Імуногенні ліпосомні композиції

1. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди та антигенний комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох антигенних детермінантів та гідрофобного домену, при цьому гідрофобний домен має площу поверхні більше 500 ангстрем2 і є асоційованим з мембраною вищезгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, причому імуногенна композиція індукує формування антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинномедійованим імунітетом in vivo. 2. Імуногенна ліпосомна композиція за п.1, яка відрізняється тим, що додатково включає один чи кілька ад'ювантів. 3. Імуногенна ліпосомна композиція за п.1, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є хімічно синтезованим. 4. Імуногенна ліпосомна композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен є пептидом. 5. Імуногенна ліпосомна композиція за п.4, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен складається з від приблизно 15 до приблизно 500 амінокислотних залишків. 6. Імуногенна ліпосомна композиція за п.5, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен вклю 2 (19) 1 3 75327 4 19. Спосіб за п.17, який відрізняється тим, що 32. Спосіб одержання імуногенної ліпосомної комантигенний детермінант вибирають з групи, що позиції, який включає експресію гена, що кодує складається з HSV gB, HSV gD, HIV gp120, CMV антигенний комплекс за п.1, розчинення антигенgB, HCV E2, INFV НА, INFV NA, H. influenzae P6, H. ного комплексу за п.1 у водному буфері та додаinfluenzaе P5, фімбріального протеїну і протеїну D. вання антигенного комплексу за п.1 до попередньо 20. Композиція вакцини, яка включає ефективну сформованих ліпосом з утворенням імуногенної кількість композиції за п.1 та фармацевтично приліпосомної композиції. 33. Імуногенна композиція за п.1, яка відрізняєтьйнятний носій. 21. Композиція вакцини за п.20, яка відрізняється ся тим, що додатково включає фармацевтично тим, що додатково включає один чи кілька ад'юваприйнятний носій. 34. Імуногенна композиція за п.33, яка відрізнянтів. ється тим, що антигенний комплекс додатково 22. Касета ДНК для вставки до вектора експресії, яка включає послідовності, що кодують імуногенвключає лінкерну ділянку, що з'єднує антигенні ний злитий протеїн, при цьому вказаний протеїн детермінанти з гідрофобним доменом. 35. Імуногенна композиція за п.33, яка відрізнявключає гідрофобний домен, що має площу повеється тим, що додатково включає один чи кілька рхні більше 500 ангстрем2, та антигенний комплекс, який включає один чи кілька антигенних ад'ювантів. детермінантів. 36. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, 23. Касета ДНК за п.22, яка відрізняється тим, що яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що антигенний детермінант виділяють з антигену, знаходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та вибраного з групи, що складається з HSV gB, HSV антигенний комплекс за п.1. 37. Композиція за п.36, яка відрізняється тим, що gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA, INFV NA, H. influenzae P6, H. influenzaе P5, фімбріальантигенний комплекс є злитим протеїном. ного протеїну і протеїну D. 38. Імуногенна ліпосомна композиція, де вищезга24. Касета ДНК за п.22, яка відрізняється тим, що дані ліпосоми складаються з уніламелярних везигідрофобний домен є пептидом, який складається кул, що складається з везикулоутворюючих ліпідів з від приблизно 15 до приблизно 500 амінокислотта антигенного комплексу, що одержаний шляхом них залишків. злиття одного чи кількох антигенних детермінантів 25. Касета ДНК за п.24, яка відрізняється тим, що та гідрофобного домену, при цьому гідрофобний пептид включає одну чи кілька амінокислот, вибдомен має площу поверхні більше 500 ангстрем2 і раних з групи, що складається з Ala, Asn, Cys, Gln, є асоційованим з мембраною вищезгаданих уніGly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr та ламелярних везикул, причому імуногенна компоVal. зиція індукує формування антитіл або викликає 26. Касета ДНК за п.22, яка відрізняється тим, що реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітеантигенний комплекс додатково включає лінкерну том in vivo. ділянку, яка з'єднує антигенний детермінант та 39. Імуногенна ліпосомна композиція за п.38, яка відрізняється тим, що додатково включає один гідрофобний домен. 27. Касета ДНК за п.26, яка відрізняється тим, що чи кілька ад'ювантів. лінкерна ділянка складається з від 1 до приблизно 40. Імуногенна ліпосомна композиція за п.38, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс є 200 амінокислотних залишків. 28. Касета ДНК за п.27, яка відрізняється тим, що хімічно синтезованим. амінокислотні залишки вибирають з групи, що 41. Імуногенна ліпосомна композиція за п.38, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен є пепскладається з Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr та тидом. Val. 42. Імуногенна ліпосомна композиція за п.41, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен скла29. Вектор, який включає касету ДНК за п.22. 30. Спосіб одержання імуногенної ліпосомної комдається з від приблизно 15 до приблизно 500 аміпозиції, який включає експресію гена, що кодує нокислотних залишків. антигенний комплекс за п.1, розчинення везикуло43. Імуногенна ліпосомна композиція за п.41, яка відрізняється тим, що гідрофобний домен вклюутворюючих ліпідів та антигенного комплексу за п.1 у придатному органічному розчиннику, чає одну чи декілька амінокислот, які вибирають з утворення ліпідної плівки чи висушеного розпилюгрупи, що складається з Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, ванням порошку шляхом випарювання органічного His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr та Val. розчинника, гідратацію ліпідної плівки чи порошку 44. Імуногенна ліпосомна композиція за п.38, яка відрізняється тим, що антигенний детермінант та диспергування гідратованої ліпідної плівки чи порошку з утворенням імуногенної ліпосомної комвиділяють з антигену, вибраного з групи, що склапозиції. дається з HSV gB, HSV gD, HIV gp120, CMV gB, 31. Спосіб одержання імуногенної ліпосомної комHCV E2, INFV HA, INFV NA, H. influenzae P6, H. позиції, який включає експресію гена, що кодує influenzaе P5, фімбріального протеїну і протеїну D. антигенний комплекс за п. 1, розчинення антиген45. Імуногенна ліпосомна композиція за п.38, яка відрізняється тим, що антигенний комплекс доного комплексу за п.1 у водному буфері, гідратацію ліпідних порошків чи ліпідних плівок буфером, датково включає пептидну лінкерну ділянку, яка який містить антигенний комплекс за п.1, та дисз'єднує антигенні детермінанти з гідрофобним допергування ліпідних порошків чи плівок з утворенменом. ням імуногенної ліпосомної композиції. 46. Імуногенна ліпосомна композиція за п.45, яка відрізняється тим, що пептидна лінкерна ділянка 5 75327 6 складається з від 1 до приблизно 200 амінокисло54. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка тних залишків. включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що зна47. Імуногенна ліпосомна композиція за п.46, яка ходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та відрізняється тим, що амінокислотні залишки антигенний комплекс, який одержаний шляхом вибирають з групи, що складається з Ala, Arg, Asn, злиття одного чи кількох вірусних антигенних деAsp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, термінантів та гідрофобного домену, що має плоPro, Ser, Thr, Trp, Туr та Val. щу поверхні більше 500 ангстрем2, причому імуно48. Імуногенна ліпосомна композиція за п.38, яка генна композиція індукує формування антитіл або відрізняється тим, що антигенний комплекс є викликає реакцію, пов'язану з клітиннозлитим протеїном. медійованим імунітетом in vivo. 49. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка 55. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка включає олію, везикулоутворюючі ліпіди і антигенвключає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаний комплекс, що одержаний шляхом злиття одноходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та го чи кількох антигенних детермінантів та пептидантигенний комплекс, який одержаний шляхом ного гідрофобного домену, що має площу поверхні злиття одного чи кількох бактеріальних антигенних більше 500 ангстрем2 . детермінантів та гідрофобного домену, що має 50. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиплощу поверхні більше 500 ангстрем2, причому ція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антиімуногенна композиція індукує формування антитіл генний комплекс, що одержаний шляхом злиття або викликає реакцію, пов'язану з клітинноодного чи кількох вірусних антигенних детермінанмедійованим імунітетом in vivo. тів та гідрофобного домену, при цьому гідрофоб56. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка ний домен має площу поверхні більше 500 ангствключає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антирем2 і є асоційованим з мембраною вищезгаданої генний комплекс, який одержаний шляхом злиття уніламелярної ліпосомної композиції, причому одного чи кількох вірусних антигенних детермінанімуногенна композиція індукує формування антитіл тів та пептидного гідрофобного домену, що має або викликає реакцію, пов'язану з клітинноплощу поверхні більше 500 ангстрем2. медійованим імунітетом in vivo. 57. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка 51. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композивключає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антиція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антигенний комплекс, який одержаний шляхом злиття генний комплекс, що одержаний шляхом злиття одного чи кількох бактеріальних антигенних детеодного чи кількох бактеріальних антигенних детермінантів та пептидного гідрофобного домену, що рмінантів та гідрофобного домену, при цьому гідмає площу поверхні більше 500 ангстрем2. рофобний домен має площу поверхні більше 500 58. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка ангстрем2 і є асоційованим з мембраною вищезгавключає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаданої уніламелярної ліпосомної композиції, приходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та чому імуногенна композиція індукує формування антигенний комплекс, який одержаний шляхом антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинзлиття одного чи кількох грибкових антигенних но-медійованим імунітетом in vivo. детермінантів та гідрофобного домену, що має 52. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиплощу поверхні більше 500 ангстрем2. ція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і анти59. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка генний комплекс, що одержаний шляхом злиття включає олію, везикулоутворюючі ліпіди, що знаодного чи кількох грибкових антигенних детерміходяться у рідкій фазі при температурі тіла, та нантів та гідрофобного домену, при цьому гідроантигенний комплекс, який одержаний шляхом фобний домен має площу поверхні більше 500 злиття одного чи кількох паразитних антигенних ангстрем2 і є асоційованим з мембраною вищезгадетермінантів та гідрофобного домену, що має даної уніламелярної ліпосомної композиції, приплощу поверхні більше 500 ангстрем2. чому імуногенна композиція індукує формування 60. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинвключає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антино-медійованим імунітетом in vivo. генний комплекс, який одержаний шляхом злиття 53. Імуногенна уніламелярна ліпосомна композиодного чи кількох грибкових антигенних детерміція, яка включає везикулоутворюючі ліпіди і антинантів та пептидного гідрофобного домену, що має генний комплекс, що одержаний шляхом злиття площу поверхні більше 500 ангстрем2. одного чи кількох паразитних антигенних детермі61. Імуногенна ліпідна емульсійна композиція, яка нантів та гідрофобного домену, при цьому гідровключає олію, везикулоутворюючі ліпіди та антифобний домен має площу поверхні більше 500 генний комплекс, який одержаний шляхом злиття ангстрем2 і є асоційованим з мембраною вищеодного чи кількох паразитних антигенних детермізгаданої уніламелярної ліпосомної композиції, нантів та пептидного гідрофобного домену, що має причому імуногенна композиція індукує формуванплощу поверхні більше 500 ангстрем2. ня антитіл або викликає реакцію, пов'язану з клітинно-медійованим імунітетом in vivo. 7 Історично склалося, що використання вакцин є безпечним та ефективним методом захисту великих популяцій проти різноманітних інфекційних захворювань. Імунізація проти вірусних та інших мікробних організмів є звичайно безпечною та ефективною і забезпечила значну частину збільшення тривалості життя осіб у розвинутих країнах. Проте, може виявитись ряд шкідливих побічних ефектів, у залежності від природи вакцини та конкретного імуногена. Недостатня інактивація інтактного вірусу у минулому призводила до ненавмисного інфікування замість захисту після вакцинації [Tigertt, 1959, Military Med. 124: 342]. У деяких випадках імунізація інтактними організмами, такими як вірус грипу, може прискорити розвиток аутоімунних захворювань, спрямованих проти нормальних тканин, таких як синдром Гійєна-Барре [Langmuir et al., 1984, J. Epidemiol. 119:841]. Крім власне агентів, присутність певних речовин усередині клітин чи у комплексному середовищі може створити умови для індукування тяжких алергічних реакцій на чужорідні протеїни [Yamane and Uemura, 1988, Epidem, Inf. 100: 291]. Оскільки процедури ефективної вакцинації часто вимагають багатократних імунізацій, ці небажані події можуть знизити ефективність вакцини і погіршити ставлення громадськості до процедури вакцинації. Нещодавно були проведені випробування сучасних молекулярно-біологічних методик з метою забезпечення поліпшених безпечності та ефективності нових препаратів вакцин. Потенційні стратегії, з яких зараз проводять дослідження, включають: вакцини, одержані з використанням методик, пов'язаних із рекомбінантними ДНК [Conry et al., 1994, Cancer Res. 54:1164; Hu et al., 1988, J. Virol. 62:176], одержання простих синтетичних пептидів, призначених для використання як антигени [Nardelli et al., 1992, Vaccines 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med. 165:459], і пряму ін'єкцію генетичного матеріалу до тканин з метою стимулювання захисних реакцій [Ulmer et al., 1993, Science 259:1745]. Зокрема, використання антигенів на основі простих пептидів для індукування специфічних імунізаційних реакцій знаходиться у центрі уваги багатьох досліджень. Ця стратегія є привабливою, оскільки вона має потенціал щодо забезпечення імунологічної специфічності, більш суворого контролю виробничих процесів, та усунення більшості вторинних джерел матеріалів чи забруднень, асоційованих з продукуванням імуногена. Однак, використання очищених протеїнів чи пептидних фрагментів для вакцинації залежить від доставки матеріалу до ділянки імунізації за допомогою ефективного носія антигену. Потенційно, одним з найбезпечніших носіїв були комплекси вакцин на ліпідній/ліпосомній основі. Ліпосоми вже давно визнані як комерційно життєздатна технологія, оскільки вони знижують токсичність лікарських засобів, збільшують час циркуляції у кровотоці, і змінюють біорозподіл та фармакокінетику молекул лікарського засобу [Fujii, 1996; Vesicles, ed. M.Rosoff, Marcel Dekker, New York, NY, p.491]. При введенні in vivo ліпосоми циркулюють у крові й видаляються фагоцитарною системою моноцитів/макрофагів, особливо у печінці, селезінці, лім 75327 8 фатичних вузлах та тканинах легенів [Claasen, 1996; Vesicles, ed. M.Rosoff, Marcel Dekker, New York, NY, p.649]. Здатність ліпосом впливати на характер розподілу антигенів дає можливість припустити, що ліпосомальний імуноген буде максимально експонованим для імунної системи. Досі були проведені випробування кількох систем на ліпідній основі, включаючи пептиди, кон'юговані з ліпідами [Nardelli et al., 1992, Vaccines 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med. 165:459], реконституцію цілих субодиниць протеїнів у присутності ліпідів [Morein and Simons, 1985, Vaccines 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech 13:527], та асоціацію протеїнів з попередньо утвореними ліпосомами [Therien and Shahum, 1989, Immunol. Lett. 22:253; Alving et al., 1985, Vaccines 4:166]. Хоч було показано, що ці методики є імунологічно активними, технічні труднощі, асоційовані з великомасштабним виробництвом протеїнів та їх ліпідних носіїв, а також вартісні обмеження роблять їх менш привабливими для промислового виробництва. Отже, для використання потенціалу, пов'язаного зі застосуванням ліпосом у розробці вакцин, потрібна вдосконалена система чи підхід до одержання протеїнових антигенів. Цей винахід пропонує імуногенну ліпосомну композицію, яка включає везикулоутворюючі ліпіди та антигенний комплекс, який включає один чи кілька антигенних детермінантів та гідрофобний домен. Кращий варіант, коли гідрофобний домен є асоційованим з мембраною ліпосомної композиції. Також добре, коли гідрофобний домен є пептидом і, за оптимальним варіантом втілення, складається з від приблизно 15 до приблизно 500 амінокислотних залишків, ще краще - з менш ніж приблизно 300, і найкраще - з менш ніж приблизно 50 залишків, де принаймні одна чи кілька амінокислот є обраними з групи, що складається з Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, lle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr та Val. Згідно з одним із варіантів втілення цього винаходу, імуногенна ліпосомна композиція додатково включає один чи кілька ад'ювантів. Приклади придатних ад'ювантів включають ліпофільні молекули, такі як Ліпід А та інші ліпополісахариди, Quil A, QS2I, MF59, P3CSS, МТР-РЕ, а також водорозчинні молекули, включаючи цитокіни, такі як IL-2, 1L-4, IL-12, інтерферони тощо. Інші приклади цитокінів наведені у Таблиці 1 нижче. Згідно з іншим варіантом втілення цього винаходу, антигенний комплекс додатково включає лінкерну ділянку, яка зв'язує антигенний детермінант(и) з гідрофобним доменом. За кращим варіантом втілення, лінкерна ділянка є пептидом, який складається з від 1 до приблизно 200 амінокислотних залишків. Ліпше, коли амінокислотні залишки є поширеними у природі амінокислотами, такими як Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr та/або Val. Крім того, цей винахід пропонує спосіб індукування імуногенної реакції у тварини-хазяїна, який включає введення імуногенно ефективної кількості описаної вище ліпосомної композиції. Хоч хазяїн може бути будь-якою твариною, включаючи домашню птицю, краще, коли тварина-хазяїн є ссав 9 75327 10 цем, і найкраще - людиною. У певних кращих варіФіг.2 зображує порівняння ефективності ліпоантах втілення імуногенна ліпосомна композиція сомної композиції за цим винаходом з іншими комдодатково включає один чи кілька придатних позиціями вакцини. ад'ювантів. Фіг.3 показує криву виживаності мишей, що Крім того, цей винахід пропонує касету ДНК демонструє здатність ліпосомального HSV2g(1для інсерції до вектора, який включає послідовно23)-HD викликати захисну імунну реакцію. сті, що кодують імуногенний злитий протеїн, де Цей винахід пропонує систему доставки антизлитий протеїн включає гідрофобний білковий догенів, розроблену з метою поліпшення ефективномен та один чи кілька антигенних детермінантів. сті та безпеки імунізації проти різноманітних мікЦей винахід також пропонує спосіб одержання робних агентів та ракових захворювань. Імуноген імуногенної ліпосомної композиції, який включає: може бути кодованим касетою гена, яка складаекспресію гена, що кодує злитий протеїн, який ється з гідрофобного домену (HD), злитого зі спевключає антигенний детермінант та гідрофобний цифічною антигенною послідовністю. Готують пладомен, розчинення ліпідів та злитого протеїну у зміду, яка містить послідовності нуклеїнової придатному органічному розчиннику чи суміші оркислоти, що кодують HD та антигенний епітоп, та ганічних розчинників, утворення ліпідної плівки експресують у придатному хазяїні, такому як, нашляхом упарювання органічного розчинника, гідприклад, E.coli, P.pastoris, клітини комах, клітини ратації ліпідної плівки, та диспергування гідратоCOS-1 чи клітини яєчника китайського хом'ячка ваної ліпідної плівки з утворенням імуногенної лі(СНО) [Genetic Engineering News, 18:17 (1998)]. посомної композиції. Після експресії та очищення протеїну його викориКрім того, цей винахід пропонує спосіб одерстовують для створення ліпосомної композиції. У жання імуногенної ліпосомної композиції, який присутності мембрани протеїн асоціюється з ліпідвключає: експресію гена, що кодує злитий протеїн, ним бішаром з утворенням стабільної структури, який включає антигенний детермінант та гідрофопричому гідрофобна ділянка є асоційованою з бний домен, розчинення злитого протеїну у водмембраною, а антигенний епітоп орієнтований до ному буфері, гідратацію ліпідних порошків чи ліпіводного середовища. Може бути розроблена пладних плівок буфером, який містить злитий білок, і зміда з рестрикційними сайтами у ключових полодиспергування ліпідних порошків чи плівок з утвоженнях, так щоб можна було легко здійснювати ренням імуногенної ліпосомної композиції. заміщення різних антигенних епітопів, таким чином За іншим варіантом втілення, цей винахід простворюючи можливість використання різних антипонує спосіб одержання імуногенної ліпосомної генних епітопів для забезпечення максимального композиції, який включає: експресію гена, що козахисту після імунізації. Однією з унікальних ознак дує злитий протеїн, який включає антигенний децієї касети є те, що протеїновий компонент може термінант та гідрофобний домен, розчинення злибути продукованим у клітинах-хазяях у великій того протеїну у водному буфері, й додавання кількості, легко очищеним, а потім введеним до злитого протеїну до попередньо утворених ліполіпосом. Це забезпечує максимальну гнучкість при сом з утворенням імуногенної ліпосомної комвизначенні епітопу, який буде найбільш придатним позиції. для захисту від мікробних агентів чи ракових заЗа іншим варіантом втілення, цей винахід прохворювань, водночас задовольняючи кінцевим понує спосіб одержання композиції імуногенної вимогам великомасштабного виготовлення та коліпідної емульсії, який включає: експресію гена, що мерційного розповсюдження вакцини. кодує злитий протеїн, який включає антигенний Отже, цей винахід має кілька переваг: (1) епідетермінант та гідрофобний домен, та виготовтопи можуть бути легко заміщені з метою забезпелення композиції імуногенної ліпідної емульсії у чення максимальної гнучкості при розробці вакцибудь-який з описаних вище способів з використанни; (2) до молекули-носія можуть бути введені ням ліпідної дисперсії (наприклад, масла, такого як численні епітопи; (3) у разі потреби можуть бути соєвої олії) замість ліпосом. включені великі антигенні послідовності (тобто, За ще іншим варіантом втілення, цей винахід оболонкові протеїни чи рецепторні домени) чи пропонує спосіб одержання