Антагоніст толл-подібного рецептора 3

Реферат: Винахід належить до антитіла-антагоніста толл-подібного рецептора 3 (TLR3), полінуклеотиду, що кодує антитіло-антагоніст TLR3, і способу виготовлення вищезгаданого антитіла. UA 112282 C2 (12) UA 112282 C2 UA 112282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується антитіл, які є антитілами-антагоністами толл-подібного рецептора 3 (TLR3), полінуклеотидів, які кодують антитіла-антагоністи TLR3 або їх фрагменти, а також способів отримання і використання названих продуктів. Передумови створення винаходу Толл-подібний рецептор (TLR) регулює активацію уродженої імунної відповіді, а також розвиток адаптивного (специфічного) імунітету, активуючи каскади внутрішньоклітинної передачі сигналу у відповідь на зв'язування бактерійних, вірусних, паразитичних, а в деяких випадках і ендогенних лігандів (Lancaster et al., J. Physiol. 563: 945-955, 2005). Розташовані на плазматичній мембрані TLR, TLR1, TLR2, TLR4 і LR6 розпізнають ліганди, включаючи білкові або ліпідні компоненти бактерій і грибків. Толл-подібні рецептори, TLR3, TLR7 і TLR9, переважно внутрішньоклітинні, активуються дволанцюжковими РНК, одноланжюжковими РНК і неметилованими CpG ДНК, відповідно. Вважається, що дисрегуляція сигнального шляху TLR є причиною множини проблем, і терапевтичні стратегії розвиваються в цьому напрямку (Hoffman et al., Nat. Rev. Drug Discov. 4:879-880, 2005; Rezaei, Int. Immunopharmacol. 6:863-869, 2006; Wickelgren, Science 312:184-187, 2006). Наприклад, антагоністи TLR4, а також TLR 7 і TLR 9, проходять клінічні випробування можливості їх застосування для лікування тяжкого сепсису і системного червоного вовчака, відповідно (Kanzler et al., Nat. Med. 13: 552-559, 2007). Сигнальний шлях TLR3 активується дволанцюжковою РНК, матричною РНК або РНК, що вивільняється некротичними клітинами при запаленні або вірусній інфекції. Активація TLR3 індукує секрецію інтерферонів і прозапальних цитокінів, а також приводить до активації і збільшення числа імунних клітин, захищаючи таким чином від деяких мікробних інфекцій. Наприклад, виявлений зв'язок домінантно-негативного алелю TLR3 з підвищеною сприйнятливістю до енцефаліту, викликаного вірусом простого герпесу, після первинного інфікування вірусом HSV-1 в дитячому віці (Zheng et al., Science 317:1522-1527 2007). У мишей недостача TLR3 пов'язана зі зниженою виживаністю при експериментальному зараженні вірусом Коксакі (Richer et al., PLoS One 4:e4127, 2009). Проте, показано, що порушена регуляція сигнального шляху TLR3 стосується захворюваності і смертності при певних вірусних інфекціях, в тому числі викликаних вірусом западнонільської лихоманки, флебовірусом, вірусом коров'ячої віспи і вірусом грипу типу А (Wang et al., Nat. Med. 10:1366-1373, 2004; Gowen et al., J. Immunol. 177:6301-6307, 2006; Hutchens et al., J. Immunol. 180:483-491, 2008; Le Goffic et al., PloS Pathog. 2:E53, 2006). Кристалічна структура позаклітинних доменів людського і мишачого TLR3 відома (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 102:10976-80, 2005; Choe, et al., Science 309:581-585, 2005; Liu et al., Science, 320:379-381, 2008). TLR3 має підковоподібну форму соленоїда, несе на своїй поверхні глікани і включає 23 домени, що складаються з лейцитових повторів (LRR). Були картовані ділянки зв'язування дволанцюжкової РНК в двох різних областях (Liu et al., Science, 320:379-81, 2008). Передбачається, що сигнальна одиниця складається з однієї дволанцюжкової РНК і двох позаклітинних доменів TLR3 (Leonard et al., Proc. Natl. Acad. Natl. Acad. Sci. (USA) 105: 258-263, 2008). Показано, що TLR3 запускає патогенні механізми при цілому ряді запальних, імуноопосередкованих і аутоімунних захворювань, що включають, наприклад, септичний шок (Cavassani et al., J. Exp. Med. 205:2609-2621, 2008), гостре ураження легень (Murray et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:1227-1237, 2008), ревматоїдний артрит (Kim et al., Immunol. Lett. 124:9-17, 2009; Brentano et al., Arth. Rheum. 