Застосування il-18-зв’язуючого білка для лікування закритої травми голови

1. Застосування інгібітору IL-18 для одержання лікарського препарату для лікування закритої травми голови, викликаної не інсультом і не ішемічним ушкодженням головного мозку, де інгібітор IL-18 вибраний з IL-18-зв'язуючого білка (IL-18BP), його ізоформи, мутеїну, злитого білка або функціонального похідного, що зберігають біологічну активність IL-18BP. 2. Застосування за п. 1, де інгібітор IL-18 глікозильований в одному або декількох місцях. 3. Застосування за п. 1 або 2, де злитий білок включає злиття з імуноглобуліном (Ig). 4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, де функціональне похідне включає щонайменше одну складову, прикріплену до однієї або більше функціональних груп, які є одним або більше бічними ланцюгами на залишках амінокислот. 5. Застосування за пунктом 4, де вказаною складовою є частина поліетиленгліколю (PEG). 6. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де лікарський препарат, крім того, містить інтерферон для одночасного, послідовного або роздільного застосування. 7. Застосування за пунктом 6, де інтерфероном є інтерферон- a або інтерферон- b . 8. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де лікарський препарат, крім того, включає фактор некрозу пухлин (TNF) для одночасного, послідовного або роздільного застосування. 9. Застосування за пунктом 8, де TNF є TNF- a . 10. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де лікарський препарат, крім того, включає протизапальний агент для одночасного, послідовного або роздільного застосування. 2 (19) 1 3 80396 4 29. Застосування за будь-яким з пп. 17-28, де інгі25. Застосування за п. 24, де TNF є TNF- a . бітор IL-18 застосовують у кількості близько 0,00126. Застосування за будь-яким з пп. 17-25, де лі100 мг/кг ваги тіла або близько 0,01-10 мг/кг ваги карський препарат, крім того, включає протизапатіла, або близько 0,1-5 мг/кг ваги тіла, або близько льний агент для одночасного, послідовного або 1-3 мг/кг ваги тіла. роздільного застосування. 30. Застосування за будь-яким з пп. 17-29, де інгі27. Застосування за п. 26, де протизапальним агебітор IL-18 вводять підшкірно. нтом є СОХ інгібітор, особливо СОХ-2 інгібітор. 31. Застосування за будь-яким з пп. 17-30, де інгі28. Застосування за будь-яким з пп. 17-27, де лібітор IL-18 вводять щодня. карський препарат, крім того, включає антиокси32. Застосування за будь-яким з пп. 17-31, де інгідант для одночасного, послідовного або роздільбітор IL-18 вводять через день. ного застосування. Даний винахід відноситься до сфери патологічних станів головного мозку. Точніше, він відноситься до застосування інгібітору IL-18 для лікування і/або запобігання пошкодженню центральної нервової системи (ЦНС), особливо, травматичного пошкодження головного мозку. У 1989 році була описана ендотоксиніндукована активність сироватки, яка індукує інтерферон-γ (IFN-γ), одержаний в клітинах селезінки мишей (Nakamura et al., 1989). Дана активність сироватки діяла не як прямий індуктор IFN-γ, а швидше як костимулятор разом з IL-2 або мітогенами. У спробі виділити активну речовину з сироватки мишей після впливу ендотоксину був виявлений, ймовірно, гомогенний білок масою 50-55 кД. Оскільки інші цитокіни можуть діяти як костимулятори продукції IFN-γ, через нездатність нейтралізуючих антитіл до IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 або TNF нейтралізовувати активність сироватки передбачили, що вона визначалася особливим фактором. У 1995 році тими ж дослідниками було продемонстровано, що ендотоксин-індукований костимулятор продукції IFN-γ знаходиться в екстрактах печінки мишей, заздалегідь підданих впливу P.acnes (Okamura et al., 1995). У даній моделі популяція печінкових макрофагів (клітини Купфера) збільшувалася, і у даних мишей низькі дози бактерійного ліпополісахариду (LPS), які у заздалегідь непідготовлених мишей не були смертельними, ставали смертельними. Фактор, названий П^ЬРуіндукуючим фактором (IGIF) і пізніше позначений як інтерлейкін-18 (IL-18), був очи щений до гомогенності з 1200 грамів печінки мишей, підданих впливу P.acnes. Вироджені олігонуклеотиди, що походять з послідовностей амінокислот очищеного IL-18, застосовували для клонування кДНК IL-18 мишей. IL-18 є білком з масою 18-19 кД, що складається з 157 амінокислот, який не має очевидної схожості з яким-небудь пептидом з баз даних. Молекули матричної РНК для IL-18 і інтерлейкіну-12 (IL-12) легко визначають в клітинах Куп фера і активованих макрофагах. Рекомбінантний IL-18 стимулює IFN-гамма більш ефективно, ніж IL-12, ймовірно, через окремий механізм (Micallef et al., 1996). Подібно до ендотоксин-індукованої активності сироватки, IL-18 стимулює IFN-γ не самостійно, а діє переважно як костимулятор з мітогенами або IL-2. IL-18 посилює проліферацію Т-клітин, ймовірно по IL-2-залежному шляху і посилює продукцію цитокінів Thl in vitro і надає синергічну дію при поєднанні з IL-12 відносно продукції IFN-γ (Maliszewski etal, 1990). Після клонування мишачої форми, у 1996 р. було повідомлено про послідовність кДНК IL-18 людини (Ushio et al., 1996). Шляхом клонування IL-18 з уражених тканин і вивчення експресії гена IL-18 була виявлена тісна асоціація даного цитокіну з аутоімунними захворюваннями. У мишей без ожиріння з діабетом (NOD) спонтанно розвивається аутоімунний інсуліт і діабет, які можуть бути посилені і синхронізовані шляхом однієї ін'єкції циклофосфаміду. Наявність мРНК IL-18 продемонстрована методом ПЛР із зворотною транскриптазою в підшлунковій залозі NOD-мишей під час ранніх стадій інсуліту. Рівні мРНК IL-18 швидко збільшувалися після лікування циклофосфамідом і передували збільшенню мРНК IFN-γ і, згодом, діабету. Цікаво, що дана кінетика повторює таку мРНК IL-12-p40, приводячи до тісної кореляції між індивідуальними рівнями мРНК. Клонування кДНК IL-18 з панкреатичної РНК з подальшим секвенуванням виявило ідентичність з послідовністю IL-18, клонованою з клітин Купфера і заздалегідь активованих in vivo макрофагів. Також макрофаги NOD-мишей реагували на циклофосфамід експресією гена IL-18, в той час як макрофаги мишей лінії Balb/c, оброблених паралельно, не реагували. Отже, регуляція експресії IL-18 порушена у NOD-мишей з аутоімунною патологією і тісно асоційована з розвитком діабету (Rothe et al., 1997). IL-18 грає потенційну роль в імунорегуляції або в запаленні шляхом посилення функціональної активності Fas-ліганду на клітинах Thl (Conti et al., 1997). IL-18 також експресується в корі надниркових залоз і, отже, може бути секретованим нейроімуномодулятором, що грає важливу роль в гармонійній роботі імунної системи у відповідь на стресовий вплив (Chater, 1986). In vi vo IL-18 утворюється шляхом розщеплення npo-IL-18 і, ймовірно, його ендогенна активність відповідає за продукцію IFN-γ при смертності, опосередкованій P. acnes і LPS. Зрілий IL-18 утворюється з його попередника за допомогою ІL-1βконвертуючого ферменту (IL-1бета-конвертуючий фермент, ICE, каспаза-1). Рецептор IL-18 складається як мінімум з двох компонентів, діючих спільно при скріпленні ліганду. Високо- і низькоафінні зв'язуючі ділянки для IL18 були виявлені на стимульованих IL-12 Тклітинах мишей (Yoshimoto et al., 1998), що дозволило передбачити наявність рецепторного комплексу з множиною ланцюгів. До цього часу були ідентифіковані дві субодиниці рецептора, що оби 5 80396 6 дві належать до сімейства рецепторів IL-1 (Parnet більній аварії або при падінні. У цьому випадку, et al., 1996). У трансдукцію сигналу IL-18 залучена череп ударяється об стаціонарний об'єкт, і голоактивація NF-В (DiDonato et al., 1997). вний мозок, що знаходиться всередині черепа, Недавно з сечі людини був виділений розчинповертається і скручується навколо осі (стовбура ний білок, що володіє високою афінністю до IL-18, і головного мозку), викликаючи місцеве або пошибули описані кДНК людини і миші (Novick et al., рене пошкодження. Також, головний мозок, м'яка 1999; WO 99/09063). Даний білок був названий ILмаса, оточена рідиною, що дозволяє йому «плава18-зв'язуючим білком (IL-18BP). ти», може рикошетувати від черепа, що сприяє IL-18BP є не позаклітинним доменом одного з подальшому пошкодженню. відомих рецепторів IL-18, a секретованим, який Після травми може мати місце період несвізустрічається в природі, циркулюючим білком. Він домого стану, який може продовжуватися хвилини, належить до нового сімейства секретованих білків. тижні або місяці. Внаслідок обертання і віддачі, Дане сімейство, крім того, включає декілька білків, пацієнт з травматичним пошкодженням головного що кодуються поксвірусом, які володіють високою мозку звичайно має пошкодження або контузію гомологічністю з IL-18BP(Novick et al., 1999). ILбагатьох відділів головного мозку. Це називається 18BP постійно експресується в селезінці, наледифузним пошкодженням або «нереактивним пожить до суперсімейства імуноглобулінів і має обшкодженням» головного мозку. Типи пошкодження межену гомологію з рецептором IL-1 типу II. Його головного мозку, що є при нереактивних пошкоген локалізований на людській хромосомі 11q13 і в дженнях, можуть бути класифіковані як первинні геномній послідовності розміром 8,3 т.