Живильне середовище для виділення та пересіву чистих культур базидіального гриба irpex lacteus fr.

Корисна модель відноситься до біотехнології і може біти використана у науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях для отримання з пересівів чистих культур штамів базидіоміцета Irpex lacteus продуцентів біологічно-активних речовин для різних галузей промисловості [1, 2]. Гриб Irpex lacteous Fr., який в природі представлений широким біорізномаїттям штамів - відомий сьогодні як активний продуцент протеолітичних ферментів, в тому й числі молокозсідальних. В лабораторних умовах виділення та пересівання даного гриба ускладнюється його морфологічними особливостями: в культурі гриб I. lacteus, за рахунок щільного переплетіння гіф, важко відділяється від субстрату навіть в досить молодому віці (25діб). Відоме картопляно-глюкозне агаризоване живильне середовище (КГА), до складу якого входять: картопля, глюкоза та агар. До недоліків відноситься дороговизна компонентів живильного середовища (ЖС) - картоплі та глюкози. Відомі також живильні середовища невизначеного складу: сусло-агар (СА), картопляний агар (КА) та інші [68]. Застосування цих живильних середовищ для виділення та вирощування міцеліальних культур вищи х базидіоміцетів обмежується дороговизною та малодоступністю компонентів - бульб картоплі, глюкози, знехміленого пивного сусла, то що. Найбільш-близьким за технічною суттю і досяжністю результату є живильне середовище картопляноглюкозний агар, яке широко застосовується у мікологічній практиці [7]. Приготування живильного середовища КГА за прототипом потребує включення в його склад дорогих компонентів - глюкози, бульб картоплі. В основу корисної моделі поставлено завдання створення живильного середовища для виділення і пересівів чистих культур базидіоміцету I. lacteus - перспективного продуценту протеолітичних ферментів. Поставлене завдання вирішується тим, що живильне середовище для виділення і пересівів чистих культур штамів базидіоміцета I. lacteus, яке містить агар-агар та воду, згідно корисної моделі, додатково містить відвар гарбуза при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: агар-агар 1,0-1,5 відвар гарбуза 25,0-50,0 вода дистильована решта Експериментальні дані з лінійної швидкості росту (ЛШР) штамів І. lacteus P-04, Ч-03, А-Дон-02, В-04 наведені в таблиці. Використовували агаризоване живильне середовище, відвар гарбуза в якому становив 50%®живильне середовище №1, 25%®живильне середовище №2, 15%®живильне середовище №3, в якості контрольного середовища - картопляно-глюкозний агар (прототип). Температура культивування чистих міцеліальних культур вищи х базидіоміцетів була оптимальною для кожного штаму: Р-04, Ч-03, А-Дон-02-32°С, В-04-35°С. Результати лінійної швидкості росту штамів на дослідних і контрольному живильних середовищах свідчать про наступне. Для виділення і вирощування штамів Р-04 та Ч-03 найпридатнішим виявилось середовище №2, для А-Дон-02 середовище №1, для штаму В-04 - середовища №1, 2, 3. На даних середовищах швидкість росту вірогідно перевищувала або не відрізнялась від швидкості росту контрольних культур, тобто найкращим ріст був на середовищах, де концентрація відвару гарбуза становила 50% (живильне середовище №1) та 35% (живильне середовище №2). Таблиця Лінійна швидкість росту (мм/добу) штамів І.lacteus на різних агаризованих середовищах Штами І. lacteus Р-04 4-03 А-Дон-02 В-04 1 10,33±0,22 11,58±0,20 И,43±0,50 11,99±0,30 Живильне середовище 2 3 Лінійна швидкість росту, мм/добу 11,50±0,24 9,53±0,03 11,88±0,09 10,59±0,07 11,25±0,00 9,50±0,11 9,10±0,12 11,21±0,26 КГА 9,75±0,00 11,25±0,00 11,00±0,00 11,15±0,00 Приклад конкретного виконання. Приклад 1. Отримати агаризоване середовище для пересівів чистих культур базидіоміцету І. lacteus продуценту протеолітичних ферментів. Плоди гарбуза подрібнюють, заливають водою у співвідношенні 1:1 кип'ятять протягом 15 хвилин. Відвар фільтрують через марлевий фільтр. У даному відварі міститься глюкози - 4мг/мл, водорозчинних білкових речовин - 2мг/мл. Вміст білків визначали за допомогою спектрофотометричного методу [4] на СФ-26, при довжині хвилі 280 та 260нм. Вміст глюкози визначали методом Шведової та Лук'яненко [5]. До фільтрованого відвару додають дистильовану воду до потрібного розведення в залежності від штаму і 1015г мікробіологічного агару (кількість агару, потрібну для повного загустіння живильного середовища). Розчиняють агар-агар при слабкому підігріві суміші. Отримане живильне середовище розливають в чашки Петрі і стерилізують в автоклаві при тискові 1,5±0,2атм, температурі 128±2°С протягом 45 хвилин. Чашки Петрі після стерилізації розкладають на рівну поверхню. Через три доби контролю стерильності середовища [3] чашки Петрі засівають чистими культурами І. lacteus. Для інокуляції беруть шматочки міцелію розміром приблизно 1x1см. Чисті культури, їхні пересіви отримують на 47 добу, в залежності від швидкості росту штаму та швидкості заростання середовища (таблиця). Приклад 2. Отримати агаризоване середовище для виділення чистих культур базидіоміцету І. lacteus продуценту протеолітичних ферментів. Виконують всі те хнологічні прийоми, які описані в прикладі 1, склад середовища у відповідності до штаму (таблиця). Після контролю стерильності, чашки Петрі інокулюють шматочками плодових тіл ви щи х базидіоміцетів, які попередньо обробляють розчином перекису водню для стерилізації їхньої поверхні. Для інокуляції використовують шматочки плодових тіл розміром приблизно 1x1см. Після початку заростання пробірок, слідкують за ростом міцелію грибів та вилучають пробірки із зараженням бактеріями та іншими грибами. Після повного заростання субстрату (4-5 діб) чиста к ультура базидіального гриба придатна для подальшої роботи чи зберігання. Таким чином, отримане живильне середовище на основі відвару гарбуза забезпечує, порівняно із прототипом, заміну дорогих компонентів живильного середовища - картоплі та глюкози. Розробка живильного середовища на основі відвару гарбуза значно полегшує пересів та скорочує час отримання чистих і пересіяних культур ви щи х базидіоміцетів. Джерела інформації, використані при складанні заявки 1. Белова Н.В. Базидиомицеты - источник биологически активных веществ // Растительные ресурсы. - 1991. №2. - С.8-17. 2. Белова Н.В., Єфремова И.Я. Препарты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. - 26, вып.4. - С.321-324. 3. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - К.: Наук, думка, 1988. - 144с. 4. Кочетов Т.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высш. школа, 1980. - 272с. 5. Ме тоды экспериментальной микологии. / Справочник. - К.: Наук, думка, 1982. - 544с. 6. Патент 63177А України. Живильне середовище для виділення і пересівання чистих культур ви щих базидіоміцетів / Федотов О.В., Бугрім Є.Ю., Крюков О.А. Заявка 2003021394 від 15,01,2004, C12N9/54, А23С19/32. 7. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. - М.: Агропромиздат, 1990. 240с. (прототип). 8. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиоммцетов в микробиологической промышленности. - М., 1985. - 48с. - ВНИИСЭНТИ: Обзор.информац.: Сер. 3.