Штам соматичних культур макроміцету irpex lacteus fr.-д-4 продуцент молокозсідального ферменту

УКРАЇНА (19) UA (51) 6 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ (11) 34088 (13) A C12N9/50, A23C19/032 ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ КУЛЬТУР МАКРОМІЦЕТУ IRPEX LACTEUS FR. - Д-4 ПРОДУЦЕНТ МОЛОКОЗСІД АЛЬНОГО ФЕРМЕНТУ (13) 34088 (11) Отриманий штам Д-4 І. lacteus має слідуючу характеристику. Морфологія. Плодових тіл у к ультурі не утворює. Міцелій білого кольору, досить міцний. Гіфи розгалужені з перегородками. Ширина гіф 2,3-5,6 м. Спороношення у культурі немає. У природних умовах плодове тіло резупінантне або черепично розташоване. Поверхня шляпки мохната, біла або сіра, гіменофор трубчатий. Спори еліпсоїдальні, 46*2-3m у основі косо загострені. На мінеральному середовищі Чапека-Докса колонія має білий колір та представлена зануреним міцелієм. Середня швидкість зростання міцелію за 1 добу при 35°С складає 11,95±0,28 мм. Зворотна сторона колонії не пігментована. На агаризованому пивному суслі штам Д-4 утворює пишний білий міцелій. Добре розвинутий повітряний міцелій. Середня швидкість зростання за 1 добу при 35°С становить 7,5±0,314 мм. Зворотна сторона колонії не пігментована. Дуже добре зростає на глюкозо-картопляному агарі. При 35°С швидкість зростання становить 15,33±0,39мм. Міцелій пишний, білий досить міцний. Зворотна сторона колонії не пігментована. При 40°С зростання штаму майже не відбувається. Фізіолого-біохімічні ознаки При відборі джерела вуглецевого живлення критерієм придатності служило значення МЗА культурального фільтрату (КФ). Найкраще усього штам Д-4 засвоює глюкозу, крохмаль та мальтозу, менш добре ксилозу та сахарозу та погано галактозу. Штам Д-4 зростаючи на зазначених середовища х утворює молокозсідальний фермент, активність якого неоднакова. Приклад 1. Штам Д-4 I. lacteus отриманий з плодового тіла зібраного з сухого гілля листяних порід у штучному масиву поблизу м. Донецька у UA Винахід відноситься до ферментативної технології та представляє собою новий штам соматичних структур макроміцету (базидіального гриба) Irpex lacteus Fr. для отримання молокозсідального ферменту в якості замінника сичужного ферменту при виробництві сирів. Відомі штами вищих базидіальних грибів Tyromyces revolutus (Bred.) Bond. et. Sing БН-32 та Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv., які продукують молокозсідальні ферменти, активність яких уступає активності пропонуємого штаму I. lacteus Д-4. Розвиток біотехнології ферментів пов’язаний з пошуком нових штамів - продуцентів, які мають високі біосинтетіїчні здібності [1, 3]. Найбільш близьким по суті та досягаємим результату є штам сапротрофного дереворуйнівного гриба Eirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. [2]. Його молокозсідальна активність має не досить високе значення та сягає 2,5 хвилин. Представлені результати досягаються при культивуванні штаму на високій температурі 30°С. В основу винаходу поставлена задача використовування нового штаму нового гриба І. lacteus Д4 в якості продуцента високоактивного молокозсідального ферменту. Поставлена задача вирішується тим, що штам Д-4 сапротрофного дереворуйнівного гриба Irpex lacteus (клас Basidiomycetes, порядок Aphyllophoralis, родина Нуdnaceae) культивують при температурі 22°С, під час чого він синтезує та виділяє у середовище фермент з високою молокозсідальною активністю (МЗА). МЗА к ультурального фільтрату. Штам Д-4 І. lacteus зберігається у колекції кафедри фізіології рослин Донецького держуніверситету, який депоновано в спеціальну колекцію культур Інституту ботаніки ім. Холодного НАН України, колекційний номер. A (73) Донецький державний університет (57) Штам соматичних культур макроміцету Irpex lacteus Fr. - Д-4 (зберігається в спеціалізованій колекції культур Інституту ботаніки ім. Холодного НАН України, колекційний номер - 1630 ) – продуцент молокозсідального