випадку, тичні або еукаріотичні клітини звичайними метомолекула нуклеїнової кислоти може знаходитися дами трансформації або трансфекції. Як вжито або під керуванням свого власного промотору або тут, терміни "трансформація" та "трансфекція", під керуванням гетерологічного промотору. Вектор "кон'югація" та "трансдукція" повинні вказувати на або молекула нуклеїнової кислоти, згідно даного різноманітні визнані методики введення чужорідної винаходу, яка знаходиться в клітині хазяїні може нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК), в клітину бути або інтегрована в геном клітини хазяїна або хазяїна, включаючи сумісне осадження фосфатом знаходитися в якійсь позахромосомній формі. Відкальцію або хлоридом кальцію, DEAE-декстранповідно до цього, також має бути зрозумілим, що опосередкована трансфекція, ліпофекція, природмолекула нуклеїнової кислоти даного винаходу на компетенція, хімічно опосередкована передача може використовуватися для відновлення або або електропорація. Придатні способи трансфорстворення мутантного гену шляхом гомологічної мації або трансфекції клітин хазяїнів, включаючи рекомбінації (Paszkowski (ed.), Homologous рослинні клітини можуть бути знайдені в Recombination and Gene Silencing in Plants Kluwer Sambrook, et al. (Molecular Cloning A Laboratory Academic Publishers (1994)). Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Відповідно, в іншій реалізації даний винахід Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring стосується клітини хазяїна одержаної методом Harbor, NY, 1989) та інших лабораторних довіднигенетичної інженерії, за допомогою полінуклеотиду ках, таких як Methods in Molecular Biology, 1995, даного винаходу або вектору даного винаходу або Vol. 44, Agrobactenum protocols, ed Gartland and вказаного вектору або вказаного полінуклеотиду Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. та вектору або полінуклеотиду для експресії додаДля стабільної трансфекції еукаріотичних кліткового протеїну резистентності. тин, відомо, що залежно від використаних вектору Терміни "клітина хазяїн" та "рекомбінантна кліекспресії та методики трансфекції, лише маленькі тина хазяїн" тут є взаємозамінними. Є зрозумілим, фракції клітин можуть інтегрувати чужорідну ДНК у що ці терміни вказують не лише на окрему клітину свій геном. Для ідентифікації та селектування цих але й на її потомство або потенціальне потомство інтегрантів, ген, що кодує селективний маркер (натакої клітини. Завдяки певним модифікаціям моприклад, резистентність до антибіотиків) зазвичай жуть з'являтися успішні покоління, завдяки або вводиться в клітину хазяїна поряд із бажаним гемутаціям або впливам зовнішнього середовища, ном. Преважні селективні маркери включають ті, такі потомства, фактично, можуть не бути ідентичщо несуть резистентність до ліків, таких як G418, ними до батьківських клітин, але включатися в гігроміцин та метотрексат або в рослини які несуть обсяг та умови викладеного тут. резистентність до такого гербіциду як гліфозат Наприклад, полінуклеотид даного винаходу глуфозинат. Нуклеїнова кислота, що кодує селекможе бути введений в бактеріальні клітини, клітитивний маркер може бути введена в клітину хазяїни комах, клітини грибів або клітини ссавців (такі на в тому ж самому векторі, що кодує поліпептид як, клітини яєчників китайського ховрахи (СНО) даного винаходу або може бути введений в окреабо клітини COS), водоростей, інфузорій, рослинмому векторі. Клітини, стабільно трансфіковані них клітин або грибів. Придатні клітини є добре введеною нуклеїновою кислотою можуть бути ідевідомими кваліфікованим фахівцям. Переважними нтифіковані за допомогою, наприклад, хімічною є E. coli, baculovirus, Agrobactenum, або рослинні селекцією (тобто, клітини, які мають включений клітини. селективний маркерний ген виживуть, тоді як інші Також, клітина хазяїн може бути трансформоклітини загинуть). вана таким чином, що додаткові ферменти та проТакож можуть одержані клітини хазяїни, які теїни, що підтримує експресію є мають селективні системи, які дозволяють регу(над)експресованими, підвищують резистентність лювати експресію введеного гену. Наприклад, до рослинних патогенів. Переважно, додаткові включення полінуклеотиду даного винаходу у векгени резистентності також експресуються, переватор, розміщенням його під керування Іас-оперону жно один або більше генів резистентності, передозволяє експресувати полінуклеотид лише в приважно гени, згадані тут, та/або також експресовані. сутності IPTG. Такі регуляторні системи є добре Найбільш переважною є сумісна експресія Rpi-blb2 відомими на практиці. та Rpi-blb. 47 90849 48 Наступними переважними є клітини однієї зі бути виділені з клітин (таких як, ендотеліальні клізгаданих тут рослин, зокрема, одного з вище згатини), наприклад, з використанням антитіл даного даних Solanaceae, найбільш переважними є карвинаходу, як описано нижче, зокрема антитіл до топля, помідор, петунія, томатне дерево, баклажан Rpi-blb2, які можуть одержані стандартною метоабо динна груша. дикою із застосуванням поліпептид даного винаВ іншій реалізації, даний винахід стосується ходу або його фрагменту, наприклад, поліпептиду способу одержання поліпептиду даного винаходу, цього винаходу. зокрема протеїну, що має активність Rpi-blb2, що В одній з реалізацій, даний винахід стосується включає культивування хазяйської клітини згідно протеїну Rpi-blb2 або протеїну, що має активність даного винаходу та виділення поліпептиду, який Rpi-blb2. кодується вказаним полінуклеотидом та експресуВ іншій реалізації, даний винахід стосується ється хазяйською клітиною, з культури або клітин. поліпептиду, що має амінокислоту послідовність, Термін "експресія" означає продукування прокодовану полінуклеотидом даного винаходу або теїну або нуклеотидної послідовності клітини. Ододержуваний за способом даного винаходу. нак, згаданий термін також включає експресію В одному з