Рідка лікарська форма кон’югата полімер-g-csf

Реферат: Даний винахід стосується рідкої фармацевтичної композиції, що містить поліпептид гранулоцитарного колонієстимулюючого чинника, кон'югований з полімером, причому композиція має значення рН в діапазоні від 4,5 до 5,5, а натрій присутній в концентрації 10 ммоль/л. UA 98001 C2 (12) UA 98001 C2 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується рідкої фармацевтичної композиції, що містить поліпептид гранулоцитарного колонієстимулюючого чинника, кон'югований з полімером, причому композиція має значення рН в діапазоні від 4,5 до 5,5. Композиція додатково містить сурфактант і необов'язково одну або більше фармацевтично прийнятні допоміжні речовини. Додатково, композиція у даному винаході не містить винної кислоти і її солей, а також янтарної кислоти і її солей як буферних речовин, і не містить амінокислот як стабілізаторів. Композиція демонструє хорошу стійкість при зберіганні і особливо зручна для профілактики і лікування розладів і при медичних показаннях, при яких композиції гранулоцитарних колонієстимулюючих чинників розглядаються як прийнятні лікарські засоби. Гранулоцитарний колонієстимулюючий чинник (G-CSF) являє собою гематопоетичний фактор росту, стимулюючий проліферацію і диференціювання гематопоетичних клітинпопередників і активацію зрілих нейтрофілів. G-CSF може сприяти проліферації нейтрофілів in vitro і in vivo. Людська форма G-CSF була клонована групами з Японії і США у 1986 (див., наприклад, Nagata et al. (1986) Nature 319: 415-418). Природний людський глікопротеїн існує в двох формах, одна з яких містить 174, а інша 177 амінокислот. Більш поширена і більш активна 174-амінокислотна форма використовується при розробці фармацевтичних продуктів за технологією рекомбінантної ДНК. Великі кількості рекомбінантного G-CSF були продуковані за допомогою одержаної генетичним шляхом Escherichia coli і успішно застосовувалися в медичній практиці для лікування ракових пацієнтів, страждаючих від нейтропенії, викликаної хіміотерапією. Escherichia coli-продукований G-CSF являє собою 175-амінокислотний поліпептидний ланцюг, що містить додатковий метіонін на N-кінці. Білок продукувався шляхом експресії гену G-CSF в Е. coli і очищення білкового продукту до однорідного стану. Це гідрофобний білок, що містить 5 цистеїнових залишків, чотири з яких задіяні в утворенні дисульфідних зв'язків Вільний цистеїновий залишок звичайно залучається до утворення агрегатів більшої молекулярної ваги при зберіганні в розчині. Агрегати білків також можуть утворюватися з окиснених форм білка, які з'являються шляхом окиснення внутрішніх метіонінових залишків в первинній послідовності білка. З чотирьох метіонінових залишків один знаходиться на N-кінці і три інших - внутрішні. Окиснеш форми білка, що містять окиснений метіонін в положенні 122, можуть бути відділені від форм, що містять окиснений метіонін в положеннях 127 або 138, і від нативного білка шляхом звичайних процедур розділення обернено-фазовою високоефективною рідинною хроматографією (положення розраховані для метіоніл-G-CSF, що складається з 175 амінокислот). Рекомбінантний людський G-CSF, синтезований за допомогою системи експресії Е. соlі, називається філграстим (міжнародне непатентоване найменування, МНН). Структура філграстиму дещо відрізняється від природного глікопротеїну. Інша форма рекомбінантного людського G-CSF називається ленограстим (МНН) і синтезується в клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО). Філграстим і ленограстим продаються в Європі під торгівельними ® найменуваннями Neupogen і Granocyte, відповідно. Однак комерційно доступні форми рекомбінангного людського G-CSF мають короткочасну фармакологічну дію і часто повинні вводитися більше одного разу на день протягом всього стану лейкопенії. Молекула з великим терміном напівжиття циркуляції в крові знизила б кількість введень, необхідних, щоб полегшити лейкопенію і запобігти подальшим інфекційним захворюванням. Інша проблема доступних в цей час продуктів рекомбінантного людського G-CSF складається у виникненні дозозалежного болю в кістках. Оскільки пацієнти відчувають біль в кістках як значний побічний ефект лікування рекомбінантним людським G-CSF, то було б бажано створити продукт рекомбінантного людського G-CSF, який би не викликав біль в кістках, або за своєю природою, або ефективний в кількостях, достатньо малих, щоб не викликати або, щонайменше, викликати менший біль в кістках. Таким чином, очевидна необхідність у вдосконалених молекулах G-CSF і фармацевтичних композиціях, що містять молекули G-CSF, у вигляді стійких, готових до використання композицій. Варіанти людського G-CSF зі зміненою структурою білка були опубліковані, наприклад, серед варіантів G-CSF, описаних в WO 01/87925, ЕР 0 456 200 A, US 6,166,183, US 6,004,548, US 5,580,755, US 5,582,823, US 5,675,941, US 5,416,195, US 5,399,345, WO 2005/055946 і WO 2006/074467. Також опублікована модифікація людського G-CSF й інших поліпептидів для введення щонайменше одного додаткового вуглеводневого ланцюга в порівнянні з нативним поліпептидом (US 5,218,092). Додатково, були опубліковані й досліджені полімерні модифікації 1 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нативного людського G-CSF, включаючи приєднання поліетиленглікольних (ПЕГ) груп (US 5,824,778, US 5,824,784, WO 96/11953, WO 95/21629 і WO 94/20069). Звичайно приймається, що стійкість білків може бути підвищена, а імунна відповідь проти цих білків знижена, коли ці білки зв'язані з полімерними молекулами. WO 94/28024 розкриває, що фізіологічно активні білки, змінені ПЕГ, виявляють знижену імуногенність і антигенність, і циркулюють у кров'яному руслі значно довше, ніж некон'юговані білки, тобто мають знижену швидкість виведення. У даній галузі відоме приєднання синтетичних полімерів до пептидного скелету з метою спроби поліпшити фармакокінетичні властивості глікопротеїнових лікарських засобів. Прикладом полімеру, кон'югованого з пептидами, служить ПЕГ. Використання ПЕГ з метою одержати пептидні лікарські засоби показало зниження імуногенності пептидів. Наприклад, патент US № 4,179,337 розкриває неімуногенні поліпептиди, такі як ферменти і пептидні гормони, зв'язані з ПЕГ або поліпропіленгліколем (ППГ). У доповнення до зниженої імуногенності, час виведення з системи кровообігу збільшений завдяки збільшеному розміру