імуногенної ліпосомної субодиниці; та (4) експресований протеїн-носій є композиції чи ліпідної емульсії, який включає: хіміводорозчинним і може бути легко очищеним з вичний синтез злитого протеїну, що включає антикористанням стандартних методик одержання генний детермінант та гідрофобний домен, і вигопротеїнів. Синтез антигенного комплексу як водотовлення імуногенної ліпосомної композиції чи розчинного злитого продукту зводить до мінімуму ліпідної емульсії у будь-який з описаних вище спопотенційні проблеми великомасштабного виробсобів. ництва, причиною яких є гідрофобна ділянка проУ тому значенні, що використовується тут, теїну. Отже, створення протеїну, який має гідро«асоційований з мембраною» означає, що гідрофобний домен для заглиблення до ліпосомної фобний домен є принаймні частково зануреним до мембрани, але залишається водорозчинним, буде ліпосомної мембрани, і краще, коли він не є ковавеликою перевагою. За певних обставин, під час лентно зв'язаним з везикулоутворюючими ліпідапроцесу очистки може бути використана невелика ми. Гідрофобний домен може бути також зв'язакількість солюбілізуючого агента, такого як гуаніним з ліпідним «хвостом» жирної кислоти, який дин, сечовина, додецилсульфат натрію, октилглісам є зануреним до мембрани. козид чи дезоксихолат. Цей винахід також пропоФіг.1 показує ефективність ліпосомної компонує комплекси, які включають два чи більше зиції за цим винаходом у створенні захисту проти антигенів. Такі комплекси можуть бути представHSV2. лені як: 11 75327 12 H2N - Ділянка антигену І-HD - Ділянка антигену цитами, ініціюючи ряд реакцій, які називають кліII-СООН тинно-медійованим імунітетом. Добре, коли до Винахід також передбачає використання одеімуногенних композицій за цим винаходом антиген ржаних з природних чи синтетичних джерел окревходить у кількості приблизно 0,1-20мг/мл антигемих трансмембранних спіралей або пучків спірану-HD. Ще краще, коли вміст антигену становить лей (2-12). Ділянки антигенів можуть знаходитись приблизно 0,5-5мг/мл антигену-HD. біля N- чи С-кінця, або розташовуватися між пет«Антигенний детермінант» є такою частиною лями, утвореними між окремими нитками пучка. антигену чи антигенного комплексу, яка визначає Термін «антиген» у тому значенні, що викорийого імунологічну специфічність. Звичайно антистовується тут, стосується будь-якої речовини генний детермінант, або гаптен, є пептидом, про(включаючи протеїн чи протеїн-полісахарид, ліпотеїном чи полісахаридом, що входить до складу полісахарид, мікробну субодиницю, патоген у ціпоширених у природі антигенів. У штучних антигелому, або раковий маркер), яка, будучи чужоріднах він може бути речовиною з низькою молекуляною для тварини-хазяїна, при одержанні доступу рною вагою, такою як похідне арсанілової кислоти. до тканини такої тварини, стимулює макрофаги, Антигенний детермінант буде специфічно реагуваантиген-презентуючі клітини та утворення антигети in vivo чи in vitro з антитілом чи Т-лімфоцитами, нспецифічних антитіл, і специфічно реагує in vivo індукованими антигенною формою антигенного чи in vitro з такими антитілами. Крім того, антиген детермінанта (наприклад, антигенного детермінастимулює проліферацію та/або активацію Тнта, приєднаного до імуногенної речовини). лімфоцитів з рецепторами для антигену та перехАнтигенні детермінанти, які можуть бути ресно-реагуючі антигени (наприклад, природні використані у практиці цього винаходу, можуть клітини-кілери (NK-клітини), цитотоксичні Т-клітини бути одержані, лише як приклад, з вказаних нижче та Т-клітини-хелпери), і може реагувати з лімфоантигенів: Вірусні патогени Вірус Синього язика (Bluetongue) Герпесу великої рогатої худоби (IBR) Вірусної діареї великої рогатої худоби Цитомегаловірус* Антиген Структурний Е2 Чуми (Собачої) Еболи Епштейна-Барр Ящуру Гепатиту А Гепатиту В др58 GB Поліепітоп Ад РгМ Δ E/NS1 NS1/NS2 Оболонка В капсид типу 4 F/H GP/NP ΔΒΝΑ 1,2,3,4,6 VP1 А/В combo Ag HbsAg Гепатиту С E2/NS1 NS3 NS4 NS5 ΔΙ GD GB GD Простого герпесу І c Простого герпесу 11 Герпесу В Собачої холери d Імунодефіциту людини Папіломи людини Грипу b Японського енцефаліту Марбурга Хвороби Марека (домашня птиця) Кору ЕІ LI Е6 Е7 HA/N NP Δ GP GA GB НА ΝΡ Посилання Murray and Eaton, 1996, Austral. Vet. J. 73:207 Franz et ai., 1996, Veterini Medicina 41:213 Bruschke et al_, 1997, Vaccine 15: 1940 Ludeman and Katz, 1994, Biologicals 22: 21 Wagner et al., 1992. J. Virol. 66: 5290 Wang et al., 1996. J. Inf. Dis. 174: 387 Thomson et al., 1996. J. Immunol. 157: 822 Fonseca et al., 1994, Vaccine 12: 279 Fonseca et al., 1994, Vaccine 12: 279 Venugopal and Gould, 1994, Vaccine 12: 967 Green et al., 1997, Virol. 234: 383 Simmons et al., 1998, Am. J. Trap. Med. Hyg. 58:655 Gagnon et al., 1996, J. Virol. 70: 141 Pardo et al., 1997, Am. J. Vet. Res. 58: 833 Vanderzanden et al., 1998, Virol. 246: 134 Moss et al., 1992. Sem. Immunol. 4: 97 Filgueria et al., 1995, Vaccine 13: 953 Bruguera et al., 1996, Vaccine 14: 1407 Thanavala et al.. 1995, PNAS 92: 3358 Skelly et al., 1981, Nature 290:51 Weiner et al., 1992. PNAS 89: 3468 Taniguchi et al., 1993, Virol. 195:297 Khudyakov et al.. 1995. Virol. 206: 666 Khudyakov et al., 1995, Virol. 206: 666 Khudyakov et al., 1995. Virol. 206: 666 Lechneret al., 1998. Virol. 243:313 Long et al., 1984, Inf. Immun. 37: 761 McDermott et aL, 1989, Virol. 169:244 Long et al., 1984, Inf. Immun. 37: 761 Hunt and Melendez, 1969, Lab. Animal Care 19: 221 van Rijn et al., 1994, J. Virol. 68:3934 HIV Molecular Immunology Database Suzich et al., 1995, PNAS 92: 11553 Stauss et al., 1992, PNAS 89: 7871 Stauss et al., 1992, PNAS 89: 7871 Stauss et al., 1992, PNAS 89: 7871 Laverand Webster, 1976, Virol. 69: 511 Martinon et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 1719 Kimura-Kuroda and Yasui, 1988, J. Immunol. 141: 3606 Hevey et al., 1997, Virol. 239: 206 Boyle and Heine, 1993, Immun. Cell Biol. 71: 391 Boyle and Heine, 1993, Immun. Cell Biol. 71: 391 Cordoso et al., 1998, J. Virol. 72: 2516 Cordoso et al., 1998, J. Virol. 72: 2516 13 Норвалка Ньюкасльської хвороби (домашня птиця) Парагрипу Парвовірус (собачий) Сказу Респіраторно-синцитіальний Чуми великої рогатої худоби е Ротавірус Краснухи Вітряної віспи Жовтої лихоманки b 75327 14 капсид 56кД F Ball et al., 1998, J. Virol. 72: 1345 Reddy et al., 1996, Vaccine 14: 469 ΗΝ F/HN VP2 G Протеїн F Субодиниця FG Reddy et al., 1996. Vaccine 14: 469 Morein et al., 1983, J. Gen. Virol. 64: 1557 Lopez de Turiso et al.. 1992, J. Virol. 66: 2748 Wiktor et al., 1984, PNAS 81: 7194 Falsey and Walsh, 1996, Vaccine 14: 1214 Neuzil et al., 1997, Vaccine 15: 525 Hemming et al., 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8: 22 Naik et al.. 1997, Vaccine 15: 603 Zhou et al., 1994, J. Virol. 68: 3955 Zhou et al.. 1994 ,J. Virol. 68: 3955 Palombo et al., 1994. J. Gen. Virol. 75: 2415 Trudel et al., 1985, J. Virol. Meth. 12: 243 Fowler et al., 1995, Virol. 214: 531 Arvin, 1996, Inf. Clin. Dis. N. Amer. 10: 529 Gould et al.. 1986, J. Gen. Virol. 67:591 Schleschinger et al.. 1987, J. Immunol. 135: 2805 H/F VP4 VP7 VP6 ΔΙ GE Δ NS1 (48кД) a. Огляд див. у Pass, 1996. Inf. Ag. Dis. 5: 240; Avery, 1998, Curr. Op. Cardiol. 13: 122. b. Усі ці віруси є флавівірусами - огляд наведений у Venugopal and Gould, 1994, Vaccine 12: 966. c. Огляд див. у Adimora et al., 1994, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 8: 859. d. Перелік антигенів ВІЛ див. у HIV Molecular Immunology Database, publ. Theoretical Biology and Biophysics, New Mexico (1995). e. Перелік антигенів ротавірусу див. у "Rotavirus Antigens", Hoshino and Kapikian, 1994, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 185:179. Бактеріальні токсини* Бактерія Bacillus anthracis Bordetella pertussis Clostridium botulinum Clostridium difficile Clostridium tetani Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Shigella dysenteriae Vibrio cholerae Токсин Сибірської язви Коклюшу Ботуліничний Дифіциле Правцевий Дифтерії Ентеротоксин Екзотоксин А Шиги Холерний Посилання Leppla, 1982, PNAS 79: 852 Weiss and Hewlett, 1986, Ann. Rev. Microbiol. 40: Simpson, 1981, Pharmacol. Rev. 33: 155 Knoop et al., 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6: 251 Eidels et al., 1983, Microbiol. Rev. 47: 596 Pappenheimer, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46: 69 Gill and Richardson, 1980, J. Inf. Dis. 141: 64 Iglewski and Kabat, 1977, PNAS 72: 2284 Keusch and Jacewicz, 1975. J. Inf. Dis. 131: S33 Finkelstein, 1973, Crit. Rev. Microbiol. 2: 553 * Загальний огляд див. у Middlebrook and Dorland, 1984, p.199. Бактеріальні патогени Бактерія Bacillus sp Bordetella sp Borrelia sp Brucella sp Campylobacter sp f Chlamydia Ehrlichia sp Escherichia sp Haemophilus sp Helicobacter pylori Legionella sp Leptospira sp Listeria sp Антиген PA/LF/EF Pertactin/P.69 OspA/OspB OspC L7/L12 Omp16 Omp18 MOMP PAL P1 P2 P4 P5 P6 Протеїн D D15 Протеїн 98кД HtrA Уреаза А Уреаза В Vac A Каталаза PplA ОМА LLO Посилання Singh et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3447 Anderson etal., 1996, Vaccine 14: 1384 MaetaL, 1996. Vaccine 14: 1366 Mathiesen et al., 1998, Inf. Immun. 66: 4073 Bachrach et al., 1994, Inf. Immun. 62: 5361 Tibor et al., 1994, Inf. Immun. 62: 3633 Konkel et al., 1996, Inf. Imm Sparling et al., 1994, PNAS 91: 2456 Rikihisa, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 286 Chen and Henning, 1987, Eur. J. Biochem. 163: 73 Loeb, 1987, Inf. Immun. 55: 2612 Munson et al, 1983, J. Clin. Invest. 72: 677 Green etal., 1991, Inf. Immun. 59: 3191 Munson and Granoff 1985, Inf. Immun. 49: 544 Green et al., 1990, Inf. Immun. 58: 3272 Akkoyunlu et al., 1996, Inf. Immu Thomas et al., 1990, Inf. Immun. 58: 1909 Yang et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3349 Kimura et al., 1985, Inf. Immun. 47: 253 Loosmore et al., 1998, Inf. Immun. 66: 899 Michetti et al., 1994, Gastroenterol. 107: 1002 Michetti et al., 1994, Gastroenterol. 107: 1002 Kleanthous et al., 1998, Brit. Med. Bull. 54: 229 Radcliffet al., 1997, Inf. Immun. 65: 4668 Ludwig et al., 1996, Inf. Immun. 64: 1659 Brown et al., 1991, Inf. Immun. 59: 1772 Hatty and Bevan. 1992, J. Exp. Med. 175: 1531 15 Mycobacterium leprae Mycobacterium tuberculosum Mycoplasma f Neisseria sp Pseudomonas sp Salmonella sp Staphylococcus sp Streptococcus sp f Treponema palladiur Yersinia sp 75327 Протеїн 35 кД 18кД Ag85A МРВ59 Ag85A 90 кД OMV Рог OprF Opri О-полісахарид OMP/Por Vi CP RAP (38кД) Μ TROMP Fl/V 16 Triccas et al., 1996, mf. Immun. 64: 5171 Baumgart et al., 1996, Inf. Immun. 64: 2274 Launois et al., 1994, Inf. Immun. 62: 3679 Roche et al., 1994, Inf. Immun. 62: 5319 Launois et al., 1994, Inf. Immun. 62: 3679 Franzoso et al., 1993, Inf. Immun. 61: 1523 Anderson et al., 1997, Vaccine 15: 1225 Sparling et al., 1994. PNAS 91:2456 Hughes et al., 1992. Inf. Immun. 60: 3497 Spechtetal., 1996. Vaccine 14: 1111 Hatano and Pier, 1998, Inf. Immun. 66: 3719 Alurkarand Kanat, 1997, Inf. Immun. 65: 2382 Plotkin and Bouveret-LeCam, 1995, Arch. Int. Med. Fatten et al., 1996, Inf. Immun. 64: 1659 Balaban et al., 1998, Science 280: 438 Beachey et al., 1988, Vaccine 6: 192 Sparling et al., 1994, PNAS 91: 2456 Leary et al., 1997, Microbial Pathogen. 