Кристалічна форма анти-egfr антитіл – mab с225 і mab h425 (emd 72000)

1. Кристал анти-EGFR антитіла та/або одного з його варіантів та/або фрагментів, який в результаті забезпечує одержання біологічно активного білка антитіла шляхом розчинення або суспендування у водному середовищі, який одержують шляхом осадження антитіла та/або одного з його варіантів та/або фрагментів, розчинених або суспендованих у водному середовищі, за допомогою осаджувального реагенту, який відрізняється тим, що анти-EGFR антитіло вибирають з Mab с225 (цетуксимаб) або Mab h425 2. Кристал за (EMD 72000). пунктом 1, який відрізняється тим, що як осаджувальний реагент використовують солі, полімери та/або органічні розчинники. 3. Кристал за пунктом 2, який відрізняється тим, що як осаджувальний реагент використовують 2 (19) 1 3 84893 Винахід відноситься до твердих форм антитіл проти рецептора EGF (EGFR), зокрема до преципітатів і кристалів моноклональних антитіл проти рецептора EGF, особливо переважно Mab C225 (цетуксимаб) і Mab h425 (EMD 72000), які призводять до одержання біологічно активного білка антитіла при розчиненні або суспендуванні у водному або неводному середовищі, які одержують за допомогою осадження антитіла та/або одного з його варіантів та/або фрагментів, розчинених або суспендованих у водному середовищі при використанні осаджувального реагенту. Винахід також відноситься до фармацевтичних препаратів, які містять принаймні одну тверду форму згаданих вище антитіл в осадженій некристалічній, осадженій кристалічній або у розчиненій чи суспендованій формі, і необов'язково наповнювачі та/або допоміжні речовини, та/або додаткові фармацевтичні активні інгредієнти, а також до способу одержання твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом. Успіхи в галузі біотехнології робили можливим впродовж останніх 10 років одержання низки білків для фармацевтичного застосування за допомогою методик рекомбінантної ДНК. Білкові лікарські засоби, такі як моноклональні антитіла, використовують, наприклад, у терапії пухлин, наприклад для специфічної імунотерапії або пухлинної вакцинації. Терапевтичні білки є більш великими і складнішими, ніж традиційні органічні та неорганічні активні інгредієнти, вони мають складні тривимірні структури і численні функціональні групи, які визначають біологічну активність білка або, альтернативно, можуть викликати небажані ефекти. У процесі одержання, зберігання та транспортування білкові лікарські засоби зазнають численних екзогенних впливів, які можуть мати дію, що знижує стабільність, на білковий активний інгредієнт. Таким чином, необхідно досконало вивчити випадки та механізми специфічних реакцій розкладу для того, щоб зробити можливою стабілізацію білка, наприклад, шляхом додавання певних стабілізувальних допоміжних речовин [дивись, наприклад, Manning M.C, Patel K., і Borchardt RT. (1989) Стабільність білкових лікарських засобів. Pharm. Res. 6, 903918]. Літературні джерела розкривають численні композиції терапевтичних білків. Однак вимоги до композицій фармацевтичних препаратів білкових активних інгредієнтів можуть бути доволі різними, і у загальному випадку не є можливим застосовувати вже наявні білкові композиції для нових білкових активних інгредієнтів з причини специфічних фізико-хімічних властивостей і реакцій розкладу різних білків. Прийнятні фармацевтичні композиції та стабільні форми цих нових активних інгредієнтів, таким чином, залишаються основною проблемою. Хімічна нестабільність відрізняється ковалентними модифікаціями білка. Первинна структура білка змінюється при розриві, утворенні або по 4 вторному утворенні хімічних зв'язків. Знову утворена речовина у загальному випадку повністю відрізняється за біологічною активністю від вихідного природного білка. Фізична нестабільність модифікує просторове розташування молекули (вторинна, третинна і четвертинна структура) за відсутності руйнування ковалентних зв'язків. Ця нестабільність може бути поділена на денатурацію, асоціацію, агрегацію, осадження або адсорбцію. Фізична нестабільність являє собою часте явище, зокрема у разі відносно великих білків. Преципітати являють собою макроскопічно видимий еквівалент агрегатів і утворюються механістичним чином кластерами агрегатів або асоціатів. При перевищенні межі розчинності і завдяки осадженню пластівці стають видимими, починаючи від діаметру приблизно 10мкм, за допомогою світлового мікроскопу і, починаючи від приблизно 50мкм, неозброєним оком. Агрегація білків може являти собою оборотний або необоротний процес [дивись, наприклад, Cleland J.L., Powell M.F. і Shire SJ. (1993)] Розробка стабільних білкових композицій: широкий погляд на агрегацію білків, дезамінування та окислення. [Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 10, 307-377]. Хоча існуюча лі тература описує осадження білків із солями, полімерами та органічними розчинниками як стандартний спосіб для очищення білків ([Scopes R.K. (1997)] Поділ за допомогою преципітації. В: Очи щення білків: Правила і практика [(ред. Scopes R.K.), 2-е вид., стор.41-71. Springer Verlag, New York]), однак використання цього способу звичайно призводить, особливо у разі імуноглобулінів, до денатурації, асоційованого з цим зниження активності і незначного кількісного виходу, зокрема при використанні солей та органічних розчинників ([Phillips A.P., Martin K.L., і Horton W.H. (1984)] Вибір способів для очищення імуноглобуліну IgG: Ви хід, чисто та і активність антитіла. [Journal of lmmunological Methods 74, 385-393]). При використанні поліетиленгліколю (ПЕГ), у противагу цьому, були досягнуті кращі результати ([A. Poison, G. M. Potgieter, J. F. Largier і G. E. F. Joubert, F. J. Mears]. Фракціонування білкових сумішей при використанні лінійних полімерів з високою молекулярною масою. [Biochim. Biophys. Acta 82: 463-475,1964]). Кристали білків є відомими для процесів очищення (технологія виробництва і виділення цільового продукту), краще ферментів, і для визначення третинної структури білків за допомогою рентгеноструктурного аналізу (R. K. Scopes. Аналіз на чистоту: кристалізація. В: Очищення білків: правила і практика, [за ред. R. K. Scopes, New York: Springer Verlag, 1997, стор.284-301]). При цьому відбувається утворення по-новому впорядкованих внутрішньомолекулярних зв'язків між білками. Це є повільним процесом зі зниженою мобільністю. Під час цього процесу знижується концентрація білка у розчині. 5 84893 Незважаючи на те, що літературні джерела описують кристалізацію білків із солями, полімерами та органічними розчинниками як стандартний спосіб визначення структури імуноглобулінів ([Harris LJ., Skaletsky E. і McPherson A. (1995)] Кристалізація інтактних моноклональних антитіл. Білки: структура, функція і генетика. [23, 285-289; Harris LJ., Skaletsky E. і McPherson A. (1998)] Кристалографічна структура інтактного IgGI моноклонального антитіла. [Journal of Molecular Biology 275, 861-872; Edmundson A.B., Guddat L.W. і Andersen K.N. (1993)] Кристалічна структура інтактних IgG антитіл. [ImmunoMethods 3, 197-210]), кристалізація інтактних, наприклад, глікозильованих антитіл, проте, є вельми складною, оскільки розмір білка, різні моделі глікозилювання індивідуальних молекул антитіла, а також асоційована з цим мікрогетерогенність і структурна гнучкість імуноглобуліну роблять упорядковане вбудовування у кристалічну решітку більш складним або навіть перешкоджають йому [McPherson A. (1999) Кристалізація біологічних макромолекул, 1-е вид. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Крім того, молекули антитіла демонструють тенденцію до агрегації, що, ймовірно, викликає великі труднощі при кристалізації [McPherson A. (1999) Кристалізація біологічних макромолекул, 1-е вид. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. На додаток, ризик денатурації антитіл під час процесів кристалізації робить кристалізацію терапевтичних антитіл непривабливою для кваліфікованого спеціаліста у цій галузі. Таким чином, до цього часу лише декілька інтактних антитіл було кристалізовано для вивчення структури, і усього лише три антитіла було до сіх пір піддано кристалізації у препаративних масштабах. Таким чином, імуноглобуліни, наведені у базі даних кристалізації біологічних макромолекул [Gilliland, G.L., Tung, M., Blakeslee, D.M. і Ladner, J. 1994., База даних кристалізації біологічних макромолекул. Редакція 3.0: Нові характеристики, дані та архів NASA для даних відносно вирощування кристалів білків. Acta Crystallogr. D50 408-413.], які вже були кристалізовані, в основному являють собою Fab і Fc фрагменти. [WO 02072636] описує кристали антитіла, які, проте, були одержані при використанні складного процесу внесення та використання детергентів, яких слід уникати, за можливістю, у фармацевтичних композиціях, і допоміжних речовин, деякі з яких є токсикологічно неприйнятними. Крім того, в описаному процесі неможна контролювати розмір часток. У контрольному експерименті (дивись Приклад 8) виявилося можливим продемонструвати факт, що описані кристали голкової форми одержують як з розчину білка, так і з негативного контролю (за відсутності білка), використовуючи процес, описаний у [WO 02072636]. З цього факту є зрозумілим, що ці кристали, ймовірно, у кращому разі являють собою білкові включення у кристалах осаджувального реагенту. Зі згаданих вище причин є зрозумілим, що кристалізація антитіл є надто складною для спеціаліста у цій галузі, і способи кристалізації, розкриті у літературі, не можуть бути застосовані до усіх 6 відомих антитіл з причини значної гетерогенності різних відомих антитіл відносно первинної, вторинної та третинної структури, їх глікозилювання та структурної гнучкості. Більш того, для кваліфікованого спеціаліста у цій галузі є неприйнятним з указаних вище причин одержувати преципітати терапевтичних антитіл, оскільки, зокрема, можна очікувати необоротну денатурацію. Задача цього винаходу, таким чином, полягала в тому, щоб відшукати стабільні форми, наприклад, преципітатів або кристалів для терапевтичних білків, зокрема, антитіл, так щоб їхня ефективність зберігалася у процесі одержання, зберігання, транспортування і застосування. Оскільки, як було згадано вище, вже існуючі композиції білка у загальному випадку не можуть бути використані для нових білкових активних інгредієнтів, додатковою задачею цього винаходу було відшукання нових стабільних композицій для моноклональних антитіл проти рецептора EGF, наприклад Mab C225 (цетуксимабу) і Mab h425 (EMD 72000). Незважаючи на те, що композиції, які містять Mab C225 (цетуксимаб) або Mab h425 (EMD 72000), описані у [WO 03053465 і WO 03/007988], композиції, розкриті у [WO 03053465], мають, проте, відносно низьку концентрацію білка і не є стабільними впродовж тривалого періоду зберігання при кімнатній температурі, а композиції, розкриті у WO 03007988, також мають низьку концентрацію білка і препарату (ліофілізату), який має відновлюватись перед застосуванням. Відповідно, додаткова задача цього винаходу полягала у відшуканні стабільного фармацевтичного препарату, який має високу концентрацію згаданих вище антитіл. Процес ліофілізації для стабілізації композицій білка розкритий, наприклад, у [WO 9300807 і WO 9822136], але істотні недоліки ліофілізованих препаратів полягають у тому, що користувач має відновлювати ліофілізат перед застосуванням, що становить значне джерело помилки при одержанні його перед застосуванням. Оскільки порівняно з рідкими композиціями додається додатковий процес одержання, цей процес є недоцільним відносно здійснення додаткової роботи для проведення процесу (підтвердження стабільності у процесі ліофілізації), приготування (ціни препарату і тривалості) і, наприклад, його атестації. Задача цього винаходу, таким чином, полягала у відшуканні рідких форм і композицій для вказаних вище антитіл, які мають підвищену стабільність до стресових умов, таких як підвищена температура, атмосферна вологість і/або зсувові сили, і не містить жодних токсикологічно неприйнятних допоміжних речовин. Несподівано було виявлено, що тверді форми і композиції, приготовані з них, не мають недоліків, згаданих у характеристиці рівня техніки. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом, описані нижче, та/або композиції, приготовані з них, несподіваним чином відрізняються однією або більше перевагами, вибраними з: високої стабільності, контрольованого розміру часток, можливості одержання нативного і біологічно активного білка після повторного розчинення або суспендування, високої чистоти, відсутності фармацевтично не 7 84893 прийнятних агентів і, таким чином, високої безпеки, доброї прийнятності і можливості безпосереднього застосування, низької тенденції до агрегації і, таким чином, можливості одержання висококонцентрованих композицій, а також низької в'язкості як композиції, так і білкової суспензії, порівняно з розчином. Процес одержання згідно з винаходом, описаний нижче, несподіваним чином відрізняється однією або більше перевагами, вибраними з: простоти, зберігання часу і засобів, застосування фармацевтично прийнятних агентів, високого виходу. Процес згідно з винаходом може, таким чином, переважно бути здійснений за допомогою значно способу, який є більш легким, зберігає час і є ефективним відносно засобів, що витрачаються, порівняно з методами, описаними в літературі, оскільки тільки додання одного осаджувального реагенту є необхідним. На додаток, осаджувальний реагент додають до розчину антитіла у прийнятній буферній системі, тобто стабілізація реакційних розчинів за допомогою додаткових допоміжних речовин, таких як, наприклад, детергенти, не є необхідною. Застосування детергентів у препаратах для парентерального введення слід було, як правило, уникати або мінімізувати, оскільки вони мають значний токсичний та імуногенний потенціал [Sweetana S. і Akers MJ. (1996) Принципи розчинності і практика для розробки парентеральних дозованих форм лікарських засобів. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50, 330342], вони також можуть призводити до зміни у вторинній структурі білків [Vermeer A.W.P. і Norde W. (2000). Вплив зв'язування сур фактантів з низькою молекулярною вагою на термальну стабільність і вторинну структуру IgG. Колоїди і поверхні А: Фізико-хімічний та інженерний аспекти 161, 139150]. Таким чином, одержані тверді форми антиEGFR антитіл можуть безпосередньо бути використані у лікарських засобах, і додаткове очищення для видалення фармакологічно неприйнятних агентів не є необхідним. У противагу цьому, кристали, одержані у [WO 02072636], мають бути звільнені від фармакологічно неприйнятних агентів, наприклад CHES, імідазолу, Трис, хлориду марганцю (II), хлориду цинку (II), сульфа ту міді (II), 2пропанолу, 2-метоїл-2,4-пентандіолу, HEPES, сульфату літію, етоксіетанолу або детергентів, таких як полісорбат 80 або 20, при використанні складного процесу, іноді буває навіть неможливо повністю видалити згадані вище неприйнятні агенти. Несподівано було виявлено, що переважно стабільні тверді форми одержують у разі, якщо антитіла проти рецептора EGF (анти-EGFR антитіла), краще моноклональні анти-EGFR антитіла, особливо краще Mab C225 (цетуксимаб) або Mab h425 (EMD 72000), інкубують при прийнятному значенні рН і прийнятній температурі у присутності прийнятного буфера при використанні певних осаджувальних реагентів, вибраних з полімерів, краще поліетиленгліколю (ПЕГ), солей, краще сульфату амонію, або органічних розчинників, краще етанолу, або їх сумішей. Несподівано було виявлено, що тверді форми анти-EGFR антитіл, краще моноклональних антиEGFR антитіл, особливо краще Mab C225 (цетук 8 симаб) або Mab h425 (EMD 72000), та/або їх варіанти чи фрагменти, одержані за допомогою процесу згідно з винаходом, є переважно нативними після повторного розчинення, а також, що їх переважно одержують з високим виходом. Винахід, таким чином, відноситься до твердих форм анти-EGFR антитіл і/або їх варіантів чи фрагментів, які призводять до одержання біологічно активного білка антитіла при розчиненні або суспендуванні у водному середовищі, який одержують за допомогою осадження антитіла та/або його варіантів та/або фрагментів, розчинених або суспендованих у водному середовищі за допомогою осаджувального реагенту, вибраного з полімерів, краще поліетиленгліколю (ПЕГ), солей, краще сульфату амонію, або органічних розчинників, краще етанолу, або їх сумішей, у присутності прийнятного буфера, при прийнятному значенні рН і прийнятній температурі. Тверді Форми анти-EGFR антитіл: Вираз «тверді форми анти-EGFR антитіла згідно з винаходом» переважно взятий для позначення преципітатів або кристалів, які призводять до одержання біологічно активного антитіла шляхом розчинення або суспендування у водному або неводному середовищі. Тверді форми згідно з винаходом одержують за допомогою осадження антитіла, розчиненого або суспендованого у водному середовищі згідно з процесом, описаним нижче. Тверді форми згідно з винаходом можуть мати розміри, що перебувають у межах мікрометрового і нанометрового діапазону. «Преципітати»: для цілей цього винаходу термін «преципітати» взятий для позначення твердих форм в аморфній некристалічній структурі або у стані агрегації чи асоціації. «Кристали»: для цілей цього винаходу термін «кристали» взятий для позначення твердих форм у кристалічній структурі. Кристалічні структури можуть бути визначені при використанні наступних процесів. «Осаджений»: для цілей цього винаходу термін «осаджений» взятий для позначення твердих форм згідно з винаходом в осадженій формі, тобто у формі преципітату або кристалу, залежно від умов процесу. «Осаджений кристалічний»: для цілей цього винаходу термін «осаджений кристалічний» або «кристалічний» взятий для позначення твердих форм згідно з винаходом в упорядкованій кристалічній структурі. «Осаджений некристалічний»: для цілей цього винаходу термін «осаджений некристалічний» взятий для позначення твердих форм згідно з винаходом в аморфній некристалічній структурі або у стані агрегації та асоціації. «Розчинений»: для цілей цього винаходу термін «розчинений» взятий для позначення твердих форм згідно з винаходом, які є розчиненими або повторно розчиненими у розчині згідно з винаходом. «Суспендований»: термін «суспендований» взятий для позначення твердих форм згідно з ви 9 84893 находом, які є суспендованими або повторно суспендованими у розчині згідно з винаходом. Для цілей цього винаходу термін «водне середовище» взятий для позначення води або сумішей води із прийнятними інертними розчинниками або іншими агентами, згаданими у Прикладі 1, такими як, наприклад, буфери, стабілізатори або допоміжні речовини, які мають таку властивість, що водне середовище згідно з винаходом саме по собі не призводить до осадження або кристалізації антитіла, а замість цього осадження або кристалізація відбуваються лише при додаванні осаджувальних реагентів згідно з винаходом. Для цілей цього винаходу термін «неводне середовище» взятий для позначення масел або сумішей масел з водою або іншими прийнятними інертними розчинниками або іншими агентами, згаданими у Прикладі 1, такими як, наприклад, стабілізатори або допоміжні речовини, які мають таку властивість, що неводне середовище згідно з винаходом саме по собі не призводить до осадження або кристалізації антитіла, а замість цього осадження або кристалізація відбуваються лише при додаванні осаджувальних реагентів згідно з винаходом. Відносно анти-EGFR антитіл згідно з винаходом і для цілей цього винаходу терміни «біологічно активний», «нативний» та «ефективний» взяті для позначення факту, що анти-EGFR антитіла згідно з винаходом здатні виявляти свій біологічний ефект навіть після перетворення на тверді форми згідно з винаходом і подальшого повторного розчинення або ресуспендування, зокрема зв'язування з EGFR, інгібування зв'язування лігандів, зокрема EGF з EGFR1 модуляцію, зокрема інгібування опосередкованої EGFR сигнальної трансдукції, та ефект відносно профілактики або терапії захворювань, опосередкованих EGFR. Зокрема, безпосереднього одержання кристалів анти-EGFR антитіл згідно з винаходом, таким чином, не передбачали, оскільки антитіла здебільшого мають високу тенденцію до агрегації, що робить упорядковане введення у кристалічну решітку більш складним або навіть запобігає її утворенню [McPherson A. (1999) Кристалізація біологічних макромолекул, 1-е вид. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Незважаючи на складнощі, які очікують спеціаліста у цій галузі при кристалізації антитіл згідно з винаходом з причини згаданої вище негомогенності відносно білкової структури, глікозилювання та структурної сегментальної гнучкості, яка існує навіть у межах видів антитіл, несподівано відмінні результати були досягнуті за допомогою процесу згідно з винаходом. Висока стабільність одержаних кристалів антитіл згідно з винаходом також не відрізняється ані зміною форми часток, ані діапазоном розмірів часток, який слід розглядати як критичний відносно імуногенних побічних ефектів, ані змінами первинної структури або вторинної структури одержуваного білка. Спосіб згідно з винаходом, таким чином, забезпечує перевагу, яка полягає в тому, що розмір одержаних кристалів є переважно контрольованим, при цьому переважно одержують стабільні тривимірні кристали. Розмір кристалів може 10 перебувати у микрометровому і нанометровому діапазоні. «Анти-EGFR антитіла»: анти-EGFR антитіла згідно з винаходом переважно являють собою моноклонапьні антитіла і такі, що мають походження від миші або людини, а також химерні або гуманізовані антитіла. Антитіло, спрямоване проти рецептора епідермального фактору росту (EGFR), зокрема, являє собою Mab С225 (цетуксимаб) або Mab h425 (EMD 72000) та/або їх варіанти чи фрагменти. Додаткові антитіла проти EGFR описані, наприклад, у [EP 0586002 і у J. Natl. Cancer lnst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528)]. Mab C225 (цетуксимаб. Ербітукс™): Mab C225 (цетуксимаб) являє собою клінічно схвалене антитіло, яке зв'язується з рецептором EGF. Mab C225 (цетуксимаб) являє собою химерне антитіло, варіабельні ділянки якого мають мишаче походження, а константні ділянки - походження від людини. Це антитіло було вперше описане [Naramura та ін., Cancer Immunol, lmmunotherapy 1993, 37: 343-349, і у WO 96/40210 А1]. Mab h425 (EMD 72000): Mab h425 (EMD 72000) являє собою гуманізоване моноклональне антитіло (Mab), одержане з мишачого анти-EGFR антитіла 425 (Mab 425) [EP 0531472]. Ми шаче моноклональне антитіло Mab 425 було розроблене на лінії клітин карциноми людини А431, оскільки тут воно зв'язується з позаклітинним епітопом рецептора епідермального фактору росту (EGFR). Було виявлено, що воно інгібує зв'язування EGF [Murthy та ін., 1987]. Підвищена експресія EGFR була виявлена у злоякісних тканинах, одержаних з різних джерел, і, відповідно, Mab 425 є можливим активним інгредієнтом для діагностики і терапевтичного лікування пухлин людини. Так, було виявлено, що Mab 425 опосередковує пухлинну цитотоксичність in vitro і супресує п ухлинний ріст лінії клітин епідермоїдних і колоректальних карцином in vitro [Rodeck та ін., 1987]. На додаток до цього, було показано, що Mab 425 зв'язується з ксенотрансплантатами людських злоякісних гліом у мишей [Takahashi та ін., 1987]. Гуманізовані та химерні форми цього антитіла було розкрито, наприклад, у [EP 0531472; Kettleborough та ін., Білкова інженерія, 1991, 4: 773-783; Bier та ін., Cancer Chemother Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier та ін., Cancer Immunol, lmmunother. 