52:2656-2665, 2005), астму (Sugiura et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40:654-662, 2009; Morishima et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 145:163-174, 2008; Stowell et al., Respir. Res. 10:43, 2009), запальні захворювання ШКТ, наприклад, хворобу Крона і виразковий коліт (Zhou et al., J. Immunol. 178:4548-4556, 2007; Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 104:7512-7515, 2007), аутоімунні захворювання печінки (Lang et al., J. Clin. Invest. 116:2456-2463, 2006) і цукровий діабет I типу (Dogusan et al. Diabetes 57:1236-1245, 2008; Lien and Zipris, Curr. Mol. Med. 9: 52-68, 2009). Крім того, показано, що органоспецифічна експресія TLR3 корелює з рядом патологічних станів, що викликаються порушенням регуляції місцевих запальних реакцій, наприклад, в тканинах печінки при первинному біліарному цирозі (Takii et al., Lab Invest. 85:908-920, 2005), в суглобах при ревматоїдному артриті (Ospelt et al., Arthritis Rheum. 58:3684-3692, 2008) і слизовій оболонці носа при алергічному риніті (Fransson et al., Respir. Res. 6:100, 2005). При некрозі вивільнення клітинного вмісту, в тому числі ендогенних матричних РНК, індукує секрецію цитокінів, хемокінів і інших чинників, які ініціюють процес місцевого запалення, полегшують знищення клітинних залишків і відновний процес. Некроз часто приводить до безупинного запального процесу, сприяючи його переходу в хронічну форму або посиленню (Bergsbaken et al., Nature Reviews 7:99-109, 2009). Активація TLR3 в місці некрозу може сприяти 1 UA 112282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розвитку ненормального запального процесу і привести до виникнення прозапального позитивного зворотного зв'язку за рахунок вивільнення лігандів TLR3. Таким чином, антагоністи TLR3 можуть відіграти позитивну роль при багатьох захворюваннях, що супроводжуються хронічним або гострим запаленням і/або некрозом. Зниження активації TLR3 може розглядатися як нова стратегія в лікуванні онкологічних захворювань, таких, як нирковоклітинний рак і плоскоклітинний (епідермальний) рак області голови і шиї (Morikawa et al., Clin. Cancer Res. 13:5703-5709, 2007; Pries et al., Int. J. Mol. Med. 21: L423F 209-215, 2008). Крім того, алель TLR3 , що кодує білок з меншою активністю, пов'язаний з функцією захисту проти просуненої "сухої" макулярної дегенерації внаслідок вікових змін (Yang et al., N. Engl. J. Med. 359:1456-1463, 2008), що вказує на можливу позитивну роль антагоністів TLR3 при цьому захворюванні. Захворювання, пов'язані із запаленням, також як і захворювання, що викликаються інфекціями, мають значний вплив на здоров'я і, отже, велике економічне значення. Проте, незважаючи на прогрес в багатьох галузях медицини, існує відносно мало можливостей для лікування більшості названих захворювань. Таким чином, існує необхідність в придушенні активності TLR3 для лікування пов'язаних з функцією цього рецептора захворювань. Короткий опис фігур На фіг. 1 показаний ефект моноклональних антитіл (мАb) проти людського TLR3 (huTLR3) в експерименті з використанням гена-репортера NF-κB. На фіг. 2A і 2Б показаний ефект (% інгібування) або ефект моноклональних антитіл проти людського TLR3 в експерименті з використанням гена BEAS-2B. На фіг. 3A і 3Б показаний ефект моноклональних антитіл проти людського TLR3 в експерименті з використанням гена NHBE. На фіг. 4 показаний ефект моноклональних антитіл проти людського TLR3 в експерименті з використанням гена PBMC. На фіг. 5A і 5Б показаний ефект моноклонального антитіла проти людського TLR3 в експерименті з використанням гена HASM. На фіг. 6A, 6Б і 6В показане зв'язування моноклонального антитіла