втілень, полінуклеотид не складапротеїну в безклітинній системі. Він включає транється з послідовності, послідовності зображеної в скрипцію в РНК-продукт, посттранскрипційну моSeq ID NO.: 8 та/або 10 та/або не складається з дифікацію та/або трансляцію в протеїновий пропослідовності кодованої молекулою нуклеїнової дукт або поліпептид із ДНК, що кодує цей продукт, кислоти, приведеної в Seq ID NO.: 7 та/або 9. також можливі посттрансляційні модифікації. В одному з втілень, поліпептид даного винаЗалежно від застосованих специфічних консходу не складається з послідовності протеїну Мі1.1 труктів та умов, протеїн може бути виділений з або Мi1.2 та/або протеїну кодованого молекулою клітин, культурального середовища або з обох. нуклеїнової кислоти, що кодує протеїн МіІ.1 або Для досвідченого спеціаліста, є добре відомим те, Mil.2. що можливо не лише експресувати нативний проТаким чином, в одному з втілень, поліпептид теїн але й експресувати протеїн який утворений даного винаходу, може не складатися із послідовзлиттям поліпептидів або додавати сигнальні посностей приведених в Rossi et al. 1998, PNAS USA лідовності, які спрямовують протеїн до певних 95:9750-9754, Milhgan et al., 1998. Plant Cell компартментів клітини хазяїна, як такі, що забез10:1307-1319; та/або WO98/06750. печують секрецію протеїну в культуральне сереТерміни "протеїн" та "поліпептид" використані довище. Також, такий протеїн та його фрагменти в цій заявці є рівноцінними. "Поліпептид" вказує на можуть бути синтезовані хімічно та/або модифікополімер амінокислот (амінокислотну послідовність) вані згідно стандартних методів, описаних, наприта не вказує на певну довжину молекули. Отже клад нижче. пептиди та олігопептиди включені в межі визнаКлітина хазяїн даного винаходу, така як прокачення поліпептиду. Термін також вказує на або ріотична або еукаріотична клітина в культурі, може включає посттранскрипційну модифікацію поліпепбути використана для вироблення (наприклад, тиду, наприклад, глікозилування, ацетилування, експресування) поліпептиду, кодованого полінукфосфорилування та подібне. Включеними до вилеотиду винаходу, переважно полінуклеотиду, значення є, наприклад, поліпептиди, що містять якиймає активність Rpi-blb2. Іншим методом, який один або більше аналогів амінокислот (включаюможе бути застосований додатково в рослинах є чи, наприклад, неприродні амінокислоти, та інше), прямий трансфер ДНК в квітку, що розвивається поліпептиди із заміщеними зв'язками, а також інші, або генетичний трансфер, опосередкований відомі в практиці модифікації, як природного так і Agrobacterium. Відповідно, винахід також пропонує неприродного походження. способи продукування Rpi-blb2 за допомогою кліПереважно поліпептиди є виділеними. "Видітин даного винаходу. В одній з реалізацій, спосіб лений" або "чищений" протеїн або його біологічно включає культивування клітини хазяїна даного активна частина є в значній мірі вільною від клівинаходу в придатному середовищі, й таким читинного матеріалу при одержуванні за допомогою ном виробляння поліпептиду даного винаходу. методів рекомбінації ДНК, або хімічних попередниТакож, спосіб включає виділення та/або відновків при синтезуванні хімічно. лення вказаного поліпептиду з культурального Термін "в значній мірі вільний від клітинного середовища або клітини хазяїна. матеріалу" включає одержування поліпептиду даПоліпептид даного винаходу переважно вироного винаходу в якому протеїн є відокремленим бляється методами рекомбінантної ДНК. Напривід клітинних компонентів клітин, в котрих він проклад, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує дукувався природним або рекомбінантним шляпротеїн, клонується в експресійний вектор (як опихом. В одному з втілень, термін "в значній мірі вісано вище), експресійний вектор вводиться в клільний від клітинного матеріалу" включає тину хазяїна (як описано вище) та вказаний поліодержування, яке має менш ніж приблизно 30% пептид експресується в клітині хазяїні. Вказаний (за сухою масою) "забруднюючого протеїну", більш поліпептид може бути виділений з клітини за відпереважно менш ніж приблизно 20% "забруднююповідною схемою очищення, з використанням стачого протеїну", ще більш переважно менш ніж ндартних методик очищування протеїнів. Також приблизно 10% "забруднюючого протеїну", та найдля рекомбінантного експресування, поліпептид більш переважно менш ніж приблизно 5% "забруабо пептид даного винаходу можуть бути синтезоднюючого протеїну". Термін "забруднюючий протевані з використанням стандартних методик синтеїн", вказує на поліпептиди, які не є поліпептидами зу пептидів. Більш того, нативні Rpi-blb2 можуть даного винаходу. Коли рекомбінантно продукуєть 49 90849 50 ся поліпептид даного винаходу або його біологічно наймні на 70%, переважно принаймні на 75%, активна частина, також бажано щоб протеїновий більш переважно принаймні на 80%, 90%, або препарат був "в значній мірі вільний від культура95%, та ще більш переважно принаймні на 96%, льного середовища", тобто, культуральне середо97%, 98%, 99% або більше гомологічний до повної вище представляло менш ніж приблизно 20%, ще амінокислотної послідовності SEQ ID No: 1 або 3 більш переважно менш ніж приблизно 10%, та або 5 або 6. найбільш переважно менш ніж приблизно 5% Біологічно активна частина поліпептиду данооб'єму. Термін "в значній мірі вільний від хімічних го винаходу має амінокислотну послідовність, яка попередників або інших хімікатів" включає препамає походження із амінокислотної послідовності рати, які є суб'єктом даного винаходу, наприклад, протеїну Rpi-blb2, наприклад, амінокислотної посполіпептиди даного винаходу, які відокремлені від лідовності в SEQ ID No: 2 або 4 або амінокислотхімічних попередників або інших хімікатів, які залуної послідовності гомологічного до неї протеїну, чені до синтезу протеїну. Термін "в значній мірі який включає менше амінокислот, ніж протеїн поввільний від хімічних попередників