п.н. не виабо вторинні. явлено екзону, що кодує трансмембранний домен Первинне пошкодження головного мозку роз(Novick et al., 1999). вивається в момент травми, переважно в місцях Чотири людські і дві мишачі ізоформи IL-18BP, впливу, особливо, коли має місце перелом черепа. що ви ходять в результаті сплайсінгу мРНК, виявВеликі контузії можуть бути асоційовані з внутрішлені в різних бібліотеках кДНК, були одержані, ньомозковим крововиливом або можуть супровоочищені і оцінені відносно біологічної активності джуватися кортикальними розривами. Розсіяні зв'язування і нейтралізації IL-18 (Kim et al., 2000). пошкодження аксонів з'я вляються внаслідок зсуву і деформації розтягнення нейрональних паростків, Людська ізоформа a IL-18BP (IL-18BPa) показала що викликаються ротаційними рухами головного найбільшу афінність до IL-18 з швидким зв'язуванмозку всередині черепа. Також можуть мати місце ням і повільним від'єднуванням і константою дисоневеликі геморагічні пошкодження або дифузне ціації (K(d)), що становить 399 пМ. IL-18BPc має Igпошкодження аксонів, що може бути визначено домен такий же як IL-18BPa, крім 29 С-кінцевих тільки за допомогою мікроскопа. амінокислот; K(d) IL-18BPc в 10 раз менше (2,94 Вторинне пошкодження головного мозку рознМ). Проте, IL-18BPa і IL-18BPc нейтралізують ILвивається внаслідок ускладнень, що розвиваються 18 > 95% при молярному надлишку в два рази. У після моменту травми. Ці пошкодження включають ізоформ IL-18BPb і IL-18BPd відсутній повний Igвнутрішньочерепний крововилив, травматичне домен і відсутня здатність до зв'язування або нейпошкодження позачерепних артерій, утворення тралізації IL-18. Мишачі ізоформи IL-18BPc і ILвнутрішньочерепних гриж, гіпоксичне пошкоджен18BPd, що володіють ідентичним Ig-доменом, таня головного мозку або менінгіт. кож нейтралізують >95% мишачого IL-18 примоля«Відкрита травма голови» являє собою видирному надлишку в два рази. Однак, мишачий ILме пошкодження голови і може розвинутися вна18BPd, який володіє такою ж С-кінцевою послідовслідок вогнепального поранення, нещасного випаністю, що і людський IL-18BPa, також нейтралізує дку або пошкодження головного мозку предметом, людський IL-18. Молекулярне моделювання дощо пройшов через череп («реактивне пошкоджензволило ідентифікувати великі комбіновані електня головного мозку»). Для даного тину травм голоростатичні і гідрофобні зв'язуючі ділянки в Igви більш характерне пошкодження специфічної домені IL-18BP, які можуть відповідати за його ділянки головного мозку. високоафінне зв'язування з лігандом (Kim et al., Так зване «м'яке пошкодження головного моз2000). ку» може розвиватися без втрати свідомості і, моТравматичне пошкодження головного мозку жливо, супроводжуватися тільки почуттям оніміння (ТВІ), яке також просто називається травмою гоабо сплутаного стану свідомості протягом коротколови або закритою травмою голови (СНІ), відного часу. Хоча забезпенуваний медичний догляд ситься до пошкодження центральної нервової сисможе бути мінімальним, пацієнти з пошкодженням теми, при якому пошкодження головного мозку головного мозку без коми можуть відчувати симпвикликане зовнішнім ударом по голові. Це частіше томи і порушення, схожі на такі, що відчуваються за все зустрічається при автомобільних або велотими, що вижили після травматичної коми. сипедних аваріях, але може також розвиватися У відповідь на травму, в головному мозку розвнаслідок неповного утоплення, серцевого пристувиваються зміни, які вимагають спостереження пу, інсульту або інфекцій. Даний тип травматичного пошкодження головного мозку звичайно розвидля запобігання подальшому пошкодженню. Розмір головного мозку часто збільшується після сервається внаслідок нестачі кисню або йозної травми голови. Цей стан називається набукровопостачання головного мозку і внаслідок цьоханням головного мозку і розвивається при го може бути віднесений до «аноксичного пошкозбільшенні кількості крові в головному мозку. З дження». Закрите пошкодження голови розвивається плином захворювання вода може скупчуватися в головному мозку, що називається набряком головнаслідок удару по голові, наприклад, при автомо 7 80396 8 вного мозку. Як набухання головного мозку, так і 1999). Підвищені рівні IL-18 визначали в спиннонабряк головного мозку приводить до надмірного мозковій рідині (СМР) пацієнтів із запальними затиску в головному мозку, який називається внутріхворюваннями ЦНС, такими як бактерійний меніншньочерепним тиском ("ІСР"). гіт і вірусний менінгоенцефаліт, але не в СМР у Кома є тривалим періодом несвідомого стану, пацієнтів з розсіяним склерозом (MS) (Fassbender що розвивається безпосередньо після травматичet al., 1999). На відміну від виявленого, як правило, ного пошкодження голови. низького підоболонкового рівня IL-18 у пацієнтів з Існує декілька ступенів коми. Ступені коми моMS, в спинному мозку щурів лінії Lewis з експерижуть бути оцінені по прогресуванню міри реагументальним аутоімунним енцефаломієлітом вання пацієнта з травмою голови. У гострій фазі (ЕАЕ), моделі дослідження на тваринах MS, була травми голови застосовується шкала коми Глазго. продемонстрована підвищена експресія мРНК ILПри поліпшенні стану пацієнта або його стабіліза18 (Jander and Stall, 1998). Експресія і функціонації застосовується шкала «Rancho Los Amigos льне значення IL-18 при нейротравмі до цього чаScale», яка оцінює міру когнітивного (розуміння і су не досліджувалося. здібності до міркування) мислення. Пошкодження головного мозку часто привоДаний винахід відноситься до патофізіологічдить до персистуючи х порушень, таких як постної ролі IL-18 при захворюваннях ЦНС. Він оснотравматична епілепсія, персистуючий вегетативваний на виявленні того, що лікування мишей інгіний стан або посттравматична деменція. біторами IL-18, через одну годину або три дні після Пошкодження спинного мозку є іншим типом експериментального закритого пошкодження голопошкоджень ЦНС. Пошкодження спинного мозку є ви (СНІ), приводить до поліпшення відновлення і причиною більшості госпіталізацій з параплегією і меншої протяжності пошкодження головного мозку тетраплегією. Більше 80% розвиваються внаслідок в порівнянні з контрольними тваринами. Тому дадорожніх аварій. Клінічно виділяють дві головних ний винахід відноситься до застосування інгібітору групи пошкоджень: відкриті пошкодження і закриті IL-18 для одержання лікарського препарату для пошкодження. лікування і/або запобігання пошкодженню центраВідкриті пошкодження викликають пряму тральної нервової системи (ЦНС) і зокрема травмативму спинного мозку і нервових корінців. Проривні чному пошкодженню головного мозку. пошкодження можуть викликати поширені розриви Застосування комбінацій інгібітору IL-18 з іні крововиливи. Закриті пошкодження, що є причитерфероном і/або TNF, і/або інгібіторами запаленною більшості спинномозкових пошкоджень, звиня, і/або антиоксидантами також забезпечується чайно асоційовані з переломом/зміщенням хребезгідно з даним винаходом. З метою застосування тного стовпа, що звичайно визначається підходів генної терапії для доставки інгібітору IL-18 радіологічно. Пошкодження спинного мозку залев пошкоджені тканини або клітини, подальші аспежить від протяжності пошкодження кісток і розглякти даного винаходу відносяться до застосування дається як дві головні стадії: первинне пошкомолекул нуклеїнових кислот, що включають кодудження, яким є удари, розтин нервових волокон і ючу послідовність інгібітору IL-18 для лікування геморагічний некроз, і вторинне пошкодження, і/або запобігання пошкодженню ЦНС. Даний винаяким є екстрадуральна гематома, інфаркт, інфекхід також відноситься до застосування клітин, геція і набряк. нетично сконструйованих з метою експресії інгібіПізні результати пошкодження спинного мозку торів IL-18, для запобігання і/або лікування включають: висхідну і низхідну антероградну дегепошкодження ЦНС. нерацію пошкоджених нервових волокон, посттраФіг.1 показує гістограму, що зображує рівень в вматичну сирингомієлію і системні вияви параплеплазмі внутрішньомозкового IL-18 (нг/мл) в цілому гії, такі як інфекції сечового тракту і грудної мозку (заштрихований), в лівій півкулі (чорний), клітини, пролежні і м'я зова слабкість. або в правій півкулі (сірий) в різних умовах. Патологія травматичного пошкодження голоФіг.2 показує розвиток оцінки по шкалі NSS вного мозку є комплексною і до цього часу неяс(Neurological Severity Score) через 1 годину (год.), ною. Науково-дослідні праці в останні десять років 24 год., 72 год. або 168 год. після травми, з ввепідкреслюють важливу роль цитокінів, що вивільденням внутрішньочеревинно 50 мкг IL-18BP через няються системно і локально в підоболонковому 1 год. після травми (квадрати) або з ін'єкцією тільвідділі після пошкодження головного мозку і пеки розчинника (контроль, кола). редбачають наявність подвійного ефекту прозапаФіг.3 показує ΔNSS, що оцінюється через 24 льних цитокінів, таких як TNF, IL-6 або IL-8, на осгод., 72 год. або 168 год. після травми, з введеннові виявлення залежних від часу корисних і ням