23: 167 f. Огляд див. у Adimora et al., 1994, Inf. Dis.Clin.N. Amer. 8: 859. Грибкові патогени Організм Aspergillus Candida Coccidioides Cryptococcus Histoplasma Paracoccidioides brasiliensis Pneumocystis carinii Паразитичні патогени Організм Cryptosporidium Entamoeba histolytica Giardia lamblia Leishmania sp Plasmodium sp Schistosoma sp Trypanosoma sp Ракові захворювання** Неоплазм Молочної залози Товстої кишки Лейкемія Лімфома Меланома Яєчнику Підшлункової залози Антиген Pra1 Протеїн 48кД CF PRA GpA Антиген Посилання Kurup and Kumar, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 439 Setandreu et al., 1998, J. Bacteriol. 180: 282 Kirkland et al.. 1998, Inf. Immun. 66:424 Yang et al., 1997, Inf. Immun. 65: 4068 Kirkland et al., 1998. Inf. Immun. 66: 3519 Mitchell and Perfect, 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8: 515 Deepe. 1997, Clin. Microbiol. Rev. 10: 585 Brummer et al., 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6: 89 Gigliotti et al., 1998. Inf. Immun. 66: 3179 SREHP (K2) Ariel 170кД VSP др63 Nramp-1 TSA Протеїн 27кД АМА-1 CS епітопи prot Протеїн 195кД Протеїн 55кД Протеїн 35кД Sm28GST Протеїн 56кД Посилання Current and Garcia, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 325 Stanley et al., 1990, PNAS 87: 4976 Mat and Samuelson, 1998. Inf. Immun. 66: 353 Lotteret al., 1997, J. Exp. Med. 185: 1793 Stager et al., 1997. Int. J. Parasitol. 27: 965 Kahl et al., 1990, Inf. Immun. 58: 3233 1998, lnf.lmmun.66: 1910 Webb et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3279 Contreras et al., 1998, Inf. Immun. 66: 3579 Anderson et al., 1998, Vaccine 16: 240 Nardin et al., 1998, Vaccine 16: 590 1998, Inf. Immun. 66:2895 Patarroyo et al., 1987, Nature 328: 629 Patarroyo et al., 1987, Nature 328: 629 Patarroyo et al., 1987, Nature 328: 629 Ballone et al., 1987, Nature 326: 149 Harm et al., 1994, Моl. Microbiol. 11: 261 Антиген MUC-1 СЕА BCR/ABL SelfAg MART-1 MAGE-1 р97 MUC-1 MUC-1 Посилання Denton et al., 1993, Cane. Lett. 70: 143 Conry et al., 1994, Cane. Res. 54: 1164 Chen et al., 1992, PNAS 89: 1468 Kwak et al., 1992, New Eng. J. Med. 327: 1209 Kawakami et al., 1994, PNAS 91: 3515 Traversari et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1453 Hu et al., 1988, J. Virol. 62: 176 Jerome et al., 1993, J. Immunol. 151: 1654 Bashford et al., 1993. Int. J. Cane. 54: 778 ** Загальний огляд див. у Finn, 1993, Curr. Op. Immunol. 5: 701. Додаткові приклади антигенів та патогенів, які можуть бути використані, наведені [у Milich, 1989 (Adv. Immunol. 45: 195), Hoshino and Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 185: 179) або Venugopal and Gould, 1994 (Vaccine 12: 966)]. Згідно з одним із варіантів втілення, використовують субодиниці gp120 гена env та p27 гена gag з вірусу імунодефіциту людини (HIV). За іншим варіантом 17 75327 18 втілення, антигенний детермінант може бути видіржання антигенних комплексів з використанням лений з антигену, обраного з HSV gD чи gB, HIV засобів хімічного синтезу або шляхом поєднання gpІ20, CMV gВ, HCV Е2, INFV НА чи NA, Н. рекомбінантних та хімічних засобів та виготовленinfluenzae Р5 чи Р6, фімбріального протеїну та ня імуногенної ліпідної композиції, як описано виПротеїну D. ще. У тому значенні, що використовується тут, теНа додаток до кращого пептидного лінкера, рмін «гідрофобний домен» (HD) означає будь-який для приєднання антигену до гідрофобного домену протеїн, пептид, ліпід чи молекулу з гідрофобною можуть бути використані інші лінкери, відомі у цій ділянкою чи структурою, яка має площу поверхні галузі. Приклади таких лінкерів включають, без більш ніж 5002. Приклади потенційних HD включаобмеження ними, поліетиленгліколі, полісахариди, ють будь-який трансмембранний (ТМ) сегмент полісіалові кислоти, бурштинову кислоту, бутанди[наприклад, глікофорин A, Tomita and Marchesi, кислоту, адипінову кислоту та стандартні хімічні 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 2964], гідрофозасоби для зшивання, такі як SMPT (4бний домен цитохрому b5 [Taylor and Roseman, сукцинімідилоксикарбоніл-а-метил-а-(21995, BBA 1278: 35], Т-домен токсину дифтерії піридилдитіо)-толуол), DSP (дитіобіс(Choe et al., 1992, Nature 357:216), домен II екзото(сукцинімідилпропіонат)), EGS (етиленглі кольксину A Pseudomonas [Allured et al., 1986, PNAS біс(сукцинімідилсукцинат)), SMCC (483:1320], 4-спіральний лучок пеніцилінчутливого сукцинімідилоксикарбоніл-4-(Nрецептора [Hardt et al., 1997, Моl. Microbiol. 23: малеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат) та 935], 7-спіральний пучок бактеріородопсину SPDP (М-сукцинімідил-3-(2[Henderson and Unwin, 1975, Nature 257: 28], 12піридилдитіо)пропіонат) (див. також каталог Pierce, спіральний пучок пермеази lac [Kaback et al., 1997, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Curr. Op. Struct. Biol. 7: 537] та пороутворюючий Згідно з цим винаходом, ліпосома відіграє кридомен коліцину [Parker et al., 1989, Nature 357: 93]. тичну роль у доставці антигену, оскільки комплекс Термін «вектор» у тому значенні, що викорисантиген-ліпосома безпосередньо презентується до товується тут, стосується нуклеїнової кислоти (наімунної системи після виведення з циркуляції кліприклад, ДНК), виділеної з плазміди, косміди, фатинами імунної системи. Крім того, вибір імуностигміди чи бактеріофага або одержаний синтетично, муляторних шляхів може бути змінений через внедо якого можуть бути вставлені чи клоновані фрасення змін до ліпідної композиції ліпосом. гменти нуклеїнової кислоти. Для цього вектор моНаприклад, для стимулювання різних імунологічже містити один чи кілька унікальних рестрикційних шляхів у композиції ліпосом можуть бути виконих сайтів, і може бути здатним для аутономічної ристані різні імуностимуляторні молекули, такі як реплікації у певному хазяїні чи організмі таким Ліпід A [Asano and Kleinerman, 1993, J. Immunother. чином, щоб відбувалось репродукування клонова14: 286], P3CSS [Lex et al., 1986, J. ImmunoL 137: ної послідовності. Молекула вектора може нада2676], мурамілди та трипептид-РЕ [Fidler et al., вати організму-хазяїну певний добре визначений 1981, PNAS 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines 4: фенотип, який є придатним для селекції або та166], та катіонні ліпіди [Walker et al., 1992, PNAS ким, що легко виявляється. Деякі компоненти век89: 7915]. Разом із комплексом антиген-ліпосоми тора можуть бути молекулою ДНК, яка включає можуть бути використані інші ад'юванти, такі як, регуляторні елементи для забезпечення транскринаприклад, MF59, Quil A, QS21 чи галун. Крім того, пції, трансляції, стабільності РНК та реплікації, й для викликання імунної реакції можуть бути додані іншими ДНК-послідовностями. імунорегуляторні молекули, такі як цитокіни. Термін «ДНК-касета» у тому значенні, що виЛіпосоми, що використовуються у практиці користовується тут, стосується генетичних посліцього винаходу, можуть бути одержані з різноманідовностей усередині вектора, який може експретних везикулоутворюючих ліпідів, включаючи фосувати описаний тут злитий протеїн. Касета сфатидильні прості та складні ефіри, такі як фоснуклеїнової кислоти є орієнтованою усередині векфатидилетаноламін (РЕ), фосфатидилсерин (PS), тора за положенням та нуклеотидною послідовнісфосфатидилгліцерин (PG) та фосфатидилхолін тю таким чином, що нуклеїнова кислота у касеті (PC), гліцериди, такі як діолеоїлгліцеросукцинат, може бути транскрибована у РНК і, у разі потреби, цереброзиди, гангліозиди, сфінгомієлін, стероїди, трансльована у продукт злитого протеїну. Краще, такі як холестерин, та інші ліпіди, а також інші ексколи 3'- та 5'-кінці касети є придатними для легкої ципієнти, такі як вітамін Δ чи вітамін С пальмітат інсерції до вектора, наприклад, вона має з обох [див. також пат США №№4235871, 4762720, кінців сайти ендонуклеази рестрикції. 4737323, 4789633, 4861597 та 4873089]. Приклади Хоч антигенні комплекси краще продукують з ліпідів на основі PC включають, без обмеження використанням методів рекомбінації, вважається, ними, (С-18) дистеароїлфосфатидилхолін (DSPC), що комплекси можуть бути синтезовані будь-якими (С-16) дипальмітоїлфосфатидилхолін (DPPC), (Сзасобами, відомими у цій галузі, такими як, напри14) диміристоїлфосфатидилхолін (DMPC) та (С-18, клад, хімічними. Це може бути особливо корисним ненасичений) діолеоїлфосфатидилхолін (DOPC). у тих випадках, коли треба використати непептидКраще, коли ліпіди знаходяться у рідкій фазі при ний лінкер, або коли гідрофобний домен включає температурі тіла (приблизно 38-39°С). Отже, ліпіди залишок амінокислоти, яка не є поширеною у приз Тпл вище температури тіла, такі як DSPC та роді, чи аналог. Отже, хоч у кращому варіанті втіDPPC, є відносно менш корисними (але проте ще лення для продукування антигенного злитого проможуть бути придатними). Ліпідам, які мають Тпл теїну використовуються рекомбінантні методи, цей нижче температури тіла, такі як DMPC чи DOPC, винахід пропонує також спосіб, який включає: оденадається більша перевага. Крім того, краще, щоб 19 75327 20 ліпідна композиція містила не більш ніж приблизно дені далі докладно приклади, які подані для ілюст10% холестерину. Особливо кращі ліпідні компорації й не мають обмежувати винахід, якщо це не зиції включають приблизно 0-10% холестерину, зазначено окремо. приблизно 0-15% PG та приблизно 0-100% PC. У Приклади певних кращих варіантах втілення композиція моПриклад 1 - HSV2 же додатково включати приблизно 1-10% ад'юванОдержання HSV2gD(1-23)-TM. N-кінцевий сегта (ад'ювантів), краще, коли вміст ад'юванта стамент з 23 амінокислот оболонкового протеїну gD новить менш ніж приблизно 5%. HSV2 приєднували до трансмембранного (ТМ) Препарати ліпосом є добре відомими на сусегмента шляхом хімічного синтезу в автоматизочасному рівні техніки. Загалом, ліпосоми одержуваному пептидному синтезаторі. Синтезований вали з використанням ряду різних методик, вклюпептид відщеплювали за стандартним методом чаючи етанольну ін'єкцію [Batzri et al., 1973, розщеплення HF і очищали препаративною висоBiochem. Biophys. Acta. 298: 1015], ефірну інфузію коефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) з [Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta. 443: використанням колонки Waters C18 та 100% аце629; Schieren et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta. тонітрилу з 0,1% трифтороцтової кислоти (TFA) як 542: 137], видалення детергента [Razin, 1972, рухомої фази. Методами мас-спектрометрії та Biochem. Biophys. Acta. 265: 241], випарювання капілярного електрофорезу було продемонстророзчинника [Matsumato et al., 1977, J. Colloid вано, що чистота пептиду становить принаймні Interface Sci. 62: 149], випарювання органічних 95%. розчинників із хлороформу у водних емульсіях Одержання ліпосом. Ліпосоми готували шля(REV's) [Szoka Jr. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. хом озвучення проб згідно з раніше описаними USA, 75: 4194], екструзію MLV чи EUV скрізь нукметодиками [Fujii et al., 1997, Biochemistry 36: леопористу полікарбонатну мембрану [Olson et al., 4959]. Стисло, ліпіди (з протеїном чи без нього) 1979, Biochem. Biophys. Acta. 557: 9], заморожурозчиняють в органічному розчиннику, такому як вання та відтаювання фосфоліпідних сумішей хлороформ/метанол. Тонкі ліпідні плівки одержу[Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, ють шляхом внесення піпеткою аліквот ліпідних 212: 186], а також озвучування та гомогенізація. розчинів до круглодонних скляних пробірок та виУмовно, ліпосоми категоризують за розміром, парювання розчинника при 65°С у тоці газоподібвикористовуючи 3-буквений акронім для познаного азоту. Плівки поміщали під вакуум принаймні чення типу ліпосом, що обговорюються. Мультина вісім годин для видалення залишкового органіламелярні везикули загалом позначають «MLV». чного розчинника. Одержання ліпосом здійснюваМалі уніламелярні везикули позначають «SUV», а ли шляхом гідратації ліпідних плівок буфером та великі уніламелярні везикули позначають «LUV». інкубування суспензії при 65°С протягом 5-10 хвиСлід за цими позначеннями інколи наводиться лин перед озвученням проби. Потім ліпосоми фіхімічний склад ліпосоми. Обговорення номенклальтрували скрізь фільтр 0,22мкм для стерилізації тури та стислий опис відомих типів ліпосом навепрепарату. Розмір ліпосом визначали методом дений [у Storm et al., 1998, PSIT, 1: 19-31]. динамічного світлорозсіяння, і утворення агрегатів Цей винахід передбачає використання ліпосовідстежували протягом принаймні чотирьох тижнів. мних композицій з придатним ад'ювантом. Однак Особливо краща ліпосомальна композиція цей винахід також передбачає використання антиHSV2gD(1-23)-TM має молярне співвідношення генного комплексу, який не є асоційованим з ліпо15:2:3 DMPC:Chol:DMPG (диміристоїлфосфатидисомою, у комбінації з придатним ад'ювантом. Отлхолін : холестерин : диміристоїлфосфатидилгліже, вакцина чи імуногенна композиція складається церин), з 2,5% мас. Ліпіду А. з двох компонентів: антигену, зв'язаного з гідроПроцедури вакцинації та випробувань індукуфобним доменом, і придатної системи ад'юванта. вання імунної реакції на вірусний антиген. СамиПриклади потенційних фармацевтично прийнятних цям мишей BALB/c чи C57BL/6 (у віці 6-8 тижнів) систем носіїв, що можуть бути використані, вклюробили підшкірні ін'єкції раз на тиждень протягом чають, без обмеження ними, ліпосоми, емульсії, двох, трьох чи чотирьох тижнів дослідним препаад'ювант Фрейнда (повний чи неповний), ISCOMS ратом вакцини чи буфером. Місця ін'єкцій контрота віруси в оболонці. лювали на вияви небажаних реакцій, таких як розУ способах за винаходом використовується виток гранульом та/або утворення струпів. Якщо імуногенно ефективна кількість ліпосомної компотварин імунізували вакциною інтраназальним зиції, тобто, кількість композиції, яка, у комбінації з шляхом, то їх анестезували галотаном, і композибудь-якими доданими ексципієнтами чи носіями, цію (10-20мкл) вводили до ніздрів для вдихання за викличе помітну імуногенну реакцію у хазяїна. У допомогою стерильної насадки на мікропіпетці тих випадках, коли композиція використовується у [Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168: 622]. вигляді композиції вакцини, ефективною кількістю Через регулярні проміжки часу під час процебуде кількість, яка, у комбінації з будь-якими додадури вакцинації та після вірусного зараження виними ексципієнтами чи носіями, спричинить винимірювали імунну реакцію мишей на вірусний антикнення у хазяїна специфічної та достатньої імуноген. Тест на нейтралізацію вірусного антитіла логічної реакції, яка забезпечує захист хазяїна від здійснювали з використанням 24-лункових планнаступної дії мікробів (профілактична вакцинація) шетів, що містили 1 105 клітин ВНК, до яких додаабо забезпечує захист вже захворілого хазяїна вали змішану з вірусом мишачу сироватку з різни(терапевтична вакцинація). ми ступенями розведення. Після 48-72 годин Після закінчення загального опису винаходу інкубування при 37°С у СO2-інкубаторі моношари він буде краще пояснений з посиланням на навеклітин досліджували на цитотоксичність і визнача 21 75327 22 ли їх титр нейтралізації антитіла. Преципітувальні попередньо одержували естроген підшкірно за антитіла до вірусу вимірювали шляхом інкубувантиждень до зараження та у день (-1) перед зараня сироватки з різними ступенями розведення з 5женням. Потім їх анестезували інтраперитонеаль10мкг вірусного антигену чи 25-50мкл маточної ною ін'єкцією ацепромазину та кетаміну. Потім вводили інтравагінально HSV2 (10-30мкл) з викосуспензії HSV2 (1 105 колонієутворюючих одиниць ристанням стерильного ковпачка мікропіпетки піс(КУО)). Ліпосоми, які містять антигенний епітоп, ля того, як спочатку брали піхвовий мазок сухим також використовували як мішені для проведення Calgiswab [McDermott et al., 1984, J. Virol. 51: 747]. аналізу антитіло/ELISA, як було описано раніше Тварин спостерігали протягом 80 днів після зара[Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375]. Резульження на виживання (щоденно), втрату ваги (через тати останнього аналізу будуть використані для день протягом перших двох тижнів, а потім раз на вимірювання рівня зв'язування та ізотипового тиждень), зовнішній вигляд шерстного покриву та складу антитіл. неврологічні симптоми (знижений рівень активносВипробування на алергічну реакцію уповільті, волочіння чи параліч кінцівок). неного типу на вірусний антиген у вакцинованих Антиген-індукована проліферація Т-клітин. мишей проводили за методикою аналізу ножних Сенсибілізацію хазяїна до gD-антигену визначали подушечок. Вакцинованих тварин анестезували з використанням методу аналізу на антигенгалотаном і робили ін'єкції 50мкл інактивованого індуковану проліферацію Т-клітин. Гомогенати ультрафіолетом HSV2 до подушечки однієї задселезінки готували шляхом обережного розбиванньої лапи та 50мкл лізованих неінфікованих клітин ня селезінок стерильним штоком та продавлювандо подушечки другої задньої лапи. Через двадцять ня клітин скрізь нейлонове сито. Клітини суспендучотири, сорок вісім та сімдесят дві години вимірювали у середовищі RPM11640, яке містить 10% вали ступень розпухання ножної подушечки мисироватки плоду корови (FCS), 10мМ буфера шей за допомогою штангенциркуля з ноніусом і Hepes, L-глутамін (2мМ) пеніцилін (25МО/мл) та порівнювали з вихідними значеннями. Вимірювали стрептоміцин (25мкг/мл). Клітини культивують при також активність Т-клітин у цих тварин за продукуванням цитокінів у відповідь на інкубування Тконцентрації 1 106 клітин/мл з gD (5-20мкг/мл) чи клітин селезінки з вірусним антигеном. Селезінки без нього у 96-лункових планшетах з U-подібним видаляли з вакцинованих тварин і гомогенати седном протягом 4 днів у атмосфері з 5% CO2. Кульлезінки готували шляхом обережного розбивання тури пульс-мітили 20мкл барвником ресазурином селезінок стерильним штоком та продавлювання протягом 3 годин, а потім вимірювали флуоресцеклітин скрізь нейлонове сито. Суспензії клітин нцію за допомогою приладу Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA). промивають і висівають при 1 106 клітин/лунку на Аналіз цитокін-специфічної мРНК. Т-клітини 96-лункові планшети для мікротитрування. Після від імунізованих та неімунізованих тварин аналізуінкубування клітин при 37°С протягом 3-4 днів з вали на рівні цитокін-специфічної мРНК для важрізними кількостями вірусного антигену збирали ливих цитокінів, які можуть відображати сенсибілінадосадну рідину з лунок і аналізували на присутзацію, асоційовану з імунізацією, включаючи IL-2, ність цитокінів. Для визначення цитокінового проIFN-D, IL-4, IL-5, IL-6, та IL-10. Т-клітини одержувафілю використовували комерційно доступні наболи з селезінок, як описано вище. Ізолювали загари для аналізу на цитокіни методом ELISA (IL-2, ILльну РНК з використанням модифікації [Cosenza et 4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-, -актин та TNF-α виробниal., 1995, Liver Transpl. Surg. 1: 16] методу, описацтва PharMingen, Inc. (San Diego, CA)). Детектуного Chomczynsky and Sacchi [Chomczynsky et al., вання цитокінового протеїну у надосадній рідині 1987, Analyt. Biochem. 162: 156]. Свіжі чи заморокультур тканин методом сендвіч-ELISA здійснювали з використанням моноклональних антитіл жені клітини (2 106) подрібнювали у 1мл денату(mAb), специфічних до конкретних цитокінів. Стисрувального розчину (4мМ тіоціанату гуанідінію, ло, на планшети для ELISA протягом ночі наноси25мМ цитрату натрію (рН7,0), 0,5% саркозилу та ли покриття з mAb антимишачого цитокіну щура. 0,1мМ 2-меркаптоетанолу). РНК осаджували шляПланшети блокували 3% сироватки плоду корови хом інкубування з одним об'ємом ізопропанолу у фосфатно-сольовому буфері (PBS) протягом 2 протягом ночі при -20°С. Концентрацію загальної годин, а потім до кожної лунки додавали аліквоти РНК доводили до 260нМ і зразки зберігали при кожного дослідного зразка. До кожної лунки дода80°С до проведення аналізу. вали цитокін-специфічне біотиніловане антимишаАналіз цитокінів проводили з використанням че mAb щура, а потім авідинпероксидазу. Провомодифікації методу, описаного Cosenza et al. дили кольорову реакцію шляхом додавання [Cosenza et al, 1995, Liver Transpl. Surg. 1: 16]. Одколориметричних субстратів. Планшети зчитували нониткову кДНК одержували шляхом транскрипції у спектрофотометрі для проведення аналізів 2мкг загальної РНК у 20мкл загальної реакційної ELISA і концентрації цитокінів обчислювали зі стасуміші з використанням зворотної транскриптази ндартної кривої, одержаної для контрольних рековірусу мієлобластозу птиці (Boehringer Mannheim, мбінантних цитокінів. Indianapolis, IN). Для ампліфікації фрагментів ДНК Модель мишачого енцефаліту HSV2 для випопередньо визначеного розміру кожного з генів пробування ліпосомальних препаратів вакцини. цитокінів, що становлять інтерес, використовували Вакцинованих чи невакцинованих (контрольних) послідовність-специфічні олігонуклеотидні слідовсамиць мишей BALB/c (у віці 10-12 тижнів) інтраність, яка поєднує три епітопи (CTL, Т-клітинпомічників та В-клітин) перитонеально заражали летальною дозою (1 105 (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRA КУО) мозок-пасивованого HSV2. Миші, яких зараFYTTK (SEQ ID NO.19)), і виділяли з цієї протеїножали інтравагінально летальною дозою HSV2, 23 75327 24 вої послідовності з використанням кодонових предля вимірювання рівня зв'язування та ізотипового ференцій Е.соlі [Looman et al., 1987.EMBO J. 6: складу антитіл. 2489]. Синтетичний ген, що кодує послідовність Аналіз на алергічну реакцію уповільненого тиHIV, збирають шляхом синтезу, гібридизації, PCR пу (DTH). DTH-реакцію на вірусний антиген у вакта лігування перекривних олігонуклеотидів. Зібрацинованих мишей проводили за методом виміру ний непроцесований ген, який кодує фрагменти ножних подушечок. Вакцинованих тварин анестеHIV, ампліфікують методом PCR, а потім лігують зували галотаном і робили ін'єкції по 50мкл ліподо плазміди експресії. Кінцеві гени аналізують месомального антигену чи вільного антигену до потодом секвенування ДНК. душечки однієї задньої лапи та 50мкл буферу до Плазміди pTrcHis, що містять HIV-HD, трансподушечки другої задньої лапи. Через двадцять формують до Е.соlі. Бактерії інкубують у середочотири, сорок вісім та сімдесят дві години вимірювищі LB з ампіциліном (50мкг/мл) при 37°С до фавали ступень розпухання ножної подушечки мизи середнього логарифмічного росту. У цей час шей за допомогою штангенциркуля з ноніусом і додавали IPTG для індукування гібридного промопорівнювали з вихідними значеннями. тора trp/lac. Проводили виміри кожну годину для Аналіз цитокінспецифічної мРНК. Т-клітини від визначення оптимальної післяіндукційної експресії імунізованих та неімунізованих тварин аналізували протеїнів HIV-HD. У момент оптимальної експресії на рівні цитокінспецифічної мРНК для важливих клітини збирали центрифугуванням. Осади клітин цитокінів, які можуть відображати сенсибілізацію, піддавали лізису і центрифугували. Лізат аналізуасоційовану з імунізацією, включаючи IL-2, IFN-D, вали на присутність протеїну. Протеїни HIV-HD IL-4, IL-5, IL-6, та IL-10. Т-клітини селезінки ізолюочищали методом селективної схожості до нікелю, вали, як описано вище, на 1 та 4 тижні після імунізв'язаного з твердою основою. У разі потреби, зації. Загальну РНК ізолювали з використанням використовували ексклюзійну, іонообмінну чи гідмодифікації [Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. рофобну хроматографію для додаткової очистки Surg. 1: 16] методу, описаного [Chomczynsky et al., HIV-HD. 1987, Analyt. Biochem. 