ПЕГ-кон'югату поліпептидів, що розглядаються. Пегфілграстим (МНН) являє собою ковалентний кон'югат рекомбінантного метіонільного людського G-CSF (філграстим) і одиночної 20 кДа молекули монометокси-ПЕГ. Молекула монометокси-ПЕГ ковалентно зв'язана з N-кінцевим метіонільним залишком філграстиму. ® Пегфілграстим продається в Європі під торгівельним найменуванням Neulasta . Основна форма приєднання ПЕГ і його похідних до пептидів являє собою неспецифічне зв'язування через амінокислотний залишок пептиду (див., наприклад, US 4,088,538, US 4,496,689, US 4,414,147, US 4,055,635 і WO 87/00056). Інша форма приєднання ПЕГ до пептидів - через неспецифічне окиснення глікозильних залишків на глікопептиді (див, наприклад, WO 94/05332). У даних неспецифічних методах ПЕГ приєднується випадковим, неспецифічним чином, до реакційноздатних залишків на пептидному скелеті. Випадкове приєднання молекул ПЕГ має свої недоліки, включаючи недостатню однорідність кінцевого продукту і можливість зниження біологічної або ферментативної активності пептиду. Отже, протягом останніх років були зроблені спроби розробити більш сайт-специфічні методи приєднання синтетичного полімеру або іншої мітки до пептиду, і було виявлено, що специфічно кон'юговані однорідні пептидні лікарські засоби можна одержати in vitro за допомогою дії ферментів. Такі кон'югати на основі ферментів мають переваги регіоселективності і стереоселективності. Два основних класи ферментів для застосування в синтезі кон'югованих пептидів являє собою глікозилтрансферази (наприклад, сіалілтрансферази, олігосахарилтрансферази, N-ацетилглюкозамінілтрансферази) і глікозидази. Ці ферменти можуть бути використані для специфічного приєднання цукрів, які надалі можуть бути змінені для того, щоб містити в собі лікарські речовини. Альтернативно, глікозилтрансферази і модифіковані глікозидази можуть бути використані для точного перенесення модифікованого цукру на пептидний скелет (див, наприклад, US 6,399,336 і US 2003/0040037, US 2004/0132640, US 2004/0137557, US 2004/0126838 і US 2004/0142856). Також відомі способи, що поєднують як хімічні, так і ферментативні синтетичні елементи (див, наприклад, US 2004/137557). Добре відомі й детально описані у відомому рівні техніки різні способи кон'югування поліпептидів, таких як G-CSF, з полімерними фрагментами, такими як ПЕГ. Одержання глікопегильованого G-CSF описане, наприклад, в WO 2005/055946. Інша заявка на патент, спрямована на одержання кон'югатів між G-CSF і фрагментами ПЕГ - WO 2006/074467. При цьому способі такі кон'югати утворюються через глікозильну лінкерну групу в незмінному вигляді, розташовану між і ковалентно приєднану до поліпептиду G-CSF і модифікуючої групи. За допомогою дії глікозилтрансферази кон'югати утворюються як з глікозилованого, так і з неглікозилованого поліпептидів G-CSF. Глікозилтрансфераза зшиває фрагменти модифікованого цукру або з амінокислотним, або з глікозильним залишком на поліпептиді. На розкриття WO 2005/055946 і WO 2006/074467 явним чином дається посилання в контексті даного винаходу. Крім ПЕГ, інші полімерні фрагменти також були описані як прийнятні для кон'югування з GCSF й іншими лікувальними білками. WO 02/09766 розкриває, серед інших, біосумісні сполуки білок-полімер, продуковані шляхом кон'югування біологічно активного білка з похідним біосумісного полімеру. Застосовувані біосумісні полімери являють собою високоактивні розгалужені полімери, і одержувані кон'югати містять довгий лінкер між похідним полімеру і білком. Прикладами біосумісних полімерів, згідно WO 02/09766, служать ПЕГ, ППГ, поліоксіетилен (ПОЕ), політриметиленгліколь, полімолочна кислота і її похідні, поліакрилова кислота і її похідні, поліамінокислоти, поліуретан, поліфосфазен, полі(L-лізин), поліалкіленоксид 2 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (ПАО), водорозчинні полімери, такі як полісахарид, декстран, а також неімуногенні полімери, такі як полівініловий спирт (ПВС) і поліакриламід. WO 94/01483 розкриває біосумісні кон'югати полімерів, утворені шляхом ковалентного зв'язування біологічно неактивного полімеру або похідної полімеру з фармацевтично чистим синтетичним гідрофільним полімером, через специфічні типи хімічних зв'язків. Як природні полімери і їх похідні розкриті полісахариди, такі як гіалуронова кислота; протеоглікани, такі як хондроітинсульфати А, В, і С, хітин, гепарин, гепаринсульфат; декстрани, такі як циклодекстран, гідроксіетилцелюлоза, простий ефір целюлози і крохмаль; ліпіди, такі як тригліцериди і фосфоліпіди. WO 96/11953 описує N-кінцеві хімічно модифіковані білкові сполуки і способи їх виробництва. Зокрема описуються сполуки G-CSF, одержувані шляхом зв'язування водорозчинного полімеру з N-кінцем G-CSF. Приклади водорозчинних полімерів, перераховані в WO 96/11953 являють собою співполімери етиленгліколю і пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилен/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або випадкові співполімери), полі(п-вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери ППГ, співполімери оксиду поліпропілену/оксиду поліетилену або поліоксіетильовані багатоатомні спирти. WO 97/30148 описує кон'югати поліпептидів зі зниженою алергенністю, що містять полімерну молекулу-носій з двома або більше зв'язаними з нею молекулами поліпептиду. Ці кон'югати утворюються шляхом активації полімерної молекули-носія, реакції двох або більше молекул поліпептиду з активованою полімерною молекулою-носієм і блокуванням залишкових активних груп сполуки. WO 97/30148 перелічує ряд полімерних молекул-носіїв, включаючи природні або синтетичні гомополімери, такі як багатоатомні спирти, поліаміни, полікарбонові кислоти, і гетерополімери, що містять щонайменше дві різні приєднані групи. Приводяться приклади, що містять в собі зіркоподібні ПЕГ, розгалужені ПЕГ, полівінілові спирти, полікарбоксилати, полівінілпіролідони і полі-D,L-амінокислоти. Кон'югати в WO 97/30148 також містять в собі такі, які містять декстрани, такі як карбоксиметиловий декстран, целюлози, такі як гідроксіетилцелюлоза або гідроксипропілцелюлоза, гідролізати хітозану, крохмалі, такі як гідроксіетилові крохмалі або гідроксипропілові крохмалі, глікоген, агарозу, гуарову камедь, інулін, пулулан, ксантанову камедь, карагінін, пектин, альгінову кислоту і т.