внутрішньочеревинно 50 мкг IL-18BP через 1 побічних ефектів даних медіаторів (Morgantiгод. після травми (квадрати) або з ін'єкцією тільки Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shoрозчинника (контроль, кола). hami et al., 1999; Scherbel et al., 1999; Whalen et al., Фіг.4 показує ΔNSS, що оцінюється через 1 2000). Як описано вище, недавно відкритим цитогод., 24 год., З дні (д), 7 д або 14 д після травми з кіном сімейства IL-1 є IL-18. Недавні дослідження введенням внутрішньочеревинно 50 мкг IL-18BP продемонстрували, що IL-18 постійно експресуоднократно на 3-ій після травми (ромби) або в поється в ЦНС мишей, щурів і людини in vivo (Culдвійній дозі через 1 годину і на 3-ій день після траhane et al., 1998; Jander and Stall, 1998; Prinz et al., вми (квадрати) або ін'єкції тільки розчинника (кон1999; Fassbender et al., 1999; Wheeler et al., 2000), троль, трикутники). так само, як і в первинних культура х астроцитів і Даний винахід оснований на виявленні статисмікроглії, але не нейронів, in vitro (Conti et al., тично достовірного корисного ефекту інгібітору IL 9 80396 10 18 на відновлення після пошкодження головного Терміни «лікування» і «запобігання», що замозку в моделі закритої травми голови на мишах. стосовується в даному описі, розуміють як часткоВідповідно до даного винаходу, надалі було виявве або повне запобігання, інгібування, послабленлено, що IL-18 підвищується в головному мозку і ня, поліпшення або регресію одного або більше спинномозковій рідині після травматичного пошкосимптомів або причин пошкодження ЦНС, а також дження головного мозку, що показує, що даний симптомів, захворювань або ускладнень, супровопрозапальний цитокін грає важливу роль в патогеджуючих пошкодження ЦНС. При «лікуванні» понезі пошкодження головного мозку. шкодження ЦНС речовини згідно з даним винахоОтже, даний винахід відноситься до застосудом вводять після початку захворювання, вання інгібітору IL-18 для одержання лікарського «запобігання» відноситься до введення речовин препарату для лікування і/або запобігання пошкодо того, як у пацієнта будуть помічені симптоми дженню центральної нервової системи (ЦНС). захворювання. Даний винахід крім того відноситься до застоЛікування пошкодження ЦНС є переважним сування інгібітору IL-18 для одержання лікарського відповідно до даного винаходу. Переважно, з мепрепарату для лікування і/або запобігання ускладтою лікування пошкодження ЦНС, інгібітор IL-18 ненням і пізнім наслідкам пошкодження ЦНС. вводять по можливості якнайшвидше після пошкоУ переважних варіантах втілення винаходу дження ЦНС, наприклад, протягом першої години пошкодженням ЦНС є травматичне пошкодження після пошкодження. Однак, як показано в приклаголовного мозку або закрита травма голови. дах, нижче, було показано, що один інгібітор IL-18 У подальших переважних варіантах втілення надає свою позитивну дію на пошкодження головинаходу пошкодженням ЦНС є пошкодження вного мозку навіть при введенні через три дні пісспинного мозку. ля розвитку пошкодження головного мозку. Тому, з Крім того, в подальшому переважному варіанті метою лікування пошкодження ЦНС, переважне втілення винаходу пошкодження головного мозку введення інгібітору IL-18 протягом трьох днів після має судинне походження. пошкодження. У контексті даного винаходу, вираження «поТермін «інгібітор IL-18» в контексті даного вишкодження центральної нервової системи» або находу відноситься до будь-якої молекули, що «пошкодження ЦНС» відноситься до будь-якого модулює продукцію і/або дію IL-18 таким чином, пошкодження головного або спинного мозку, незащо продукція і/або дія IL-18 ослабляється, меншає лежно від періоду часу від початку або причини, або частково, істотно або повністю запобігається що його викликала. Причиною може бути, наприабо блокується. Термін «інгібітор IL-18» містить в клад, механічний вплив або інфекція. Пошкодженсобі інгібітори продукції IL-18, так само як інгібітори ня ЦНС, його клінічні симптоми і наслідки детальдії IL-18. но описані в розділі «Передумови винаходу». Інгібітором продукції може бути будь-яка моПошкодження ЦНС включає, наприклад, травму лекула, що негативно впливає на синтез, процесінг або інше пошкодження головного або спинного або дозрівання IL-18. Інгібітори, що розглядаються мозку і також може бути назване нейротравмою. згідно з даним винаходом, можуть бути, наприПошкодження головного мозку може, наприклад, супресорами експресії гена інтерлейкіну ILклад, включати або приводити до одного або декі18, антисмисловими мРНК, що зменшують і що лькох виявів з наступного: 1. погіршення уваги; 2. запобігають транскрипції мРНК IL-18 або ведуть до порушення когнітивних функцій; 3. порушення модеградації мРНК, білками, що порушують правивних функцій; 4. порушення пам'яті; 5. порушення льне укладання, або частково або істотно запобіповедінки; 6. моторні розлади; 7. будь-які інші негають секреції IL-18, протеазами, сприяючими деврологічні порушення. градації IL-18, після того, як він був синтезований, Пошкодження спинного мозку може, наприінгібіторами протеаз, що розщеплюють npo-IL-18 з клад, приводити до розвитку параплегії або тетраметою утворення зрілого IL-18, такими як інгібітори плегії. каспази-1 і подібними. Ускладнення або пізні результати пошкодженІнгібітором дії IL-18 може бути, наприклад, ання ЦНС також можна лікувати і/або запобігти відтагоніст IL-18. Антагоністи можуть зв'язувати або повідно до даного винаходу. Ускладнення і пізні ізолювати саму молекулу IL-18 з достатньою афінрезультати пошкодження головного мозку описані ністю і специфічністю з частковою або істотною вище в розділі «Передумови винаходу». Вони нейтралізацією IL-18 або IL-18-зв'язуючої ділянвключають, але не обмежені вказаним, наприклад, ки(ок), відповідальним за зв'язування IL-18 з його кому, менінгіт, посттравматичну епілепсію, постлігандами (як, наприклад, з його рецепторами). травматичну деменцію, дегенерацію нервових Антагоніст може також інгібувати шлях передачі волокон або посттравматичну сирингомієлію, або сигналу з участю IL-18, який активується в клікрововилив. тинах після зв'язування IL-18 з його рецептором. Даний винахід також відноситься до застосуІнгібіторами дії IL-18 також можуть бути розвання інгібіторів IL-18 для одержання лікарського чинні рецептори IL-18 або молекули, що імітують препарату для лікування і/або запобігання будьрецептори, або агенти, що блокують рецептори ILякому пошкодженню головного мозку судинного 18, або антитіла до IL-18, такі як поліклональні або походження, такого як гіпоксичне пошкодження моноклональні антитіла або будь-які інші агенти головного мозку при церебральному інфаркті, або молекули, що запобігають скріпленню IL-18 з ішемія, цереброваскулярна катастрофа або інйого мішенями, що зменшують або запобігають сульт. ініціюванню внутрішньо- або позаклітинних реакцій, опосередкованих IL-18. 11 80396 12 У переважному варіанті втілення даного винаімуноаналіз або аналіз ELISA. Прості ходу інгібітор IL-18 вибирають з інгібіторів каспазифункціональні дослідження для оцінки біологічної 1 (ICE), антитіл до IL-18, антитіл до будь-яких субактивності IL-18ВР були детально описані в WO одиниць рецептора IL-18, інгібіторів шляху пере99/09063, наприклад, в прикладах 2 (зв'язування дачі сигналу з участю IL-18, антагоністів IL-18, які IL-18, що оцінюється шляхом утворення попереконкурують з IL-18 або зв'язуються і блокують речних міжмолекулярних зв'язків) або 5 (інгібування цептор IL-18, і IL-18-зв'язуючих білків, ізоформ, індукованих IL-18 індукції IFN-γ в мононуклеарних мутеїнів, злити х білків, функціональних похідних, клітинах крові). активних фракцій або похідних циркулярної переУ переважному варіанті втілення винаходу становки або їх солей. будь-який такий мутеїн має, щонайменше, 40% Термін «IL-18-зв'язуючі білки» в даному описі ідентичності або гомології з послідовністю IL-18BP застосовується синонімічно з «IL-18BP». Він вклюабо кодованим вірусом гомологом IL-18BP. Більш чає IL-18 зв'язуючі білки, визначені в WO 99/09063 переважно, щоб він мав, щонайменше, 50%, щоабо в Novick et al., 1999, включаючи варіанти найменше, 60%, щонайменше, 70%, щонайменше, сплайсінгу і/або ізоформи IL-18-зв'язуючих білків, 80% або, найбільш переважно, щонайменше, 90% як визначено в Kim et al., 2000. Зокрема, людські ідентичності або гомології з ними. ізоформи а і с IL-18BP є корисними відповідно до Мутеїни поліпептидів IL-18BP або мутеїни віданого винаходу. Білки, корисні відповідно до дарусних IL-18BP, які можуть бути використані відпоного винаходу, можуть бути глікозильованими або відно до даного винаходу, або нуклеїнова кислота, неглікозильованими і можуть бути одержані з нащо кодує їх, включають обмежений набір значною туральних джерел, таких як сеча, або вони можуть мірою відповідних послідовностей як, наприклад, переважно бути одержані рекомбінантним шлящо замінюють пептиди або полінуклеотиди, які хом. Рекомбінантна експресія може виконуватися можуть бути звичайно одержані звичайним фахівза допомогою прокаріотичних систем експресії, цем в області техніки без надмірного експериментаких як Е. соli, або