1998, 46: 167-173]. Mab h425 (EMD 72000) являє собою гуманізоване антитіло (h425), яке перебуває на клінічній фазі І/ІІ, його константні ділянки складаються з к і людського γ-1 ланцюга [EP 0531472]. Людське анти-EGFR антитіло може бути одержане за допомогою методики XenoMouse, як описано у [WO 9110741, WO 9402602 і WO 9633735]. Антитіло, яке проходить у цей час клінічні випробування і було одержане згідно з цією методикою, являє собою, наприклад, ABX-EGF [Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38:17-23; Cancer Research 1999, 59:1236-43]. Антитіло: антитіло або імуноглобулін використовують у найширшому смислі для цілей цього винаходу і відноситься, зокрема, до поліклональних антитіл і мультиспецифічних антитіл (наприклад, біспецифічних антитіл) і, зокрема, переважно 11 84893 інтактних моноклональних антитіл (Mab), які є біологічно активними, їх варіантів чи фрагментів. Термін також охоплює гетероантитіла, які складаються з двох або більше антитіл чи їх фрагментів і/або мають різні зв'язувальні специфічності і зв'язуються одне з одним. Залежно від амінокислотної послідовності їх константних ділянок антитіла можуть відноситись до різних класів антитіл (імуноглобулінів): IgA, IgD, IgE, IgG і IgM. Цей ряд може бути поділений далі на підкласи (ізотипи), наприклад IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 і ІgА2. Антитіла звичайно мають молекулярну вагу приблизно 150 кДа і складаються з двох ідентичних легких ланцюгів (L) і двох ідентичних важких ланцюгів (H). Моноклональні антитіла одержують з популяції гомогенних клітин. Вони є високо специфічними і спрямовані проти одного епітопу, в той час як поліклональні антитіла охоплюють різні антитіла, які спрямовані проти різних епітопів. Способи одержання моноклональних антитіл вміщують, наприклад, гібридомний спосіб, описаний Kohler і Milstein [Nature 256, 495 (1975)], а також у [Burdon та ін., (1985) «Технологія моноклональних антитіл, одержання і характеристика гібридом гризунів і людей», вид. Лабораторні способи в біохімії і молекулярній біології, том 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam]. Вони можуть бути одержані, зокрема, за допомогою відомих способів рекомбінантної ДНК [дивись, наприклад, US 4816567]. Моноклональні антитіла також можуть бути ізольовані з бібліотеки фагових антитіл, наприклад за допомогою методик, описаних у Clackson та ін. [Nature, 352: 624-628 (1991)] і Marks та ін. [J. Моl. ВіоІ., 222: 58,1-597(1991)]. Варіанти та фрагменти: варіанти (мутеїни) антитіл являють собою структурно споріднені білки, наприклад такі, що можуть бути одержані шляхом модифікації первинної послідовності (амінокислотної послідовності), глікоінженерії (варіанти сайтів глікозилювання або структур, а також деглікозильовані білки), за допомогою ПЕГілювання, шляхом одержання у модифікованих хазяйських клітинах або за допомогою інших методик. Варіанти згідно з винаходом не обмежені наведеними вище прикладами, а вміщують усі варіанти антитіл згідно з винаходом, що є відомими спеціалістові у цій галузі. Фрагменти (часткові сегменти) антитіл являють собою продукти розщеплення одержаних антитіл, наприклад, за допомогою обмеженого ферментативного перетравлювання за допомогою папаїну, пепсину та плазміну, або шляхом одержання часткових сегментів при використанні генетичної інженерії. Типові часткові сегменти являють собою, наприклад, бівалентний фрагмент F(ab')2, моновалентний фрагмент Fab і фрагмент Fc [Lottspeich F., H. Zorbas (ред.). Bioanalytik, Heidelberg; Berlin: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, (1998) стор.1035]. Фрагменти згідно з винаходом не обмежуються наведеними вище прикладами, а вміщують усі фрагменти антитіл згідно з винаходом, що відомі спеціалістові у цій галузі. Фармацевтичні препарати: термін «фармацевтична композиція» і «фармацевтичний препарат» 12 використовують як синоніми для цілей цього винаходу. Як використовують у цій заявці термін «фармацевтично стерпний» відноситься до лікарських засобів, осаджувальних реагентів, наповнювачів, допоміжних речовин, стабілізаторів, розчинників та інших агентів, які сприяють введенню фармацевтичних препаратів ссавцеві у відсутності небажаних побічних ефектів, таких як блювота, запаморочення, проблеми з перетравлюванням їжі або тому подібне. Якщо фармацевтичні препарати призначені для парентерального введення, то існує вимога відносно ізотонічності, еугідрії, стерпності та безпеки композиції (низька токсичність), використовуваних допоміжних речовин і первинної упаковки. Несподівано було виявлено, що тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом у кращому разі мають перевагу, яка полягає в тому, що є можливим безпосереднє застосування, оскільки використовувані осаджувальні реагенти являють собою фізіологічно стерпні агенти і, таким чином, додаткові етапи очищення для видалення токсикологічно неприйнятних агентів, таких як, наприклад, високі концентрації органічних розчинників або інших токсикологічно неприйнятних допоміжних речовин, не є необхідними перед застосуванням твердих форм згідно з винаходом у фармацевтичних композиціях. Одержання твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом переважно з одночасним високим виходом нативного і фармацевтично прийнятного білка високої чистоти є, таким чином, простим, таким, що економить час, і недорогим. Винахід, таким чином, також відноситься до способу одержання твердої форми анти-EGFR антитіла згідно з винаходом і/або одного з його варіантів і/або фрагментів, який призводить до одержання біологічно активного білка антитіла, шляхом розчинення або суспендування у водному середовищі, який відрізняється тим, що антитіло та/або його варіанти та/або фрагменти, розчинені або суспендовані у водному розчині, осаджують за допомогою осаджувального реагенту, а продукт осадження відокремлюють. Осаджувальні реагенти, які використовують у способі згідно з винаходом, переважно являють собою полімери, зокрема краще поліетиленгліколь (ПЕГ), солі, зокрема сульфат амонію, або органічні розчинники, зокрема краще етанол. Тверда форма анти-EGFR антитіла згідно з винаходом може бути одержана шляхом додавання реагентів осадження згідно з винаходом, згаданих у Прикладі 1, краще полімерів, таких як особливо краще поліетиленгліколь (ПЕГ) у концентрації від 0,1 до 99,9% (мас/об.), який має середню молекулярну вагу 200-80000, краще від 400 до 20,000, особливо краще 400-8000; солей, таких як, зокрема, краще сульфат амонію у концентрації 0,1-4,5M, тригідрат ацетату натрію у концентрації 0,1-4,5M, дигідрат цитрату динатрію у концентрації 0,1-1,5M, фосфат калію у концентрації 0,1-1,2M, хлорид калію у концентрації від 0,1 до 4,7M, хлорид натрію у концентрації від 0,1 до 6,1M, гідрофосфат дикалію у концентрації від 0,1 до 13 84893 3,0M, дигідрат гідрофосфату динатрію у концентрації від 0,1 до 0,5M, або органічних розчинників, таких як особливо краще етанол у концентрації 0,1-99,9% (об./об.), або їх сумішей, а також допоміжних речовин, буферів і/або стабілізаторів, до розчину, що містить антитіла згідно з винаходом у періодичному процесі, та інкубації суміші при значеннях рН і температурах, згаданих у Прикладі 1. З цією метою визначені обсяги маткових розчинів, які містять осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори, згадані у Прикладі 1, у визначеній концентрації переважно додавали до розчину, що містить визначені концентрації EGFR антитіл (від 0,01 до 150мг/мл, краще від 2 до 100мг/мл, зокрема краще приблизно 520мг/мл), як одержані у своєму препараті, і необов'язково розводили водою або буфером (наприклад, цитратним або фосфатним буфером, у концентрації від 1мМ до 200мМ, краще від 2 до 20мМ, особливо краще приблизно 10мМ; також з додаванням агентів ізотонічності, таких як, наприклад, хлорид калію, хлорид натрію у концентрації 11000мМ, краще 40мМ-310мМ) до попередньо розрахованої концентрації. Альтернативно, осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та стабілізатори згідно з винаходом можуть також додаватися у твердій формі. Якщо антитіла самі по собі перебувають у твердому агрегатному стані, наприклад у вигляді ліофілізату, то тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом можуть бути одержані шляхом початкового розчинення антитіл згідно з винаходом у воді або водному розчині, що містить один або більше додаткових інгредієнтів, і подальшого додавання визначених об'ємів маткових розчинів, що містять осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори, згадані у Прикладі 1, у визначеній концентрації. Осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори згідно з винаходом можуть на додаток також додаватись у твердому агрегатному стані. Антитіла згідно з винаходом можуть переважно безпосередньо розчинятись у розчині, що містить усі осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори. Винахід також охоплює всі гідрати, солі та похідні згаданих вище агентів, що є відомими і доступними для спеціаліста у цій галузі. Один або більше агентів, згаданих у винаході, можуть переважно додаватись під час або після завершення процесу осадження і можуть необов'язково видалятись знову для того, щоб, наприклад, здійснити додатковий етап очищення. Один або більше реагентів осадження, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори, згадані у винаході, можуть переважно додаватись під час або після завершення процесу одержання антитіла. Це можна переважно здійснювати шляхом розчинення антитіла згідно з винаходом безпосередньо у водному розчині, що містить один, безліч або всі додаткові осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори на заключному етапі очищення, який здійснюють після його одержання. Для одержання фармацевтичного препарату згідно з винаходом відповідний(і) дода 14 тковий(і) інгредієнт(и) потім лише має(ють) бути доданий(і) у відповідним чином менших кількостях або не додаватиметься(руться) взагалі. Є особливо кращим, якщо відповідний інгредієнт розчинений у водному розчині, що містить усі додаткові осаджувальні реагенти, допоміжні речовини, буфери та/або стабілізатори на заключному етапі очищення антитіла після його одержання. Таким чином, у кращому разі може бути одержаний розчин, який упаковують або ліофілізують безпосередньо. Одержаний розчин, що містить відповідне антитіло, доводять до значення рН від 4 до 10, краще від 5 до 9, стерильно фільтрують і, якщо це є необхідним, піддають сублімаційному сушінню. Реакцію здійснюють за допомогою способів, відомих спеціалістові у цій галузі у прийнятному розчиннику, зокрема в інертному розчиннику. Прийнятні інертні розчинники являють собою етанол, гліцерин, суміші з водою або чисту воду, або воду, яка містить інші допоміжні речовини, такі як, наприклад, солі, що мають буферну дію або дію, що регулює ізотонічність. Особливу перевагу надають воді. Спосіб, описаний у цій заявці, може, зокрема, переважно бути здійснений у періодичному форматі. Тверді анти-EGFR антитіла згідно з винаходом та/або їх варіанти та/або фрагменти, одержані способом згідно з винаходом, можуть, зокрема, переважно перетворюватись на біологічно активний білок антитіла шляхом розчинення або суспендування у водному середовищі. З цією метою антитіла та/або один з їх варіантів і/або