д. WO 03/074087 стосується способу зв'язування білків з модифікованими полісахаридами, що одержуються з крохмалю. Процес зв'язування між білком і полісахаридом, гідроксіалкіловим крохмалем, являє собою утворення ковалентного зв'язку між кінцевою альдегідною групою або функціональною групою, що одержується шляхом хімічної модифікації вказаної кінцевої альдегідної групи молекули гідроксіалкілового крохмалю, і функціональною групою білка. Як реакційноздатна група білка розкриті аміногрупи, тіогрупи і карбоксильні групи. WO 2005/014050 описує одержання кон'югатів гідроксіалкілового крохмалю (ГАК) і білка GCSF, де щонайменше одна функціональна група полімеру або його похідного реагує з щонайменше однією функціональною групою білка, тим самим утворюючи ковалентний зв'язок. Інші відомі в даній галузі документи, що стосуються ГАК-ілювання, переважно ГЕК-ілювання (приєднання гідроксіетилового крохмалю), поліпептидів - WO 2005/014655, WO 2005/092390, WO 2007/031266, WO 2005/092928 і WO 2005/092391. Хоча в даній галузі описано декілька підходів до модифікації лікувальних поліпептидів, таких як G-CSF, полімерними фрагментами для того, щоб збільшити час їх виведення і щоб знизити імуногенність, але в розробці вигідних лікарських форм для таких полімер-G-CSF-кон'югантів виконано, мабуть, недостатньо роботи. ® Вищезгаданий продукт Neulasta являє собою рідку композицію, призначену для підшкірних ін'єкцій. Композиція містить пегфілграстим, ацетат натрію, сорбіт, полісорбат 20 і воду для ін'єкцій і має рН, що дорівнює 4,0 (див. http://www.neulasta.com і ROTE LISTE 2007). Продукти ® ® Neulasta і Neupogen , обидва Amgen, що продаються, майже ідентичні відносно буферної ® речовини, допоміжних речовин і значення рН розчину: Neupogen містить філграстим (замість пегфілграстиму), ацетат натрію, сорбіт, полісорбат 80 і воду для ін'єкцій і має рН, що дорівнює 4,0 (див. http://www.Neupogen.com і ROTE LISTE 2007). Даний винахід спрямований на рідкі фармацевтичні композиції, що містять полімер-G-CSFкон'югат, причому композиції були особливим чином розроблені з урахуванням характеристик полімер-G-CSF-кон'югатів. Хоча в даній галузі було опубліковано декілька підходів відносно лікарських форм, що містять некон'юговані G-CSF, про зручні композиції кон'югатів полімер-GCSF відомо мало. 3 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хоча в патентній літературі представлені деякі фармацевтичні композиції, розроблені для некон'югованого G-CSF, так, щоб охопити композиції, в яких некон'югований G-CSF, замінений кон'югатом ΠΕΓ-G-CSF, очевидно, що ці композиції призначені і перевірені тільки для некон'югованого G-CSF. Наприклад, WO 2005/042024 описує стійкі фармацевтичні композиції, що містять G-CSF, причому композиція має значення рН більше 4,0 і додатково містить кислоту, але не містить сурфактантів. Хоча фармацевтична композиція, описана в WO 2005/042024, явно була розроблена для некон'югованого G-CSF, в інструкції згадується, що вона також містить в собі GCSF, хімічно модифікований ПЕГ або т.п., що проявляє таку ж або підвищену біологічну активність. Іншим прикладом служить WO 2005/039620, також спрямована на стійку водну композицію, що містить G-CSF. Композиція містить янтарну кислоту або винну кислоту, або їх солі, як буферні речовини і має переважне значення рН в діапазоні від 4,0 до 5,8. Згідно з інструкцією, білок G-CSF також може бути синтетично модифікований, наприклад, шляхом ферментативного глікозилування або хімічного пегилювання. ЕР 1 260 230 А1 розкриває стійкі лікарські форми білка, що містять триптофан як стабілізатор. Список білків покриває G-CSF, а також G-CSF, хімічно модифікований ПЕГ і т.п. Зазначено, що лікарські форми G-CSF переважно повинні мати рН від 5 до 7, більш переважно від 6,0 до 6,7. Інший приклад являє собою ЕР 1 336 410 А1, яка описує ін'єктовані фармацевтичні лікарські форми, що містять фізіологічно активний білок як активний інгредієнт і щонайменше один цукор як заспокійливий засіб і що мають рН від 6,5 до 7,4. У цьому випадку також зазначено, що GCSF, хімічно модифікований ПЕГ і т.п., також міститься. ЕР 1 329 224 А1 описує лікарську форму розчину G-CSF, що містить щонайменше одну амінокислоту або її сіль, переважно метіонін, як стабілізатор. Лікарські форми розчинів G-CSF переважно повинні мати рН від 5 до 7, більш переважно від 5,5 до 6,8. У цьому випадку також обговорено, що G-CSF, хімічно модифікований ПЕГ і т.п., також міститься. Однак жодна з лікарських форм, відомих в даній галузі, не являє собою лікарську форму, що містить специфічний полімер-G-CSF-кон'югат. Точніше, описувані в патентній літературі розчини розроблялися і випробовувалися тільки для некон'югованого G-CSF. Задача, що лежить в основі даного винаходу - забезпечити композицію полімер-G-CSFкон'югатy, призначеного для таких кон'югатів, яка при цьому була б стійка при підвищених температурах, тобто вище температури холодильника, яка звичайно знаходиться в межах від 2 до 8°С. Додатково, мета даного винаходу - забезпечити фармацевтичну композицію, що не вимагає відновлення ні на одній стадії виготовлення і що спричиняє настільки слабке подразнення при введенні пацієнту, наскільки це можливо. Ці проблеми вирішуються згідно з даним винаходом шляхом одержання водної фармацевтичної композиції, що містить кон'югат полімер-G-CSF, причому рН композиції знаходиться в діапазоні від 4,5 до 5,5. Водна композиція у даному винаході містить сурфактант і необов'язково одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин. У переважному варіанті здійснення композиція не містить амінокислот або їх похідних або солей як стабілізаторів, і не містить винної кислоти і її солей, янтарної кислоти і її солей, як буферних речовин. Несподівано було виявлено, що складання рецептури кон'югату полімер-G-CSF в складі композиції, що має значення рН в діапазоні від 4,5 до 5,5, переважно 5,0, запобігає кислотному гідролізу зв'язку, що створює цей кон'югат. Такийспектр рН підвищує стійкість розчину при температурах вище температури холодильника (2-8°С), особливо при кімнатній температурі (тобто нижче 25°С) і навіть при більш високих температурах, наприклад, при 40°С. Це означає, що композиція може зберігатися без охолоджування протягом тривалого часу без істотної втрати активності і без значного погіршення властивостей. Додатково, не стосовно стійкості при зберіганні, композиції у даному винаході мають перевагу в порівнянні з композиціями, які мають рН, що дорівнює 4,0, оскільки менш кисла композиція спричиняє більш слабке подразнення при введенні пацієнту. Поки не вказано інше, подальші визначення даються для того, щоб проілюструвати і визначити значення і об'єм різних термінів, використовуваних тут для того, щоб описати даний винахід. Термін «кон'югат полімер-G-CSF» стосується кон'югату між поліпептидом G-CSF і полімером, причому кон'югат утворюється за допомогою ковалентного зв'язку між: функціональною групою полімеру і функціональною групою поліпептиду. Кон'югати можуть містити один або більше полімерних фрагментів. 