Штам соматичних культур макроміцета irpex lacteus fr. бн-3 – продуцент молокозсідального ферменту

Винахід відноситься до ферментативної технології та представляє собою новий штам соматичних структур макроміцету (базидіального гриба) Іrрех lacteus Fr. для отримання молокозсідального ферменту в якості замінника сичужного ферменту ігри виробництві сирів. Відомі штами вищих базидіальних грибів Tyromyces revolutus (Brеd.) Bond et. Sing БН-32, Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. M-81 та Irрех lacteus Fr Д-4 які продукують молокозсідальні ферменти, активність яких уступає активності пропонуємого штаму, I.lacteus БH-3 [3, 4]. Найбільш близькими по суті га досягаємому результату, є штам: Д-4 сапротрофного дереворуйнівного гриба Іrрех lacteifs Fr., активність якого складає 1,3 хвилини [4], що майже у 2 рази менше ніж у пропонуємого штаму БН-3. В основу винаходу поставлена задача використання нового штаму гриба І. lacteus БН-3 в якості продуцента високоактивного молокозсідального ферменту. Поставлена задача вирішується тим, що штам БН-3 сапротрофного дереворуйнівного гриба Іrрех lacteus (клас Basidiomycetes, порядок Aphyliophoralis, родина Роriасеае [6]) культивують при температурі 37°С, під час чого він синтезує та виділяє у середовище фермент, з високою молокозсідальною активністю (МЗА). МЗА культурального фільтрату становить 40 секунд (600 од/мл). Отриманий згусток має білий колір, не має: побічного запаху та присмаку. Штам БН-3 I. lacteus зберігається у колекції кафедри фізіології рослин Донецького національного університету, який депоновано в спеціальну колекцію культур Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, колекційний номер 1082. Отриманий штам БН-3 I. lacteus має слідуючу характеристику: Морфологія. Плодових тіл у культурі не утворює. Міцелій білого кольору, досить міцний. Гіфи розгалужені з перегородками. Виділяються генеративні та скелетні гіфи (диметична гіфальна система). Ширина гіф 2,6 - 7,0 m. Спороношення у культурі нема. У природних умовах плодове тіло резупінантне або черепично розташоване. Поверхня шляпки мохната, біла або ара, гіменофор трубчатий. Спори еліпсоїдальні, 4 - 6 * 2 - 3m у основі косо загострені. На мінеральному середовищі Чапека-Докса колонія має занурений міцелій білого кольору. Середня швидкість зростання міцелію за 1 добу при 27-35°С складає 11,8 ± 0,9 мм. Зворотна сторона колонії не пігментована. На агаризованому пивному суслі штам БН-3 утворює пишний білий міцелій. Добре розвинутий повітряний міцелій. Середня швидкість зростання за 1 добу при 27-35°С становить 16,0±0,8мм. Зворотна сторона колонії не пігментована. Дуже добре зростає на глюкозо-картопляному агарі. При 27-35°C швидкість зростання становить в середньому 15,5±0,7мм. Зворотна сторона колонії не пігментована. Міцелій пишний, білий досить міцний. При 40°С зростання штаму майже не відбувається. Фізіолого-біохімічні ознаки. При відборі джерела вуглецевого живлення критерієм придатності служило значення МЗА культурального фільтру (КФ). Найкраще усього штам БН-3 засвоює глюкозу, крохмаль та сахарозу, менш добре ксилозу та галактозу. Штам БН-3 зростаючи на зазначених середовищах утворює фермент молокозсідальної дії, активність якого неоднакова. Приклад 1. Штам БН-3 І. lacteus отримано з плодового тіла зібраного з сухого гілля листяних порід у штучному масиві поблизу м. Донецька у жовтні 1996 року. Культура зберігалась шляхом пересіву на глюкозо-картопляному агарі або агаризованому пивному суслі. Дія виявлення молокозсідальної активності штам БН-3 культивували на глюкозо-пептоному середовищі [2] слідуючого складу, г/л: глюкоза-10,0; пептон-3,0; KH2PO4-0,6; K2HPO4-0,4; MgSO4.7H2O-0,5; ZnSO4.7H2O-0,001; СaCl2-0,05; дистильована вода до 1л. Кислотність середовища після стерилізації становила 3,50рН Гриб культивували у конічних колбах на 250мл, з об'ємом живильного середовища 50мл, при температурі 37°С, яка була оптимальною для даного штаму. Посівним матеріалом була 10-15 добова культура, яка зростала на агаризованих середовищах. Молокозсідальну активність культурального фільтрату визначали на 3-, 6-, 9-, 12-, 15-, 18-, 21-, 24-, 27-, 30добу зростання гриба. Середовище фільтрували, а КФ використовували для визначення молокозсідальної активності за методом Каваї та Мукаї [1]. У 100мл натурального молока вносили 1мл 15%-го розчину СаСl2 та доводили кислотність за допомогою 10%-го розчину HCl до 6,0-6,1рН. Кожна пробірка містила 10 мл молока та знаходилась на водяній бані при 35°С. Після цього у кожну пробірку вносили 1 мл КФ. Добре перемішували та ставили у водяну баню. За часом зсідання молока судили про МЗА. Розрахунок МЗА проводили за формулою, запропонованою Типографом Д.Я. та Петіной Т.А [5]: 40x100xK МСАкф = од / мл, П де 40 - середній (у хвилинах) час згортання молока, прийнятий в технології виробництва сирів; K коефіцієнт розведення культурального фільтрату; П - час (у хвилинах), за який зі 100мл спеціально підготовленого молока (pH-6,0; t°-35°C) утворюється згусток. Отриманні результати (табл.) свідчать про те, що штам БН-3 І. lacteus починаючи з 3 добовою віку синтезує у середовище фермент молокозсідальної дії, активність якого становить 24,8хв. Потім поступово збільшується активність з 4,3хв. на 6 добу до 40 секунд на 21. На 30 добу культивування штаму БН-3 активність ферменту молокозсідальної дії становить 1,1хв. Таблиця Динаміка синтезу ферменту молокозсідальної дії штаму БН-3 l. lacteus. Вік культури, доба МЗ активність, секунд 3 1485 6 260 9 130 12 80 15 55 18 48 21 40 24 45 27 51 30 67 Отримані результати свідчать про те, що активність протеїназ молокозсідальної дії залишається на високому рівні протягом усього часу культивування продуцента. Виявлена здатність штаму БН-3 І.lacteus може бути використана для його промислового культивування з метою одержання ферменту молокозсідальної дії. Таким чином, нами отримано новий активний штам-продуцент (родина Роrіасеае, род Irpex Fr.) ферменту молокозсідальної дії, який здатний синтезувати більш активний фермент у порівнянні з прототипом Irpex lacteus Fr. Д-4. Джерела інформації. 1. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов/Под ред. О.П Низковской. Л.: Наука, 1979. -72с. 2. Федоров Н.И., Стайченко Н.И. Целлюлозная активность корневой губки // Микол. и фитопатол. -1971. -Т.5, №3. -С.308-310. 3. Штамм Hirschioporus laricinus M-81 (Kafst.) Ryv. - продуцент молокосвертывающего фермента: А.с. 1211288 СССР, МКИ С12N9/58, С12N15/00./ Бойко М.И., Негруцкий С.Ф., Мирошниченко Т.И., Соболь М.А., Варенко Ю.С. (СССР). -№3787001/28-13; Заявл. 18.05.84; Опубл. 15.06.85. 4. Пат. 34088А Україна, МКВ С12N9/50, А23С19/032. Штам соматичних культур макроміцету Irpex lacteus Fr. Д-4 продуцент молокозсідального ферменту: Пат. 34088А Україна, МКВ С12N9/50, А23С19/032 / Бойко С.М., Бойко М.I., Єфанова І.Л. -№99063016; 3аяв. 02.06.99; Опубл. 15.02.01. 5. Типограф Д.Я., Петина Т.А. Условия культивирования гриба Aspergillus candidus штамм П и его ферментативный комплекс.// Прикл. биохим. и микробиол. -1966. -2, №4. -С.417-424. 6. Шварцман С.Р. Флора споровых растений Казахстана. Т.IV. Алма-Ата: Издательство академии наук Казахской ОСУ, 1964. -715с.