162: 156]. Свіжі чи замороВиготовлення ліпосом. Ліпосоми готують шляжені клітини (2 106) подрібнювали у 1мл денатухом озвучування проб згідно з раніше описаними рувального розчину (4мМ тіоціанату гуанідінію, методиками [Fujii et al., 1997, Biochemistry 36: 25мМ цитрату натрію (рН7,0), 0,5% саркозилу та 4959]. Стисло, ліпіди (з протеїном чи без нього) 0,1мМ 2-меркаптоетанолу). РНК осаджували шлярозчиняють в органічному розчиннику, такому як хом інкубування з одним об'ємом ізопропанолу хлороформ/метанол. Тонкі ліпідні плівки одержупротягом ночі при -20°С. Концентрацію загальної ють шляхом внесення піпеткою аліквот ліпідних РНК доводили до 260нМ і зразки зберігали при розчинів до круглодонних скляних пробірок та ви80°С до проведення аналізу. парювання розчинника при 65°С у тоці газоподібАналіз цитокінів проводили з використанням ного азоту. Плівки поміщали під вакуум принаймні модифікації методу, описаного [Chomczynsky et al., на вісім годин для видалення залишкового органі1987, Analyt. Biochem. 162: 156]. Однониткову чного розчинника. Одержання ліпосом здійснювакДНК одержували шляхом транскрипції 2мкг загали шляхом гідратації ліпідних плівок буфером та льної РНК у 20мкл загальної реакційної суміші з інкубування суспензії при 65°С протягом 5-10 хвивикористанням зворотної транскриптази вірусу лин перед озвученням проби. Потім ліпосоми фімієлобластозу птиці (Boehringer Mannheim, льтрували скрізь фільтр 0,22мкм для стерилізації Indianapolis, IN). Для ампліфікації фрагментів ДНК препарату. Розмір ліпосом визначали методом попередньо визначеного розміру кожного з генів динамічного світлорозсіяння, і утворення агрегатів цитокінів, що становлять інтерес, використовували відстежували протягом принаймні чотирьох тижнів. послідовність-специфічні олігонуклеотидні прайПроцедури вакцинації та випробувань індукумери для мишачих цитокінів (Таблиця 1). Суміш вання імунної реакції на вірусний антиген. Самидля полімеразної ланцюгової реакції (PCR) склацям мишей BALB/c (у віці 6-8 тижнів) робили підшдається з 1мкл кДНК, 2,5мкл буфера для PCR 10 , кірні ін'єкції раз на тижнях 1, 4 та 8 дослідним по 1мкл кожного з 5'- та 3'-праймерів, 2,5мкл 10 препаратом вакцини чи буфером. Місця ін'єкцій dNTP (2ммоль/л) та 0,125мкл термостабільної контролювали на вияви небажаних реакцій, таких ДНК-полімерази T.aquaticus (Boehringer Mannheim) як розвиток гранульом та/або утворення струпів. у кінцевому об'ємі 25мкл. Для ампліфікації фрагЯкщо тварин імунізували вакциною інтраназальмента 548п.н., узятого як внутрішній контроль, ним шляхом, то їх анестезували галотаном, і досвикористовували специфічні праймери D-актину. лідну композицію (10-20мкл) вводили до ніздрів Суміш для PCR покривали мінеральним маслом і для вдихання за допомогою стерильної насадки на проводили ампліфікацію після інкубування суміші мікропіпетці [Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. протягом 7 хвилин при 94°С, 38 циклів з денатура168:622]. цією протягом 30 секунд при 94°С, відпалюванням Кількісні виміри гуморальної імунної відповіді праймерів протягом 45 секунд при 60°С і нарощуметодом ELISA. Через регулярні проміжки часу ванням ланцюга протягом 60 секунд при 72°С, та протягом процедуривакцинації (наприклад, 1 раз інкубування протягом 7 хвилин при 72°С. Продукти на тиждень) вимірювали імунну реакцію мишей на PCR розділяли на агарозному гелі у присутності вірусний антиген. Ліпосоми, які містять антигенний броміду етидію. Смуги розглядали під УФ-світлом, епітоп, також використовували як мішені для профотографували і проводили кількісний денситомеведення аналізу антитіло/ELISA, як було описано тричний аналіз фотографій з використанням пакераніше [Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375]. ту прикладних програм Molecular Analyst (Bio-Rad, Результати останнього аналізу використовують Richmond CA). 25 75327 26 Кількісний аналіз цитокінів методом ELISA у ТМішені промивали і до кожної лунки додавали клітинах селезінки. Визначали також Т-клітинну 100мкл титрів, що містять 1 104 клітин. Ефекторні активність цих тварин шляхом вимірювання продулімфоцити промивали, додаючи до лунок у різних кування цитокінів у відповідь на інкубування Тконцентраціях, і культивували протягом 4 годин клітин селезінки з вірусним антигеном. Селезінки при 37°С. Відсоток специфічного лізису обчислювидаляли у вакцинованих тварин і гомогенати севали за результатами вимірів лактатдегідрогенази лезінки готували шляхом обережного розбивання (LDH) у надосадній рідині з використанням набору селезінок стерильним штоком та продавлювання CytoTox 96 (Promega, Madison WI) на стандартноклітин скрізь нейлонове сито. Суспензії клітин му планшет-рідері для ELISA (HTS 7000+ BioAssay промивали і висівали при 1 105 клітин/лунку на 96Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA) шляхом реєстлункові планшети для мікротитрування. Після інрації оптичної густини при 490нм. Визначення кубування клітин при 37°С протягом 3-4 днів з різНS\/2-антигенспецифічного лізису здійснювали за ними кількостями вірусного антигену збирали настандартними критеріями. Дані виражали як відсодосадну рідину з лунок і аналізували на ток специфічного лізису = =100 [(експериментаприсутність цитокінів. Для визначення цитокіновольні - ефектор-спонтанні - мішень-спонтанні) / (міго профілю використовували комерційно доступні шень-максимальні - мішень-спонтанні)]. набори для аналізу цитокінів методом ELISA. ДеПриклад V - Вірус грипу (INFV) тектування цитокінового протеїну у надосадній Одержання INFV-HD. Нуклеотидну послідоврідині культур тканин методом сендвіч-ELISA здійність обраних епітопів виділяли з протеїнової посснювали з використанням моноклональних антитіл лідовності з використанням кодонових преферен(mAb), специфічних до конкретних цитокінів. Стисцій Е.соlі [Looman et al., 1987, ЕМВО J. 6: 2489]. ло, на планшети для ELISA протягом ночі наносиАнтигенна послідовність (послідовності), вставлені ли покриття з mAb антимишачого цитокіну щура. до генної касети, відповідають епітопам з NP (147Планшети блокували 3% сироватки плоду корови 161, TYQRTRALVRTGMDP (SEQ ID NO.20), 55-69, у фосфатно-сольовому буфері (PBS) протягом 2 RLIQNSLTIERMVLS (SEQ ID NO.21)) та НА (91годин, а потім до кожної лунки додавали аліквоти 108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (SEQ ID NO.22)). кожного дослідного зразка. До кожної лунки додаМожна сконструювати вакцину з комбінованими вали цитокін-специфічне біотиніловане антимишаепітопами, яка складається з Т-В-епітопу, як опиче mAb щура, а потім авідинпероксидазу. Провосано [Brumeanu et al., 1997] (НА 110-120/НА 150дили кольорову реакцію шляхом додавання 159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (SEQ ID колориметричних субстратів. Планшети зчитували NO.23)) [Brumeanu et al., 1997, J. Virol. 71: 5473]. у спектрофотометрі для проведення аналізів Після одержання відповідної послідовності (посліELISA і концентрації цитокінів обчислювали зі стадовностей), синтетичний ген, що кодує INFV-HD, ндартної кривої, одержаної для контрольних рекозбирають синтезом, гібридизацією, PCR та лігумбінантних цитокінів. Усі набори для аналізу цитованням перекривних олігонуклеотидів. Зібраний кінів методом ELISA (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, непроцесований ген, що кодує фрагменти INFV, IFN- та TNF-α) були придбані у PharMingen, Inc. ампліфікують методом PCR та лігують до плазміди (San Diego, CA)). експресії. Кінцеві гени аналізують методом секвеАнтиген-індукована проліферація Т-клітин. нування ДНК. Сенсибілізацію хазяїна до антигенів ΗIV визначали Плазміди, що містять INFV-HD, трансформуметодом антиген-індукованої проліферації Тють до Е.соlі. Бактерії інкубують у середовищі LB з клітин. Гомогенати селезінки ізолювали, як описаампіциліном (50мкг/мл) при 37°С до фази середно раніше. Клітини суспендували у середовищі нього логарифмічного росту. У цей час додавали RPMI 1640, яке містить 10% сироватки плоду коIPTG для індукування гібридного промотора trp/lac. рови (FCS), 10мМ буфера Hepes, L-глутамін Виміри проводили кожної години для визначення (2мМ), пеніцилін (25МО/мл), стрептоміцин оптимальної післяіндукційної експресії протеїнів (25мкг/мл) та гентаміцин (80мкг/мл). Клітини кульINFV-HD. У момент оптимальної експресії клітини збирали центрифугуванням. Осади клітин піддативують при концентрації 1 106 клітин/мл з пептивали лізису і центрифугували. Лізат аналізували дом HIV-HD (5мкг/мл) чи без нього у 96-лункових на присутність протеїну. Протеїни INFV-HD очипланшетах з U-подібним дном протягом 3-4 днів у щали методом селективної схожості до нікелю, атмосфері з 5% СО2. Культури пульс-мітили 20мкл зв'язаного з твердою основою. У разі потреби, барвника ресазурину протягом 3 годин, а потім використовували ексклюзійну, іонообмінну чи гідвимірювали флуоресценцію за допомогою приларофобну хроматографію для додаткової очистки ду Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., INFV-HD. Farmington, MA). Модель вірусної інфекції. Штам INFV, викорисАнти-HIV CTL-реакції. Після вакцинації оцінютаний для того, щоб продемонструвати ефективвали присутність антиген-специфічних цитотоксиність вакцини, є рекомбінантом вірусу A/PR/8/34, чних Т-лімфоцитів (CTL) у Т-клітинах селезінки. що називається PR8. Вірус культивують у курячих Лімфоцити селезінки одержували, як описано вияйцях з ембріонами у віці 10-12 днів шляхом аланще. Лімфоцити з кожної дослідної групи розбивали тоїнової інокуляції з подальшим інкубуванням при на групи (n=5), а потім культивували протягом 3 37°С у качалці протягом 40-48 годин та 20-24 годнів без антигену при 107клітин/лунку у культурадин при 4°С, а потім - видаленням з алантоїнової льних 12-лункових планшетах. Клітини-мішені лірідини. Аналіз на гемаглютинацію вірусу з 0,5% мфоми L5198Y (Н2d) (АТТС) інкубували з пептичервоних кров'яних клітин курчати буде проводидом, який відповідав епітопу HIV CTL для Н2dтись у 96-лункових мікротитрувальних планшетах рестриктованих клітин, протягом 4 годин при 37°С. 27 75327 28 для визначення кількості гемаглютинуючих одигелі NuSieve-агароза (FMC Byproducts, Rockland, ниць (НАU)/мл маточної суспензії вірусу. ME), забарвленому бромідом етидію та сфотограДля мишачої моделі BALB/c було показано, що фованому за допомогою УФ-трансілюмінатора 1200 HAU штаму PR8 при введенні інтраназально (BioRad Gel Doc 1000). Було показано, що цей меза допомогою стерильної насадки автоматичної тод є чутливим та високоспецифічним при вимірюмікропіпетки анестезованим метофаном мишам ванні присутності вірусної ДНК (Lakeman and (20мкл) викликали виражені симптоми інфекції на Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857). 4 день, включаючи знижену рухомість, відсутність Послідовність домену НА1. Послідовність дочистки, 20%-ву втрату ваги тіла та смерть протямену НА1 (сегмент 4) може бути визначена шлягом двох тижнів. Методом цитолізу MDCK, провехом ампліфікації домену НА1 з вірусної РНК за деним у 96-лункових мікротитрувальних планшереакцією RT-PCR з наступним субклонуванням тах з кінцевою точкою 50%, було виявлено продукту 1100п.