проти людського TLR3 з мутантами TLR3. На фіг. 7A показані епітопи, розпізнавані мАb 15EVQ (чорним кольором) і C1068 (сірим кольором) (верхня частина фігури), і епітопи, розпізнавані мАb 12QVQ/QSV (чорним кольором, нижня частина фігури), накладені на зображення структури позаклітинного домену людського TLR3. На фіг. 7Б показана карта збурень при вибірковому заміщенні водню дейтерієм у випадку, коли позаклітинний домен TLR3 утворює комплекс з мАb 15EVQ. На фіг. 8A і 8В показаний ефект сурогатних щурячих/мишачих мАb (мАb проти мишачого TLR3, мАb 5429) в експериментах з використанням А) гена-репортера NF-κB і В) гена-репортера ISRE. На фіг. 9 показаний ефект сурогатних мАb (мАb 5429, мАb c1811) в експерименті з MEF CXCL10/IP-10. На фіг. 10 показана специфічність зв'язування сурогатних mAb з TLR3. Верхня панель: контроль ізотипу; нижня панель: mAb c1811. На фіг. 11 показаний вплив сурогатних мАb на рівень penH в при експериментально індукованій гіперчутливості дихальних шляхів (ГДШ). На фіг. 12 показаний ефект сурогатних мАb на загальне число нейтрофілів в рідині бронхоальвеолярного лаважу (БАЛ) при гіперчутливості дихальних шляхів (ГДШ). На фіг. 13 показаний ефект впливу сурогатних мАb на рівень продукції CXCL10/IP-10 в рідині після лаважу при ГДШ. На фіг. 14 показаний ефект сурогатних мАb на гістопатологічні показники при використанні декстран сульфату натрію (ДСН). На фіг. 15 показаний ефект сурогатних мАb на А) гістопатологічні показники і Б) приплив нейтрофілів при перенесенні Т-клітин. На фіг. 16 показаний вплив сурогатних мАb на клінічні показники при колагеніндукованому артриті (КІА). На фіг. 17 показаний ефект сурогатних мАb на площу під кривою, що описує динаміку клінічних показників при КІА. На фіг. 18 показаний вплив сурогатних mAb на виживаність мишей C57BL/6 після інтраназального введення вірусу грипу А/PR/8/34. Введення mAb почалося в день -1. На фіг. 19 показаний вплив сурогатних мАb на клінічні показники після зараження вірусом грипу типу А/PR/8/34. Введення mAb почалося в день -1. 2 UA 112282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фіг. 20 показаний вплив сурогатних mAb на масу тіла протягом 14 днів після введення вірусу грипу А/PR/8/34. Введення mAb почалося в день -1. На фіг. 21 показаний вплив сурогатних мАb на концентрацію глюкози в крові у тварин (А) WT DIO і (Б) TLR3KO DIO після пробного введення глюкози. На фіг. 22 показаний вплив сурогатних мАb на концентрацію інсуліну у тварин WT DIO. На фіг. 23 показаний вплив мАb 15EVQ на (А) NTHi і (В) продукцію CXCL10/IP-10 і CCL5/RANTES в клітинах NHBE, індуковану риновірусом. На фіг. 24 показаний вплив мАb 15EVQ на (А) вміст sICAM-1 і (В) життєздатність клітин HUVEC. На фіг. 25 показана виживаність тварин після введення сурогатних mAb через 3 дні після інфекції вірусом грипу А. На фіг. 26 показані оцінки клінічного стану після введення сурогатних mAb через 3 дні після зараження вірусом грипу А. На фіг. 27 показана зміна маси тіла тварин після введення сурогатних mAb через 3 дні після інфекції вірусом грипу А. На фіг. 28 показана молекулярна структура четвертинного комплексу позаклітинного домену TLR3 з Fab 12QVQ/QSV, Fab 15EVQ і Fab c1068 в А з представленням ланцюгів в формі стрічок і загальною структурою поверхні. Позаклітинний домен TLR3 показаний світло-сірим кольором, N-кінець відмічений буквою N; всі Fab-фрагменти на схемі розташування ланцюгів показані темно-сірим кольором. В. Епітопи показані світло-сірим кольором і відмічені на схемі позаклітинного домену TLR3 так само, як Fab в A. На фіг. 28, 29 і 30 Fab 12QVQ/QSV, Fab c1068 і Fab 15EVQ скорочено вказані як Fab12, Fab1068 і Fab15, відповідно, для ясності. Фігура 29 показує механізм нейтралізації Fab 15EVQ. А. Сигнальна одиниця (СО) дволанцюжкова РНК:TLR3 з епітопом Fab 15EVQ, відміченим світло-сірим кольором, в одному