фрагментів, розчинені або суспендовані у водному розчині, зокрема, переважно осаджують за допомогою осаджувального реагенту, згаданого у Прикладі 1, і реагент осадження відокремлюють. Залежно від вибору концентрації осаджувального реагенту одержують або аморфні преципітати, або кристали. Преципітати переважно одержують при відносно високій концентрації осаджувального реагенту, в той час як кристали переважно одержують при відносно низькій концентрації осаджувального реагенту. В результаті прийнятного вибору концентрації осаджувального реагенту, концентрації білка та інших агентів згідно з винаходом, значення рН і температури реакція може бути, таким чином, здійснена у бажаному напрямку. Приклади 2 і 3 забезпечують ілюстративні умови кристалізації для Mab C225 (Ербітукс™), а Приклади 4 і 5 забезпечують ілюстративні умови осадження. Процес осадження згідно з винаходом і процес кристалізації згідно з винаходом можуть також бути поєднані. Прийнятні значення температури реакції складають від -10 до 40°C, краще від 0 до 25°С і особливо краще від 4 до 20°C. Використовуваний тиск краще складає від 1 до 20бар, зокрема краще являє собою атмосферний тиск. Використовуване значення рН краще складає від 4 до 10. Тривалість реакції залежить від вибраних умов. Звичайно тривалість реакції складає від 0,5 години до 10 днів, краще від 1 до 24 годин, особливо краще від 2 до 12 годин. Термін «сольвати твердих форм» згідно з винаходом взятий для позначення адукції молекул 15 84893 інертного розчинника на твердих формах згідно з винаходом, які утворюються завдяки їх взаємним силам притягання. Сольвати являють собою, наприклад, гідрати, такі як моногідрати або дигідрати, або алкоголяти, тобто адитивні сполуки зі спиртами, такими як, наприклад, етанол. Одержані тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом можуть бути відокремлені від відповідного розчину, в якому вони одержані (наприклад, шляхом центрифугування і промивання), і після відокремлення можуть бути покладені у різні розчини, вони також можуть залишатись безпосередньо у вигляді препарату розчину. Одержані тверді форми згідно з винаходом можуть також бути покладені у бажані розчинники для визначеного застосування. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом є переважно біологічно активними після повторного розчинення або повторного суспендування, і денатурація антитіл переважно не відбувається під час процесу згідно з винаходом. Біологічна ефективність білка, таким чином, переважно зберігається. Несподівано також було виявлено, що стабільні фармацевтичні композиції можуть бути одержані за допомогою твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом. Ці композиції переважно мають більш високу стабільністьдо фізикохімічних впливів, таких як, наприклад, окислення, механічні стреси, несприятливі значення рН і температури, ніж традиційні білкові розчини антитіл. Порівнювану стабільність інакше звичайно досягають лише за допомогою дорогих тривалих способів, таких як, наприклад, додавання стабілізаторів, зберігання при низькій температурі, заморожування або сублімаційне сушіння. Висока стабільність переважно сприяє більш простому і менш дорогому зберіганню, транспортуванню та одержанню фармацевтично цінних композицій, таких як, наприклад, композиції, готові до споживання, композиції, які мають відкладене вивільнення активного інгредієнта або контрольоване вивільнення впродовж тривалого періоду часу. Винахід, таким чином, також відноситься до твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом у вигляді стабільних при зберіганні лікарських засобів. Винахід, зокрема, переважно також відноситься до фармацевтичних препаратів, які містять принаймні одну тверду форму анти-EGFR антитіла згідно з винаходом в осадженій некристалічній, осадженій кристалічній або у розчиненій чи суспендованій формі, а також необов'язково наповнювачі та/або допоміжні речовини та/або додаткові фармацевтично активні інгредієнти. Фармацевтичні препарати згідно з винаходом можуть, таким чином, вміщувати тверді форми згідно з винаходом в осадженій формі, тобто у вигляді преципітату або кристалу, або у повторно розчиненій чи ресуспендованій формі. Винахід, таким чином, також відноситься до фармацевтичних препаратів, які містять принаймні один преципітат і/або кристал анти-EGFR антитіла, краще моноклонального анти-EGFR антитіла, особливо краще Mab С225 (цетуксимаб) або Mab h425 (EMD 72000) і/або їх варіантів і/або фрагментів в оса 16 дженій, повторно розчиненій чи ресуспендованій формі, а також необов'язково наповнювачі та/або допоміжні речовини та/або додаткові фармацевтично активні інгредієнти. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом переважно дозволяють одержувати високо концентровані композиції за відсутності несприятливої або небажаної агрегації антитіл згідно з винаходом або небажаної виникаючої високої в'язкості, як можна спостерігати у разі традиційних високо концентрованих білкових розчинів. Таким чином, готові до споживання розчини, що мають високий вміст активного інгредієнта, можуть бути повторно розчинені або ресуспендовані у водних розчинниках або у водному середовищі за допомогою твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом. Надто високо концентровані композиції білкових активних інгредієнтів у цей час є вельми необхідними. Більшість антитіл, які використовують для терапії, використовують у дозах у діапазоні мг/кг. Висока доза і невеликі об'єми, які вводяться (наприклад, від приблизно 1 до 1,5мл для підшкірного введення), становлять потребу у високо концентрованих білкових препаратах, які мають концентрації більші ніж 100мг/мл. На додаток до цього, високо концентровані білкові композиції можуть мати значні переваги у попередніх клінічних дослідах для вивчення прийнятності та ефективності in vitro та in vi vo (на тваринних моделях), у клінічних дослідах із вивчення прийнятності та ефективності у людей і при клінічному застосуванні у продукті (зокрема, для підшкірного введення). їх переваги полягають, зокрема, у відносно невеликому об'ємі препарату, що використовується. На противагу інфузії або ін'єкції білкових лікарських засобів з відносно низькою концентрацією, заявлені препарати дозволяють, наприклад, здійснювати підшкірне введення білкових лікарських засобів пацієнтові. Підшкірне введення білкових лікарських засобів може мати різні причини. Наприклад, специфічне націлювання у зв'язку з «терапевтичним вікном» може бути бажаним. Крім того, підшкірне введення має перевагу, яка полягає в тому, що пацієнт може здійснювати введення самостійно, не покладаючись при цьому на медичний персонал. Приклад інсуліну ясно демонструє ці переваги. Однак оскільки ін'єкції для підшкірно введення можуть мати максимальний обсяг 11,5мл, високо концентровані білкові композиції, які містять більше ніж 100мг/мл білка, часто є необхідними. Несподівано було виявлено, що фармацевтичні препарати, які дозволяють досягнути концентрацій краще 10-200мг/мл, особливо краще 50150мг/мл, у рідкій композиції можуть бути одержані за допомогою твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом. Це є несподіваним, оскільки тенденція до нестабільності для високо концентрованих білкових композицій є набагато більш високою, ніж для розведених білкових композицій [Fields, G., Alonso, D., Stiger, D., Dill, K. (1992) «Теорія агрегації білків і співполімерів» J. Phys. Chem. 96, 3974-3981]. «Щільність упаковки» білкових молекул збільшується при високій концентрації білка. Відповідно до цього необхідно передбачати під 17 84893 вищену кількість співударів, і в результаті можуть виникати випадкові білкові асоціації. Цей процес у загальному випадку відбувається за допомогою механізмів утворення і росту, при яких критичні ядра часто являють собою розчинні асоційовані білки, які, проте, можуть швидко перетворюватись на нерозчинні білкові преципітати (денатурований білок) [Reithel, J.F. (1962) «Дисоціація і асоціація білкових стр уктур», Ad v. Protein Chem. 18, 123]. Розмір білкових агрегатів збільшується зі збільшенням концентрації білка, як було показано для β-лактоглобуліну [Roefs, S.P.F.M., De Kruif, K.G. (1994) «Модель для денатурації і агрегації β+лактоглобуліну» Eur. J. Biochem. 226, 883-889]. Межа у відомих високо концентрованих композиціях імуноглобулінів звичайно складає 2-50мг/мл (Humira®) у готових до споживання рідких композиціях антитіл. За допомогою твердих форм згідно з винаходом, проте, можуть бути одержані високо концентровані стабільні композиції, що є несподіваним. Таким чином, етап осадження або кристалізації може давати високо концентровані стабільні композиції антитіла, які після ресуспендування або повторного розчинення мають знижену в'язкість порівняно з рідкими композиціями антитіла тієї самої концентрації, і, таким чином, спрощує приготування у разі парентерального введення. Винахід, таким чином, також відноситься до фармацевтичних препаратів, які містять принаймні одну тверду форму анти-EGFR антитіла згідно з винаходом і/або один з його варіантів і/або фрагментів в осадженій некристалічній, осадженій кристалічній або у розчиненій чи суспендованій формі, де вміщуване антитіло є біологічно активним, при цьому фармацевтичні препарати відрізняються тим, що концентрація антитіла краще складає 10-200мг/мл, особливо краще 50-150мг/мл. Винахід також відноситься до способу одержання високо концентрованого фармацевтичного препарату згідно з винаходом, який відрізняється тим, що принаймні одна тверда форма анти-EGFR антитіла згідно з винаходом і/або один з його варіантів і/або один з його фрагментів є розчиненим або ресуспендованим у розчині згідно з винаходом, а концентрація антитіла краще складає 10200мг/мл, особливо краще 50-150мг/мл. Водні препарати можуть бути одержані шляхом розчинення або суспендування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом у водному розчині і необов'язкового додавання допоміжних речовин. З цією метою визначені об'єми маткових розчинів, які містять вказані додаткові допоміжні речовини у визначених концентраціях, переважно додають до розчину або суспензії, яка має визначену концентрацію твердих форм згідно з винаходом, а суміш необов'язково розводять водою до попередньо розрахованої концентрації. Альтернативно, допоміжні речовини можуть додаватись у твердій формі. Кількості маткових розчинів і/або води, які необхідні у кожному разі, послідовно додають до одержаного водного розчину або суспензії. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом можуть також краще бути розчинені або 18 суспендовані безпосередньо у розчині, який містить всі додаткові допоміжні речовини. Розчини або суспензії, які містять антитіла і мають значення рН від 4 до 10, які краще мають значення рН від 5 до 9, і осмолярність від 250 до 350мОсмолей/кг, можуть у кращому разі бути одержані з твердих форм згідно з винаходом при відновленні у водних розчинниках. Ресуспендований або повторно розчинений препарат може, таким чином, бути введений безпосередньо без болю внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, а також підшкірно. На додаток, препарат також може додаватись до розчинів для інфузії, таким як, наприклад, розчин глюкози, ізотонічний фізіологічний розчин або розчин Рингера, які також можуть містити активні інгредієнти, що також забезпечує можливість введення відносно великих кількостей активного інгредієнта. Фармацевтичні препарати згідно з винаходом можуть також вміщувати в себе суміші преципітатів і/або кристалів згідно з винаходом в осадженій або кристалічній і/або повторно розчиненій або ресуспендованій формі. Препарати згідно з винаходом є фізіологічно добре стерпними, легкими у приготуванні, можуть бути точно відмірені і є переважно стабільними відносно кількісного аналізу, продуктів розкладу та агрегатів при зберіганні і транспортуванні, а також під час багаторазових процесів заморожування і відтаювання. Вони можуть переважно зберігатись у стабільному стані впродовж періоду часу принаймні від трьох місяців до двох років при температурі холодильника (2-8°С) і при кімнатній температурі (23-27°С) і 60%-ній відносній атмосферній вологості (відн. вол.). Несподівано було виявлено, що препарати згідно з винаходом є переважно стабільними при зберіганні впродовж принаймні шести місяців навіть при підвищених температурах і високій атмосферній вологості, наприклад при температурі 40°C і 75%-ній відносній атмосферній вологості. Наприклад, тверді форми згідно з винаходом можуть зберігатись у стабільному стані при висушуванні, і, коли необхідно, перетворюватись на готовий до споживання препарат при розчиненні або суспендуванні. Можливі способи висушування являють собою, наприклад, без обмеження цими прикладами, висушування у газоподібному азоті, висушування у вакуумній печі, ліофілізацію, промивання органічними розчинниками і подальше висушування на повітрі, висушування у рідинному шарі, висушування у псевдозрідженому шарі, висушування розпилюванням, ролерне висушування, пошарове сушіння, висушування на повітрі при кімнатній температурі та інші способи. Термін «ефективна кількість» означає кількість лікарського засобу або фармацевтично активного інгредієнта, яка викликає медичну відповідь у тканині, системі, тварині або людині, якої прагнуть або яка є бажаною, наприклад, для дослідника або практикуючого лікаря. На додаток, термін «терапевтично ефективна кількість» означає кількість, яка, порівняно з відповідним індивідуумом, якому не вводили цю кількість, має такий наслідок: поліпшене лікування, 19 84893 загоєння, запобігання або усунення захворювання, синдрому, хворобливого стану, ускладнення, розладу або запобігання побічних ефектів чи також зниження розвитку захворювання, ускладнення або розладу. Термін «терапевтично ефективна кількість» також охоплює кількості, які є ефективними для посилення нормальної фізіологічної функції. Лікарські засоби можуть бути введені у формі одиничних доз, які вміщують попередньо визначену кількість активного інгредієнта на одиничну дозу. Одиниця цього типу може вміщувати, наприклад, від 0,5мг до 1г, краще від 1мг до 800мг, активного інгредієнта згідно з винаходом, залежно від хворобливого стану, який піддається лікуванню, способу введення та віку, ваги і стану здоров'я пацієнта. Кращі композиції одиничної дози являють собою такі, що вміщують добову дозу або піддозу, як вказано вище, або її відповідну фракцію активного інгредієнта. Крім того, лікарські засоби цього типу можуть бути одержані за допомогою одного зі способів, які добре відомі у галузі фармацевтики. Лікарські засоби можуть бути адаптовані для введення будь-яким бажаним прийнятним шляхом, наприклад, за допомогою перорального (у тому числі букального або під'язикового), ректального, легеневого, назального, місцевого (у тому числі букального, під'язикового або трансдермального), вагінального або парентерального (у тому числі підшкірного, внутрішньом'язевого, внутрішньовенного або внутрішньошкірного) шляхів введення. Лікарські засоби цього типу можуть бути одержані за допомогою усіх способів, відомих у галузі фармацевтики, шляхом, наприклад, поєднання активного інгредієнта з наповнювачем(ами) або допоміжною(ими) речовиною(ами). Парентеральне введення є переважно прийнятним для введення лікарських засобів згідно з винаходом. У разі парентерального введення, внутрішньовенне або підшкірне введення є особливо кращими. У разі внутрішньовенного введення ін'єкцію здійснюють безпосередньо або також у вигляді добавки до розчинів для інфузії. Лікарські засоби для підшкірного введення є особливо прийнятними, оскільки стабільні, високо концентровані композиції можуть бути одержані за допомогою твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом. Високо концентровані композиції, необхідні для парентерального або підшкірного введення, і введені невеликі об'єми можуть бути досягнуті наступним чином. Підшкірне введення має перевагу, яка полягає в тому, що пацієнт може вводити лікарський засіб самостійно без кваліфікованої медичної допомоги. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом є також прийнятними для одержання введених парентерально лікарських засобів, які містять активний інгредієнт для повільного, відстроченого та/або контрольованого вивільнення. Преципітати та/або кристали згідно з винаходом перебувають переважно у формі суспензії і розчиняються впродовж тривалого та/або контрольованого періоду часу і після цього перебувають у нативному та ефективному стані. Тверді форми анти-EGFR ан 20 титіл згідно з винаходом є також прийнятними для одержання композицій відстроченого вивільнення, які забезпечують переваги для пацієнта, оскільки є необхідним введення лише при відносно великих часових інтервалах. Фармацевтичні препарати згідно з винаходом можуть також бути введені безпосередньо у пухлину і, таким чином, розвивають свою дію безпосередньо у в наміченому сайті. Лікарські засоби, адаптовані для парентерального введення, вміщують водні та неводні стерильні ін'єкційні розчини, які містять антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні речовини та рідку фазу, за допомогою яких композиція набуває ізотонічності, аналогічної ізотонічності крові реципієнта, якого піддають лікуванню; а також водні та неводні стерильні суспензії, які можуть вміщува ти суспензійне середовище та згущувачі. Композиції можуть постачатись у контейнерах для однієї дози, багатодозових контейнерах, наприклад як запечатані ампули та флакони, і зберігатись у сублімованому (ліофілізованому) стані, так що є необхідним лише додавання стерильної рідини носія, наприклад води для ін'єкційних цілей, безпосередньо перед застосуванням. Ін'єкційні розчини та суспензії, одержані згідно з композицією, можуть бути одержані зі стерильних порошків, гранул і таблеток. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом, необов'язково у повторно розчиненій формі, можуть також вводитись у формі систем, які забезпечують доставку за допомогою ліпосом, таких як, наприклад, невеликі одношарові носії, великі одношарові носії або багатошарові носії. Ліпосоми можуть бути утворені з різних фосфоліпідів, таких як, наприклад, холестерин, стеариламін або фосфатидилхоліни. Тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом та їх варіанти в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі можуть також зливатись з розчинними полімерами як націленими лікарськими наповнювачами. Такі полімери можуть охоплювати полівінілпіролідон, пірановий співполімер, полігідроксипропілметакриламідофенол, полігідроксіетиласпартамідофенол або поліетиленоксидполілізин, заміщений радикалами пальмітоїлу. Тверді форми анти-EGFR антитіл можуть також бути злитими з класом полімерів, що біорозкладаються, які є прийнятними для досягнення повільного вивільнення лікарського засобу, наприклад, полімолочною кислотою, полі-епсилонкапролактоном, полігідроксимасляною кислотою, поліортоестерами, поліацеталями, полігідроксипіранами, поліціаноакрилатами, полімолочною-співгліколевою кислотою, полімерами, такими як кон'югати декстрану і метакрилатів, поліфосфоестерами, різними полісахаридами та поліамінами і полі-епсилон-капролактоном, альбуміном, хітозаном, колагеном або модифікованим желатином і поперечно зв'язаними або амфіпатичними блокспівполімерами чи гідрогелями. Лікарські засоби, адаптовані для трансдермального введення, можуть доставлятись як незалежні пластирі для тривалого, тісного контакту з епідермісом реципієнта. Таким чином, наприклад, активний інгредієнт може надходити з пластиру за 21 84893 допомогою іонофорезу, як описано у загальних рисах у [Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986)]. Лікарські засоби, адаптовані для місцевого введення, можуть бути рецептовані у вигляді мазей, кремів, суспензій, лосьйонів, порошків, розчинів, паст, гелів, аерозолів або масел. Для лікування очей або іншої зовнішньої тканини, наприклад рота або шкіри, композиції переважно вводять у вигляді місцевої мазі або крему. У разі перебування композиції у вигляді мазі, активний інгредієнт може використовуватись або з парафіновою, або зі змішуваною з водою основою крему. Альтернативно, активний інгредієнт може бути рецептований з одержанням крему на кремовій основі масло-у-воді або вода-у-маслі. Лікарські засоби, адаптовані для місцевого введення для очей, вміщують очні краплі, в яких активний інгредієнт розчинений або суспендований у прийнятному наповнювачі, зокрема у водному розчиннику. Лікарські засоби, адаптовані для ректального введення, можуть доставлятися у формі супозиторіїв або клізм. Лікарські засоби, адаптовані для введення шляхом інгаляції, охоплюють порошки або аерозолі, які містять дрібні частки, що можуть бути одержані при використанні різних типів роздавальних механізмів під тиском, що містять аерозолі, розпилювачі або інсуфлятори. Для цілей цього винаходу особливу перевагу надають порошкам твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом для введення у вигляді форми для інгаляцій. Лікарські засоби, адаптовані для вагінального введення, можуть доставлятися у вигляді вагінальних супозиторіїв, тампонів, кремів, гелів, паст, пін або композицій для розпилювання. Є само по собі зрозумілим, що окрім складових, зокрема згаданих ви ще, лікарські засоби згідно з винаходом можуть також містити інші агенти, які звичайно використовують у цій галузі відносно окремого типу фармацевтичної композиції. Винахід також відноситься до наборів (комплектів), які складаються з окремих пакетів a) ефективної кількості преципітату та/або кристалу анти-EGFR антитіла, переважно моноклонального анти-EGFR антитіла, зокрема краще Mab C225 (цетуксимабу) або Mab h425 (EMD 72000) і/або їх варіантів чи фрагментів в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі, та b) ефективної кількості додаткового лікарського активного інгредієнта. Набір вміщує прийнятні контейнери, такі як коробки або картонні упаковки, індивідуальні пляшечки, пакети або ампули. Набір може, наприклад, містити окремі ампули, кожна з яких містить ефективну кількість твердої форми згідно з винаходом, необов'язково у повторно розчиненій формі, та ефективну кількість додаткового лікарського активного інгредієнта у розчиненій або ліофілізованій формі. Терапевтично ефективна кількість твердої форми анти-EGFR антитіла згідно з винаходом залежить від низки факторів, у тому числі, наприклад, від віку та ваги, від певного хворобливого 22 стану, що потребує лікування, від його тяжкості, природи композиції та способу введення, і в кінцевому рахунку визначається лікуючим лікарем або ветеринаром. Однак, ефективна кількість антиEGFR антитіла згідно з винаходом для лікування непластичного росту, наприклад, раку кишечнику або молочної залози, звичайно перебуває в межах від 0,1 до 100мг/кг ваги тіла реципієнта (ссавця) на добу і, зокрема, типово в інтервалі від 1 до 10мг/кг ваги тіла на добу. Таким чином, фактична кількість на добу для дорослого ссавця вагою 70 кг перебуватиме звичайно в межах від 70 до 700мг, де ця кількість може вводитись у вигляді однієї дози на добу або звичайно у вигляді низки піддоз (таких як, наприклад, дві, три, чотири, п'ять або шість) на добу, так щоб загальна добова доза була такою самою. Прийнятний