еукаріотичних, і переважно, тування, основуючись на вченні і керівництві, систем експресії ссавців. Клітинною лінією, особпредставленому в даному описі. ливо добре відповідною для інгібіторів IL-18 даноМутеїни відповідно до даного винаходу вклюго винаходу, є клітини яєчника китайського хом'яка чають білки, що кодуються нуклеїновою кислотою, (СНО). такою як ДНК або РНК, яка гібридизується з ДНК Рекомбінантна продукція інгібітору IL-18, при або РНК, яка кодує інгібітор IL-18, відповідно до рекомбінантній експресії в клітинах ссавців або даного винаходу, при помірно або дуже жорстких клітинних лініях, може переважно здійснюватися в умовах. Термін «жорсткі умови» відноситься до середовищі для клітинних культур, що не містить умов гібридизації і подальшого промивання, які сироватку. звичайно розглядаються фахівцями в даній обласТермін "мутеїн", що застосовується в даному ті техніки як «жорсткі». Дивись Ausubel et al., описі, відноситься до аналогів IL-18BP або аналоCurrent Protocols in Molecular Biology, раніше, Interгів вірусного IL-18BP, в яких один або більше аміscience, N.Y., §§6.3, 6,4 (1987, 1992), і Sambrook et нокислотних залишків IL-18BP, що зустрічається в al. (Sambrook, J.C., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. природі, або вірусного IL-18BP заміщені відмінни(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold ми амінокислотними залишками або делетовані, Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, або один або більше амінокислотних залишків NY). додані до послідовності IL-18BP, що зустрічається Без обмежень, приклади жорстких умов вклюв природі, або вірусного IL-18BP, без значного чають умови промивання при температурі на 12зниження активності одержаних продуктів в порів20°С нижче розрахованої Тер гібрида, що дослінянні з диким типом IL-18BP або вірусним IL-18BP. джується, в, наприклад, 2 x SSC (хлорид натрію + Дані мутеїни одержують шляхом відомої технології цитрат натрію) і 0,5% SDS (додецилсульфат насинтезу і/або шляхом те хнології сайттрію) протягом 5 хвилин, 2 x SSC і 0,1% SDS пронаправленого мутагенезу, або будь-якої іншої вітягом 15 хвилин; 0,1 x SSC і 0,5% SDS при 37°С домої відповідної технології. протягом 30-60 хвилин і потім, 0,1 x SSC і 0,5% Будь-який такий мутеїн переважно має посліSDS при 68°С протягом 30-60 хвилин. Звичайні довність амінокислот, що достатньо дублює таку фа хівці в даній області техніки розуміють, що жорIL-18BP, або достатньо дублюючу вірусний ILсткість умов також залежить від довжини послідо18BP так, щоб володіти значною мірою схожою вностей ДНК, олігонуклеотидних зондів (таких як активністю з IL-18BP. Однією з дій IL-18BP є його 10-40 основ) або суміші олігонуклеотидних зондів. здатність зв'язувати IL-18. Поки мутеїн володіє При застосуванні суміші зондів, переважно застоістотною активністю зв'язування IL-18, він може совува ти хлорид тетраметиламонію (ТМАС), зазастосовуватися для очищення IL-18, такого як за мість SSC. Дивись Ausubel, раніше. допомогою афінної хроматографії, і тому можна У переважному варіанті втілення винаходу вважати, що він володіє значною мірою схожою будь-який такий мутеїн має, щонайменше, 40% активністю з IL-18BP. Отже, можна визначити, чи ідентичності або гомології з послідовністю SEQ ID володіє будь-якою конкретний мутеїн активністю, N0:1, 2 або 3 в прикладеному списку послідовносзначною мірою схожою з IL-18BP, за допомогою тей. Більш переважно, щоб він мав, щонайменше, звичайних експериментів, що включають як об'єкт 50%, щонайменше, 60%, щонайменше, 70%, щотакий мутеїн, наприклад, методом простого конкунайменше, 80% або, найбільш переважно, щонайрентного сендвіч-аналізу для визначення, чи зв'яменше, 90% ідентичності або гомології з ним. зує він спеціально помічений IL-18, такого як радіо 13 80396 14 Ідентичність відображає взаємовідношення Smith and Waterman (1981) і виявляє найкращу між двома або більше поліпептидними послідовєдину аналогічну ділянку між двома послідовносностями або двома або більше полінуклеотидними тями. Інші програми для визначення ідентичності послідовностями, що визначається шляхом поріві/або схожості між послідовностями також відомі в няння послідовностей. У загальних рисах, ідентичобласті техніки, наприклад, сімейство програм ність відноситься до точної відповідності нуклеоBLAST (Altschul S.F. et al, 1990, Altschul S.F. et al., тиду з нуклеотидом або амінокислоти з 1997, доступне на домашній сторінці NCBI за адамінокислотою в двох полінуклеотидних або поліресою www.ncbi.nlm.nih.gov) і FASTA (Pearson пептидних послідовностях, відповідно, при порівW.R., 1990; Pearson 1988). нянні по всій довжині послідовності. Переважними змінами для мутеїнів відповідно Для послідовностей, в яких немає точної віддо даного винаходу є такі, відомі як «консервативповідності, можна визначати «% ідентичності». У ні» заміни. Консервативні амінокислотні заміни загальних рисах, дві послідовності, що порівнюполіпептидів або протеїнів IL-18BP або'вірусних ILються, вирівнюють для одержання максимальної 18BP можуть включати синонімічні амінокислоти в відповідності між послідовностями. Даний процес межах групи, які володіють в достатній мірі схожиможе включати додання «інтервалів» в одну або ми фізико-хімічними властивостями, такі заміни обидві послідовності для посилення міри вирівнюміж членами групи дозволяють зберегти біологічну вання. % ідентичності можна визначати по всій функцію молекули (Grantham, 1974). Ясно, що довжині кожної послідовності, що порівнюється, вставки і делеції амінокислот також можуть бути (так зване глобальне вирівнювання), яке особливо зроблені в охарактеризованих вище послідовноспідходить для послідовностей однакової або дуже тях без порушення їх функції, особливо, якщо схожої довжини, або для більш коротких, визначевставки або делеції залучають усього декілька них послідовностей (так зване локальне вирівнюамінокислот, наприклад, менше тридцяти, і перевання), що більш підходить для послідовностей важно, менше десяти і не видаляють або не перенерівної довжини. міщують амінокислоти, що є критичними для фунСпособи порівняння ідентичності і гомології кціональної конформації, наприклад, залишки двох або більше послідовностей добре відомі в цистеїну. Протеши і мутеїни, одержані шляхом області техніки. Так, наприклад, програми, що є в таких делецій і/або вставок, відносяться до сфери Wiskonsin Sequence Analisys Package, версія 9.1 дії даного винаходу. (Devereux J. et al., 1984), наприклад, програми Переважно, групи синонімічних амінокислот BESTFIT і GAP, можуть застосовуватися для вивизначені в Таблиці 1. Більш переважно, групи значення % ідентичності між двома полінуклеотисинонімічних амінокислот визначені в Таблиці 2; і дами і % ідентичності і % гомології між двома понайбільш переважно, групи синонімічних амінокиліпептидними послідовностями. BESTFIT слот визначені в Таблиці 3. використовує алгоритм «локальної гомології» Таблиця 1 Перев ажні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly He Phe Тут Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gin, Lys, Glu, His He, Phe, Тут, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Тут, Phe, He, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, He, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Gin, Asp, Ser, Asn Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Phe, lie, Val, Leu, Met Trp 15 80396 16 Таблиця 2 Більш переважні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly He Phe Тут Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser His, Lys, Arg Leu, He, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, He Gly He, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, He, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gin, Arg Glu, Gin, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gin Met, Phe, lie, Val, Leu Trp Таблиця 3 Найбільш переважні групи синонімічних амінокислот Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly He Phe Тут Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser Arg Leu, He, Met Pro Thr Ala Val Gly He, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gin Asn Lys Asp Glu Met, He, Leu Met Приклади одержання замін амінокислот в білках, які можуть бути використані для одержання мутеїнів поліпептидів або білків IL-18ВР, або мутеїнів вірусних IL-18BP для застосування в даному винаході, включають будь-які відомі стадії способу, такі як представлені в патентах США 4 959 314, 4 588 585 і 4 737 462, видані Mark et al.; 5 116 943, виданому Koths et al., 4 965 195, виданому Namen et al., 4 879 111, виданому Chong et al; і 5 017 691, виданому Lee et al; і лізинзаміщених білків, представлених в патенті США № 4 904 584 (Shaw et al). Термін «злитий білок» відноситься до поліпептиду, що включає IL-18BP або вірусний IL-18BP або їх мутеїн, або їх фрагмент, в злитті з іншим білком, який, наприклад, має більш тривалий час існування в рідких середовищах організму. Так, IL18BP або вірусний IL-18BP може бути злитий з іншим білком, поліпептидом або т.п. наприклад, імуноглобуліном або його фрагментом. 