або інших хіміканої довжини Rpi-blb2 або протеїн повної довжини тів" включає препарати, які мають менш ніж прибгомологічний до протеїну Rpi-blb2 приведеного лизно 30% (за сухою масою) хімічних попередників тут, та проявляє принаймні одну активність протеабо хімікатів не Rpi-blb2, більш переважно менш їну Rpi-blb2. Звичайно, біологічно (або імунологічніж приблизно 20% хімічних попередників або хіміна) активні частини, такі як, пептиди, які, наприкатів не Rpi-blb2, ще більш переважно менш ніж клад, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 приблизно 10% хімічних попередників або хімікатів або більше амінокислот в довжину мають домен не Rpi-blb2, та найбільш переважно менш ніж приабо ділянку, із принаймні однією активністю або близно 5% хімічних попередників або хімікатів не епітопом протеїну Rpi-blb2. Також, інші біологічно Rpi-blb2. В переважних реалізаціях, виділені проактивні частини, в котрих інші видалені регіони теїни або їхні біологічно активні частини, що не поліпептиду можуть бути одержані методами ремають забруднюючих протеїнів того ж організму з комбінації та проаналізовані на наявність однієї котрого одержано поліпептид даного винаходу. або більше описаних тут активностей. Звичайно, ці протеши виробляються методами Маніпуляція полінуклеотидом Rpi-blb2 даного рекомбінантної ДНК. винаходу може призвести до вироблення Rpi-blb2, Полінуклеотид даного винаходу, можуть брати який має функціональні відмінності від протеїну участь в поліпептиді або його частину, яка вклюRpi-blb2 дикого типу. Ці протеїни можуть бути покчає амінокислотну послідовність, яка достатньо ращені за ефективністю або активністю, можуть гомологічна до амінокислотної послідовності SEQ бути представлені в більшій кількості в клітині ніж ID No: 2 або 4 так, що протеїн або його частина звичайно або можуть бути знижені в активності зберігає здатність брати участь в резистентності або ефективності. до патогенів даного винаходу. Частина протеїну, є Будь-яка мутагенезна стратегія для Rpi-blb2 переважно активною частиною як описано тут. дасть в результаті згадувану підвищену резистенПереважно, полінуклеотид даного винаходу, має тність або резистентність до іншого виду рослинамінокислотну послідовність приведену в SEQ ID ного патогену або інший згаданий вище штам росNo: 2 або 4. Також поліпептид може мати амінокилинного патогену, згаданої речовини не слотну послідовність, яка кодується нуклеотидною розуміється як обмежуюча; варіації цих стратегій є послідовністю, яка гібридизується, переважно гібочевидними для фахівця. Використовуючи ці підридизується за жорстких умов, як описано вище, із ходи, та поєднуючи розкриті тут механізми, полінунуклеотидною послідовністю полінуклеотиду даноклеотид та поліпептид винаходу може бути викого винаходу. Відповідно, поліпептид має амінокисристаний для створення рослин або їхніх частин; лотну послідовність, яка кодується нуклеотидною експресія полінуклеотиду Rpi-blb2 дикого типу або послідовністю, яка принаймні на 70%, переважно мутованого полінуклеотиду Rpi-blb2 та молекул принаймні на 75%, більш переважно принаймні на протеїну таким чином, що покращуються вихід, 80%, 90%, або 95%, та ще більш переважно привиробництво, та/або ефективність продукування наймні на 96%, 97%, 98%, 99% або більше гомолобажаної сполуки. Цільовою сполукою може бути гічна до повної амінокислотної послідовності SEQ будь-який природний продукт рослин, який вклюID No: 2 або 4. Переважний поліпептид даного чає кінцевий продукт шляху біосинтезу та проміжвинаходу, переважно має принаймні одну активний продукт природного метаболічного шляху, а ність протеїну Rpi-blb2, описану тут, наприклад, також молекул, які звичайно не зустрічаються при його резистентність або імунологічні активності. метаболізмі вказаних клітин, але які продукуються Переважний поліпептид даного винаходу включає вказаними клітинами даного винаходу. амінокислотну послідовність, яка кодується нуклеВинахід також пропонує химерні або злиті проотидною послідовністю, яка гібридизується, перетеїни. важно гібридизується за жорстких умов, із нуклеоЯ вжито тут, "химерний протеїн" або "злитий тидною послідовністю полінуклеотиду SEQ ID No: протеїн" включає протеїни функціонально зв'язані 1 або 3 або 5 або 6 або таку, що гомологічні їм, як із поліпептидом який не є Rpi-blb2. описано вище. "Поліпептид Rpi-blb2" вказує на поліпептид, Також поліпептид даного винаходу може відріякий має амінокислотну послідовність відповідну знятися від SEQ ID No: 2, або 4 за амінокислотною до поліпептиду, який має активність Rpi-blb2, припослідовністю, із-за природної мінливості або мучому "поліпептид який не є Rpi-blb2" вказує на потагенезу, як докладніше тут описано. Також, поліліпептид, який має амінокислотну послідовність пептид має амінокислотну послідовність, яка привідповідну до протеїну не є суттєво гомологічним 51 90849 52 до Rpi-blb2, тобто, протеїн, який не несе описану за допомогою комп’ютеризованих пошуків комтут резистентність, зокрема який не несе резистеплементарних послідовностей (Fassina, нтність до P. infestans, та який не походить з того Immunomethods (1994), 114-120). Інші придатні або іншого організму. Для злитих протеїнів, термін комп’ютерні програми для кончтруювання протеїну "функціонально зв'язаний" має вказувати на те, що та пептидів описані в літературі, наприклад в поліпептид Rpi-blb2 та поліпептид який не є RpiBerry, BioChem.Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; blb2 є злитим з іншим, таким чином, що обидві Wodak, Ann.N.Y.Acad.Sci.501 (1987), 1-13; Pabo, послідовності задовольняють запропоновану фунBiochemistry 25 (1986), 5987-5991. Результати кцію, притаманну використаній послідовності. Поотримані з описаних вище комп’ютерних десліліпептид який не є Rpi-blb2 можу бути приєднаний джень можуть бути використані, наприклад для до N-кінця або С-кінця поліпептиду Rpi-blb2. Наодержання пептидоміметиків протеїну даного виприклад, в одній з реалізацій, злитий протеїн є находу або його фрагментів. Ці псевдопептидні злитим протеїном GST-LMRP в якому послідовноаналоги природних амінокислотних послідовноссті Rpi-blb2 приєднані до С-кінця послідовностей тей протеїну можуть дуже ефективно імітувати GST. Такі злиті протеїни можуть полегшити очибатьківський протеїн (Benkirane, J.Biol. Chem.271 щуваня рекомбінантного Rpi-blb2. В іншій з реалі(1996), 33218-33224). Наприклад, ведення легко зації, злитий протеїн є Rpi-blb2 який містить гетедоступного ахірального Q-амінокислотного залишрологічну сигнальну послідовність на своєму Nку в протеїн винаходу або його фрагмент призвокінці. В певних клітинах хазяїнах (наприклад, клідить до заміщення амідних зв'язків поліметиленотинах хазяїнах ссавців), експресія та/або селекція вими одиницями аліфатичного ланцюга, й таким Rpi-blb2 може бути підвищена використанням гечином забезпечує придатний підхід до конструютерологічної сигнальної послідовності. вання пептидоміметиків (Banerjee, Biopolymers 39 Переважно химерний або злитий протеїн Rpi(1996), 769-777). blb2 даного винаходу виробляється стандартними Надактивні пептидоміметичні аналоги малих методами рекомбінантної ДНК. Наприклад, фрагпептидних гормонів в інших системах описано в менти ДНК, які кодують різні поліпептидні послідолітературі (Zhang, BioChem.Biophys. Res. Commun вності є лігованими разом в рамку відповідно зви224 (1996), 327-331). Відповідні пептидоміметики чайних методів, наприклад, з використанням тупих протеїнів даного винаходу також можуть бути кінцевих або висячих кінців для лігування, рестризнайдені синтезом пептидоміметичних комбінатокційних ферментів розщеплювання для забезперних бібліотек, шляхом поступового амідного алкічення відповідних кінців, відповідного заповнення лування та тестування одержанх сполук, наприлипких кінців, обробки лужною фосфатазою для клад, на предмет їхнього зв'язування та уникнення небажаного сполучення та ферментаімунологічних властивостей. Способи створення тивного лігування. Злиті гени можуть бути синтета використання пептидоміметичних комбінаторзовані звичайною методикою з використанням них бібліотек описано в літературі, наприклад в автоматизованих синтезаторів ДНК. Також, амплііOstresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220кація за допомогою PLR генетичних фрагментів 234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem.4 (1996), 709може проводитися із застосуванням якірних прай715. мерів, які дають збільшення липких комплементаТакож, тривимірні та/або кристалографічні рних кінців між двома послідовними фрагментами структури протеїну даного винаходу можуть бути гену, які в свою чергу можуть бути нормалізованивикористані для конструювання пептидоміметичми та раемпліфікованими для створення химерних них інгібіторів біологічної активності протеїну даногенних послідовносте (дивись, наприклад, Current го винаходу (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. 12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem.4 (1996), 1545John Wiley & Sons: 1992). Більш того, багато екс1558). пресійних векторів, що кодують злиту частину є В іншій реалізації даний винахід стосується комерційно доступними (наприклад, поліпептид антитіла, яке специфічно зв'язується з поліпептиGST). Полінуклеотид даного винаходу може бути дом даного винаходу або частиною, наприклад, клонований в експресійний вектор таким чином, специфічним фрагментом або епітопом такого що злита частина буде зв'язана в рамці зчитуванпротеїну. ня до кодованого протеїну. Антитіла даного винаходу мужуть використоТакож, моделювання складання та суватися для визначання та виділення Rpi-blb2 та комп’ютерна перебудова структурних фрагментів генів в будь-якому організмі, переважно рослинах, протеїну даного винаходу, може бути виконано з переважно в описаних тут рослинах. Ці антитіла використанням відповідних комп’ютерних програм можуть бути моноклональними антитілами, полік(Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, лональними антитілами або синтетичними антитіComput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). лами, а також фрагментами антитіл, такими як Комп’ютерне моделювання складанні протеїну фрагменти Fab, Fv або scFv та інші. Моноклональможе бути використане для детального конфорні антитіламожуть бути одержані, наприклад, мемаційного та енергетичного аналізу пептиду та тодиками, які вперше були описані в Kdhler and протеїнових моделей (Monge, J.Mol. Biol. 247 Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfr6, Meth. (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 Enzymol. 73 (1981), 3, які включають злиття клітин (1995), 37-45). Зокрема, відповідні програми момишиної мієломи із клітинами селезінки одержажуть бути використані для ідентифікації взаємодіними від імунізованих ссавців. Також, антитіла або ючих сайтів мітогенного ципліну та його рецептоїхні фрагменти до зазначених вище пептидів мору, його ліанду або інших взаємодіючих протеїнів жуть бути одержані способами, які описані, напри 53 90849 54 клад, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory леотидом, який є антисмисловим лише до кодуюManual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Ці чої або некодуючої частини мРНК Rpi-blb2. Наприантитіла можуть використовуватися, наприклад, клад, антисмислові полінуклеотиди можуть бути для імунопреципітацн та імунолокалізацн протеїнів комплементарні до регіону оточеного сайтом позгідно даного винаходу а також для моніторингу чатку трансляції мРНК Rpi-blb2. Антисмислові олісинтезу цих протеїнів, наприклад, в рекомбінантгоклеотиди можуть бути, наприклад, приблизно 5, них організмах, та для ідентифікування речовин, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, або 50 нуклеотидів в що взаємодіють із протеїнів даного винаходу Надовжину. Антисмислова молекула нуклеїнової киприклад, поверхневий плазмоновий резонанс, як слоти даного винаходу може бути сконструйована застосовано в системі ВІАсоrе, може бути викориза допомогою хімічного синтезу та реакцій ферместаний для підвищеня ефективності антитіл фагонтативного лігування викорисовуючи відомі на вої селекції, що дає високий приріст афінності від практиці методики. Наприклад, антисмислова моєдиної бібліотеки фагових антитіл, які зв'язують лекула нуклеїнової кислоти (наприклад, антисмисепітоп протеїну винаходу (Schier, Human ловий олігоклеотид) може бути хімічно синтезоваAntibodies Hybndomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, ний використовуючи природні нуклеотиди або J.Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). В багатьох різним чином модифіковані нуклеотиди, створені випадках, феномен зв'язування антитіл із антигедля збільшеня біологічної стабільності або для ном є еквівалентним до іншого зв'язування ліпідвищення фізичної стабільності, дуплексу утвоганд/антиліганд. реного між антисмисловою та смисловою нуклеїВ іншій реалізації, даний винахід стосується новими кислотами, наприклад, можуть бути викоантисмислової молекули нуклеїнової кислоти, яка ристані фосфоротюатні похідні та акрідинові містить комплеменарну послідовність пептиду дазаміщені нуклеотиди. Приклади модифікованих ного винаходу. нуклеотидів, які можуть бути використані для Cпособи модифікування рівнів експресії та/або створення анти смислової нуклеїнової кислоти активності є відомими фахівцям в даній галузі, та включають 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5включають, наприклад, надекспресію, сумісну ексхлорурацил, 5-йодурацил, гіпоксантин, ксантин, 4пресію, використання рибозимів, смислові та антиацетоцитозин, 5-(карбксигідроксиметил)урацил, 5смислові стратеги, підходи сайленсингу генів. карбксиметил-амінометил-2-тіоурідин, 5"Смисловий ланцюг" вказує на ланцюг дволанцюкарбксиметиламінометилурацил, дигідроурацил, гової молекули ДНК, який гомологічний транскрпту бета-D-галактозилквеозин, інозин, N6її мРНК. "Анти-смисловий ланцюг" має інвертовану iзопентентаденiн, 1-метилгуанідин, 1-метилінозин, послідовність яка є комплементарною до "смисло2,2-диметилгуанін, 2-метиладенін, 2-метилгуанін, вого ланцюга". 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденін, 7"Антисмислова" молекула нуклеїнової кислоти, метилгуанін, 5-метиламінометилурацил, 5має нуклеоидну послідовність, яка є комплементаметоксиамінометил-2-тіоурацил, бета-Dрною до "смислової" молекули нуклеїнової кисломаннозилквеозин, 5'-метоксикарбоксиметилти, яка кодує протеїн, наприклад, комплементарної урацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтio-Ν6до кодуючого ланцюга дволанцюгової молекули ізопентеніладенін, урацил-5-оксиоцтова кислота кДНК або комплементарної послідовності до (ν), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2мРНК. Відповідно, антисмислова молекула нуклеїтіоцитозин, 5-метил-2-тіоурацил, 2-тіоурацил, 4нової кислоти, може утворювати водневй зв'язок із тіоурацил, 5-метилурацил, урацил-5-оксиоцтова смисловою молекулою нуклеїнової кислоти. Антикислота метиловий естер, урацил-5-оксиоцтова смислова молекула нуклеїнової кислоти може бути кислота (ν), 5-метил-2-тіоурацил, 3-(3-aмiнo-3-N-2комплементарною до цілого кодуючого ланцюга кapбoкcипpoпил) урацил, (acp3)w, та 2,6Rpi-blb2a6o лише до його частини. Відповідно, диамінопурин. Також, антисмислова нуклеїнова антисмислова молекула нуклеїнової кислоти може кислота може бути одержана біологічно, із застобути антисмисловою до "кодуючого регіону" кодусуванням експресійного вектору, в кторий біло ючого ланцюга нуклеотидної послідовності полінусубклоновано полінуклеотид в антисмисловій оріклеотиду даного винаходу. Термін "кодуючий регієнтації (тобто, РНК транскрибована з вставленого он" вказує на ділянку нуклеотидної послідовності, поінуклеотиду буде знаходитися в антисмисловій яка містить кодони, які транслюються в амінокисорієнтації до цільового полінеклеотиду, як це буде лотні залишки. Також, антисмислова молекула описано в наступній частині). нуклеїнової кислоти є антисмисловою до "некодуАнтисмислові молекули нуклеїнової кислоти ючого регіону" кодуючого ланцюга нуклеотидної винаходу звичайно вводяться в клітину або генепослідовності, що кодує Rpi-blb2. Термін "кодуюруються in situ, таким чином, щовони гібридизучий регіон" вказує на 5' та 3' послідовності, які ються із або зв'язуються ізкдітинноі мРНК та/або фланкують кодуючий регіон та не транслюються в геномною ДНК, що кодує Rpi-blb2, що таким чином поліпептид, тобто, також називаються, як 5' та 3' інгібувати експресію протеїну, наприклад, інгібунетрансльовні ділянки (5'-UTR або 3'-UTR). Дані ванням транскрипції та/або трансляції. Гібридизакодуючі ланюги послідовностей, що кодують Rpiція може бути за допомогою звичайної нуклеотидblb2 розкрито тут, антисмислова молекула нуклеїної комплементарності з утворенням стабільного нової кислоти даного винаходу можуть бути сконсдуплексу або наприклад, у випадку антисмислової труйовані згідно правил пар основ за Watson and молекули нуклеїнової кислоти, яка зв'язується із Crick. Антисмислова молекула нуклеїнової кислоти дуплексами ДНК, через специфічні взаємодії в може бути комплементарною до цілого кодуючого головній борізді подвійні спіалі. Антисмислова моланцюга мРНК Rpi-blb2, але й також бути олігонуклекула може бути модифікована, таким чином, що 55 90849 56 вона специфічно зв'язуватиметься із рецептором Також, в іншій реалізації, даний винахід стосуабо антиеном, еспресованим або селектованим на ється способу одержання трансгенних рослин, клітинній поверхні, наприклад, зв'язуванням антирослинних клітин або рослинної тканини, який смислової молекули нуклеїнової кислоти із пептивключає введення полінуклеотиду або вектору дом або антитілом, яке зв'язується із ецептором даного винаходу в геном вказаної рослини, росклітинної поверхні або антигеном. Антисмислова