Штам соматичних структур макроміцету амylороrіа lenis (karst.) bond. et sing. kb-92 (a-004)-продуцент молокозсідального фермента

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и касается получения нового штамма соматических структур макромицета (высшего базидиального гриба) Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing. - продуцента молокосвертывающего фермента (МСФ), который может быть использован в сыроделии как заменитель сычужного фермента. Известен штамм агарикального макромицета Mycena pura (Fr.) Kumm. - продуцента молокосвертывающего фермента. Средняя молокосвертывающая активность (МСА) ферментного препарата, получаемого при различных способах культивирования составляет 500000ед/г; максимальная - 1000000ед/г и более [5]. Представленные результаты достигаются при использовании дорогостоящих компонентов питательной среды, не показана динамика изменения МСА культурального фильтрата при культивировании продуцента. Развитие биотехнологии ферментов связано с дальнейшим поиском новых штаммов - продуцентов, обладающих высокими, производственными свойствами [1, 3]. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм сапрофитного дереворазрушающего гриба Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. [2]. Получение МСФ по прототипу предлагает культивирование продуцента до 12 - 15 суток на синтетической питательной среде, содержащей дорогостоящие компоненты, выращивание посевного материала до 10 - 15сут. В основу изобретения поставлена задача получения нового штамма соматических структур афиллофорального макромицета Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing., который способен к активному биосинтезу экзофермента молокрсвертывающего действия на питательных средах, не содержащих дефицитных и дорогостоящих компонентов (глюкоза и др.) [2, 5]. Поставленная задача решается тем, что интродуцированный штамм KB-92 (A-004) Amyloporia lenis, показывает высокую МСА в культуре на питательных средах, включающих доступные и дешевые компоненты (неохмеленное пивное сусло, пептон, вода). Предлагаемый штамм KB-92 (A-004) Amyloporia lenis хранится в коллекции чистых культур кафедры физиологии растений Донецкого государственного университета (кол. №A-004) и депонирован в специализированную коллекцию культур Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины, коллекционный номер 1026. Полученный штамм KB-92 (A-004) Amyloporia lenis имеет следующие характеристики. Культурально-морфологические признаки. Штамм исследовали на сусло-агаре, глюкозо-картофельном агаре и агаре Чапека - Докса. На сусло-агаре 7-дневная мицелиальная колония имеет круглую форму, войлочная со слабо выраженными концентрическими кругами. Цвет колонии белый, с возрастом приобретает кремовый оттенок, субстрат не окрашивает. Край колонии прижат к субстрату. Внешняя линия колонии бахромчатая. Реверзум белый. На глюкозо-картофельной среде колония имеет вид как и на сусло-агаре. На агаризованной среде Чапека Докса колония представлена главным образом погруженным мицелием. Скорость роста мицелия на сусло-агаре в чашках Петри при температуре 30 ± 1°C составляет 11,25 ± 0,13мм/сут., на глюкозо-картофельном агаре - 10,76 ± 0,15мм/сут., на агаризованной среде Чапека - Докса - 6,18 ± 0,3мм/сут. Плодоношение на применяемых средах культивирования не наблюдали. Микроскопические исследования показывают, что мицелий состоит из ветвистых, тесно переплетающихся гиф, с отчетливо просматривающимися стенками и перегородками. В молодом возрасте мицелия (до 5сут.) пряжки не обнаружены, Из-за плотного переплетения гиф, мицелий имеет кожистую консистенцию. Гифы инкрустированы кристаллами. Минеральная среда Чапека. Грибница белого цвета, редкая, паутинообразная. Воздушный мицелий не развит. Гифы ветвящиеся, с перегородками. Средняя скорость роста при t - 30°C, 10,51 ± 0,15мм/сут. Колония, субстрат не окрашены. Спороношений не образует. Рост мицелия возможен в интервале температур 2 - 50°C. Температурный оптимум роста гриба находится в пределах 27 - 32°C, биосинтетический 30 - 32°C. При 45°C рост гриба резко снижается до 0,25 ± 0,1мм/сут, а при 50°C рост прекращается. На жидких глюкозо-пептонной и сусло-пептонной средах образует в равной степени