з двох позаклітинних доменів TLR3 (світло- і темно-сірий колір, і відмічений TLR3). Ліганд дволанцюжкової РНК показаний у вигляді подвійної спіралі сірого кольору. В. Ілюстрація зв'язування Fab 15EVQ, що створює стеричні перешкоди для зв'язування з дволанцюжковою РНК і, таким чином, утворення СО. Зв'язування Fab 15EVQс високою спорідненістю буде перешкоджати формуванню СО, або викличе розпад СО, що вже утворилася. На фіг. 30 показаний механізм Fab 12QVQ/QSV і Fab c1068 і з'єднання одиниць в сигнальну одиницю (СО) TLR3. а. Fab 12QVQ/QSV і Fab c1068 можуть зв'язуватися (в тому числі спільно) з однією СО. В. Модель тісного об'єднання двох СО на дволанцюжковій РНК довжиною приблизно 76 пар основ. Для наочності три епітопи виділені кольором. С. Зв'язування Fab 12QVQ/QSV і Fab c1068 перешкоджає об'єднанню СО через стеричні зіткнення між антитілами і сусідніми СО. Дві стрілки, направлені ліворуч, означають різні кількісні ступені розділення СО під впливом антитіл (нижня стрілка стосується Fab 12QVQ/QSV, а верхня - до Fab c1068). На фіг. 31 показана відповідність між послідовною нумерацією і системою нумерації Кабата і Чотіа на прикладах антитіл. Області, що визначають комплементарність, і гіперваріабельні ділянки показані сірим кольором. На фіг. 32 показане поєднання області VL mAb 15EVQ з каркасним сегментом людського антитіла Vκ1. Гіперваріабельні петлі Чотіа підкреслені, паратопи підкреслені подвійною межею, а відмінності каркасного сегмента показані сірим кольором. Гени Vκ1 являють собою алелі *01, якщо не вказане інше. Нумерація залишків послідовна. На фіг. 33 показане поєднання області VH mAb 15EVQ з каркасним сегментом людського антитіла Vh5. Особливості послідовності показані як на фіг. 32. На фіг. 34 показане поєднання області VL mAb з каркасним сегментом людського антитіла Vk3. Особливості послідовності показані як на фіг. 32. На фіг. 35 показане поєднання областей VL і VH mAb 15EVQ або mAb 12QVQ/QSV з каркасними сегментами людського антитіла Jκ, Jλ або Jh. Особливості послідовності показані як на фіг. 32. Виклад суті винаходу Один з аспектів винаходу стосується ізольованого антитіла або його фрагмента, при цьому антитіло зв'язується з амінокислотними залишками K416, K418, L440, N441, E442, Y465, N466, K467, Y468, R488, R489, A491, K493, N515, N516, N517, H539, N541, S571, L595 і K619 SEQ ID NO: 2 толл-подібного рецептора 3 (TLR3). Інший аспект даного винаходу стосується ізольованого антитіла або його фрагмента, при цьому антитіло зв'язується з амінокислотними залишками S115, D116, K117, A120, K139, N140, N141, V144, K145, T166, Q167, V168, S188, E189, D192, A195 і A219, SEQ ID NO: 2, толлподібного рецептора 3 (TLR3). Інший аспект даного винаходу стосується ізольованого антитіла, що має варіабельну 3 UA 112282 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, або його фрагменту, при цьому антитіло зв'язується з TLR3, що має амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 2, через варіабельну область важкого ланцюга із залишками Чотіа W33, F50, D52, D54, Y56, N58, P61, E95, Y97, Y100 і D100b і варіабельну область легкого ланцюга із залишками Чотіа Q27, Y32, N92, T93, L94 і S95. Інший аспект даного винаходу стосується ізольованого антитіла, що має варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга, або його фрагменту, при цьому антитіло зв'язується з TLR3, що має амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 2 через варіабельну область важкого ланцюга із залишками Чотіа N31a, Q52, R52b, S53, K54, Y56, Y97, P98, F99, і Y100, і варіабельну область легкого ланцюга із залишками Чотіа G29, S30, Y31, Y32, E50, D51, Y91, D92 і D93. Наступний аспект даного винаходу полягає в ізольованих антитілах, здатних реагувати з TLR3, причому антитіла мають щонайменше одну з наступних властивостей: a. зв'язуються з людським TLR3 з Kd