титр антитіла визначається за допомогою способів, відомих спеціалістові у цій галузі. Дози, що пропонуються для введення, у загальному випадку є достатніми для досягнення бажаної дії відносно інгібування пухлини. Однак при цьому доза має також бути вибрана, щоб вона була настілки низькою, наскільки це можливо, щоб не виникало жодних побічних ефектів, таких як небажані перехресні реакції, анафілактичні реакції або тому подібне. Винахід також відноситься до застосування твердих форм згідно з винаходом для одержання лікарського засобу, який вміщує біологічно активне антитіло та/або один з його варіантів і/або один з його фрагментів в осадженій некристалічній, осадженій кристалічній або у розчиненій чи суспендованій формі. Лікарські засоби згідно з винаходом можуть використовува тись, зокрема, для профілактики та/або лікування захворювань і хворобливих станів. Винахід, таким чином, відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом, переважно моноклональних антиEGFR антитіл, особливо краще Mab С225 (цетуксимабу) або Mab h425 (EMD 72000) і/або їх варіантів чи фрагментів в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювань. Було продемонстровано у різних дослідженнях in vitro та in vivo, що блокування EGFR за допомогою антитіл проти пухлин може відбуватись на різних рівнях, наприклад шляхом інгібування ракових клітин, зниження опосередкованого пухлиною ангіогенезу, індукції апоптозу ракових клітин та підвищення токсичних ефектів радіаційної терапії і традиційної хіміотерапії. Лікарські засоби, які містять тверді форми антитіл згідно з винаходом у повторно розчиненій або суспендованій формі, є здатними ефективно регулювати, модулюва ти або інгібувати EGFR і можуть, таким чином, використовуватись для запобігання та/або лікування захворювань у зв'язку з нерегульованою або порушеною активністю EGFR. Зокрема, тверді форми анти-EGFR антитіл згідно з винаходом можуть, таким чином, бути використані для лікування певних форм раку та при захворюваннях, викликаних патологічним ангіоге 23 84893 незом, таких як діабетична ретинопатія або запалення. Винахід, таким чином, також відноситься до застосування твердих форм згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювань, викликаних, опосередкованих та/або розповсюджуваних EGFR і/або за допомогою сигнальної трансдукції, опосередкованої EGFR. Лікарські засоби згідно з винаходом є особливо прийнятними для лікування та/або профілактики раку, у тому числі солідних карцином, таких як, наприклад, карциноми (наприклад, легенів, підшлункової залози, щитовидної залози, сечового міхура або кишечнику), мієлоїдних захворювань (наприклад, мієлоїдної лейкемії) або аденоми (наприклад, ворсинчастої аденоми обідкової кишки), патологічного ангіогенезу та метастатичної міграції клітин. Лікарські засоби також є корисними при лікуванні хронічних запалень, залежних від активації комплементу [Niculescu та ін. (2002) Immunol. Res., 24:191-199] та імунодефіциту, індукованого ВІЛ-1 (вірусом імунодефіциту людини типу 1) [Рорік та ін. (1998) J Virol, 72: 6406-6413]. На додаток, лікарські засоби згідно з винаходом є прийнятними як фармацевтично активні інгредієнти для ссавців, зокрема для людей, при лікуванні захворювань, індукованих EGFR. Термін «захворювання, індуковані EGFR» відноситься до патологічних станів, що залежать від активності EGFR. EGFR є безпосередньо або опосередковано залученим до шляхів сигнальної трансдукції різної активності клітин, у тому числі до проліферації, адгезії та міграції, а також до диференціації. Захворювання, асоційовані з активністю EGFR, вміщують проліферацію пухлинних клітин, патологічну неоваскуляризацію, які сприяють росту солідних пухлин, неоваскуляризації в оці (діабетична ретинопатія, стареча дегенерація жовтої плями і тому подібне) та запалення (псоріаз, ревматоїдний артрит і тому подібне). Захворювання, обговорювані у цій заявці, звичайно підрозділяють на дві групи: гіперпроліферативні та негіперпроліферативні захворювання. У цьому зв'язку псоріаз, артрит, запалення, ендометріоз, рубцювання, доброякісна гіперплазія передміхурової залози, імунологічні захворювання, автоімунні захворювання розглядають як неракові захворювання, де артрит, запалення, імунологічні захворювання, автоімунні захворювання та імунодефіцитні стани звичайно розглядають як негіперпроліферативні захворювання. У цьому зв'язку рак мозку, рак легенів, карциному лускатих клітин, рак сечового міхура, рак шлунку, рак підшлункової залози, рак печінки, рак нирки, колоректальний рак, рак молочної залози, рак голови, рак шиї, рак стравоходу, гінекологічний рак, рак щитовидної залози, лімфому, хронічну лейкемію та гостру лейкемію розглядають як ракові захворювання, всі з яких звичайно включають до групи гіперпроліферативних захворювань. Зокрема, ріст ракових клітин і особливо ріст ракових клітин, опосередкований прямо чи непрямо EGFR, 24 являє собою захворювання, яке становить мету цього винаходу. Можна показати, що лікарські засоби згідно з винаходом мають in vivo антипроліферативну дію у ксенотрансплантатних модельних пухлинах. Лікарські засоби згідно з винаходом вводять пацієнтові з гіперпроліферативним захворюванням, наприклад для інгібування пухлинного росту, для зниження запалення, асоційованого з лімфопроліферативним захворюванням, для інгібування відторгнення трансплантату або при неврологічному ушкодженні внаслідок загоєння тканини тощо. Лікарські засоби згідно з цим винаходом є корисними для профілактичних і терапевтичних цілей. Як використаний у цій заявці, термін «лікування» використовують як посилання як на запобігання захворюванням, так і для лікування існуючих ускладнень. Запобігання проліферації досягають шляхом введення лікарських засобів згідно з винаходом перед розвитком вираженого захворювання, наприклад для запобігання пухлинного росту, запобігання метастатичного росту, зниження рестенозу, асоційованого із серцево-судинною хірургією, тощо. Альтернативно, ці лікарські засоби використовують для лікування захворювань, що тривають, шляхом стабілізації або поліпшення клінічних симптомів пацієнта. Хазяїн або пацієнт можуть належати до будьякого виду ссавців, наприклад, до виду приматів, зокрема людини; гризунів, у тому числі миші, пацюки та хом'яки; кроликів, коней, корів, собак, котів тощо. Тваринні моделі становлять інтерес для експериментальних досліджень, забезпечуючи модель для лікування захворювань людини. Чутливість певної клітини до лікування за допомогою лікарських засобів згідно з винаходом може бути визначена в аналізах in vitro. Типово, культур у клітин інкубують з лікарським засобом згідно з винаходом при різних концентраціях впродовж періоду часу, який є достатнім для того, щоб дозволити активним інгредієнтам індукувати смерть клітин або інгібувати міграцію, звичайно він складає від однієї години до одного тижня. Аналізи in vitro можуть бути здійснені при використанні культивованих клітин зі зразка біопсії. Живі клітини, що залишилися після обробки, потім підраховують. Доза варіює залежно від використовуваних специфічних лікарських засобів, специфічного захворювання, стану пацієнта тощо. Звичайно терапевтична доза є достатньою для того, щоб значно зменшити небажану популяцію клітин у цільовій тканині, в той час як життєздатність пацієнта підтримується. Лікування у загальному випадку продовжують до ти х пір, доки не виникає істотне зниження, наприклад, принаймні приблизно на 50% числа специфічних клітин. Лікування можна продовжувати до ти х пір, доки істотно не буде виявлено жодних небажаних клітин в організмі. Різні аналітичні системи є доступними для ідентифікації інгібіторів EGFR. У сцинтиляційному аналізі близькості [Sorg та ін., J. of. Biomolecular Screening, 2002, 7, 11-19] та способі електролітичного покриття радіоактивне фосфорилювання білка або пептиду як субстрату вимірюють при вико 25 84893 ристанні γ-ΑΤΦ. У присутності інгібіторної сполуки можна визначити знижений радіоактивний сигнал або не визначити його взагалі. Крім того, методики гомогенного перенесення резонансної енергії флуоресценції з часовим дозволом (HTR-FRET) і флуоресцентної поляризації (FP) є корисними як аналітичні способи [SiIIs та ін., J. of Biomolecular Screening, 2002, 191-214]. Інші нерадіоактивні методи аналізу ELISA використовують специфічні фосфо-антитіла (фосфоАТ). Фосфо-АТ лише зв'язують фосфорильований субстрат. Це зв'язування може визначатись за допомогою другого кон'югованого з пероксидазою анти-баранячого антитіла при використанні хемолюмінісценції [Ross та ін., 2002, Biochem. J., у друку, р укопис BJ20020786]. Існує безліч хворобливих станів, асоційованих з нерегульованою клітинною проліферацією та смертю клітин (апоптоз). Захворювання та хворобливі стани, які можуть піддаватися лікуванню, запобігатися або полегшуватися за допомогою лікарських засобів згідно з винаходом, вміщують захворювання та хворобливі стани, наведені нижче, але не обмежуються ними. Лікарські засоби згідно з винаходом є корисними при лікуванні та/або профілактиці низки різних захворювань і хворобливих станів, які залучають проліферацію та/або міграцію клітин гладкої мускулатури та/або запальних клітин в інтимальному шарі судини, що призводить до обмеженого потоку крові крізь цю судину, наприклад, до неоінтимальних оклюзивних ушкоджень. Оклюзивні захворювання трансплантантних судин вміщують атеросклероз, коронарне васкулярне захворювання після трансплантації, стеноз трансплантантів вен, періанастомотичний рестеноз протеза, рестеноз після пересадження судин або заміна стенту і тому подібне. Цей винахід відноситься до застосування лікарських засобів згідно з винаходом для лікування або попереджання раку. Винахід, таким чином, особливо переважно відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики пухлин та/або пухлинних метастазів, де пухлина особливо переважно вибрана з групи, яка складається з пухлини мозку, пухлини сечостатевого тракту, пухлини лімфатичної системи, пухлини шлунка, пухлини гортані, моноцитарної лейкемії, аденокарциноми легенів, дрібноклітинної карциноми легенів, раку підшлункової залози, гліобластоми та карциноми молочної залози, не обмежуючись, проте, цими пухлинами. Винахід також відноситься до застосування лікарських засобів згідно з винаходом для одержання лікарського засобу для лікування захворювань, вибраних з групи, яка складається з карциноми лускатих клітин, раку сечового міхура, раку шлунку, раку печінки, раку нирки, колоректального раку, раку молочної залози, раку голови, раку шиї, раку стравоходу, гінекологічного раку, раку щитовидної залози, лімфоми, хронічної лейкемії та гострої лейкемії. Лікарські засоби згідно з винаходом можуть бути введені пацієнтам для лікування раку. Ці лікарські засоби інгібують пухлинний ангіогенез і, 26 таким чином, мають вплив на ріст пухлин [J. Rak та ін. Cancer Research, 55: 4575-4580, 1995]. Інгібувальні ангіогенез властивості лікарських засобів згідно з винаходом є також прийнятними для лікування певних форм сліпоти, асоційованої з ретинальною неоваскуляризацією. Винахід, таким чином, також відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювань, викликаних, опосередкованих або розповсюджуваних за допомогою ангіогенезу. Захворювання цього типу, що залучають ангіогенез, являють собою очні захворювання, такі як ретинальна васкуляризація, діабетична ретинопатія, стареча дегенерація жовтої плями і тому подібне. Винахід, таким чином, також відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювань, вибраних з групи, яка складається з ретинальної васкуляризації, діабетичної ретинопатії, старечої