Спосіб одержання препарату інсуліну середньої дії

Спосіб одержання препарату інсуліну середньої, дії, що включає водноспиртову екстракцію підшлункової, залози тварин, іонообмінну хроматографію, хроматографічне відділення проінсуліну та інших баластних білків, розчинення очищеного інсуліну в кислому водному середовищі з вмістом консерванту та рН- регулюючих сполук, який відрі 33797 производства инсулина-лонга и инсулина-ультралонга", М.,1982). Основні недоліки методу: невисокий вихід інсуліну, невизначеність якості спиртового екстракту підшлункової, залози, багатостадійність, трудоємність і енергоємність, неекономічний метод концентрування, дуже низька продуктивність (50 мл/год), використання соляної, кислоти, неконтрольовані (тільки розрахункові) частини аморфного і кристалічного інсуліну в препараті, значні витрати високоочищеного інсуліну для приготування його готової, лікарської, форми. Метою винаходу є розробка високоефективного, економічного, науковоємного, швидкого і високопродуктивного способу одержання високоочищеного інсуліну свиней або великої, рогатої, худоби з характеристиками субстанції, інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5-99,2 % (як правило 98,8-99,3%), вміст проінсуліну - не більше 10 ррМ (як правило, 0,5-5,0 ррМ), вміст інших баластних білків - не більше 1%, і препарату інсуліну середньої, дії.: вміст інсуліну високоочищенного свиного або телячого або їх суміші - 36-42 ОД, натрію хлориду - 4,8-5,0 мг, натрію оцтовокислого - 1,35-1,36 мг, цинку хлориду або окису - 0,055-0,057 мг, цинку оцтовокислого - 0,023-0,025 мг, ніпагіну - 0,085-1,400 мг або іншого консерванту, води високочищеної, - до Імл. Поставлена мета досягається тим, що подрібнену підшлункову залозу екстрагують 60-85%-вим спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітом, відмивання баластних білків проводять амонійно-ацетатним буфером з рН 6,0, а елюцію проводять 0,1-1,0 М бікарбонатним буфером з рН 6,5-9,0. Відділення проінсуліну і інших полімерних білків проводять на сорбенті на основі силікагелю з прищепленими гексадецильними групами, а як елюєнт використовують водні розчини а вмістом ізопропілового спирту (10-50%) і оцтової кислоти (0,1-5,0%). Очищення від дезамідованих і інших форм інсуліну проводять в градієнті водно-органічного-елюенту з вмістом оцтової, кислоти від 0,2 до 0,8%. Приготування препарату інсуліну середньої дії здійснюють шляхом отримання розчину високоочищеного інсуліну з застосуванням спеціальної технології і використанням розчинів натрію оцтовокислого, натрію хлориду, цинку хлориду або окису, цинку оцтовокислого та розчином консерванту наприклад, ніпагіну). Суть способу заключається в дво-тристадійній обробці підшлункової. залози: на першій стадії, видаляють основні баластні білки шляхом водно-спиртового екстрагування підшлункової, залоаи з наступною іонообмінною хроматографією на колонці з сульфокатіонітом і елююванням 0,1-1,0 М бікарбонатним буфером а рН 6,5-9,0, що дозволяє підвищити на 5-12% вихід інсуліну, одержують інсулін-сирець з вмістом інсуліну на рівні 90-93%, на другій стадії видаляють проінсулін і полімерні білки хроматографією розчину інсуліну-сирцю, що містить ізопропиловий спирт і оцтову кислоту, на колонці (10х30 ом) з Діасорбом-1ЗО-С16Т, 20 мкм. Елюювання здійснюють тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною оптичного шляху кювети 0,5 мм. Далі інсулін можна кристалізувати і висушувати до вмісту води не більше 10%, одержуючи (вихід не менше 80%) кристалічний інсулін з вмістом основної, речовини не менше 95% і вмістом проінсуліну - не більше 5 ррМ. на третій стадії, інсулін, одержаний на стадії. 2, вносять в розчин, що містить 5-50% етанолу (ацетонітрилу, ізопропілового спирту) і 0,1- 5,0% оцтової, кислоти. Наносять на колонку (15х30 см), упаковану сорбентом Діасорбом-1ЗО-С16Т з розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 год із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 12% етанолу, 0,3% оцтової кислоти у воді; буфер Б: 50% етанолу, 0,3% оцтової, кислоти. Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ). Після аналізу об'єднують фракції, з вмістом інсуліну не менше 98%. Об'єднані фракції, інсуліну кристалізують (вихід не менше 90%) і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують кристалічний інсулін з вмістом основної, речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 5 ррМ, дезамідованих форм інсуліну - не більше 0,3%, високомолекулярних білків - не більше 0,3%. Фракції, з вмістом основної речовини від 30 до 98% об'єднують і накопичують для наступної переробки за стадією 3. на четвертій стадії отримують препарат інсуліну середньої діі шляхом спеціальної, технології, розчинення кристалічного високоочищеного та аморфного інсуліну з використанням компонентів у такому співвідношенні: вміст інсуліну високоочищеного свиного або телячого або їх суміші 3642 ОД, натрію хлориду - 4,8-5,0 мг, натрію оцтовокислого 1,35-1,36 мг, цинку хлориду або окису 0,055-0,057 мг, цинку оцтовокислого - 0,023-0,025 мг, ніпагіну - 0,085-1,400 мг або іншого консерванту, води високочищеної - до 1мл. Основні переваги запропонованого способу порівняно з прототипом: зменшено кількість операцій: одна операція при виділенні і дві операції, при очищенні цільового продукту, що в свою чергу значно здешевлює весь процес і скорочує в 180 (!) разів час його проведення; - на першій стадії, робочі об'єми зменшуються практично у 15 разів, що спрощує технологію і суттєво полегшує дотримання санітарних норм виробництва; - вміст білкових домішок в інсуліні, одержаному запропонованим способом, набагато нижче, ніж у кращих зразках закордонного виробництва.