4 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Термін «G-CSF» (або поліпептид G-CSF, або білок G-CSF, або пептид G-CSF) стосується білка, in vivo що має біологічну активність природного людського G-CSF, тобто білка, здатного стимулювати диференціювання і проліферацію гематопоетичних клітин-попередників. G-CSF може бути безпомилково визначений як G-CSF згідно з аналізом, описаним у Stute, N., et al. «Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children» (1992) Blood 79 (11), сторінки 2849-2854. У зразковому варіанті здійснення G-CSF має амінокислотну послідовність згідно з подальшою SEQ ID NО:1 або SEQ ID NО:2, де SEQ ID NО:1 відображає амінокислотну послідовність дикого типу людського метіоніл-G-CSF, таку, яка продукується в Е. соlі, і SEQ ID NО:2 відображає амінокислотну послідовність людського G-CSF, таку, яка продукується в клітинах ссавців, наприклад, в клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО). SEQ ID NО:1 являє собою 175-амінокислотний варіант, в якому перша амінокислота являє собою метіонін і в якому присутній треоніновий залишок на Thr 134. SEQ ID NО:2 являє собою 174-амінокислотний варіант, що має таку ж послідовність амінокислот, як і 175-амінокислотний варіант, за винятком того, що перший метіонін відсутній, таким чином послідовність починається з Τ і треоніновий залишок присутній в положенні 133. Фахівець в даній галузі без великих зусиль зрозуміє, що даний винахід не обмежується відображеними тут послідовностями, але також включає в себе варіанти G-CSF. Такі варіанти добре відомі в даній галузі. Вони можуть містити видалення, заміни або додавання однієї або більше амінокислоти у відображених вище амінокислотних послідовностях, зберігаючи при цьому біологічну активність природного G-CSF. Як приклади, але ніяким чином не призначені для обмеження даного винаходу, варіанти G-CSF описані в WO 01/87925, ЕР 0 456 200 A, US 6,166,183, US 6,004,548, US 5,580,755, US 5,582,823, US 5,675,941, US 5,416,195, US 5,399,345, WO 2005/055946 і WO 2006/074467. Поліпептид G-CSF може бути глікозилованим або неглікозилованим. У переважному варіанті здійснення поліпептид G-CSF являє собою рекомбінантний людський G-CSF, продукований в Е. соlі, тобто що має амінокислотну послідовність, відображену вище в SEQ ID NО:1 або її варіант. Полімер може бути будь-яким полімером, який може бути ковалентно зв'язаний з поліпептидом G-CSF і який утворює терапевтично корисний полімер-G-CSF-кон'югат при ковалентному зв'язуванні з поліпептидом G-CSF. Декілька прийнятних полімерів вже згадувалися вище у ввідній частині, включаючи полі(алкіленгліколі), такі як ПЕГ і ППГ, гідроксіалкілові крохмалі, такі як гідроксіетилові крохмалі (ГЕК), а також полімери, описані в WO 02/09766, WO 96/11953 і WO 97/30148 в зв'язку з кон'югатами полімер-поліпептид. У переважному варіанті здійснення полімер являє собою ПЕГ. Всі характеристики концентрації в мг/мл, застосовувані надалі в зв'язку з кон'югатом полімер-G-CSF, стосуються тільки фрагменту G-CSF. Фрагмент ПЕГ за визначенням не розглядається відносно концентрації по масі. У той час як філграстим має молекулярну вагу близько 18-19 кДа, пегфілграстим - набагато більше, завдяки фрагменту монометокси-ПЕГ, і має молекулярну вагу близько 39 кДа. Полімер 5 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 G-CSF-кон'югати у даному винаході можуть мати молекулярну вагу в діапазоні від 20 до 60 кДа, переважно в діапазоні від 35 до 45. У даній галузі розкриті прийнятні ПЕГ, наприклад, в WO 2005/055946, WO 2006/074467 і WO 01/87329. Фрагмент ПЕГ може бути лінійним або розгалуженим і мати розміри від 5 до 40 кДа. Переважно, щоб фрагмент ПЕГ мав молекулярну вагу від 15 до 25 кДа, більш переважно близько 20 кДа. Способивиробництва полімер-G-CSF-кон'югатів також описані в даній галузі. Документи, згадані вище в зв'язку з композиціями кон'югатів між поліпептидами і полімерними фрагментами, даним включені сюди у вигляді посилань. Інші полімер-G-CSF-кон'югатy, корисні у даному винаході, детально описані в WO 96/11953, ЕР 822 199 A, WO 01/51510, WO 2006/0128460, ЕР 921 131 А і ЕР 744 409. Даним явним чином робиться посилання на відкриття цих документів, тобто на описані в них кон'югати і способи їх виробництва. Фахівець в даній галузі без великих зусиль визначить, що даний винахід не обмежується кон'югатами, в яких полімер, такий як ПЕГ, або ГЕК, прямо пов'язаний з амінокислотним залишком білка, але також охоплює кон'югати, в яких полімерний фрагмент і поліпептид G-CSF зв'язані один з одним через лінкер. Наприклад, зручними лінкерами всередині кон'югатів у даному винаході служать глікозильні лінкерні групи, розташовані між поліпептидом і фрагментами ПЕГ. WO 2006/074467 описує такі полімер-G-СSF-кон'югати, в яких поліпептид GCSF і полімерний фрагмент зв'язані один з одним через глікозильний лінкер або неглікозильний лінкер, наприклад через заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл. Дане розкриття WO 2006/0744467 явним чином включено сюди у вигляді посилання. Термін «ΠΕΓ-G-CSF» (пегильований G-CSF) стосується білка G-CSF, який ковалентно зв'язаний з одним або більше фрагментами поліетиленгліколю, як описано нижче. Група(и) ПЕГ і білок G-CSF можуть бути зв'язані один з одним або безпосередньо, або через лінкер, наприклад, глікозильний лінкер. В одному варіанті здійснення даного винаходу кон'югат пептиду полімер-G-CSF одержують згідно зі способом, описаним в WO 2006/074467. У переважному варіанті здійснення полімер-GCSF являє собою кон'югат пептиду ΠΕΓ-G-CSF, що має глікозильну лінкерну групу, розташовану між модифікуючим фрагментом ПЕГ і поліпептидом G-CSF. Такий кон'югат згадується як «глікопегильований» G-CSF. У зразковому варіанті здійснення молекули «глікопегильованого» G-CSF у даному винаході продукуються шляхом опосередкованого ферментами утворення кон'югату між глікозилованим або неглікозилованим пептидом G-CSF і ферментативно переношуваним фрагментом сахарилу, що містить в собі фрагмент поліетиленгліколю всередині своєї структури. Фрагмент ПЕГ приєднаний до фрагмента сахарилу прямо (тобто через єдину групу, утворену шляхом реакції двох реакційноздатних груп) або через фрагмент лінкера, наприклад, через заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл і т.