н. для секвенування та секвенуприсутність високого титру інфекційного вірусу у вання з використанням дидезоксинуклеотидного гомогенатах легенів, виготовлених на 4 день після методу термінації. Аналіз методом RT-PCR провоінфікування. дять з використанням системи Titan One Tube RTПроцедури вакцинації та випробувань індукуPCR System, як описано вище, з такими відмінносвання імунної реакції на вірусний антиген. Самитями: праймерами ампліфікації є праймер кДНК цям мишей BALB/c (у віці 6-8 тижнів) робили підш(5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3' (SEQ кірні ін'єкції на 1-му, 4-му та 8-му тижнях ID NO.26)) та праймер PCR (5'дослідним препаратом вакцини чи буфером. Місця CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3' (SEQ ID ін'єкцій контролювали на вияви небажаних реакNO.27)) [Pyhala et al., 1995 J. Gen. Virol. 76: 205], за цій, таких як розвиток гранульом та/або утворення умов проведення одного циклу з 60°С протягом 30 струпів. Якщо тварин імунізували вакциною інтрахвилин, 94°С протягом 2 хвилин, десяти циклів з назальним шляхом, то їх анестезували метофа94°С протягом 30 секунд, 60°С протягом 30 сеном, і дослідну композицію (10-20мкл) вводили до кунд, 68°С протягом 45 секунд, двадцяти п'яти ніздрів для вдихання за допомогою стерильної циклів з 94°С протягом 30 секунд, 60°С протягом насадки на автоматичній мікропіпетці [Gallichan et 30 секунд, 68°С протягом 45 секунд зі збільшенням al., 1993, J. Inf. Dis. 168: 622]. часу нарощування ланцюга на п'ять секунд для Виявлення РНК INFV у тканині легенів метокожного циклу, з наступним одним циклом при дом RT-PCR. Детектування РНК INFV методом RT68°С протягом 7 хвилин. Продукт 1100п.н. субклоPCR проводили на легенях дослідних тварин, узянують до вектора клонування ТА PCR 2.1 тих через 4 дня після вірусного зараження для (Invitrogen, Carlsbad, CA) для подальшого секвенувизначення ефективності імунізації з метою провання. Секвенування здійснюють з використанням філактики вірусної інфекції. Зразки легенів, узятих протоколу та реагентів з набору AutoCycle у мишей, миттєво заморожували, розмелювали і (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), а заморожений порошок зберігали при –70°С до результати одержували на апараті для секвенупроведення аналізів. Ізоляцію загальної РНК та вання набору ALFExpress (Amersham Pharmacia аналіз методом RT-PCR на вірусну РНК проводять Biotech, Piscataway, NJ), і аналізували за допомоз використанням модифікації раніше описаних гою набору прикладних програм AM v.3.02 методик [Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). 162: 156; Shirwan et al., 1993, J. Immunol. 151: Кількісні виміри гуморальної імунної реакції 5228; Lakeman and Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171: методом ELISA. Через регулярні інтервали під час 857]. Використовуються праймери, які є специфічпроцедури вакцинації вимірювали імунну реакцію ними для матричного гена (сегмент 7) вірусу грипу мишей на вірусний антиген. Ліпосоми, які містять A [Atmar et al., 1996, J. Clin. Microbiol. 34:2604]. антигенний епітоп, також використовували як міАніліз методом RT-PCR проводять з використаншені для проведення аналізу антитіло/ELISA, як ням реагентів та протоколу системи Titan One було описано раніше [Tuso et al., 1993, Tube RT-PCR System (Boehringer Mannheim, Transplantation 55: 1375]. Результати останнього Indianapolis, IN). Стисло, від 1пг до 1мкг загальної аналізу використовують для вимірювання рівня матричної РНК інкубують у присутності 0,2мМ зв'язування та ізотипового складу антитіл. dNTPs, 0,4мкМ антисмислового праймера FAM1 Антиген-індукована проліферація Т-клітин. (5'-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-31 (SEQ ID Сенсибілізацію хазяїна до антигену INFV визначаNO/24)), 0,4мкМ смислового праймера FAM2 (5'ли з використанням антиген-індукованої проліфеGCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3' (SEQ ID NO.25)), рації Т-клітин. Селезінки видаляли у вакцинованих 5мМ DTT, 5од. інгібітора Рнази, 1,5мМ МgСІ2 та мишей і гомогенати готували шляхом обережного ензими AMV/Expand High Fidelity за таких умов: розбивання селезінок стерильним штоком та проодин цикл з витримуванням при 60°С протягом 30 давлювання клітин скрізь нейлонове сито. Клітини хвилин, 94°С протягом 2 хвилин, десять циклів при суспендували у середовищі RPMI 1640, яке міс94°С протягом 30 секунд, 55°С протягом 30 сетить 10% сироватки плоду корови (FCS), 10мМ кунд, 68°С протягом 45 секунд, двадцять п'ять цибуфера Hepes, L-глутамін (2мМ), пеніцилін клів при 94°С протягом 30 секунд, 55°С протягом (25МО/мл), стрептоміцин (25мкг/мл) та гентаміцин 30 секунд, 68°С протягом 45 секунд зі збільшенням (80мкг/мл). Клітини культивують при концентрації часу нарощування ланцюга на п'ять секунд для 1 106клітин/мл з хімічно синтезованими пептидакожного циклу, з наступним одним циклом при ми, що відповідають антигенам (5мкг/мл), чи без 68°С протягом 7 хвилин. Позитивний результат них, у 96-лункових планшетах з U-подібним дном підтверджується видимою смугою 212п.н. у 1,5% протягом 3-4 днів у 5% СО2. Культури пульс 29 75327 30 мітили 20мкл барвника ресазурину протягом 3 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Лабораторне одержання годин, а потім вимірювали флуоресценцію за доплазміди здійснювали з використанням стандартпомогою приладу Cytofluor II (Perseptive ного методу лужного лізису [Maniatis, 1989 Biosystems, Inc., Farmington, MA). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Анти-INFV CTL-реакіці. Після вакцинації оціSambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor нювали присутність антиген-специфічних цитотокLaboratory Press, NY. p.125]. Вставку PCRсичних Т-лімфоцитів (CTL) у Т-клітинах селезінки. продукту секвенували звичайним методом дидезоЛімфоцити селезінки одержували, як описано викси-термінації з використанням протоколу та реаще. Лімфоцити з кожної дослідної групи розбивали гентів набору AutoCycle (Amersham Pharmacia на групи (n=5), а потім культивували протягом 3 Biotech, Piscataway, NJ), а результати одержували днів без антигену при 107клітин/лунку у культурана апараті для секвенування набору ALFExpress II льних 12-лункових планшетах. Клітини-мішені ма(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), і стоцитоми Р815 чи лімфоми L5178 (Η2d) (АТТС) аналізували за допомогою набору прикладних інкубували з пептидом, який відповідав епітопу програм AlfWin v.2.0 (Amersham Pharmacia Biotech, INFV NP CTL (амінокислоти 147-158) для Н2dPiscataway, NJ). рестриктованих клітин, протягом 4 годин при 37°С. Одержання NTHi(P6)-HD. Після одержання геМішені промивали і до кожної лунки додавали на, що кодує Р6, синтетичний ген, який кодує NTHi(P6)-HD, збирають шляхом синтезу, гібриди100мкл титрів, що містять 1 104 клітин. Ефекторні зації, PCR та лігування перекривних олігонуклеолімфоцити промивали, додаючи до лунок у різних тидів. Сегмент HD приєднують до N- чи С-кінця концентраціях, і культивували протягом 4 годин протеїну за допомогою лінкера, що складається з при 37°С. Відсоток специфічного лізису обчислюгліцину та серину. Це дає нам можливість дослідивали за результатами вимірів лактатдегідрогенази ти вплив відносного положення HD стосовно анти(LDH) у надосадній рідині з використанням набору гену на процесинг імунною системою. Зібраний CytoTox 96 (Promega, Madison WI) на стандартнонепроцесований ген, який кодує фрагмент му планшет-рідері для ELISA (HTS 7000+ BioAssay NTHi(P6)-HD, ампліфікують методом PCR та лігуReader, Perkin Elmer, San Jose, CA) шляхом реєстють до плазміди експресії. Кінцевий ген аналізують рації оптичної густини при 490нм. Визначення секвенуванням ДНК. HSV2-антигенспецифічного лізису здійснювали за Плазміду, що містить NTHi(P6)-HD, трансфорстандартними критеріями. Дані виражали як відсомують до Е.соlі. Бактерії інкубують у середовищі ток специфічного лізису =100 [(експериментальні LB з ампіциліном (50мкг/мл) при 37°С до фази се- ефектор-спонтанні - мішень-спонтанні) / (мішеньредини логарифмічного росту. У цей час додавали максимальні - мішень-спонтанні)]. IPTG для індукування гібридного промотора trp/lac. Приклад V - Нетипований H.influenzae (NTHi) Результати щогодинних вимірів використовують та H.influenzae типу b (Hib) для визначення оптимальної післяіндукційної ексКлонування протеїнів NTHi. Повну генну поспресії протеїну NTHi(P6)-HD. У момент оптимальлідовність, що кодує Р6, одержують зі штаму NTHi ної експресії клітини збирали центрифугуванням. шляхом ампліфікації методом RT-PCR мРНК Р6 Осади клітин піддавали лізису і центрифугували. [Deich et al, 1988, J. Bacteriol. 170: 489; Nelson et Лізат та клітинний осад аналізували на присутність al., 1988, Inf. Immun. 56: 128; Looman et al., 1987, протеїну. Для екстракції протеїну NTHi(P6)-HD з EMBO J. 6: 2489]. Ампліфікацію проводять з виколізованих осадів клітин використовували 1-2% ристанням протоколу та реагентів системи Titan розчин дезоксихолату натрію. Потім NTHi(P6)-HD One Tube RT-PCR System (Boehringer Mannheim, очищали методом селективної схожості до нікеля, Indianapolis, IN). Стисло, бактерії інкубують у призв'язаного з твердою основою. У разі потреби, сутності 0,2мМ dNTPs, 0,4мкМ антисмислового використовували ексклюзійну, іонообмінну чи гідпраймера H-lnvfP6AS (5'рофобну хроматографію для додаткової очистки GAGTCCGCTGCTCTACCAAC -3' (SEQ ID NO.28)), NTHi(P6)-HD. 0.4мкМ смисового праймера H-lnvfP6S (5'Одержання ліпосом. Існує три загальних підAATTTCCAGCTTGGTCTCCA -3' (SEQ ID NO.29)), ходи до одержання стабільних ліпосом NTHi(P6)5мМ DTT, 5од. інгібітора РНази, 1.5mM МgСl2 та HD. За першим, композицію ліпосом складають ензимів AMV/Expand High Fidelity за таких умов: таким чином, щоб протеїн та ліпіди розчинялись один цикл з витримуванням при 60°С протягом 30 разом у органічному розчиннику (хлорохвилин, 94°С протягом 2 хвилин, десять циклів при форм/метанол), а потім висушувались до тонкої 94°С протягом 30 секунд, 55°С протягом 30 сеплівки. Після ресуспендування у водному буфері кунд, 68°С протягом 45 секунд, двадцять п'ять циліпіди та протеїн збираються у великі двошарові клів при 94°С протягом 30 секунд, 55°С протягом структури. Суспензію потім озвучують з одержан30 секунд, 68°С протягом 45 секунд зі збільшенням ням малих уніламелярних везикул (SUV). У разі часу нарощування ланцюга на п'ять секунд для малих протеїнів цей метод працює добре. Однак, у кожного циклу, з наступним одним циклом при цих експериментах може бути небажаним піддава68°С протягом 7 хвилин. Позитивний результат ти протеїн суровим умовам у розчиннику внаслідок підтверджується видимою смугою 867п.