- препарат інсуліну середньої, дії. забезпечує високу терапевтичну ефективність, стабільність розчину, його "м'яку" дію, контрольований розподіл аморфної, і кристалічної, частин інсулінового компоненту в препараті, надійність дії. консерванту і повну нетоксичність останнього. Метод простий і оригінальний в реалізації, не потребує значної. кількості дорогокоштовного обладнання. Запропонований спосіб видрізня-ється значною наукоємністю, як за видом матеріалів і обладнання, що використовуються, так і за змістом і типом технологічних операцій. Приклад . Одержання високоочищеного препарату монокомпонентного інсуліну свиней середньої, дії.. Стадія 1. 0,4-1,0 тони підшлункової. зало 2 33797 зи свиней подрібнюють, екстрагують 60-85% спиртовим розчином, центрифугують, осаджують баластні білки, фільтрують і одержаний розчин наносять на колонку з сульфокатіонітом КУ-ЙЗ або Масго-Ргер high S support, Bio-Rad USA, 50 мкм, відмивку баластних білків проводять амоній-ацетатним буфером з рН 6,0, елюювання здійснюють 0,5М бі-карбонатним буфером (рН 7,5). Проводять кристалізацію і висушують до залишкової, вологості 10%. Одержують 100 г кристалічного інсуліну з вмістом основної, речовини 9й%. Стадія 2. 100 г кристалічного інсуліну, одержаного за стадією 1, розчиняють в 10 л розчину, що містить 10 % ізопропілового спирту і 0,3% оцтової, кислоти та наносять на колонку діаметром 10 см, довжиною ЗО см, заповнену сорбентом Діасорб-ІЗО-СІбТ, 20 мкм. Елюювання проводять тим же розчином із швидкістю 150 мл/хв. Збирають фракцію, що містить основний пік за оптичною густиною. Як детектор використовують фотометр при довжині хвилі 280 нм і довжиною.оптичного шляху кювети 0,5 мм. Інсулін кристалізують і висушують до вмісту води не більше 10%. Одержують 80 г (вихід 80%) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини 95% і вмістом проінсуліну 5 ррМ. Стздія 3. 80 г кристалічного інсуліну, одер-жаного за стадією 2, розчиняють в 9 л розчину, що містить 8% етанолу (або ацетонітрилу чи іао^ропілового спирту) і 0,3% оцтової, кислоти. Наносять на коленку 15ХЗС см, запаковану сорбентом Діасорб-130-С16Т а розміром частинок 12 мкм. Елюювання здійснюють лінійним градієнтом від 0 до 100% буфера А+Б за 5 годин із швидкістю 120 мл/хв. Буфер А: 15% етанола, 0,3% оцтової кислоти у воді (17 л), буфер Б: 50% етанола, 0,3% оцтової кислоти у воді (17 л). Збирають 10 фракцій основного піку і аналізують їх аналітичною ВЕРХ. Після аналізу об'єднують фракції з вмістом інсуліну не менше 98%. Одержують 72 г (вихід 90%) кристалічного інсуліну з вмістом основної речовини не менше 98,5%, проінсуліну - не більше 1 ррМ, дезамідованих форм - не більше 0,3%, інсуліну ВРХ не більше 0,2%, високомолекулярних білків - не більше 0,2%. Фракції із вмістом основної, речовини від 30 до 98% об'єднують і накопичують для наступної, переробки за стадією 3. Стадія 4. 72 г високоочищеного інсуліну порціями розчинюють в 0,005-0,05 М оцтовій кислоті з доданням води для ін'єкцій (рН 3,0-3,5). Отриманий розчин інсуліну змішують поступово з розчином 5%-ного натрію хлориду, 1-2%-ного натрію оцтовокислого, 1-2%-ними розчинами цинку хлориду або окису цинку та цинку оцтовокислого, 1-3%-ним розчином ніпагіну або іншого консерванту, і доводять загальний об'єм суспензії до 48-53 літрів, який потім направляють на стерилізуючу фільтрацію. Простерилізований розчин інсуліну надалі стерильно розливають у флакони або пенфіли, інші користувачі, та укупорюють їх. Потім здійснюють контроль, маркування, упаковку готової, продукції (препарату інсуліну середньої, дії.). Отриманий таким чином препарат інсуліну середньої дії має наступний склад: вміст інсуліну високоочищенного (свиного або телячого або їх суміші) - 36-42 ОД (характеристика субстанції, інсуліну: вміст інсуліну - не менше 98,5-99,2 % (як правило 98,8-99,3%), вміст проінсуліну - не більше 10 ррМ (як правило, 0,01-5,0 ррМ), вміст інших баластних білків - не більше 1-2%), натрію хлориду - 4,8-5,0 мг, натрію оцтовокислого - 1,35-1,36 мг, цинку хлориду або окису - 0,055-0,057 мг, цинку оцтовокислого - 0,023-0,025 мг, ніпагіну - 0,085-1,400 мг або іншого консерванту, води високочищеної - до 1мл. ЛІТЕРАТУРА І. Авт. свід. СРСР N 389793. 2. Авт. овід. СРСР N 552972. 3. Патент США N 41295690. 4. Патент ФРН N 1966573. 5. Патент США N 3878186. 6. Патент Англії. N 2038340. 7. Патент PI N 2027444. 8. Современные гормональные средства", Київ, "Здоров'я", 1994. 9. Регламент производства инсулина-лонга и инсулина-ультралонга", М.,1982. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3