17 80396 18 Термін «функціональні похідні», що застосонього для досягнення хорошої регресії або полегвуються в даному описі, включає похідні IL-18BP шення патогенного стану або будь-якого симптому або вірусного IL-18BP і їх мутеїни і злиті білки, які або групи симптомів, що відноситься до патогенможуть бути одержані з функціональних груп, які ного стану, і низькою токсичністю. зустрічаються у вигляді бічних ланцюгів на залишНейтралізуючі антитіла легко одержують від ках або N- або С-кінцевих груп, за допомогою спотварин, таких як кролики, кози або миші, шляхом собів, відомих в області техніки, і вони включаютьімунізації IL-18. Імунізовані миші є особливо корися в даний винахід доти, поки вони залишаються сними для забезпечення джерела В-клітин для фармацевтично прийнятними, тобто вони не поодержання гібридом, які в свою чергу культивують рушують активність білка, яка значною мірою сходля одержання великих кількостей анти-ІL-18 можа з активністю IL-18BP або вірусного IL-18BP, і не ноклональних антитіл. додають токсичних властивостей композиціям, що Химерними антитілами є молекули імуногломістять їх. буліну, що характеризуються двома або більше Дані похідні можуть, наприклад, включати бічні сегментами або частинами, що походять від різних ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати видів тварин. Як правило, варіабельну ділянку антигенні ділянки і подовжувати час життя IL-18BP химерного антитіла одержують з антитіла ссавця, або вірусного IL-18BP в рідких середовищах органе людини, такого як мишаче моноклональне аннізму. Інші похідні включають аліфатичні складні титіло, а константну ділянку імуноглобуліну одерефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних жують з молекули людського імуноглобуліну. Пегруп внаслідок реакції з аміаком або з первинними реважно, щоб обидві ділянки і їх комбінація або вторинними амінами, N-ацильні похідні вільволоділи низькою імуногенністю при звичайному них аміногруп амінокислотних залишків, що утвовизначенні (Elliott et al., 1994). Гуманізовані антитірюються з ацил-складовими (наприклад, алканоїла є молекулами імуноглобулінів, створеними льні або карбоциклічні ароїльні групи), або Ошляхом технологій генної інженерії, при яких миацильні похідні вільних гідроксильних груп (напришачі константні ділянки замінюють людськими клад, таких серинових або треонінових залишків), копіями, зберігаючи мишачі ділянки, зв'язуючі анщо утворюються з ацил-складовими. тиген. Одержане мишаче-людське химерне антиЯк «активні фракції» IL-18BP або вірусного ILтіло переважно володіє зниженою імуногенністю і 18BP, мутеїнів і злитих білків, даний винахід охопполіпшеною фармакокінетикою у людей (Knight et лює будь-які фрагменти або попередники поліпепal., 1993). тидного ланцюга білкової молекули як такої, або Таким чином, в подальшому переважному варазом з асоційованими молекулами або залишкаріанті втілення винаходу антитілом до IL-18 є гуми, пов'язаними з нею, наприклад, залишками нуманізоване антитіло до IL-18. Переважні приклади кру або фосфату, або агрегати білкових молекул гуманізованих анти-ІL-18 антитіл описані, наприабо тільки залишків нукру, при умові, що вказана клад, в Європейській патентній заявці ЕР 0974600. фракція має активність, значною мірою схожу з ILУ ще одному переважному втіленні винаходу 18BP. антитіло до IL-18 є повністю людським. Технологія Термін «солі» в даному описі відноситься як одержання людських антитіл описана детально, до солей карбоксильних груп, так і до кислотнонаприклад, в WO 00/76310, WO 99/53049, US 6 162 адитивних солей аміногрупи молекули інгібітору 963 або AU 5336100. Повністю людськими антитіIL-18 або його аналогів. Солі карбоксильної групи лами є переважно рекомбінантні антитіла, що можуть бути утворені за допомогою способів, віодержуються від трансгенних тварин, наприклад, домих в області техніки, і включають неорганічні ксеномишей, що включають повністю або частково солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, зафункціональні локуси людського Ig. ліза або цинку і т.п., і солі з органічною основою, У високо переважному варіанті втілення данояк такі, що утворюються, наприклад, з амінами, го винаходу інгібітором IL-18 є IL-18BP, або його такими як триетаноламін, аргініном або лізином, ізоформа, мутеїн, злитий білок, функціональне піперидином, прокаїном і т.п. Кислотно-адитивні похідне, активна фракція або похідне циркулярної солі включають, наприклад, солі з мінеральними перестановки. Дані ізоформи, мутеїни, злиті білки кислотами, такими як, наприклад, соляна кислота або функціональні похідні зберігають біологічну або сірчана кислота, і солі з органічними кислотаактивність IL-18BP, особливо в зв'язуванні IL-18, і ми, такими як, наприклад, оцтова кислота або щапереважно мають по суті як мінімум активність, влева кислота. Звичайно, будь-яка така сіль повисхожу з IL-18BP. В ідеалі, такі білки володіють біонна зберігати біологічну активність OPN, логічною активністю, яка навіть вище при поріввідповідну для даного винаходу, тобто надавати нянні з немодифікованим IL-18BP. Переважні акпроліферативну дію на олігодендроцити. тивні фракції володіють активністю, кращою, ніж У наступному переважному варіанті втілення активність IL-18BP, або мають подальші переваги, винаходу інгібітором IL-18 є антитіло до IL-18. Антакі як краща стабільність або більш низька токсититіла до IL-18 можуть бути поліклональними або чність або імуногенність, або їх легше одержувати моноклональними, химерними, гуманізованими у великих кількостях, або легше очищати. або навіть повністю людськими. Рекомбінантні Послідовності IL-18BP і його варіантів/ізоформ антитіла і їх фрагменти характеризуються високою сплайсінгу можуть бути одержані з WO 99/09063 афінністю зв'язування з IL-18 in vivo і низькою токабо з Novick et al., 1999, так само як з Kim et al., сичністю. Антитіла, які можуть застосовуватися в 2000. даному винаході, характеризуються їх здатністю Функціональні похідні IL-18BP можуть бути до лікування пацієнтів протягом періоду, достаткон'юговані з полімерами з метою поліпшення 19 80396 20 властивостей білка, таких як стабільність, час наВ іншому переважному варіанті втілення винапівжиття, біодоступність, переносимість організходу інтерфероном є інтерферон-β (IFN-β), і більш мом людини або імуногенність. Для досягнення переважно, IFN-β 1а. цієї цілі функціональні похідні можуть включати, Інгібітор продукції і/або дії IL-18 переважно защонайменше, одну складову, прикріплену до одністосовується одночасно, послідовно або роздільно єї або більше функціональних груп, які зустрічаз інтерфероном. ються як один або більше бічних ланцюгів на заФактор некрозу пухлини, як описано в літералишках амінокислот. Такою складовою може бути, турі, володіє як захисною, так і токсичною дією при наприклад, поліетиленгліколь (PEG). PEGпошкодженні головного мозку (Shohami et al., илювання може здійснюватися відомими способа1999). У Прикладі 1, нижче, ін'єкція TNF мишам ми, наприклад, описаними в WO 92/13095. після тяжкої травми головного мозку, приводила Отже, в переважному варіанті втілення даного до істотного зниження рівнів IL-18 в головному винаходу інгібітори IL-18, і особливо IL-18BP, є мозку, що показує, що TNF може володіти корисPEG-ильованими. ним ефектом на відновлення після травматичного У наступному переважному варіанті втілення пошкодження головного мозку. Отже, переважний винаходу інгібітором IL-18 є злитий білок, що варіант втілення даного винаходу відноситься до включає цілий IL-18-зв'язуючий білок або його часзастосування інгібітору IL-18 в комбінації з TNF тину, який зв'язаний з цілим імуноглобуліном або для одержання лікарського препарату для лікуйого частиною. Фахівці в області те хніки розумівання і/або запобігання пошкодженню головного ють, що злитий білок, що одержується, зберігає мозку, для одночасного, послідовного або роздібіологічну активність IL-18ВР, особливо відносно льного застосування. зв'язування з IL-18. Злиття може бути безпосередКомбінація інгібіторів IL-18 з TNF альфа є пенім або через короткий лінкерний пептид, який реважною відповідно до даного винаходу. може складати від 1 до 3 амінокислотних залишків У наступному переважному варіанті втілення в довжину або більше, наприклад, 13 амінокислотданого винаходу лікарський препарат крім того них залишків в довжину. Вказаний лінкер може містить протизапальний агент, такий як НСПЗЗ бути, наприклад, трипептидом з послідовністю Е(нестероїдні протизапальні засоби). У переважноF-M (Glu-Phe-Met) або лінкер з послідовністю з 13 му варіанті втілення винаходу в комбінації з інгібіамінокислот, що включає Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leuтором IL-18 застосовується СОХ-інгібітор, і більш Val-Leu-Gly-Gly-Gln, вставленим між послідовністю переважно, СОХ-2-інгібітор. СОХ-інгібітори відомі IL-18BP і послідовністю імуноглобуліну. Одержав області те хніки. Специфічні інгібітори СОХ-2, ний злитий білок володіє поліпшеними властивоснаприклад, описані в WO 01/00229. Активні компотями, такими як збільшений час існування в рідких ненти можуть застосовуватися одночасно, послісередовищах організму (час напівжиття), збільшедовно