д. Лінкерною групою глікозиду можуть бути фрагменти сіалової кислоти, одержувані з ПЕГ. У переважному варіанті здійснення у даному винаході глікозильний лінкер зв'язаний з білком G-CSF через О-глікозилування, переважно через О-глікозилування по треоніновому залишку білка G-CSF. Переважно, щоб глікозильний лінкер містив в собі моно-, ди- або олігосахарид, більш переважно, щоб глікозильний лінкер містив в собі сіалову кислоту і N-ацетилгалактозамін. В одному варіанті здійснення даного винаходу кон'югат пептиду полімер-G-CSF містить в собі фрагмент: де R1 являє собою фрагмент, що містить в собі лінійний або розгалужений залишок поліетиленгліколю, і L являє собою лінкер, який являє собою елемент, вибраний з пари: заміщений або незаміщений алкіл і заміщений або незаміщений гетероалкіл; і де пептид глікозилований глікозильним залишком, і де даний фрагмент ковалентно зв'язаний з глікозильним залишком. Переважно, щоб глікозильним залишком був N-ацетилгалактозамін. У 6 UA 98001 C2 5 переважному варіанті здійснення пептид G-CSF глікозилований по треоніновому залишку, переважно по треоніновому залишку в 134-ому положенні (розраховано для поліпептиду метіоніл-G-CSF, тобто що має N-кінцевий метіонін і в загальній складності 175 амінокислот). У переважному варіанті здійснення R1 являє собою лінійний залишок поліетиленгліколю, a L являє собою гетероалкіл. Вищеописаний кон'югат пептиду G-CSF може бути одержаний за способом, що включає в себе (а) приведення субстрату пептиду G-CSF в контакт з донором ПЕГ-сіалової кислоти, що має формулу: 10 15 20 25 30 35 де R1 і L визначені вище, а також з ферментом, здатним переносити фрагмент ПЕГ-сіалової кислоти з донора на глікозильний залишок субстрату пептиду G-CSF. У переважному варіанті здійснення фермент являє собою сіалілтрансферазу, наприклад, ST6GalNAcI, як описано в WO 2005/055946. Кон'югат пептиду G-CSF, описаний вище, може бути одержаний за способом, що включає в себе (а) приведення неглікозилованого субстрату пептиду G-CSF в контакт з глікозильним донором і ферментом, здатним переносити фрагмент глікозилу з донора на субстрат пептиду G-CSF і (b) приведення глікозилованого пептиду G-CSF в контакт з донором ПЕГ-сіалової кислоти, що має формулу: де R1 і L визначені вище, а також з ферментом, здатним переносити фрагмент ПЕГ-сіалової кислоти з донора на глікозильний залишок субстрату пептиду G-CSF, причому (а) і (b) являє собою або послідовні, або одночасні реакції. У переважному варіанті здійснення донор глікозилу являє собою UDP-N-ацелілгалактозамін. У переважному варіанті здійснення фермент в (а) являє собою N-ацелілгалактозамінтрансферазу, і фермент в (b) являє собою сіалілтрансферазу, наприклад, GalNAcT2 в (а) і ST6GalNAcI в (b). G-CSF може бути продукований шляхом хімічних методик синтезу або може походити з будь-яких джерел, як людських, так й інших ссавців, і може бути одержаний шляхом очищення з природних джерел, таких як людська плацента, людська кров або людська сеча. Додатково, багато які епітеліальні карциноми, клітини, уражені гострим мієлолейкозом і різні пухлинні клітинні лінії здатні експресувати цей фактор. Переважно, щоб G-CSF був продукований рекомбінантним шляхом. Це включає в себе експресію прокаріотичних або еукаріотичних хазяїнів екзогенних послідовностей ДНК, одержаних з геномної ДНК або шляхом клонування кДНК, або шляхом синтезу ДНК. Прийнятні прокаріотичні хазяїни містять в собі різні бактерії, такі як Е. соlі., де Е. соlі є переважним 7 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 хазяїном. Прийнятні еукаріотичні хазяїни містять в собі дріжджі, такі як S. cerevisiae, і клітини ссавців, такі як клітини яєчників китайського хом'ячка і клітини мавп. У даній галузі відоме рекомбінантне продукування білка, такого як G-CSF. Як правило, воно містить в собі трансфекцію клітин-хазяїнів відповідними експресійними векторами, культивацію клітин-хазяїнів за умов, що дозволяють продукування білка, а також очищення білка від клітинхазяїнів. Для одержання докладної інформації, див., наприклад, Souza, L. Μ. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science (1986) 232: 61-65; Nagata, S. et al. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature (1986) 319: 415-418; Komatsu, Y. et al. 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn. J. Cancer Res. (1987) 78: 1179-1181. У переважному варіанті здійснення G-CSF має амінокислотну послідовність зрілого людського G-CSF (див., наприклад, Nagata, S et al. (1986), див. вище), і може додатково містити метіонін на своєму N-кінці, стаючи, таким чином, білком із 175 амінокислот (див. SEQ ID NО:1 вище). Крім того, замість метіоніну G-CSF може містити сериновий або треоніновий залишок. Потім білок очищують згідно із загальноприйнятим протоколом послідовної обробки. Прийнятні для G-CSF способи очищення описані в даній галузі техніки, наприклад, в WO 87/01132, ЕР 0 719 860 А, ЕР 1 458 757мА, ЕР 1 527 188 A, WO 03/051922, WO 01/04154 і WO 2006/097944. В одному з варіантів здійснення даного винаходу кон'югат пептиду полімер-G-CSF одержують, як описано в приведеному тут прикладі 1. Цей кон'югат характеризується тим, що поліпептид G-CSF і фрагмент ПЕГ зв'язані через N-ацетилгалактозамінільну (GalNAc) групу і сіаловокислу (SA) групу. Кон'югат має наступну структуру: G-CSF-GalNAc-SA-ΠΕΓ де R1 і L відповідають визначеним вище, а АА являє собою амінокислотний залишок G-CSF. У зразкових варіантах здійснення R1 являє собою лінійний фрагмент, зв'язаний через сіаловокислу групу і GalNAc групу з поліпептидом G-CSF, як показано нижче: 30 де L відповідає визначеному вище, АА являє собою амінокислотний залишок G-CSF, і f ціле число, взяте в проміжку від 1 до 2500. У деяких варіантах здійснення кон'югат полімер-G-CSF має наступну формулу: 35 де АА являє собою треонін 133 (треонін 134, якщо є N-кінцевий метіонін) G-CSF, і f являє собою ціле, взяте в проміжку від 1 до 2500. 