н. у 1,0% можливості денатурації протеїну. Отже, щоб уникгелі NuSieve-агароза (FMC Byproducts, Rockland, нути небажаних конформаційних змін, може викоME), забарвленому бромідом етидію та сфотограристовуватися другий метод, який включає солюфованому за допомогою УФ-трансілюмінатора білізацію NTHi(P6)-HD у буфері для (BioRad, Gel Doc 2000). Продукт PCR субклонують ресуспендування перед гідратацією ліпідної плівз метою секвенування до вектора ТА 2.1 з викорики. Після гідратації ліпідів протеїн спонтанно асостанням реагентів та протоколу набору ТА Cloning 31 75327 32 ціює з новоутвореною мембраною і проникає до ня струпів у місці інокуляції. Через один тиждень бішару SUV під час озвучування. Третій метод після останньої вакцинації малят щурів анестезувключає одержання ліпосом без протеїну вали галотаном і збирали кров серцевою пункцією, NTHi(P6)-HD з його наступним додаванням до вже а слизові шляхи промивали сольовим розчином сформованих SUV, що дає HD можливість інтегрудля збирання мукозальної секреції. Тварин піддаватись до ліпідного бішару. Ліпосоми готують шлявали евтаназії діоксидом карбону. Титри бактерихом озвучування проб згідно з раніше описаними цидних антитіл сироватки та мукозальної рідини процедурами [Fujii et al., 1997, Biochemistry 36: вимірювали, як описано далі. 4959]. Стисло, ліпіди (з протеїном чи без нього) У дослідженнях з інтраперитонеального зарарозчиняють в органічному розчиннику, такому як ження малят щурів (у віці 26 днів) заражали бактехлороформ/метанол. Тонкі ліпідні плівки утворюріями і контролювали бактеріальне навантаження ють шляхом внесення піпеткою аліквот ліпідних у їх крові та спинномозковій рідині (CSF) порівняно розчинів до круглодонних скляних пробірок та виз невакцинованими щурами. Відбір зразків крові та парювання розчинника при 65°С у тоці газоподібCSF для аналізу на бактерію через два дні після ного азоту. Плівки поміщали під вакуум принаймні зараження показав, що у тварин існує істотне бакна вісім годин для видалення залишкового органітеріальне навантаження (тобто, 1 104КОУ/мл крочного розчинника. Одержання ліпосом здійснюваві, 1 104КОУ/мл CSF). Сироватки вакцинованих ли шляхом гідратації ліпідних плівок буфером та щурів у віці 26 днів, що містили високі титри бакінкубування суспензії при 65°С протягом 5-10 хвитерицидних антитіл, вводили внутрішньовенно лин перед озвученням проби. Потім ліпосоми фіщурам у віці 6 днів. Наступного дня малята щурів льтрують скрізь фільтр 0,22мкм для стерилізації (n=10) одержували інтраперитонеально дозу NTHi, препарату. Розмір ліпосом визначали методом як описано далі. Потім малят щурів спостерігали динамічного світлорозсіяння, і утворення агрегатів на захворюваність та смертність, тих, що вижили, відстежували протягом принаймні чотирьох тижнів. піддавали евтаназії після 26 днів, а кров і CSF Можливо, може виникнути потреба у збереженні збирали та культивували на присутність NTHi. конформації протеїну NTHi(P6)-HD. Тому ми пеІнтраперитонеальне зараження NTHi. Культуредбачаємо, що з трьох підходів, які можуть бути ру пасивованих in vivo NTHi у віці 24 годин дововикористані для виготовлення ліпосом, кращими дили до 5 107-5 109КОУ/мл і 100мкл цієї культури можуть виявитись додавання протеїну як комповводили інтраперитонеальною ін'єкцією щурам у ненту до гідратуючого розчину або додавання до віці 5-10 днів [Smith et al., 1973, Inf. Immun. 8: 278]. ліпосом після того, як вони вже будуть утворені. Заражені малята щурів залишались після інокуляБактеріальні штами. Штами NTHi 9333 (ізолят ції з їх матерями-годувальницями. Протягом 18-96 цереброспинальної рідини), 35056 (ізолят інфекції годин після зараження принаймні 90% малят щурів верхніх дихальних шляхів), 43095 (ізолят отитного вмирало від цієї дози пасивованих бактерій. середовища), 49766 (ізолят абсцесу легенів, етаВимірювання антигенспецифічної гуморальної лонний штам для досліджень на антимікробну імунної відповіді методом ELISA. Сироватку та сприйнятливість) (АТСС) та штам Hib 51654 зразки мукозальної рідини кожного щура аналізу(АТСС) були використані для демонстрації ефеквали на антитіла IgG та ІgА, специфічні до антигетивності у моделі бактеріальної інфекції. Перед ну Р6. До відповідно оброблених 96-лункових використанням заморожений матеріал організму планшетів додавали клонований нативний Р6 або субкультивували у свіжому мозково-серцевому протеїн NTHi(P6)-HD, та інкубували протягом ночі бульйоні з додаванням NAD (2мкг/мл) та гему при кімнатній температурі. Планшети блокували (10мкг/мл), та інкубували протягом 24 годин при 1% бичачого сироваточного альбуміну у бікарбо37°С у атмосфері з 10% діоксиду карбону. Для натному буфері, рН9,6, протягом 30 хвилин при регулювання інокуляту бактерій, потрібного для 37°С. Потім планшети промивали 0,05% Твін проведення бактерицидних аналізів чи інтрапери20/PBS. Серійно розведені зразки кожної сироваттонеального введення дози для зараження, викоки та мукозальної рідини додавали до покритих ристовують стандартну криву для кожного органіантигеном планшетів з подальшим інкубуванням зму, що складається з відношення протягом 2 годин при 37°С та промиванням буфеколонієутворюючих одиниць до щільності при ром Твін/PBS наприкінці інкубування. До лунок 480нм. додавали на одну годину при 37°С з'єднані з лужПроцедури вакцинації та випробувань індукуною фосфатазою моноклональні антитіла, специвання імунної реакції на бактеріальний антиген. фічні до IgG чи ІgА щура. Потім лунки промивали Групи новонароджених щурів (n=6 на групу) імунібуфером Твін/PBS і до лунок додавали субстрат зували у дні після народження 5, 12, 19 та 26, або PNPP у діетаноламіновому буфері, рН9,5, для у дні 5 та 26 дослідним препаратом вакцини чи ініціювання колориметричної реакції. Реакції зупибуфером. Системну вакцинацію щурів здійснюваняли 0,75Н гідроксидом натрію і зчитували при ли шляхом підшкірної ін'єкції ліпосомальних вак405нм за допомогою приладу Spectramax для зчицин. Якщо тварин імунізували вакциною інтранатування планшетів ELISA. Концентрації IgG та ІgА зальним шляхом, то їх анестезували метофаном, і щурів обчислювали за стандартною кривою, одедослідну композицію (20мкл) вводили за допоморжаною для контрольних зразків з відомою концегою стерильної насадки на мікропіпетці [Gallichan нтрацією щурячого IgG чи ІgА, нанесених на 96et al., 1993, J. Inf. Dis. 168: 622]. Малят щурів полункові планшети, оброблені, як описано вище. міщали разом з їх матерями-годувальницями, і Аналіз на бактерицидні антитіла. Зразки крові контролювали на появу небажаних реакцій, таких для проведення аналізів на присутність бактерияк утворення гранульом, почервоніння чи утворенцидних антитіл інкубували при 56°С протягом 30 33 75327 34 хвилин для інактивації комплементу. Потім робили (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) і клонують методом серійне розведення дослідних сироваток у фосфаобмеженого розведення. Ідентифікацію клонів, що тно-сольовому буфері (PBS). Бактеріальну культупродукують високі рівні протеїну, роблять методом вестерн-блотування. Протеїни HCV(E2/NS1)-HD та ру у віці 24 годин доводили до 5 105КОУ/мл у стеHCV(E2/NS1ΓHVR1)-HD очищають за методом рильному РСМ-буфері, що складається з PBS з селективної схожості до нікеля, зв'язаного з твер0.15mМ СаСІ2 та 1mМ МgСl2 і містить бичачий сидою основою. Гістидиновий лінкер видаляють енроваточний альбумін (BSA). Сироватки невакцитерокіназним гідролізом після завершення очистнованих малят щурів використовують як джерело ки. У разі потреби, використовували ексклюзійну, комплементу. Ці сироватки об'єднують, відбираіонообмінну чи гідрофобну хроматографію для ють аліквоти і зберігають при -70°С до викорисдодаткової очистки протеїнів HCV(E2/NS1)-HD та тання. До кожної лунки 96-лункових планшетів HCV(E2/NS1ΓHVR1)-HD. додають бактерії (20мкл), серійно розведену сироОдержання протеїнів HCV(HVR1)-HD та ватку (20мкл), комплемент (20мкл) та 40мкл 1% HCV(C)-HD у Е.соlі. Нуклеотидні послідовності BSA у РСМ-буфері. Для визначення вихідних конобраних епітопів одержують з послідовностей процентрацій бактерій аліквоти 10мкл суміші зразка теїнів з використанням кодонових преференцій висівали у час нуль на чашки зі свіжим агаром ВНІ, Е.соlі [Looman et al., 1987, EMBO J. 6: 2489]. Посякий містить живильний агар з домішками NAD та лідовність антигену (антигенів) для вставки до гему. Після інкубування реакційних сумішей при генної касети відповідає епітопам з NP (147-161. 37°С протягом однієї години в атмосфері з 10% TYORTRALVRTGMDP: 55-69. RLIONSLTIERMVLS) діоксиду карбону зі струшуванням, 10мкл зразка з та НА (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASU. Після кожної лунки висівали на чашки у двох паралельодержання відповідної послідовності (послідовноних дослідах та інкубували протягом ночі при 37°С стей) синтетичний ген, що кодує HCV-HD, фланкодля визначення кількості КУО/лунку. Контрольні ваний зручними сайтами рестрикції, збирають групи включали лунку без сироватки для підтвершляхом синтезу, гібридизації та лігування перекдження того, що самий лише комплемент не вбиривних олігонуклеотидів. Стисло, зборку фрагменває бактерій, та лунку з дослідною сироваткою, тів здійснюють шляхом нагріву до 65°С та відпаале без комплементу, щоб впевнитись у тому, що лювання олігонуклеотидів, коли вони остигають до комплемент сироватки у дослідному зразку дійсно кімнатної температури. Після інкубування на льоду був інактивований. Усі аналізи роблять з трьома протягом 2 хвилин фрагменти лігують ДНКпаралельними дослідами, а розведення, які сприлігазою. Зібраний непроцесований ген, що кодує чинюють загибель 50% бактерій, використовують фрагменти HCV, ампліфікують методом PCR, гіддля порівняння активності різних сироваток. ролізують рестриктазами та ізолюють електрофоПриклад VI - Вірус гепатиту С резом на гелі. Потім ген HCV лігують до аналогічОдержання HCV(E2/NS1)-HD та но гідролізованої плазміди експресії, яка містить HCV(E2/NSUHVR1)-HD у клітинах СНО. Нуклеотиген HD (наприклад, pTrcHis чи pQE30). Кінцеві гени дну послідовність протеїну HCV E2/NS1 виділяють аналізують методом секвенування ДНК. шляхом ампліфікації методом PCR штаму HCV, як Плазміди, що містять HCV-HD, трансформуописано далі. Використовують 5'-праймер, що відють до Е.соlі. Бактерії інкубують у середовищі LВ з повідає першим 21п.н. гена E2/NS1 ампіциліном (50мкг/мл) при 37°С до середньої лоCAAACCATGATCGCCCACGGA, та 3'-праймер, що гарифмічної фази росту. У цей момент часу додавідповідає залишкам з 622 по 628, вали IPTG для індукування гібридного промотора GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA, видаляючи транtrp/lac. Виміри проводили кожної години для висмембранний домен [Cocquerel, L. et al., 1998, J. значення оптимальної післяіндукційної експресії Virol. 72(3): 2183-91]. Крім того, кожен праймер є протеїнів HCV-HD. У момент оптимальної експрефланкованим зручним сайтом рестрикції. Продукт сії клітини збирали центрифугуванням. Осади кліPCR лігують до pcDNA3.1His, що містить HDтин піддавали лізису і центрифугували. Лізат анадомен як плазміду генної касети (Invitrogen, Inc., лізували на присутність протеїну. Протеїни HCVSan Diego, CA). HCV(E2/NS1ΓHVR1)-HD конструHD очищали методом селективної схожості до юють шляхом делеції HVR1 гена E2/NS1, що віднікеля, зв'язаного з твердою основою. У разі потповідає першим 27 амінокислотам від залишку 384 реби, використовували ексклюзійну, іонообмінну до залишку 410. Делеційний мутант одержують чи гідрофобну хроматографію для додаткової очиметодом PCR-ампліфікації з використанням 5'стки HCV-HD. праймера CAACTCATCAACACCAATGGC та того Ліпосомальні препарати та процедури вакцисамого 3'-праймера, що використовувався для нації, випробування з індукування імунної відповіконтрольної групи дикого типу. Кінцеві гени аналіді, кількісні виміри гуморальної імунної відповіді зували методом секвенування ДНК. Плазміди траметодом ELISA, аналізи DTH, аналізи на цитокінснсфекували до клітин СНО [Deen, K. С. et al., 1988, пецифічну мРНК, кількісні аналізи цитокінів метоNature 331: 82] (ATCC, Rockville, MD) з викорисдом ELISA, проліферація антиген-індукованих Ттанням реагенту для ліпофекції (Lipofectamine, клітин та визначення анти-HIV CTL-реакції по суті Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) згідно з рекомендоне відрізнялись від тих, що описані у Прикладі III ваним виробником протоколом. Відбирають стабівище. льних трансфектантів за допомогою G418 35 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 75327 Підписне 36 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601