дегенерації жовтої плями та/або запальних захворювань. Винахід також відноситься до застосування лікарських засобів згідно з винаходом для лікування та/або профілактики захворювань, вибраних з групи, яка складається з псоріазу, ревматоїдного артриту, контактного дерматиту, реакції гіперчутливості уповільненого типу, запалення, ендометріозу, рубцювання, доброякісної гіперплазії передміхурової залози, імунологічних захворювань та імунодефіцитних захворювань. Винахід також відноситься до застосування лікарських засобів згідно з винаходом для лікування та/або профілактики патологій кісток, вибраних з групи, яка складається з остеосаркоми, остеоартриту та рахіту. Лікарські засоби згідно з винаходом можуть також бути використані для забезпечення адитивного або синергетичного ефекту у відомих існуючих ракових хіміотерапіях і способах із використанням опромінювання, та/або можуть бути використані для відновлення ефективності відомих існуючих способів ракової хіміотерапії та способів із використанням опромінювання. Винахід, таким чином, також відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювань, при яких терапевтично ефективну кількість твердої форми згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі вводять у комбінації зі сполукою, вибраної з групи, яка складається з 1) модулятора рецептора естрогену, 2) модулятора рецептора андрогену, 3) модулятора ретиноїдного рецептора, 4) цитотоксичного агенту, 5) антипроліферативного агенту, 6) інгібіторів пренілпротеїнтрансферази, 7) інгібіторів HMG-CoA редуктази, 8) інгібіторів протеази ВІЛ, 9) інгібіторів зворотної 27 84893 транскриптази, 10) інгібіторів рецептора фактору росту та 11) інгібіторів ангіогенезу. Винахід, таким чином, також відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR антитіл згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі для одержання лікарського засобу для лікування та/або профілактики захворювань, при яких терапевтично ефективну кількість твердої форми згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі вводять у комбінації з радіотерапією та сполукою, вибраної з групи, яка складається із 1) модулятора рецептора естрогену, 2) модулятора рецептора андрогену, 3) модулятора ретиноїдного рецептора, 4) цитотоксичного агента, 5) антипроліферативного агента, 6) інгібіторів пренілпротеїнтрансферази, 7) інгібіторів HMG-CoA редуктази, 8) інгібіторів протеази ВІЛ, 9) інгібіторів зворотної транскриптази, 10) інгібіторів рецептора фактору росту та 11) інгібіторів ангіогенезу. Лікарські засоби згідно з винаходом можуть, таким чином, також бути введені разом з усіма добре відомими терапевтичними агентами, які вибирають відповідно до їх особливої корисності відносно стану, який піддають лікуванню. Наприклад, у разі станів, пов'язаних із кістковою системою, комбінаціями, які будуть корисними, є комбінації з антирезорбтивними бісфосфонатами, такими як алендронат і ризедронат; блокаторами інтегрину (як визначено нижче), такими як ανβ3 антагоністи; кон'югованими естрогенами, які використовують у гормон-замісній терапії, такими як Премпро®, Премарин® та Ендометріон®; селективними модуляторами рецептора естрогену (SERM), такими як ралоксифен, дролоксифен, СР336,156 (Пфайзер) і лазофоксифен; інгібіторами катепсину K та інгібіторами АТФ протонного насосу. Ці лікарські засоби також є прийнятними для комбінації з відомими протираковими агентами. Такі відомі протиракові агенти вміщують такі: модулятор рецептора естрогену, модулятор рецептора андрогену, модулятор ретиноїдного рецептора, цитотоксичний агент, антипроліферативні агенти, інгібітори пренілпротеїнтрансферази, інгібітори HMG-CoA редуктази, інгібітори протеази ВІЛ, інгібітори зворотної транскриптази, інгібітори рецептора фактору росту та інгібітори ангіогенезу. Ці сполуки є особливо прийнятними для введення одночасно зі здійсненням радіотерапії. «Модулятори рецептора естрогену» відносяться до сполук, які взаємодіють з рецептором або інгібують зв'язування естрогену з рецептором незалежно від механізму. Приклади модуляторів рецептора естрогену вміщують, але не обмежені ними, тамоксифен, ралоксифен, ідоксифен, LY353381, LY 117081, тореміксен, фулвестрант, 4[7-(2,2-диметил-1-оксопропокси-4-метил-2-[4-[2-(1піперидиніл)етокси]феніл]-2Н-1-бензопіран-3іл]феніл-2,2-диметилпропаноат, 4,4'дигідроксибензофенон-2,4-динітрофенілгідразон і SH646. «Модулятори рецепторів андрогену» відносяться до сполук, які взаємодіють з рецептором або інгібують зв'язування андрогенів з рецепто 28 ром, незалежно від механізму. Прикладами модуляторів рецептора андрогену є фінастерид та інші інгібітори 5α-редуктази, нілутамід, флутамід, бікалутамід, ліарозол та ацетат абіратерону. «Модулятори ретиноїдного рецептора» відносяться до сполук, які взаємодіють з рецептором або інгібують зв'язування ретиноїдів з рецептором, незалежно від механізму. Прикладами модуляторів рецептора андрогену є бексаротен, третиноїн, 13-цис-ретиноєва кислота, 9-цис-ретиноєва кислота α-дифторметилорнітин, ILX23-7553, транс-N-(4'гідроксифеніл)ретинамід та Ν-4карбоксифенілретинамід. «Цитотоксичні агенти» відносяться до сполук, які призводять до смерті клітин в основному шляхом безпосереднього впливу на клітинну функцію або інгібують чи втручаються у мейоз клітин, і містять алкілувальні агенти, фактори некрозу пухлини, інтеркалювальні агенти, інгібітори мікротубуліну та інгібітори топоізомерази. Прикладами цитотоксичних агентів є, але не обмежуються ними, тирапазимін, сертенеф, кахектин, іфосфамід, тазонермін, лонідамін, карбоплатин, алтретамін, преднімустин, дибромодульцитол, ранімустин, фотемустин, недаплатин, оксаліплатин, темозоломід, гептаплатин, естрамустин, імпросульфан тозилат, трофосфамід, німустин, хлорид диброспідію, пумітепа, лобаплатин, сатраплатин, профіроміцин, цисплатин, ірофульвен, дексифосфамід, цис-аміндихлор-(2-метилпіридин)платина, бензилгуанін, глюфосфамід, GPX100, (транс,транс,транс)-біс-му-(гексан-1,6-діамин)-му[діамин-платина(ІІ)]біс[діамін (хлор)платина(ІІ)] тетрахлорид, діаризиніл-спермін, триоксид миш'яку, 1-(11-додециламіно-10-гідроксіундецил)-3,7диметилксантин, зорубіцин, ідарубіцин, даунорубіцин, бісантрен, мітоксантрон, пірарубіцин, пінафід, вальрубіцин, амрубіцин, антинеопластон, 3'дезаміно-3'-морфоліно-13-дезоксо-10гідроксикарміноміцин, анаміцин, галарубіцин, елінафід, MEN 10755 і 4-деметокси-3-дезаміно-3азиридиніл-4-метилсульфонілдаунорубіцин [дивись WO 00/50032]. Прикладами інгібіторів мікротубулін у є паклітаксел, сульфат віндезину, 3'4'дидегідро-4'-дезокси-8'-норвінкалеукобластин, доцетаксол, ризоксин, доластатин, мівобулін ізетіонат, ауристатин, цемадотин, RPR109881, BMS184476, вінфлунін, криптофіцин, 2,3,4,5,6пентафтор-N-(3-фтор-4метоксифеніл)бензолсульфонамід, ангідровінбластин, N,N-диметил-L-валіл-L-валіл-N-метил-Lваліл-L-проліл-L-пролін-т-бутиламід, TDX258 і BMS188797. Деякі приклади інгібіторів топоізомерази являють собою топотекан, гікаптамін, іринотекан, рубітекан, 6-етоксипропіоніл-3',4'-Oексобензиліденчартреузин, 9-метокси-N,Nдиметил-5-нітропіразол[3,4,5-кл]акридин-2(6Н)пропанамін, 1-аміно-9-етил-5-фтор-2,3дигідро-9-гідрокси-4-метил-1H, 12Нбензо[де]пірано[3',4':b,7]індол ізино[1,2b]хінолін10,13(9Н,15Н)-діон, луртотекан, 7-[2-(Nізопропіламіно)етил]-(20S)камптотецин, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, фосфат етопозиду, теніпозид, собузоксан, 2'-диметиламіно-2' 29 84893 дезоксіетопозид, GL331, N-[2-(диметиламіно)етил]9-гідрокси-5,6-диметил-6Н-піридо[4,3-b]карбазол1-карбоксамід, азулакрин, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N[2-(диметиламіно)етил)-N-метиламіно]етил]-5-[4гідрокси-3,5-диметоксифеніл]-5,5а,6,8,8а,9гексогідрофуро(3',4':6,7)нафто(2,3-d)-1,3-діоксол-6он, 2,3-(метилендіокси)-5-метил-7-гідрокси-8метоксибензо[с]фенантридиній, 6,9-біс[(2аминоетил)аміно]бензо[g]ізохінолін-5,10-діон, 5-(3амінопропіламіно)-7,10-дигідрокси-2-(2гідроксіетиламінометил)-6Н-піразол[4,5,1де]акридин-6-он, N-[1-[2-(діетиламіно)етиламіно]-7метокси-9-оксо-9Н-тіоксантен-4-ілметил]формамід, N-(2-(диметиламіно)етил)акридин-4-карбоксамід, 6-[[2-(диметиламіно)етил]аміно]-3-гідрокси-7Ніндено[2,1-с]хінолін-7-он і димесна. «Антипроліферативні агенти» вміщують антисмислові PHK і ДНК олігонуклеотиди, такі як G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 і INX3001, а також антиметаболіти, такі як еноцитабін, кармофур, тегафур, пентостатин, доксифлуридин, триметрексат, флударабін, капецитабін, галоцитабін, цитарабін, оксфосфат, гідрат фостеабіну натрію, ралтитрексед, палтитрексед, емітефур, тіазофурин, децитабін, нолатрексед, пеметрексед, нелзарабн, 2'-дезокси-2'-метиліденецитидин, 2'фторметилен-2'-дезоксицитидин, N-[5-(2,3дигідробензофурил)сульфоніл]-N'-(3,4дихлорфеніл)сечовина, N6-[4-дезокси-4-[N2[2(Е),4(Е)-тетрадекадієноїл]гліциламіно]-L-гліцероВ-L-манногептопіранозил]аденін, аплідин, ектейнасцидин, троксацитабін, 4-[2-аміно-4-оксо-4,6,7,8тетрагідро-3Н-піримідино[5,4-b]-1,4-тіазин-6-іл-(S)етил]-2,5-тіеноїл-і-глютамінова кислота, аміноптерин, 5-фторурацил, аланозин, естер 11-ацетил-8(карбамоїлоксиметил)-4-форміл-6-метокси-14окса-1,11-діазатетроцикпо(7.4,1,0,0)тетрадека2,4,6-тріен-9-ілоцтової кислоти, свайнозонін, лометрексол, декразоксан, метіоніназа, 2'-ціано-2'дезокси-N4-пальмітоїл-1-В-Dарабінофуранозилцитозин і 3-амінопіридин-2карбоксальдегід тіосемікарбазон. «Антипроліферативні агенти» також вміщують моноклональні антитіла проти факторів росту, які відрізняються від тих, що наведені вище під найменуванням «інгібітори ангіогенезу», такі як трастузумаб, і гени супресії пухлини, такі як р53, які можуть доставлятись за допомогою опосередкованого вірусом перенесення генів [дивись, наприклад, патент США №6,069,134]. Лікарські засоби згідно з винаходом можуть також бути введені у комбінації з усіма іншими терапевтичними антитілами, відомими спеціалістові у цій галузі, або з фармацевтичними активними інгредієнтами, які є прийнятними у зв'язку зі згаданими вище захворюваннями. Крім того, тверді форми згідно з винаходом антитіл згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі можуть бути використані для ізоляції та досліджування активності або експресії EGFR. На додаток, вони є, зокрема, прийнятними для використання у діагностичних методах для захворювань у зв'язку з нерегульованою або порушеною регуляцією активності EGFR. Винахід, таким чином, також відноситься до застосування твердих форм анти-EGFR 30 антитіл згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі як активаторів або інгібіторів EGFR, особливо краще як інгібіторів EGFR. Для діагностичних цілей антитіла згідно з винаходом можуть бути, наприклад, радіоактивно міченими. Спосіб мічення, якому надають перевагу, являє собою йодогенний спосіб [Fraker та ін., 1978]. Для діагностичних цілей особливо краще використовувані антитіла являють собою F(ab')2 фрагмент. Таким чином досягають відмінних результатів, однак при цьому необхідним є вирахування фону. Фрагменти цього типу можна одержати за допомогою відомих способів [наприклад, Herlyn та ін., 1983]. У загальному випадку перетравлювання за допомогою пепсину здійснюють при кислому значенні рН, і фрагменти відокремлюють від неперетравленого IgG та фрагментів важких ланцюгів білка при використанні білок А Сефароза™ хроматографії. Преципітат і/або кристали згідно з винаходом переважно демонструють сприятливу біологічну активність, яка може бути легко визначена у ферментних аналізах, як описано у прикладах. У ферментних аналізах цього типу антитіла згідно з винаходом переважно демонструють і викликають інгібувальний ефект, який звичайно документально підтверджують