ферменту. (19) (21) 99063016 (22) 02.06.1999 (24) 15.02.2001 (33) UA (46) 15.02.2001, Бюл. № 1, 2001 р. (72) Бойко Сергій Михайлович, Бойко Михайло Іванович, Єфанова Інна Леонідівна 34088 жовтні 1996 року. Культура зберігалась шляхом пересіву на глюкозо-картопляному агарі або агаризованому пивному суслі. Для виявлення молокозсідальної активності штам Д-4 культивували на глюкозо-пептонному середовищі слідуючого складу, г/л: глюкоза - 10,0; пептон - 3,0; KH 2P04 - 0,6; K2HP04 - 0,4; MgS04·7H2O - 0,5; ZnS04·7H2О - 0,001; CaCІ2 - 0,05; дистильована вода до1 л. Кислотність середовища після стерилізації становила 4,0 рН. Гриб культивували у конічних колбах на 250 мл, з об'ємом живильного середовища 50 мл, при температурі 22°С, яка була оптимальною для даного гриба. Посівним матеріалом була 10-15 добова культура, яка зростала на агаризованих середовищах. Молокозсідальну активність культурального фільтрату визначали на 3-, 6-, 9-, 12-, 15-, 18-, 21-, 24-, 27-, 30-добу зростання гриба. Середовище фільтрували, а КФ використовували для визначення молокозсідальної активності за методом Каваї та Мукаї [6]. У 100 мл натурального молока вносили 1 мл 15%-го розчину СаСІ2 та доводили кислотність за допомогою 10%-го розчину НСІ до 6,0-6,1 рН. Кожна пробірка містила 10 мл молока та знаходилась на водяній бані при 35°С. Після цього у кожну пробірку вносили 1 мл КФ. Добре перемішували та ставили у водяну баню. За часом зсідання молока судили про МЗА. Розрахунок МЗА проводили за формулою, запропонованою Типографом Д.Я. та Петіной Т.А. [4]: МЗА = мент, активність якого становить 8 хв. Потім поступово збільшується на цьому рівні до 24 доби. На 30 добу культивування активність М3 ферменту становить 2 хв (2000 у.о.). Отримані результати свідчать про тe, що активність молокозсідального ферменту залишається на високому рівні протягом усього часу к ультивування продуцента. Виявлена здатність штаму Д-4 І. lacteus, яка може бути використана для його промислового культивування з метою одержання молокозсідального ферменту. Таким чином, нами отримано новий активний штам-продуцент (родина Hydnaceae, род Іrрех Fr.) ферменту молокозсідальної дії, якій зростає при нижчій температурі та здатний синтезувати більш активний фермент у порівнянні з прототипом Hirschioporus laricinus ( Karst.) Ryv. M-81. Джерела інформації 1. Белки, ферменты и стерины базидиальных Грибов / Под ред. О.П. Низковской. - Л.: Наука, 1979. – 72 с. 2. Бойко М.И., Негр уцкий С.Ф. Мирошниченко Т .В., Соболь М.А., Варенко Ю.С. Патент Украины № 6228, 1995 г. Штамм Hirschioporus laricmus (Karst.) Ryv. M-81 - продуцент молокосвертывающего фермента. 3. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности. - М.: Б.И., 1985. - 48 с. 4. Типограф Д.Я., Петина Т.А. Условие культивирования гриба Aspergillus сandidus штамм П и его ферментативный комплекс // Прикл. биохим. и микробиол. - 1966. – 2. - № 4. - С. 417-424. 5. Шварцман С.Р. Флора споровых растений Казахстана. Т. IV. - Алма-Ата: Изд-во Академии наук Казахской ССР, 1964. – 715 с. 6. Kawai M., Mukai N. Stadies on milk clotting enzymes produces by Basidiomycetes. І. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes // Agric. Biol. Chem., 1970, v. 34, № 2, p. 159-163. 40 ´ 100 ´ К , П ´a де 40 - середній (у хвилинах) час згортання молока, прийнятий в технології виробництва сирів; К коефіцієнт розведення кристалічного ферменту; П - час (у хвилинах), за який зі 100 мл спеціально підготовленого молока (рН - 6,0; t° - 35°С) утворюється згусток, a-наважка ферментного препарату (г). Отриманні результати (табл.) свідчать про те, що штам Д-4 І. lacteus починаючи з 6-добового віку синтезує у середовище молокозсідальний фер Таблиця Динаміка синтезу молокозсідального ферменту. Вік культури, доба М3 активність, секунди 3 немає 6 505 9 168 12 120 15 85 18 83 21 90 24 87 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 2 27 103 30 128