або роздільно. на специфічна активність, збільшений рівень ексБула описана роль окислювального стресу, пресії або полегшене очищення злитого білка. особливо реактивних форм кисню (ROS), в патоУ переважному варіанті втілення винаходу ILфізіології пошкодження головного мозку (Shohami 18BP з'єднаний з константною ділянкою молекули et al., 1997). Ig. Переважно, він з'єднаний з ділянками важких Отже, в переважному варіанті втілення даного ланцюгів, наприклад, такими як домени СН2 і СНЗ винаходу лікарський препарат крім того включає людського IgGl. Утворення специфічних злитих антиоксидант, для одночасного, послідовного або білків, що включають IL-18BP і частину імуноглороздільного застосування. Безліч антиоксидантів буліну, описане, наприклад, в прикладі 11 WO відомі в області техніки, такі як вітаміни А, С або Е, 99/09063. Інші ізоформи молекули Ig також є відабо 5-аміносаліцилова кислота, або супероксидповідними для утворення злитих білків згідно з дисмутаза. даним винаходом, такі як IgG2 або IgG4 або інші У наступному переважному варіанті втілення класи Ig, наприклад, такі як IgM або IgA. Злиті білданого винаходу інгібітор IL-18 застосовується в ки можуть бути мономерними або мультимерними, кількості близько 0,001-100 мг/кг ваги тіла або блигетеро- або гомомультимерними. зько 0,01-10 мг/кг ваги тіла, або близько 0,1-3 мг/кг Інтерферони особливо відомі своєю інгібуюваги тіла, або близько 1-2 мг/кг ваги тіла. чою дією на реплікацію вірусів і клітинну проліфеУ ще одному варіанті втілення винаходу інгібірацію. Інтерферон-γ, наприклад, грає важливу тор IL-18 застосовується в кількості близько 0,1роль в стимуляції імунної і запальної відповідей. 1000 мкг/кг ваги тіла або 1-100 мкг/кг ваги тіла або Вважається, що інтерферон β (IFN-β, інтерферон близько 10-50 мкг/кг ваги тіла. тину І) грає протизапальну роль. Даний винахід крім того відноситься до застоОтже, даний винахід відноситься до застосусування молекули нуклеїнової кислоти, що вклювання комбінації інгібітору IL-18 і інтерферону в чає кодуючу послідовність інгібітору IL-18, мутеїну, одержанні лікарського препарату для лікування функціонального похідного або їх активної фракції, пошкодження ЦНС. в одержанні лікарського препарату для запобіганІнтерферони також можуть бути кон'юговані з ня і/або лікування пошкодження ЦНС. полімерами з метою поліпшення стабільності білПереважно, молекула нуклеїнової кислоти крім ків. Кон'югат між інтерфероном β і високомолекутого включає послідовність вектора експресії, налярним спиртом поліетиленгліколем (PEG), наприприклад, для застосування генної терапії для ввеклад, описаний в WO 99/55377. дення інгібітору IL-18 згідно з винаходом. Переважно, молекулу н уклеїнової кислоти вводять внутрішньом'язово. 21 80396 22 З метою лікування і/або запобігання пошкоциркулярної перестановки, як описано вище, є дженню ЦНС, вектор генної терапії, що включає переважними інгредієнтами фармацевтичних компослідовність інгібітору продукції і/або дії IL-18, позицій. можна вводити прямо в уражену тканину, наприІнтерфероном, включеним в фармацевтичну клад, внаслідок цього уникаючи проблем, пов'язакомпозицію, є переважно IFN-бета або IFN-альфа. них з системним введенням векторів генної тераУ ще одному переважному варіанті втілення пії, таких як розведення векторів, досягнення і даного винаходу фармацевтична композиція вплив на клітини-мішені або тканини-мішені, і побівключає терапевтично ефективну кількість TNF» чних ефектів. альфа. Фармацевтична композиція згідно з даним Застосування вектора для стимуляції і/або повинаходом може крім того містити один або більсилення ендогенної продукції інгібітору IL-18 в кліше СОХ-інгібіторів. тинах, в нормі не секретуючих інгібітор IL-18, або Визначення «фармацевтично прийнятний» які експресують недостатні кількості інгібітору, таозначає будь-який носій, який не впливає на ефеккож розглядається відповідно до даного винаходу тивність біологічної активності активного інгредієндля лікування і/або запобігання пошкодженню та і не є токсичним для організму-хазяїна, якому ЦНС. Вектор може включати регуляторні елеменвводиться. Наприклад, для парентерального ввети, що функціонують в клітинах, в яких бажана дення активний білок(ки) можуть бути складені в експресія інгібітору IL-18. Такими регуляторними формі . одиниці дозування для ін'єкцій в розчиннипослідовностями або елементами можуть бути, ках, таких як фізіологічний розчин, розчин декстронаприклад, промотори або енхансери. Регуляторзи, сироватковий альбумін або розчин Рінгера. на послідовність потім може бути вбудована в Активні інгредієнти фармацевтичної композиції правильний локус геному шляхом гомологічної згідно з даним винаходом можна вводити індивіду рекомбінації, відповідно, оперативно зв'язуючи різними шляхами. Шляхи введення включають регуляторну послідовність з геном, експресію якоінтрадермальний, трансдермальний (наприклад, в го потрібно індукувати або посилити. Дана технопрепаративних формах повільного вивільнення), логія звичайно відноситься до "ендогенної активавнутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутції гена" (EGA), і вона описана, наприклад, в WO рішньовенний, підшкірний, пероральний, інтракра91/09955. ніальний, епідуральний, ректальний, місцевий і Фахівці в області техніки розуміють, що також інтраназальний шляхи. Можуть бути використані можливо безпосередньо зупинити експресію IL-18, будь-які інші терапевтично ефективні шляхи ввебез використання інгібітору IL-18, за допомогою дення, наприклад, всмоктування через епітеліальтакої ж технології. Щоб це здійснити, негативний ні або ендотеліальні тканини або шлях генної терегуляторний елемент, як, наприклад, елемент, рапії, де молекулу ДНК, що кодує активний агент, що викликає мовчання, можна вбудува ти в локус вводять пацієнту (наприклад, за допомогою вектогена IL-18, що приводить до зниження або запобіра), що викликає експресію активного агента і його гання експресії IL-18. Фахівці в області техніки росекрецію in vivo. Крім того, білок(ки) згідно з даним зуміють, що таке пониження регуляції або припивинаходом можна вводити разом з іншими компонення експресії IL-18 володіє таким же ефектом, нентами біологічно активних агентів, такими як що і застосування інгібітору IL-18 з метою запобіфармацевтично прийнятні поверхнево-активні гання і/або лікування захворювання. речовини, наповнювачі, носії, розріджувачі і розДаний винахід більше того відноситься до зачинники. стосування клітини, яка була генетично модифікоДля парентерального (наприклад, внутрішньована з метою продукції інгібітору IL-18, в одержанвенного, підшкірного, внутрішньом'язового) ввені лікарського препарату для лікування і/або дення активний білок(ки) можуть бути представлезапобігання пошкодженню ЦНС. ні у вигляді розчину, суспензії, емульсії або Крім того, даний винахід відноситься до фарліофілізованого порошку разом з фармацевтично мацевтичної композиції, особливо корисної для прийнятним розчинником для парентерального запобігання і/або лікування запального пошковведення (наприклад, водою, фізіологічним розчидження ЦНС, яка включає терапевтично ефективном, розчином декстрози) і допоміжними речовину кількість інгібітору IL-18 і/або терапевтично нами, які підтримують ізотонічність (наприклад, ефективну кількість інтерферону, і/або фармацевманіт) або хімічну стабільність (наприклад, консетично ефективну кількість TNF, і/або фармацевтирванти і буферні розчини). Препаративну форму чно ефективну кількість протизапального агента, стерилізують шляхом звичайних технологій, що і/або фармацевтично ефективну кількість антиокзастосовуються. сидантного агента. Біодоступність активного білка(ів) згідно з даЯк інгібітори IL-18 дана композиція може ним винаходом також може бути поліпшена шлявключати інгібітори каспази-1, антитіла до IL-18, хом застосування процесів кон'югації, які збільшуантитіла до будь-якої субодиниці рецептору IL-18, ють час напівжиття молекули в людському тілі, інгібітори шляху передачі сигналу з участю IL-18, наприклад, зв'язуванням молекули з поліетиленгантагоністи IL-18, які конкурують з IL-18 і блокують ліколем, як описано в патентній заявці РСТ WO рецептор IL-18, і IL-18-зв'язуючі білки, їх ізоформи, 92/13095. мутеїни, злиті білки, функціональні похідні, активні Терапевтично ефективні кількості активного фракції або похідні циркулярної перестановки, що білка(ів) є похідним від безлічі параметрів, вклюволодіють такою ж активністю. чаючи тип антагоніста, афінність антагоніста IL-18, IL-18BP і його ізоформи, мутеїни, злиті білки, будь-яку залишкову цитотоксичну активність, що функціональні похідні, активні фракції або похідні виявляється антагоністами, шлях введення, кліні 23 80396 24 чний стан пацієнта (включаючи бажаність досягДаний винахід крім того відноситься до спосонення нетоксичного рівня активності ендогенного бу лікування пошкодження ЦНС, що включає ввеIL-18). дення фармацевтично ефективної кількості інгібі«Терапевтично ефективна кількість» є такою, тору IL-18 пацієнту, потребуючому цього. при введенні якої інгібітор IL-18 приводить до інгіВсі посилання, що цитуються в даному описі, бування біологічної активності IL-18. Дозування, включаючи журнальні статті або реферати, онубяке вводять, в одній дозі або в декількох дозах ліковані або неонубліковані патенти США або заіндивіду, варіює в залежності від безлічі чинників, рубіжні патентні заявки, видані патенти СІЛА або включаючи фармакокінетичні властивості інгібітозарубіжні патенти або будь-які інші посилання пору IL-18, шлях введення, стан пацієнта і його харавністю включені в даний опис у вигляді посилання, ктеристики (стать, вік, вага тіла, стан здоров'я, включаючи всі дані, таблиці, креслення і текст, ріст), вираженість симптомів, супутнє лікування, представлений в посиланнях, що цитуються. Крім частота лікування і бажані ефекти. Кваліфіковані того, повний зміст посилальних документів, що фа хівці здатні здійснювати корекцію і маніпуляцію цитуються в посилальних документах, що привоу встановленому діапазоні доз, а також методи як дяться в даному описі, також повністю включені як in vitro, так і in vi vo для визначення інгібування ILпосилання. 