значеннями IC50 у прийнятному інтервалі, краще у мікромолярному інтервалі і більш краще у наномолярному інтервалі. Способи визначення: Відносно способів визначення цей винахід охоплює всі способи визначення, відомі спеціалістові у цій галузі з літератури. Кристалічні структури можуть бути визначені, наприклад, відносно спектру дифракції при вимірюванні дифракції у рентгенівських променях. Зокрема, кристалічні структури антитіл згідно з винаходом можуть бути визначені за допомогою мікроскопічних досліджень при використанні поляризаційних фільтрів. Додаткові способи визначення без обмеження ними охоплюють електронні мікрофотографії. Визначення розміру білка, структурної цілісності, чистоти або моделі глікозилювання твердих форм згідно з винаходом в осадженій, повторно розчиненій або суспендованій формі охоплює, без обмеження ними, SE-HPLC, пептидне картирування (перетравлювання), N-термінальне секвенірування, SDS-поліакриламідний гель-електрофорез, Трис/гліциновий градієнтний гель (не відновлювальний), FTIR спосіб (інфрачервона спектроскопія на базі перетворення Фур'є), CD (циркулярний дихроїзм), RAMAN спектроскопію, вуглеводневе фарбування (PAS метод), олігосахаридне профілювання, визначення моносахаридного складу та ізоелектричне фокусування. Стабільність твердих форм або композицій згідно з винаходом може бути визначена, наприклад, без обмеження ними, за допомогою програм стабільності, наприклад, в умовах зберігання при 25°С і 60%-ній відносній атмосферній вологості та при 40°C і 70%-ній відносній атмосферній вологості впродовж тривалого періоду та визначення стабільності або структурної цілісності білка через 31 84893 регулярні інтервали часу, наприклад за допомогою згаданих вище способів визначення (SE-HPLC, FTIR, SDS-ΠΑΓΕ (відновлювальний і не відновлювальний)). Способи визначення біологічної активності або ефективності твердих форм згідно з винаходом в осадженій кристалічній, осадженій некристалічній, розчиненій або суспендованій формі охоплюють, наприклад, без обмеження ними, ELISA, біологічний клітинний аналіз, FTIR або CD. Способи для визначення зниженої тенденції до агрегації твердих форм згідно з винаходом в осадженій кристалічній, осадженій некристалічній, розчиненій або суспендованій формі і, таким чином, можливості одержання високо концентрованих композицій, розміру кристалів або розміру преципітату охоплюють, наприклад, без обмеження ними, візуальну перевірку, аналіз часток менше видимого розміру, нефелометрію або турбідиметрію або динамічну характеристику розсіювання світла. Вище і нижче всі температури вказані у 0C. У подальших прикладах «традиційна обробка» означає, що воду додавали у разі необхідності, і, якщо необхідно, рН доводили до значення від 2 до 10 залежно від складу кінцевого продукту. Приклад 1: Агенти та умови осадження і/або кристалізації, які можуть бути використані згідно з винаходом Подальший список вміщує у кожному разі всі придатні гідрати, споріднені солі та похідні вказаних сполук, які є відомими спеціалістові у цій галузі. 1. Осаджувальні реагенти: 1.1 Солі: наприклад, тригідрат ацетату натрію, хлорид калію, хлорид натрію, дигідрат цитрату тринатрію, гідрофосфат дикалію, дигідрат гідрофосфату динатрію, сульфат амонію, ацетат амонію, бромід амонію, хлорид амонію, цитрат тріамонію, гідроцитрат діамонію, дигідрофосфат амонію, гідрофосфат діамонію, тартрат діамонію, моногідрат лимонної кислоти, імідазол, ацетат калію, бромід калію, моногідрат цитрату трикалію, дигідрофосфат калію, сульфат калію, тетрагідрат ацетату магнію, гексагідрат броміду магнію, гексагідрат хлориду магнію, гептагідрат сульфату магнію, моногідрат дигідрофосфату натрію, декагідрат сульфату натрію, пролін, бурштинова кислота, дигідрат ацетату цинку, гептагідрат суль фату цинку. 1.2 Полімери: наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ): циклодекстрини, декстран, карбоксиметилцелюлоза натрію (Na-CMC), полоксамер, поліакрилова кислота, монометиловий етер поліетиленгліколю (mPEG), поліпропіленгліколь (PPG), полівініловий спирт (PVA), полівінілпіролідон (PVP). 1.3 Органічні розчинники: наприклад, етанол, гліцерин. 2. Допоміжні речовини: наприклад, речовини, що модифікують в'язкість, детергенти (наприклад, Твін®, Солютол® HS 15, Плюронік®, Кремофор® EL, Авацел® 20, поліоксіетиленсорбітмоноолеат), відновлювальні 32 агенти (глютатіон, 2-меркаптоетанол, дитіотреїтол), комплексувальні агенти (EDTA, EGTA). 3. Буфери: наприклад, фосфатний буфер: фосфат Na (або K); також з додаванням агентів для регуляції ізотонічності (наприклад, NaCI (або KCI)), можливе значення рН складає приблизно 6,0-8,2; цитратний буфер: цитрат Na або лимонна кислота, можливе значення рН складає приблизно 2,2-6,5; також з додаванням агентів для регуляції ізотонічності (наприклад, NaCI); інші солі також є прийнятними для ізотонізації; сукцинатний буфер: рН приблизно 4,8-6,3; ацетатний буфер: ацетат натрію, рН приблизно 2,5-6; гістидиновий буфер: рН приблизно 6,0-7,8; глютамінова кислота: від рН 8,0 до 10,2; гліцин (N,N-біс(2-гідроксіетил)гліцин): рН приблизно від 8,6 до 10,6; гліцинатний буфер: рН приблизно 6,5-7,5; імідазол: рН від 6,2 до 7,8; хлорид калію: рН приблизно від 1,0 до 2,2; лактатний буфер: рН приблизно 3,0-6,0; малеатний буфер: рН приблизно 2,5-5,0; тартратний буфер: рН приблизно 3,0-5,0; Трис:рН приблизно 6,8-7,7; фосфа тно/цитратний буфер; 4. Інтервали рН: Теоретично можливе значення рН складає 410, краще значення - рН 5-9 5. Інтервали температури: Теоретично можливий інтервал температур складає від -10°C до 40°C; краще 0-25°C, особливо краще від 4°C до 20°С. 6. Стабілізатори: 6.1 Амінокислоти: наприклад, аргінін, орнітин, лізин, гістидин, глютамінова кислота, аспарагінова кислота, ізолейцин, лейцин, аланін, фенілаланін, тирозин, триптофан, метіонін, серин, пролін. 6.2 Цукри і цукрові спирти: наприклад, сахароза, лактоза, глюкоза, маноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, рафіноза, трегалоза, глюкозамін, N-метилглюкозамін, галактозамін, нейрамінова кислота. 6.3 Антиоксиданти: наприклад, ацетон бісульфіт натрію, аскорбінова кислота, естери аскорбінової кислоти, бутилгідроксіанізол (BHA), бутилгідрокситолуол (BHT), цистеїн, нордигідрогуаретова кислота (NDGA), монотіогліцерин, бісульфіт натрію, метабісульфіт натрію, токофероли, глютатіон. 6.4 Консерванти: наприклад, м-крезол, хлоркрезол, фенол, бензиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, бутилпарабен, хлорбутанол, феніл нітрат ртуті, феніл ацетат ртуті, тимерсал, хлорид бензалконію, хлорид бензетонію. 6.5 Циклодекстрини: наприклад, гідроксипропіл-п-циклодекстрин, сульфобутилетил-п-циклодекстрин, γциклодекстрин, α-циклодекстрин. 6.6 Альбуміни: наприклад, людський сироватковий альбумін (ПСА), бичачий сироватковий альбумін (БСА). 33 84893 6.7 Багатоатомні спирти: наприклад, гліцерин, етанол, манітол. 6.8 Солі: наприклад, ацетатні солі (наприклад, ацетат натрію), хлорид магнію, хлорид кальцію, трометамін, EDTA (наприклад, Na-EDTA). 7. Ізотонічні агенти: наприклад, хлорид натрію, хлорид калію, глюкоза, гліцерин, декстроза, хлорид натрію, сульфат натрію. Приклад 2: Кристалізація Ербітукса™ за допомогою сульфату амонію 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ фосфату, рН8,0) 400мкл буферу (10мМ фосфату, рН8,0). 100мкл осаджувальної речовини (насичений розчин сульфату амонію у 10мМ фосфа ту, рН8,0). Додавання осаджувальних реагентів до білкового розчину здійснювали у розчині (періодичний процес). Після піпетирування зразок слід змішати шляхом ручного перемішування. Процес можна здійснювати при кімнатній температурі або при 4°C. Приклад 3: Кристалізація Ербітукса™ за допомогою етанолу 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ цитрату, рН5,5) 400мкл буферу (10мМ цитрату, рН5,5) 100мкл осаджувальної речовини (50% (об./об.) етанолу в 10мМ цитрату, рН5,5) або 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ цитрату, рН5,5) 500 (мкл осаджувальної речовини (50% (об./об.) етанолу в 10мМ цитрату, рН5,5) Додавання осаджувальних реагентів до розчину білка здійснювали у розчині (періодичний процес). Після піпетування зразок слід змішати шляхом ручного перемішування. Процес можна здійснювати при кімнатній температурі або при 4°C. Приклад 4: Осадження Ербітукса™ за допомогою суль фату амонію 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ фосфату, рН8,0) 500мкл осаджувальної речовини (насичений розчин сульфату амонію в 10мМ фосфату, рН8,0) або 200мкл білка (20мг/мл у 10мМ фосфату, рН8,0) 800мкл осаджувальної речовини (насичений розчин сульфату амонію в 10мМ фосфату, рН8,0) або 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ цитрату, рН5,5) 500мкл осаджувальної речовини (насичений розчин сульфату амонію в 10мМ цитрату, рН5,5) або 200мкл білка (20мг/мл у 10мМ цитрату, рН5,5) 800мкл осаджувальної речовини (насичений розчин сульфату амонію в 10мМ цитрату, рН5,5) Додавання осаджувальних реагентів до розчину білка здійснювали у розчині (періодичний процес). Після піпетування зразок слід змішати шляхом ручного перемішування. Процес можна здійснювати при кімнатній температурі або при 4°C. 34 Приклад 5: Осаджування Ербітукса™ за допомогою ПЕГа 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ фосфату, рН8,0) 500мкл осаджувальної речовини (50% (ваг./об.) ПЕГа 4000 у 10мМ фосфату, рН8,0) або 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ цитрату, рН5,5) 500мкл осаджувальної речовини (50% (ваг./об.) ПЕГа 4000 у 10мМ цитрату, рН5,5) або 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ фосфату, рН8,0) 500мкл осаджувальної речовини (50% ваг./об.) ПЕГа 8000 у 10мМ фосфату, рН8,0) або 500мкл білка (20мг/мл у 10мМ цитрату, рН5,5) 500мкл осаджувальної речовини (50% (ваг./об.) ПЕГа 8000 у 10мМ цитрату, рН5,5) Додавання осаджувальних реагентів до розчину білка здійснювали у розчині (періодичний процес). Після піпетування зразок слід змішати шляхом ручного перемішування. Процес можна здійснювати при кімнатній температурі або при 4°С. Приклад 6: Мікроскопічне дослідження кристалічної форми Кристали, одержані у Прикладах 1 і 2, вивчали за допомогою мікроскопа. Визначали як двозаломлюючі властивості, що є типовими для кристалів, так і здатність до фарбування Кумассі брильянтовим блакитним, що є типовим для білків. Виявляли кристали, які мають розмір приблизно 50-200мкм. Приклад 7: Дослідження преципітатів на нативність Преципітати, одержані у Прикладах 4 і 5, повторно диспергували та досліджували за допомогою FT-IR спектрометрії. Амідні І-2. відхилення спектрів вихідного матеріалу перед осадженням і повторно суспендованого преципітату були конгруентними. Приклад 8: Здійснення способу кристалізації, описаного у [WO 02072636] Для того, щоб перевірити результати, одержані з патентної заявки [WO 02072636], спочатку спробували у контрольному експерименті, як описано у [WO 02072636], одержати кристали, які можуть бути послідовно використані як кристали запалу, за допомогою Wizard I си та. Незважаючи на те, що кристали голкової форми були одержані в умовах осадження при використанні хлориду кальцію або ацетату кальцію, вони, однак, також утворилися у цитратному буферному розчині без білка. Таким чином, описані голкові кристали одержують як з білкового розчину, так і з негативного контролю (без білка) при використанні процесу, описаного у [WO 02072636]. З цього зрозуміло, що ці кристали можливо являють собою, у кращому разі, включення у кристалах осаджувального реагенту. 35 Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а 84893 Підписне 36 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601