8 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фармацевтична композиція у даному винаході являє собою рідку композицію, наприклад, водний розчин. Для ін'єкцій переважно застосовувати чисту воду як розчинник. Проте, також можуть бути використані інші розчинники, прийнятні і загальноприйняті для фармацевтичних композицій. У переважному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтичні композиції являють собою ізотонічні розчини. Додатково, ні на якій стадії виготовлення лікарської форми рідкого розчину у даному винаході не виникає необхідності у відновленні. Розчин являє собою готову до застосування лікарську форму. Фармацевтична композиція у даному винаході має рН в діапазоні від 4,5 до 5,5. У переважному варіанті здійснення значення рН знаходиться між 4,7 і 5,3. більш переважно між 4,8 і 5,2 і найбільш переважно між 4,9 і 5,1. Якщо для досягнення бажаного діапазону рН потрібне його регулювання, то рН регулюється за допомогою прийнятних розчинів; за допомогою кислих розчинів у випадку, якщо виявлене зменшення значення рН, і за допомогою лужних розчинів у випадку, якщо виявлене збільшення значення рН. Прийнятними кислими розчинами є, наприклад, соляна кислота, фосфорна кислота, лимонна кислота і кислий фосфат натрію або калію. Прийнятними лужними розчинами є гідроксиди лужних і лужноземельних металів, лужні карбонати, лужні ацетати, лужні цитрати і двозаміщені кислі фосфати, наприклад, гідроксид натрію, ацетат натрію, карбонат натрію, цитрат натрію, двозаміщений фосфат натрію або калію, аміак. Переважно, щоб регулювання рН розчину проводилося за допомогою гідроксиду натрію. Як наслідок, лікарська форма у даному винаході може містити іони натрію. Натрій звичайно присутній в концентрації менше 10 ммоль/л, як правило, менше 6 ммоль/л. Фармацевтична композиція у даному винаході містить один або більше сурфактантів. Типові приклади сурфактантів містять в собі: неіонні сурфактанти, наприклад, сорбітанові ефіри жирних кислот, такі як монокаприлат сорбітану, монолаурат сорбітану, монопальмітат сорбітану; гліцеринові ефіри жирних кислот, такі як монокаприлат гліцерину, мономіристат гліцерину, моностеарат гліцерину; полігліцеринові ефіри жирних кислот, такі як декагліцерилмоностеарат, декагліцерилдистеарат, декагліцерилмонолінолеат; поліоксіетиленові сорбітанові ефіри жирних кислот, такі як поліоксіетиленсорбітанмонолаурат, поліоксіетиленсорбітанмоноолеат, поліоксіетиленсорбітанмоностеарат, поліоксіетиленсорбітанмонопальмітат, поліоксіетиленсорбітантриолеат, поліоксіетиленсорбітантристеарат; поліоксіетиленові сорбітолові ефіри жирних кислот, такі як поліоксіетиленсорбітолтетрастеарат, поліоксіетиленсорбітолтетраолеат; поліоксіетиленові гліцеринові ефіри жирних кислот, такі як поліоксіетиленгліцерилмоностеарат; поліетиленгліколеві ефіри жирних кислот, такі як поліетиленгліколь дистеарат; поліоксіетиленалкілові ефіри, такі як поліоксіетиленлауриловий ефір; поліоксіетиленполіоксипропіленалкілові ефіри, такі як поліоксіетиленполіоксипропіленгліколевий ефір, поліоксіетиленполіоксипропіленпропіловий ефір, поліоксіетиленполіоксипропіленцетиловий ефір; поліоксіетиленалкілфенілові ефіри, такі як поліоксіетиленонілфеніловий ефір; поліоксіетиленові отвердженні касторові масла, такі як поліоксіетиленове касторове масло, поліоксіетиленове отверджене касторове масло (поліоксіетиленове гідрогенізоване касторове масло); поліоксіетиленові похідні воску, такі як поліоксіетиленсорбітоловий віск; поліоксіетиленові похідні ланоліну, такі як поліоксіетиленланолін; поліоксіетиленові аміди жирних кислот, такі як поліоксіетиленовий амід стеаринової кислоти з гідрофільно-ліпофільним балансом в діапазоні 6-18; аніонові сурфактанти, наприклад, алкілові сульфати, що мають С10-18 алкільну групу, такі як цетилсульфат натрію, лаурилсульфат натрію, олеїлсульфат натрію; сульфати поліоксіетиленалкілових ефірів, що мають середнє число молей оксиду етилену від 2 до 4 і С1018 алкільну групу, такі як поліоксіетиленлаурилсульфат натрію; солі алкілових ефірів сульфоянтарної кислоти, що мають С8-18 алкільну групу, такі як лаурилсульфосукцинат натрію; а також природні сурфактанти, наприклад, лецитин, гліцерофосфоліпіди; сфінгофосфоліпіди, такі як сфінгомієлін; цукрозні ефіри жирних кислот з С12-18 жирними кислотами. Один або більше цих сурфактантів можуть бути додані в поєднанні до лікарських форм у даному винаході. Переважні сурфактанти являють собою поліоксіетиленсорбітаналкілові складні ефіри, більш переважно Полісорбати 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85, найбільш переважно Полісорбати 20 і 80. Концентрація детергенту в лікарській формі, як правило, знаходиться в діапазоні від 0,0005 % (ваг./об.) до 0,05% (ваг./об.), переважно від 0,001% (ваг./об.) до 0,01% (ваг./об.), більш переважно від 0,002% (ваг./об.) до 0,006% (ваг./об.) і найбільш переважно від 0,003% (ваг./об.) до 0,004% (ваг./об.), в загальному об'ємі лікарської форми розчину. 9 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Звичайно лікарські форми за даним винаходом містять сурфактант Полісорбат 20 або 80 в концентрації 0,003% (ваг./об.), 0,0033% (ваг./об.) або 0,004% (ваг./об.). полісорбат 20 є переважним. Лікарська форма у даному винаході містить фізіологічно прийнятну буферну речовину. В галузі лікарських форм розчинів відомі прийнятні буфери, наприклад, фосфатні буфери (переважно, система моногідрофосфат натрію - дигідрофосфат натрію), цитратні буфери, лактатні буфери, ацетатні буфери, карбонатні буфери. BisTris, MES, а також гліцин-НСІ. Переважне застосування ацетатних буферів, тобто оцтової кислоти або її солі, наприклад, лужних або амонійних солей. Буферна речовина звичайно присутня в лікарській формі в концентрації від 1 до 100 ммоль/л, переважно від 2 до 50 ммоль/л і найбільш переважно від 5 до 20 ммоль/л. В переважному варіанті здійснення буфер присутній в концентрації 10 ммоль/л, найбільш переважно ацетат присутній в концентрації 10 ммоль/л. Концентрація буфера, наприклад, ацетату, вибирається таким чином, щоб забезпечити як достатню буферну ємність, так і стабілізацію рН. Однак в той же час іонна концентрація і, отже, провідність розчину зберігаються настільки низькими, наскільки можливо, щоб уникнути утворення агрегатів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу провідність кінцевої лікарської форми розчину менше, ніж 1,0 мсим/см, переважно