18 у індивіда. Посилання на відомі стадії способів, стадії Згідно з даним винаходом інгібітор IL-18 затрадиційних способів, відомі способи або традистосовують в кількості близько 0,0001-100 мг/кг ційні способи в будь-якому випадку не є донущенабо близько 0,01-10 мг/кг ваги тіла, або близько ням того, що будь-який аспект, опис або варіант 0,1-5 мг/кг ваги тіла, або близько 1-3 мг/кг ваги втілення даного винаходу описаний, розкритий тіла, або близько 1-2 мг/кг ваги тіла. Як альтернаабо передбачений у відповідній області техніки. тива, інгібітори IL-18 можна вводити в кількості Вищенаведений опис специфічних варіантів близько 0,1-1000 мкг/кг ваги тіла або близько 1-100 втілення винаходу так повно розкриває загальну мкг/кг ваги тіла, або близько 10-50 мкг/кг ваги тіла. суть даного винаходу, що інші, застосовуючи спеШляхом введення, переважним згідно з даним ціальні знання в області техніки (включаючи зміст винаходом, є введення підшкірно. Внутрішньом'я посилальних документів, що цитуються в даному зове введення також переважне згідно з даним описі), легко можуть модифікувати і/або адаптувавинаходом. З метою введення інгібітору IL-18 безти для різного застосування такі специфічні варіапосередньо в місце його дії, також переважно його нти втілення винаходу, без надмірного експеримевводити інтракраніальним або підоболонковим нтування, без відхилення від загальної ідеї даного шляхом. Інтракраніальний шлях є особливо перевинаходу. Отже, така адаптація і модифікації маважним при відкритому пошкодженні голови (реакють на меті знаходитися в діапазоні еквівалентів тивне пошкодження головного мозку). описаних варіантів втілення винаходу, основаних У наступних переважних варіантах втілення інна вченні і керівництві, представленому в даному гібітор IL-18 вводять щодня або через день. описі. Зрозуміло, що фразеологія або термінологія Добові дози звичайно застосовують у вигляді в даному описі застосовується з метою опису, а не окремих доз або в формах з уповільненим вивільдля обмеження, так що термінологія і фразеологія ненням, ефективних для досягнення бажаних реданого опису повинна бути інтерпретована фахівзультатів. Др уге або подальші введення можуть цем в області техніки в світлі вчення і керівництва, здійснюватися в таких же дозах, менших або біпредставленого в даному описі, в комбінації зі льших в порівнянні з початковою або попередньою знаннями звичайного фахівця в області те хніки. дозою, що вводиться даному індивіду. Друге або Після опису винаходу, для більш повного його подальші введення можна вводити під час або до розуміння представлені посилання на наступні розвитку захворювання. приклади, які представлені для ілюстрації і не маЗгідно з даним винаходом інгібітор IL-18 можють на меті обмежити даний винахід. на вводити профілактично або терапевтично індиПриклади віду до, одночасно або послідовно з іншими тераМишами, що застосовуються в даному досліпевтичними заходами або агентами (наприклад, дженні, були самці у віці 8-16 тижнів, що важили прийом множини лікарських препаратів), в терапе30-35 г. їх вирощували в специфічному вільному втично ефективній кількості, особливо з інтерфевід патогенів середовищі, тримали при стандартроном і/або TNF, і/або іншим протизапальним агених умовах температури і світла в клітках по 4-6 нтом, таким як СОХ-інгібітор і/або антиоксидант. У тварин і забезпечували їжею і водою у вільному залежності від пошкодження головного мозку можрежимі. Дослідження проводили відповідно до на представити спільне введення антагоніста TNF керівництва Institutional Animal Care Committee, замість самого TNF (Shohami et al., 1999). Активні Hebrew University, Jerusalem, Israel. Експерименагенти, які вводять одночасно з іншими терапевтальне закрите пошкодження голови проводили з тичними агентами, можна вводити в ти х же самих використанням пристрою з падаючим вантажем, або в інших композиціях. розробленим раніше (Chen et al. 1996). Коротко, Даний винахід крім того відноситься до спосопісля проведення ефірної анестезії проводили бу одержання фармацевтичної композиції, що серединний подовжній розріз, шкіру розсовували і включає суміш ефективної кількості інгібітору IL-18 оголяли череп. Визначали ліву передню лобову і/або інтерферону, і/або антагоніста TNF, і/або область і туди вміщували тефлоновий конус з наСОХ-інгібітору з фармацевтично прийнятним носіконечником на ~ 1мм убік від серединної лінії, в єм. середньо-вінцевій площині. Голову фіксували, і вантаж вагою 75 г онускали на конус з висоти 18 25 80396 26 см, що приводило до локального пошкодження інтрацеребрального IL-18 між різними групами лівої півкулі. Після травми, миші одержували підтварин, всі концентрації нижче за рівень визначентримуючу оксигенацію 100% О2 не довше 2 хвиня в 5 пг/мл були оцінені як 4,9 пг/мл. Потім нерозлин, і потім їх вміщували назад в клітки. ведені зразки були вміщені в парні комірки, і була Оцінка рівнів IL-18 в головному мозку мишей розрахована їх остаточна концентрація по середДля визначення інтракраніальних рівнів IL-18, ній оптичній щільності (OD). OD визначали з допомиші лінії C57BL/6 (В6) (всього n=62) були розпомогою спектрофотометра (Dynatech Laboratories ділені на шість окремих груп: (1) «група нормальInc., Chantilly, VA) при гасінні довжини хвилі 405 ного контролю», неліковані миші лінії В6 (n=10). (2) нм. «група ефірної анестезії», мишам виробляли анеПротокол лікування IL-18BP стезію ефіром протягом 10 хвилин і обезголовлюСамців щурів Sabra лінії Hebrew University вали через 24 години (n=10) або 7 днів (n=10). (3) (n=40) застосовували для дослідження IL-18BP. «група псевдооперації»; дані миші піддавались Анестезію і експериментальну СШ проводили, як анестезії і подовжньому розрізу скальпа і були описано вище. Для протоколу лікування тварин умертвлені через 24 години (n=15) або 7 днів. (4) розділили на дві групи: в групі А («контрольна гру«група травми»; виконували експериментальну па», п=16) мишей піддали експериментальній СШ, закриту травму голови, як описано вище, і тварин через 1 годину зробили ін'єкцію тільки розчинника обезголовлювали під ефірною анестезією через 4 (PBS) і через 7 днів провели неврологічне обстегодини (n=7), 24 години (n=7) і 7 днів (n=7) після ження (дивись нижче). У групі В («група дослітравми. (5) «група ін'єкції TNF»; для оцінки можлидження», п=18), мишам вводили внутрішньочеревої ролі TNF в регуляції інтрацеребрального IL-18, винно 50мкг IL-18BP відразу ж після огляду по миші зазнавали ефірної анестезії, інтрацереброневрологічній шкалі при часі t=1 година після СНІ. вентрикулярно (i.c.v.) вводили 200нг мишачого Оскільки проникність гематоенцефалічного бар'єрекомбінантного TNF (R&G Systems, Abingdon, UK) ра підвищується в 5-6 разів між 1 і 4 годинами пісв 10 мкл стерильного фосфатно-буферного соляля СHI, як раніше було визначено в такій же ексного розчину (PBS), і мишей умертвляли через 24 периментальній моделі (Chen et al., 1996), при цих години (n=10). (6) «група псевдоін'єкції»; даним умовах IL-18BP мав доступ в головний мозок. Дві тваринам вводили i.c.v. тільки розчинник (10 мкл додаткові групи мишей лікували так само, як групи стерильного PBS) і їх умертвляли через 24 години А і В (група С: «контрольна група»; група D: «група (n=6), як контрольну груп у для тварин, яким вводослідження», відповідно), і їх обезголовлювали дили TNF. У всіх мишей після обезголовлювання через 48 годин, після цього проводили розкриття негайно видаляли головний мозок, який вмить головного мозку для оцінки посттравматичного заморожували в рідкому азоті і зберігали при -70°С набряку, як описано нижче. до проведення аналізу. Головний мозок з групи Оцінка неврологічних порушень травми був розділений на ліву (іпсилатеральну) і Для оцінки посттравматичних неврологічних праву (контралатеральну) півкулю з метою провепорушень була розроблена і затверджена шкала дення порівняння рівнів IL-18 в пошкодженій і неNeurological Severity Score (NSS) (Stahel et al., пошкодженій півкулі. Гомогенізацію тканин прово2000). дили за допомогою Polytron (Kinematica, Kriens, Шкала