поверхностный и погруженный мицелий. Воздушных гиф мало. Культуральный фильтрат (КФ) не окрашивает. Физиолого-биохимические признаки. При отборе источников углеродного и азотного питания критерием пригодности служило значение МСА КФ, сокращение сроков роста гриба и получение фермента. Утилизация моно-, ди- и полисахаридов происходит с различной скоростью. Наибольшее накопление биомассы наблюдалось на ксилозе, крахмале, щавелевой кислоте, фруктозе и глюкозе, очень слабое - рамнозе, рафинозе и яблочной кислоте. Штамм KB-92 (A-004) произрастая нажидкой питательной среде с указанными источниками углерода, обнаруживает различную молокосвертывающую и биосинтетическую активность в культуре. Максимальные значения МСА КФ наблюдают при выращивании гриба на питательных средах с ксилозой, мальтозой, крахмалом и фруктозой при возрасте культуры 11 - 15 суток. Изучение пригодности неорганического (аммонийного и нитратного) и органического азота (ферментативный пептон, мочевина, аминокислоты) показало, что лишь на средах с пептоном происходит активное ферментообразование и высокое накопление биомассы. Пример 1. Штамм KB-92 (A-004) Amyloporia lenis получен методом первичного отбора. Плодовые тела собраны с древесины усохшего дерева вишни Cerasus vulgaris. Чистую культуру штамма поддерживают путем пересевов через 3 - 5 месяцев на агаризованном пивном сусле, или других агаризованных питательных средах. Для обнаружения МСА, штамм KB-92 (A-004) культивируют на жидкой сусло-пептонной среде, содержащей неохмеленное пивное сусло, разведенное водопроводной водой до 4° по Баллингу и 3г/л ферментативного пептона. Кислотность среды после стерилизации 4,4 - 4,6 pH. Культуру выращивают в колбах Эрленмейера на 250мл, объем среды - 50мл, поверхностным способом при температуре 30 ± 1°C. Посевным материалом служит 7 - 10 суточная культура гриба с агаризованных сред. МСА КФ определяют в ходе роста на 5, 10, 15, 20, 25 и 30 и повторно на 5, 8 11, 14, 17 и 20 сутки культивирования. Выделение фермента из культурального фильтрата ведут осаждением сернокислым аммонием при 0,80 насыщении. После полного осаждения в течение 24 часов при температуре +5 - 10°C, осадок отделяют рефрежераторным центрифугированием при 3000 - 5000об/мин в течение 10 - 15 минут. Молокосвертывающий фермент из осадка диализуют против дистиллированной воды при +5°C. Концентрат лиофильно высушивают. Молокосвертывающую активность культурального фильтрата и ферментного препарата определяют по методу, предложенному Каваи и Мукаи [6]. В 100мл молока вносят 1мл 15% р-ра CaCl2, перемешивают и доводят кислотность 10% HCl до pH 6,0. В пробирки вносят по 10мл подготовленного молока и помещают в водяную баню при 35°C. После нагрева молока в опытные пробирки вносят 1мл КФ или 1мл 0,1% р-ра ферментного препарата. Смесь встряхивают и ставят на водяную баню. О МСА судят по времени свертывания молока в минутах. Расчет МСА в условных единицах, ведут по формуле, предложенной Типофаф Д.Я. и Петиной Т.А. [1, 4]. где K - коэффициент разведения КФ или препарата фермента; П - время (в мин), в течение которого из 100мл молока, после внесения КФ или р-ра фермента, образуется плотный сгусток; 40 - среднее время (в мин) свертывания молока при производстве сыров; a - навеска ферментного препарата, г. Полученные результаты свидетельствуют о том, что штамм KB-92 (A-004) синтезирует в среду фермент молокосвертывающего действия. Его количество. МСА КФ, постепенно увеличиваются до 16000 ± 496,1ед/мд в 11 17суточном возрасте и до 28200 ± 766,8ед/мл в 30 - 34 суточном возрасте, т.е. имеет 2 - х пиковый характер. Последнее свойство может быть использовано в биотехнологии при промышленном культивировании штамма KB92 (A-004) с целью получения молокосвертывающего фермента. Ферментный препарат, полученный из КФ штамма 15 - суточного возраста обладал МСА более 1000000ед/г. Содержание белка в препарате 43,63%. Таким образом, предлагаемый штамм Amyloporia lenis (Karst.) Bond. et Sing. (KB-92) (A-004) по сравнению с прототипом Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. M-81 способен по синтезу молокосвертывающего фермента близкой активности на более доступных и дешевых компонентах питательной среды.