менше, ніж 0,8 мсим/см і більш переважно менше, ніж 0,5 мсим/см. Додатково, переважно, щоб композиція не містила винної кислоти і янтарної кислоти, а також їх солей. Також переважно, щоб розчин не містив HEPES, TES і трицину. Також переважно, щоб лікарська форма за даним винаходом не містила сульфат-іонів. Далі, в переважному варіанті здійснення, лікарська форма не містить консервантів, де під консервантами маються на увазі речовини, традиційно використовувані як консерванти для підвищення стійкості при зберіганні і які в нормальній концентрації мають бактерицидний ефект. Зокрема лікарська форма не містить консервантів, таких як хлоретан, бензиловий спирт, пхлор-м-крезол, і діалкіловий ефір пірокарбонової кислоти і хлориду бензалконію. У варіанті здійснення даного винаходу лікарська форма додатково містить багатоатомний спирт, переважно цукровий спирт, найбільш переважно маніт або сорбіт, як регулятор тонічності. Особливо переважний сорбіт. Кількість цукрового спирту, такого як сорбіт або маніт, становить звичайно але до 10,0% (ваг./об.) в загальному об'ємі розчину. Переважно, щоб концентрація становила аж до 8,0% (ваг./об.), більш переважно аж до 6% (ваг./об.) і найбільш переважно 5,0% (ваг./об.). У переважному варіанті здійснення сорбіт присутній в кількості 5,0% (ваг./об.). Додатково, переважно, щоб лікарська форма розчину за винаходом не містила стабілізуючих речовин, вибраних з амінокислот, їх похідних і солей, полімерних стабілізуючих речовин і білковоподібних стабілізуючих речовин. Лікарські форми у даному винаході, що містять кон'югат полімер-G-CSF, звичайно вводяться через парентеральні шляхи, такі як ін'єкція (підшкірна, внутрішньовенна або міжм'язова ін'єкція), або введенням через шкіру, слизову, назально або пульмонарно, але також можуть вводитися орально. Кон'югат полімер-G-CSF звичайно присутній в лікарській формі в концентрації від 1,0 до 30,0 мг/мл, переважно від 5,0 до 20,0 мг/мл і найбільш переважно від 8,0 до 12,0 мг/мл. У переважному варіанті здійснення кон'югат полімер-G-CSF являє собою ΠΕΓ-SA-GalNAc-G-CSF, присутній в кількості 10,0 мг/мл. У переваленому варіанті здійснення лікарська форма містить кон'югат полімер-G-CSF як активний інгредієнт, сурфактант, буферну речовину, регулятор тонічності, іони натрію і воду, і не містить ніяких інших складових. Найбільш переважна водна композиція у даному винаході, що містить глікопегильований G-CSF як активну речовину, Полісорбат 20 і/або Полісорбат 80 як сурфактант, сорбіт і/або маніт як регулятор тонічності, ацетат як буфер, а також натрій, і ніяких інших допоміжних речовин. В іншому аспекті винаходу водна композиція за винаходом, як описано вище, розріджується для того, щоб одержати розбавлену водну композицію, прийнятну до застосування в педіатрії. Відповідні розведення для лікування дітей досягаються у даному винаході шляхом розріджування вищеописаного розчину в співвідношенні від 1:2 до 1:8. Винахід також стосується фармацевтичної упаковки, що містить водну композицію у даному винаході або розбавлений розчин, одержаний з неї шляхом розріджування. Прийнятні фармацевтичні упаковки відомі з рівня техніки. Упаковка може бути, наприклад, шприцом, флаконом, пляшечкою для вливання, ампулою або карпулою. У переважному варіанті 10 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 здійснення, коли упаковка являє собою шприц, цей шприц забезпечений системою захисту голки. Такі системи захисту голки, добре відомі з рівня техніки, допомагають знизити ризик пошкоджень. В іншому варіанті здійснення, упаковка являє собою карпулу всередині шприцаручки. Даний винахід також стосується способу одержання водної композиції за винаходом, в якій кон'югат полімер-G-CSF як активна речовина додається до водної композиції, що має рН в діапазоні від 4,5 до 5,5 і що містить сурфактант й інші фармацевтичні допоміжні речовини. В іншому аспекті даний винахід стосується застосування водної композиції за винаходом для лікування або запобігання нейтропенії. Додатково, водна композиція за винаходом може успішно застосовуватися для лікування або запобігання неврологічним порушенням або в зв'язку з пересадкою кісткового мозку. Загалом фармацевтичні розчини за даним винаходом корисні для активації стволових клітин. Виявилося, що фармацевтична рідка лікарська форма за даним винаходом виявляє дуже хорошу стійкість при зберіганні. В обсязі даного винаходу під терміном «стійкий при зберіганні» розуміється, що вміст активного кон'югату полімер-G-CSF все ще становить 80% або більше від вихідної концентрації після трьох місяців зберігання складу при 25°С. Переважно, щоб після зберігання протягом трьох місяців при 25°С активність, що збереглася G-CSF становила щонайменше 85%, більш переважно щонайменше 90% і найбільш переважно 95% від первинної активності. Активність кон'югату полімер-G-CSF може бути визначена за допомогою загальноприйнятих тестів активності, як вони описані у відомому рівні техніки, див., наприклад, Draft Monographie «Filgrastim Concentrated Solution» PharmEur. Vol. 19, No. 1, Jan. 2007, or Stute, N., et al. «Pharmacokinetics of subcutaneous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in children 1» (1992) Blood 79 (11), pages 2849-2854. Вимірювання активності G-CSF in vitro описане, наприклад, у Shirafuji, N. et al. 1989, A new bioassay for human granulocyte coluny-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. (1989) 17, 116-119. Для вимірювання активності G-CSF in vivo див., наприклад, Tanaka, Η. et al. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research (1991) 51,3710-3714. Подальші публікації, в яких описуються тести для вимірювання активності G-CSF, описані в US 6,555,660; Nohynek, G. J. et al. 1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and non-neutropenic CD rats, Cancer Chemother. Pharmacol. (1997) 39, 259-266. Чистота кон'югату полімер-G-CSF, застосовуваного в лікарській формі згідно з даним винаходом, повинна бути щонайменше 95%, переважно щонайменше 97, більш переважно щонайменше 99% і найбільш переважно більш ніж 99%. Ступінь чистоти може бути визначений засобами ВЕРХ-аналізу. Прийнятні матеріали і протоколи для проведення таких аналізів можуть бути одержані з комерційних джерел, таких як Vydac або TOSOH Bioscience (http://www.tosohbiosep.de). Компоненти для одержання розчинів за даним винаходом можуть бути придбані з традиційних джерелах, наприклад в компаніях, таких як Sigma або Merck. Продукція лікарської форми у даному винаході може бути одержана традиційними способами. Компоненти лікарської форми можуть бути розчинені у водному буфері. Або ж кон'югат вже може бути одержаний у водному буфері в результаті процесу очищення. І нарешті, готова рідка лікарська форма заливається у прийнятну фармацевтичну упаковку, де зберігається до свого застосування. Подальші приклади призначені для того, щоб пояснити даний винахід, без обмеження його обсягу. Приклади Приклад 1. Одержання G-CSF-GalNAc-SA-ЛЕГ Наступний приклад ілюструє одержання G-CSF-GalNAc-SA-ΠΕΓ (а) способом з двох послідовних стадій, в якому кожний проміжний продукт очищається перед використанням на наступній стадії, і (b) одностадійним способом з одночасним доданням ферментів. а. Двостадійний спосіб Одержання G-CSF-GalNAc (pH 6.2) з G-CSF і UDP-GalNAc з використанням GalNAc-T2. G-CSF (960 мкг) у 3,2 мл запакованого буфера концентрували шляхом ультрафільтрації за допомогою УФ фільтра (номінальне відсікання по молекулярній масі 5000), а потім відновлювали 1 мл 25 мМ MES-буфера (рН 6,2, 0,005% NaN3). Потім додавали UDP-GalNAc (6 11 UA 98001 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 мг, 9,24 мМ), GalNAc-T2 (40 мкл, 0,04 U), а також 100 мкМ МnСІ2 (40 мкл, 4 мМ), і одержаний розчин інкубували при кімнатній температурі. Через 24 години MALDI показала, що реакція завершена. Реакційну суміш тут же піддавали очищенню методом високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи SEC (Superdex 75 і Superdex 200) і елююючий буфер, що складається з PBS (фосфатно-сольовий буфер, рН 4,9 і 0,005% Tween 80). Зібраний G-CSF-GalNAc концентрували за допомогою фільтра Centricon 5 кДа MWCO до приблизно 150 мкл, а потім об'єм доводили до 1 мл за допомогою PBS (фосфатно-сольовий буфер, рН 4,9 і 0,005% Tween 80). Кінцева концентрація білка становила 1 мг/мл (А28о), вихід 100%. Зразок зберігали при 4°С. Одержання G-CSF-GalNAc-SA-ΠΕΓ за допомогою очищеного G-CSF-GalNAc, CMP-SA-ΠΕΓ (20 кДа) і ST6GalNAc-TI миші (рН 6,2) Буфер розчину G-CSF-GalNAc, що містить 1 мг білка, замінювали на буфер MES 25 мМ (рН 6,2, 0,005% NaN3) і додавали CMP-SA-ΠΕΓ (20 кДа) (5 мг, 0,25 мкмоль). Після розчинення додавали МnСl2 (розчин 100 мкл, 100 мМ) і ST6GalNAc-I (100 мкл, фермент миші), і реакційну суміш повільно збовтували при 32°С протягом трьох днів. Реакційну суміш концентрували шляхом ультрафільтрації (Номінальне відсікання по молекулярній масі 5000), і буфер замінювали на 25 мМ NaOAc (рН 4,9) один раз, і потім концентрували до загального об'єму 1 мл. Потім продукт очищали за допомогою SP-сефарози (А: 25 мМ NaOAc+0,005% tween-80 рН 4,5; В: 25 мМ NaOAc+0,005% Tween-80 pH 4,5+2М NaCl) з часом утримування 13-18 хв і SEC (Superdex 75; PBS-pH 7,2, 0,005% Tween 80) з часом утримування 8,6 хв (Superdex 75, потік 1 мл/хв). Потрібні фракції збирали, концентрували до 0,5 мл і зберігали при 4°С. b. Одностадійний спосіб Однореакторний («one-pot») процес з використанням ST6GalNAc-I миші (рН 6,0) G-CSF (960 мкг білка, розчиненого у 3,2 мл буфера лікарської форми продукту) концентрували шляхом ультрафільтрації (Номінальне відсікання по молекулярній масі 5000) до 0,5 мл і відновлювали 25 мМ буфером MES (рН 6,0, 0,005% NaN3) до загального об'єму близько 1 мл або до концентрації білка 1 мг/мл. Потім додавали UDP-GalNAc (6 мг, 9,21 мкмоль), GalNAc-T2 (80 мкл, 80мU), СМР-SA-ПΕΓ (20 кДа) (6 мг, 0,3 мкмоль) і фермент миші ST6GalNAc-I (120 мкл), а також 100 мМ МnСl2 (50 мкл). Розчин збовтували при 32°С протягом 48 годин і очищали при стандартних умовах хроматографії на SP-сефарозі. В результаті одержували 0,5 мг білка (Α280) або близько 50% загального виходу. Структура продукту була підтверджена за допомогою аналізу і MALDI, і SDS-PAGE. Однореакторний («one-pot») процес з використанням ST6GalNAc-I курки (рН 6,0). 14,4 мг G-CSF концентрували до кінцевого об'єму 3 мл, замінили буфер 25 мМ буфера MES (рН 6,0, 0,05% NaN3, 0,004% Tween 80) і об'єм доводили до 13 мл. Потім додали UDP-GalNAc (90 мг, 150 мкмоль), GalNAc-T2 (0,59 U), CMP-SA-ПЕГ-20 кДа (90 мг), ST6GalNAc-I курки (0,44 U), а також 100 мМ МnСl2 (600 мкл). Одержану суміш витримували при кімнатній температурі протягом 60 годин. Потім реакційну суміш концентрували за допомогою УФ (Номінальне відсікання по молекулярній масі 5000) і центрифугування. Залишок (близько 2 мл) розчиняли в 25 мМ буфері NaOAc (рН 4,5) і знову концентрували до кінцевого об'єму 5 мл. Даний зразок очищали за допомогою SP-сефарози протягом приблизно 10-23 хв, SEC (Superdex 75, 17 хв, швидкість подачі 0,5 мл/хв) і додатковим SEC (Superdex 200, 23 хв, швидкість подачі 0,5 мл/хв), одержавши 3,6 мг (25% від загального виходу) G-CSF-GalNAc-SA-ПЕГ-20 кДа (A280 і аналіз методом ВСА). Приклад 2. Рідка лікарська форма кон'югату полімер-G-CSF (ΠΕΓ-SA-GalNAc-G-CSF) Рідку лікарську форму, що містить глікопегильований G-CSF (кон'югат, що має структуру: ΠΕΓ-SA-GalNAc-G-CSF), одержували шляхом змішування наступних компонентів у водному розчині ацетатного буфера: Компонент Глікопегильований G-CSF 10 мг/л Ацетат 10 мМ Сорбіт 5,0% (ваг./об.) Полісорбат 20 0,0033% (ваг./об.) Натрій 4,38 мМ рН 5,0 50 Значення рН композицій регулювали шляхом додання NaOH. Якість всіх компонентів знаходиться відповідно до встановленої Європейською фармакопеєю (Ph. Eur.). 12 UA 98001 C2 5 Додатково, була одержана та ж композиція або з рН 4,5, або з рН 5,5, і пропорційно меншим або більшим вмістом натрію, відповідно. Також одержували лікарську форму для порівняння, ® що має рН 4,0 (як у композиції Neulasta ). Приклад 3. Тест на стійкість лікарських форм згідно з даним винаходом Композиції, рН 4,5, 5,0 і 5,5 приводили до однакового об'єму по 500 мкл/флакон і зберігали при 2-8°С і при 25°С. Через 1,2, З, 4,5, 6, 8, 12 і 15 місяців зразки досліджували за параметрами тесту, приведеними в таблиці нижче. Очікувані характеристики були такими, як указано для композиції, що має рН 5,0: Параметр тесту Зовнішній вигляд Вміст Вміст Активність Ідентичність Чистота Чистота Чистота Чистота Деамідування Спосіб Візуальний контроль UV-VIS RP-HPLC (30°С) Біоаналіз SDS-PAGE Western Blot RP-HPLC (60°C) RP-HPLC (30°C) SEC IEF Характеристика Абсолютно безбарвний 10 мг/мл ± 5% 10мг/мл ± 5% 54-156% Відповідає стандартному зразку Відповідає стандартному зразку Окиснення