линної тканини або рослинної клітини. В переважмолекула нуклеїнової кислоти може бути в клітину ній реалізації, вказаний вектор або вказаний поліза допомогою векторів, як описано тут. Для досягнуклеотид, та вектор або полінуклеотид для неня достатніх внутрішньоклітинних взаємодій експресії додаткового гену резистентності, зокреантисмислових молекул, є переважними векторні ма Rpi-blb, є також введеним геном вказаної росконструкти, в котрих антисмислові молекули нуклини, рослинної тканини або рослинної клітини до, леїнової кислоти вставлені під керуванням сильпісля або разом. них прокаріотичних, вірусних або еукаріотичних, Для експресії молекул нуклеїнової кислоти згівключаючи рослинних промоторів. дно винаходу, у смисловій або антисмисловій оріВ іншій реалізації, антисмислова молекула нуєнтації в рослинних клітинах, молекули розташоклеїнової кислоти винаходу, може бути аномерною вані під контролем регуляторних елементів, які молекулою нуклеїнової кислоти. А-аномерні молезабезпечують експресію в рослинних клітинах. Ці кули нуклеїнової кислоти утворюють специфічні регуляторні елементи можуть бути гетерологічні дволанцюгові гібриди із комплементарною РНК, в або гомологічні залежно від молекул нуклеїнової якій, навщміну від звичайних одиниць, ланцюги кислоти, що експресуватиметься а також залежно йдуть паралельно один одному (Gaultier et від виду рослини, що трансформується, та є доal.(1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). Антискладно описані вище. мислова молекула нуклеїнової кислоти також моВ загальному випадку, такі регуляторні елемеже включати 2'-о-метил-рибонуклеотид (Inoue et al. нти включають промоторну активність в рослинах. (1987) Nucleic Acids Res.15:6131-6148) або химерДля отримання експресії в усіх тканинах трансгенний аналог РНК-ДНК (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. них рослин, наприклад, використані конститутивні 215:327-330). промотори, такі як промотор 35 S CaMV (Odell, Інша антисмислова молекула нуклеїнової кисNature 313 (1985), 810-812) або промотори гену лоти винаходу, може бути рибозимом. Рибозим є поліубіквініну в кукурудзі (Chnstensen, Plant Mol. каталітичною молекулою РНК, із рибонуклеазною Biol. 18 (1982), 675-689). Для досягненя експресії в активністю яка здатна розщеплювати одноланцюспецифічних тканинах трансгенних рослин можлигову нуклеїнову кислоту, таку як мРНК, до якої вово використовувати тканево специфічні промотори ни мають комплементарний регіон. Отже, рибози(see, e.g., Stockhaus, EMBO J.8 (1989), 2245-2251). ми (наприклад, рибозими акули-молота (описані в Також відомими є промотори, які є специфічно Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) активними в бульбах картоплі або в насінні різних можуть використовуватися для каталітичного розвидів рослин, таких як кукурудза, Vicia, пшениця, щеплення транскриптів мРНК Rpi-blb2 й тикам ячмінь та інші. Можуть бути використані індуцибечином інгібувати трансляцію мРНК. Рибозими, які льні промотори, для того щоб бути здатними повмають специфічність до молекули нуклеїнової киністю контролювати експресію. Індуцибельні прослоти, кодує Rpi-blb2 може бути сконструйована мотори можуть також включати промотори, які на основі нуклеотидної послідовності кДНК Rpiіндукуються інфекціями рослин Інші реалізації blb2 розкритої тут або на основі гетерологічної описані далі. послідовності виділеної згідно способів цього виВ іншій реалізації, даний винахід стосується находу. Наприклад, похідні РНК Tetrahymena L-19 способу одержання рослини або її частини резисIVS можуть бути таким чином сконструйовані, щоб тентнох до патогену порядку Oomycetes, що вклюмістити нуклеотидну послідовність активного сайчає етапи: експресування в рослині її частині політу, була комплементарна нуклеотидній послідовпептиду даного винаходу та додаткового протеїну ності, яка мложе бути розщеплена в кодуючій резистентності. мРНК. Дивись, наприклад, Cech et al. U.S.Patent Згідно однієї з реалізацій, даний винахід стоNo.4,987,071 та Cech et al. U.S.Patent сується трансгенної рослини або рослинної тканиNo.5,116,742. Також, мРНК Rpi-blb2 mRNA може ни винаходу або одержана за способом даного бути використана для відбору каталітичної РНК, винаходу, яка при наявності полінуклеотиду або яка має специфічну рибонуклеазну активність з вектора є резистентною до згаданих патогенів. пулу молекул РНК. Дивись, наприклад, Bartel, D. Створеня трансформованого оргaнізму (або транand Szostak, J.W.(1993) Science 261:1411-1418. сформовано клітини або тканани) потребує ввеАнтисмислова молекула даного винаходу тадення ДНК, РНК або протеїну даного винаходу у кож включає полінуклеотид, який містить нуклеовідповідну клітину хазяїна. Різноманітні доступні тидну послідовність комплементарну до регулятометоди для цієї процедури, яка назвається трансрної ділянки нуклеотидної послідовності Rpi-blb2, формацією (або трансдукцією або трансфекцією) наприклад, її промотору та/або енхансерів, напри(Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185 клад для формування спіральних структур, які за527-537). Наприклад, ДНК або РНК може бути побігають транскрипції гену в цільових клітинах. введена прямо за допомогою мікроінєкци або боДивись, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. мбардування мікрочастками, покритими ДНК. Та6(6):569-84; Helene, C.et al (1992) Ann N кож, клітина може бути хімічно перміабілізована, Y.Acad.Sci.660:27-36; та Maher, L.J.(1992) наприклад, за допомогою поліетиленгліколю, таBioassays 14(12):807-15. ким чином, що ДНК може бути введена в клітину 57 90849 58 дифузією ДНК може бути введена злиттям протоSystem, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, пластів з іншими одиницями, що містять ДНК, такі Chapter V; An et al.