складається з 10 індивідуальних клінічSwitzerland), використовуючи розведення 1:4 в них завдань на моторну функцію, швидкість реаккрижаному екстракційному буфері (мас/мас), що ції і фізіологічну поведінку, де один бал привласмістить 50 мМ Тріс (рН 7,2), 150 мМ NaCl, 1% Triнюється за невиконання завдання і нуль балів за ton-X-100 (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Switzerуспішне виконання (Таблиця 4). Максимум NSS в land) і суміш інгібіторів протеаз (Boehringer 10 балів свідчить про тяжку неврологічну дисфунMannheim). Гомогенат струшували на льоду протякцію, з невиконанням всіх завдань, тоді як нуль гом 90 хвилин і потім центрифугували протягом 15 балів досягається здоровими мишами без пошкохвилин при 3000 x g і 4°С. Потім надосадову рідиджень. NSS через 1 годину після травми відобрану ділили на рівні частини і зберігали при -70°С до жає початкову тяжкість пошкодження і високо копроведення аналізу. Концентрацію загального білрелює з клінічним результатом (Beni-Adani et al., ка в екстрактах головного мозку вимірювали мето2001). Оцінку проходження завдань проводили дом Bradford (Bio Rad Laboratories, Munich, Gerдвоє дослідників, які не знали групи дослідження, many) і виявили, що вона була постійною у всіх через 1 годину, 24 години, 72 години і 7 днів після оцінюваних мишей (12,1±2,1 мг/мл; cepeflHe±SD). експериментальної СШ. Δ NSS, що розраховуєтьВизначення кількісних рівнів інтрацеребральних ся як різниця між NSS при t=l година і NSS в будьцитокінів проводили методом ELISA, специфічним якій більш пізній часовій точці, є параметром, який для мишачого IL-18, відповідно до інструкцій вировідображає міру спонтанного відновлення після бника (R&G Systems, Abingdon, UK). Чутливість пошкодження головного мозку, як описано раніше аналізу становила 5 пг/мл. Для порівняння рівнів (Chen et al., 1996). 27 80396 28 Таблиця 4 Шкала Neurological Severity Score (NSS) для мишей з пошкодженням голови Завдання Опис Здатність і ініціатива вийти з кола діаметром 30 см протягом 3 хвилин Парез верхньої і/або нижньої кінцівки на контралатеМоно-/Геміпарез ральній стороні Швидкість реакції, ініціатива і моторна здатність хоХодьба по прямій дити по прямій Природжений рефлекс; миша відскакує у відповідь на Рефлекс переляку гучний плеск в долоні Фізіологічна поведінка як знак «інтересу» в навколиШукаюча поведінка шньому середовищі Балансування на перекладині Здатність балансувати на перекладині шириною 7 мм протягом як мінімум 10 секунд Балансування на круглій пали- Здатність балансувати на круглій паличці діаметром 5 чці мм протягом як мінімум 10 секунд Здатність пройти 30 см в довжину по балці, шириною Ходьба по балці: 3 см 3 см Те ж завдання, підвищеної складності, на балці, шиХодьба по балці: 2 см риною 2 см Ходьба по балці: 1 см Те ж, підвищеної складності, на балці шириною 1 см Максимальний бал Вихід з кола Оцінка набряку мозку Вираженість набряку мозку оцінювали шляхом визначення вмісту води в тканинах пошкодженої півкулі, як описано раніше (Chen et al., 1996). Коротко, мишей піддавали анестезії, як описано вище через 48 годин після травми, що відповідало часовій точці, в якій набряк все ще залишається істотним в даній модельній системі (Chen et al., 1996). Після обезголовлювання видаляли мозочок і стовбур мозку і одержували сегмент кори головного мозку вагою ~20 мг з ділянки, що межує з місцем пошкодження, і з контралатеральної півкулі. Праву (непошкоджену) півкулю використали як внутрішній контроль. Зрізи тканини зважували і висушували протягом 24 годин при 95°С. Після зважування «сухи х» зрізів розраховували процентний вміст води в головному мозку, як %H2O = [(волога маса-суха маса)х100]/волога маса Пацієнти з пошкодженням головного мозку У дане дослідження були включені 10 пацієнтів з ізольованою тяжкою СHI (середній вік ± SD: 37 ± 10 років; діапазон 24-57 років; 9 чоловіків і 1 жінка), доставлені в травматологічне відділення University Hospital Zurich. Всі пацієнти мали оцінку по шкалі коми Глазго (GCS) < 8 після серцеволегеневої реанімації (Teasdale and Jennett, 1974). Після КТ-дослідження, всім пацієнтам були встановлені інтравентрикулярні катетери для терапевтичного дренування цереброспінальної рідини (CSF) при підвищенні внутрішньочерепного тиску (ІСР) вище за 15 мм рт. ст. Жоден з пацієнтів не одержував лікування стероїдами. Пацієнтів з множинними пошкодженнями, які вимагали втручань з приводу суп утніх пошкоджень грудної клітини, черевної порожнини, порожнини таза, спинного мозку або переломів довгих кісток, виключали з дослі Бали за виконання/не виконання 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 10 дження. Індивідуальний вихід оцінювали, використовуючи шкалу Glasgow Outcome Scale (GOS) (Jennett and Bond, 1975). Протокол дослідження зразків CMP і сироватки був затверджений Ethics Board Committee, University Hospital, Zurich. Збір зразків і аналіз IL-18 Зразки CMP і відповідні зразки сироватки у пацієнтів з СНІ (n=10) одержували щодня в один фіксований час. Контрольну СМР одержували від пацієнтів, які піддавалися діагностичній спинномозковій нункції (n=5). Дані пацієнти не мали ознак запальних захворювань ЦНС, на основі нормальних рівнів в СМР білка, глюкози і кількостей клітин (дані не представлені). У групі СНІ відбирання зразків здійснювали протягом 10 днів після травми, крім тих випадків, коли вентрикулярний катетер видаляли раніше, наприклад, у випадках, коли ІСР залишалося в нормальних межах (< 15 мм рт. ст.) протягом більше 24 годин. Всього 106 відповідних зразків СМР і сироватки було одержано у пацієнтів з травмами, що беруть участь в даному дослідженні. Всі зразки центрифугували відразу ж після одержання, ділили на рівні частини і заморожували при -70°С до проведення аналізу. Кількісне визначення рівнів IL-18 в СМР і сироватці проводили методом ELISA, специфічним для людського IL-18, застосовуючи комерційно доступні набори (R&D Systems, Abingdon, UK). Як і для аналізу у мишей, чутливість ELISA становила 5 пг/мл, і остаточну концентрацію IL-18 розраховували на основі середньої оптичної щільності, що визначається в парних зразках при гасінні довжини хвилі 405 нм. Для порівняння рівнів IL-18 в СМР між пацієнтами з СНІ і групою контролю, всі концентрації нижче за межу визначення 5 пг/мл були оцінені як 4,9 пг/мл. Аналіз даних 29 80396 30 Статистичний аналіз даних проводили за до24 годин (22,1 ± 6,9 нг/мл; n=10) в порівнянні з конпомогою комерційно доступного програмного затрольною групою з «псевдо» ін'єкцією через 24 безпечення (SPSS 9,0 для Windows™). Непарамегодини (53,6 ± 3,9 нг/мл; р< 0,001). Рівні IL-18 в тричний критерій Mann-Whitney-U застосовували «групі TNF» були навіть нижчими, ніж у неліковадля аналізу даних, що не мають нормального розних нормальних мишей (27,7 ±1,7 нг/мл), хоча в поділу, таких як оцінка по неврологічних шкалах цьому випадку різниця не була статистично досто(NSS і Δ NSS). Непарний t-критерій Ст'юдента завірною (р=0,45). стосовували для порівняння інтрацеребральних Приклад 2 концентрацій IL-18 в різних група х мишей і для Ефект від лікування IL-18BP на неврологічне аналізу різниці у вмісті води в головному мозку у відновлення після травми мишей, лікованих IL-18BP в порівнянні з мишами, З метою вивчити гіпотезу, що інгібування IL-18 яким вводили розчинник. Порівняння рівнів IL-18 у може полегшувати відновлення при пошкодженні людей, як в щоденній СМР в порівнянні з відповідголовного мозку, порівнювали відновлення в різні ними зразками сироватки у пацієнтів з СШ, так і часові точки після однієї ін'єкції IL-18BP. Раніше СМР при травмі в порівнянні з групою контролю, було показано, що оцінка по шкалі Neurological проводили, застосовуючи загальну лінійну модель Severity Score (NSS) через 1 годину після травми для повторних вимірювань ANOVA. Статистично найбільш точно відображає вираженість травми і значущим був прийнятий р-критерій < 0,05. корелює з об'ємом пошкоджених тканин, що видно Результати при МРТ і при гістологічному дослідженні. Приклад 1 З метою одержання груп тварин з порівнянною Інтрацеребральні рівні IL-18 v мишей травмою, миші були розподілені на різні групи ліЯк показано на Фіг.1, IL-18 визначався метокування після початкової оцінки по шкалі NSS при дом ELISA в гомогенатах головного мозку у неліt=l година. Як показано на Фіг.2 (NSS в групі ILкованих («нормальних») контрольних мишей лінії 18BP (квадрати) проти Контролю (кола), обидві В6 (n=10), із середнім рівнем 27,7 ± 1,7 [±SEM] групи мали схожий початковий рівень NSS (1 год.) нг/мл. В експериментальних групах, стимуляція (7,69 ± 0,3023 і 7,44 ±0,3627 контроль і IL-18BP тільки ефірною анестезією або в поєднанні з «повідповідно), свідчачи про порівнянну тяжкість помилковою» операцією (наприклад, ефірна анестешкодження. зія і подовжній розріз скальпа) приводили до істотОцінка по NSS в більш пізній час (1-7 днів) виного підвищення рівня інтракраніального IL-18 до явила, що тварини, ліковані IL-18BP внутрішньо48,9 ±1,1 нг/мл («ефірна» група, n=8) і 54,3 ± 2,7 черевинно (і.р.) мають відносно менше неврологінг/мл («псевдо» група, n=13), відповідно (р