(1985) EMBO J 4:277-287). Віяк міні-клітини, клітини, лізосоми або ліпосоми. домі різноманітні бінарні вектори, декотрі з них є Інший придатний спосіб введеня ДНК є електродоступними комерційн, такі як, наприклад, порація, коли клітини перміабілізовані зворотньо рВІ101.2 або pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. за допомогою електричного імпульсу. Придатні USA). способи описано в (наприклад, Bilang et al.(1991) Були описані інші промотори, придатні для Gene 100:247-250; Scheid et al.(1991) Mol Gen експресії в рослинах (Rogers et al. (1987) Meth in Genet 228:104-112; Guerche et al.(1987) Plant Enzymol 153:253-277; Schardl et al.(1987) Gene Science 52:111-116; Neuhause et al.(1987) Theor 61:1-11; Berger et al.(1989) Proc Natl Acad Sci USA Appl Genet 75:30-36; Klein et al.(1987) Nature 86:8402-8406). 327:70-73; Howell et al.(1980) Science 208:1265; Методи прямої трансформації є придатними Horschetal.(1985) Science 227:1229-1231; для будь-якого організму та типу клітин. DeBlocketal. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Плазміди не потребують відповідності будьMethods for Plant Molecular Biology (Weissbach and яким окремим вимогам у випадку ін'єкції або елекWeissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); та тропораци ДНК або РНК в рослинну клітину. МоMethods in Plant Molecular Biology (Schuler and жуть використовуватися прості плазміди, такі як Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)). серія pUC. Якщо потрібно регенерувати цілу росВ рослинах, описані вище способи трансфорлину з трансформованих клітин, необхідно щоб в мації та регенеруваннярослин з рослинних тканин плазміді був розташований селекційний маркер. або рослинних клітин використовуються для тимСтабільно трансформовані клітини, тобто ті, часової або стабільної трансформації. Придатнищо містять введену ДНК інтегровану в ДНК клітини ми способами є, особливо, протопластна трансхазяїна, можуть бути селектовані від нетрансфорформація за допомогою поглнання ДНК мованих клітин, якщо маркер частиною введеної індукованого поліетиленгліколем, балістичний меДНК. Прикладами генів, які діють як маркери є усі тод з використанням генної пушки, відомий як меякі здатні нести резистентність до антибіотиків або тод бомбардування частками, електропорація, гербіцидів (такі як, канаміцин, G 418, блеоміцин інкубування сихих ембріонів в розчині, що містить або гігроміцин, або фосфінотріцин) (дивись вище). ДНК та мікроінєкція. Трансформовані клітини,які експресують такі марДодатково д цих "прямих" методів трансфоркерні гени здатні виживати в присутності концентмації, трансформація також може бути проведена рацій відповідних антибіотика або гербіциду, які бактеріальною інфекцією за допомогою вбивають нетрансформовані клітини дикого типу. Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium Прикладами, вище згаданого та переважно несе є rhizogenes. Трансформація опосередкована ген bar, який несе резистентність до гербіциду Agrobacterium є найбільш придатною для дводофосфінотрицину (Rathore KS et al.(1993) Plant Mol льних рослин. Способи описані, наприклад, в Biol 21 (5):871-884), ген nptll, який несе резистентHorsch RB et al.(1985) Science 225: 1229f. ність до канаміцину, ген hpt, який несе резистентКоли використовуються агробактерії, експреність до гігроміцину, або ген EPSP, який несе ресійна касета повина бути інтегрована в специфічні зистентність до гербіциду гліфозату. Селективні плазміди, або в човниковий або проміжний вектор, маркери дозволяють провести відокремлення траабо бінарний вектор. Якщо для трансформації нсформованих від нетрансформованих використовуються плазміди Ті або Ri, принаймні (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). права межа, а в деяких випадках права та ліва Одежані рослини ожуть бути виведені або гібидимежа, Т-ДНК плазміди Ті або Ri приєднана до ексзовані звичайним чином. Два або більше покоління пресійнї касети, для введення у формі фланкуючої повинні вирости, для того щоб упевнитися, що ділянки. геномна інтеграція є стабільною та успадковною. Переважно використовуються бінарні вектори. Више згадані методи є описаними в, наприБінарні вектори здатні до реплікації в Е. coli та в клад, in Jenes В et al.(1993) Techniques for Gene Agrobacterium. Як правило, вони містять селекційTransfer, in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering ний маркерний ген та лінкер або полілінкер фланand Utilization, edited by SD Kung and R Wu, кований правою або лівою граничною послідовнісAcademic Press, pp. 128-143 та в Potrykus (1991) тю Т-ДНК. Вони можуть бути перенесені Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). безпосередньо в Agrobacterium tumefaciens Конструкт, що має бути експресованим, переважно (Holsters et al.(1978) Mol Gen Genet 163:181-187). клонується у вектор, який є придатним для трансСелективні маркерні гени дозволяють провести формації Agrobactenum tumefaciens, наприклад, відокремлення трансформованих агробактерій а є, pBm19(Bevanetal (1984) Nucl Acids Res 12:8711f). наприклад, геном nptll, який несе резистентність Як тільки були одержані трансформовані росдо канаміцину. Agrobacterium який діє в цьому вилинні клітини, може бути одержана ціла рослина падку діє як організм хазяїн, повинен мати плазміспсобом відомим досвідченому працівнику. Наприду у vir-регіоні. Останній потребний для перенеклад, можуть бути використані калюсні культури як сення Т-ДНК в рослинну клітину. Agrobacterium початковий матеріал. Ровиток пагонів а коренів трансформований таким чином, може бути викоможе бути індукований вцій ще не диференційористаний для трансформації рослинних клітин. ваній біомасі відмими способами. Одержані пагони Використаня Т-ДНК для трансформації росинних можуть бути вирощені та розмножені. клітин було докладно досліджено та описано (ЕР Досвідчений працівник знайомий із методами 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector регенерації з інтактних рослин рослинних клітин 59 90849 60 або частин рослин. Методи для виконання цього Отже даний винахід стосується також трансописані, наприклад в Fennel! et al.(1992) Plant Cell генних рослинних клітин, які містять (переважно Rep. 11:567-570; Stoeger et al.(1995) Plant Cell Rep. стабільно інтегрований в геном) полінуклеотид 14:273-278; Jahne et al.(1994) Theor Appl Genet даного винаходу, зв'язаний з регуляорними еле89:525-533. ментами, які роблять можливою експресію полінуСпосіб, згідно винаходу, переважно може бути клеотиду в рослинних клітинах та де полінуклеопоєднано з іншими методами, які несуть резистентид є чужорідним по відношенню до трансенної тнісь до патогену (наприклад, до комах, грибів, рослиної клітини. Для означення чужорідний; бактерій, нематод а подібних), стресорної резисдвись вище. тентності або іншого покращення властивостей Отже, даний винахід стосується трансгенних рослини. Приклади цього, описано в Dunwell JM, рослин або рослинної тканини, яка містить росTransgenic approaches to crop improvement, J Exp линну клітину згідно даного винаходу. Завдяки Bot. 2000;51 Spec No; pages 487-96. (над)експресії поліпептиду винаходу, вказана росПридатні штами Agrobactenum tumefaciens та лина або рослинні тканини є резистентними до вектори також для трансформації Agrobactena та рослиних патогенів, зкрема до Oomycetes. Перевідповідні ростові та селекційні середовища є добважно рослини є резистентними до інших патогере відомими досвідченим фахівцям а описані в нів, наприклад, до патогенів недорослх рослин. літературі (GV31 01 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Інші патогени описані далі. Переважно, що ці росGenet. 204 (1986), 383-396; С58С1 (pGV 3850kan), лини або рослинні тканини є резистентнми до виDeblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777, Bevan, дів Phytophthora, найбільш переважно до P. Nucleic Acid Res. 12(1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. infestans. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471, Koncz Plant Наприклад, для одержання трансгенних Mol. Biol. 20 (1992), 963-976; Koncz, Specialized рослн, що експресують ген Rpi-blb2, може бути vectors for gene tagging and expression studies. In: клоновано його кодуючий регіон, наприклад у векPlant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin and тор pBinAR (Hofgen und Willmitzer, Plant-Science, Schilperoort (Eds), Dordrecht, The Netherlands: 66, 1990, 221-230). Наприклад, згідно з технологіKluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120516, єю реакцієї полімеразного ланцюга (ПЛР) кодуюHoekema: The Binary Plant Vector System, чий регнioн Rpi-blb2 може бути ампліфікований з Offsetdrukkenj Kanters B.V., Alblasserdam (1985), використанням Праймерів, як показано в приклаChapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46, An, дах та на фігурах, наприклад, в таблиці 3, зокреEMBO J.4 (1985), 277-287). ма, ARF1F та ARF1R. Отриманй фрагмент ПЛР, Хоча в даному способі даного винаходу є пеможе бути очишений та потім фрагмент може бути реважним використання Agrobactenum tumefaciens клований у вектор. Одержаний вектор може бути можуть бути використані інші штами перенесений у Agrobactenum tumefaciens. Цей Agrobactenum, такі як Agrobactenum rhizogenes, штам може бути використаний для трансформації наприклад, якщо фенотип, що несеться даним та трансгенні рослини потім можуть бути селектоштамом є жаданим. вані. В іншій реалізації, даний винахід стосується Трансформація більшості дводольних рослин трансгенної рослини або рослинної тканини, яка можлива описаними вище способами. Але для містить рослинну клітину даного винаходу. більшості трансформацій однодольних рослин "Трансгенний", наприклад, по відношенню до розоблені успішні методики трансформації. Вони послідовності нуклеїнової кислоти, експресійної включають трансформацію із застосуванням мекасети або вектору, що містить згадану послідовтодів бioлістики, наприклад, описані вище а також, ність нуклеїнової кислоти або організм трансфорпротопластної трансформації, електропорації часмований вказаною послідовністю нуклеїнової кистково перміабілізованих клітин, індукування ДНК лоти, вказує на всі ці конструкти отримані за допомогою скловолокна та інше. рекомбінантними методами, в котрих або Термін "трансформація", як його вжито тут, a) кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти вказує на передачу екзогенного полінуклеотиду в гену Rpi-blb2, або клітину хазяїна, незалежно від способу використаb) послідовність генетичного контролю функціного для такої передачі. Полінуклеотид може бути онально зв'язана із послідовністю нуклеїнової кисвведений тимчасово або стабільно в клітину хазялоти Rpi-blb2, наприклад, промотор, або їна та може зберігатися неінтегрованою, як наприc) (а) та (b) клад, плазміда або химерні зв'язки, або також, не розташовані в своїх природних генетичних можуть бути інтегровані в геном хазяїна. Одержані місцях розташування або були модифіковані метрансформовані клітини можуть використовуватитодами рекомбінації, як приклад модифікації є зася для регенерування трансформованих рослин міщеня, додаток, делеція, вставка або вставка способом відомим фахівцю. одного або більше нуклеотидних залишків. Відповідно, в іншій реалізації, даний винахід Природне генетичне оточення вказує на пристосується рослинної клітини, що включає полінуродний хромосомной локус в організмі походженклеотид даного винаходу або та вектор даного ня, або на присутність в геномній бібліотеці. У вивинаходу або одержуваний за способом даного падку геномної бібліотеки, природне геномне винаходу. Переважно клітини містять полінуклеооточення послідовності нуклеїнової кислоти, перетид або вектор, що несе додаткову резистентність, важно зберігається, принаймні частково. Оточення більш пререважно полінуклеотид або вектор, що фланкує послідовність нуклеїнової кислоти, прикодує Rpi-blb. наймні з одного боку а має послідовність принаймні 50пн особливо переважно принайми 500пн,