Спосіб іммобілізації протеази с

Корисна модель відноситься до біотехнології, зокрема до способу іммобілізації протеази С, яка широко використовується у рановій та опіковій терапії завдяки високій стабільності в широкому інтервалі рН через те, що являє собою комплекс декількох ферментів з вираженою протеолітичною, фібринолітичною, колагеназною та еластолітичною діями, що дозволяє їй поряд з очищенням рани від некротичних мас регулювати процес утворення фібринозої тканини. Найближчим до корисної моделі, що заявляється, є спосіб іммобілізації протеази С, що передбачає зв'язування її з полі-N-вінілкапролактамом. Включення протеази С проводили з використанням 4%-ного водного розчину бронополу, з утворенням гранул, що містять до 20% бронополу і протеазу. Збереження протеолітичної активності іммобілізованого препарату склало 4%. Для збільшення протеолітичної активності іммобілізованого препарату безпосередньо при іммобілізації до розчину ПВК додавали гліцерин (10%) і сечовину (10%). Збереження ферментативної активності склало, відповідно, 12,3% і 7,6%. Додавання гліцерину сумісно з сечовиною дозволило зберегти 8,7% вихідної протеолітичної активності протеази С [див. Бондаренко Г.И. и др. Включение протеаз в поли-Nвинилкапролактам, стабилизированный 2-бром-2-нитропропандиолом-1,3. Ж. Доповіді Національної академії наук]. Але відомий спосіб має суттєвий недолік - зв'язування протеази С з полі-N-вінілкапролактамом забезпечує збереження тільки 8,7% вихідної протеолітичної активності, що майже унеможливлює використання іммобілізованого ферменту. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб іммобілізації протеази С, в якому, шляхом заміни полімерної матриці і умов іммобілізації, забезпечити суттєве збереження протеолітичної активності. Поставлена задача вирішена в способі іммобілізації протеази С, що передбачає зв'язування її з полімерною матрицею. Як полімерну матрицю використовують продукт з бурих морських водоростей «Ламідан», а процес здійснюють при масовому співвідношенні продукту з бурих морських водоростей «Ламідан» і протеази С, рівному 1:(0,03-0,05), відповідно. Досягнення заявленого технічного результату пов'язано з особливістю полімерної матриці - продукту з бурих морських водоростей «Ламідан», який виробляється відповідно до ТУ 9284-001-270314 388264-04. Заявнику невідомо використання продукту з бурих морських водоростей «Ламідан» в якості полімерної матриці для іммобілізації ферментних препаратів, зокрема протеази С. Нами було проведено порівняльне визначення протеолітичної активності декількох протеаз, іммобілізованих в продукт з бурих морських водоростей «Ламідан», зокрема, папаїну, трипсину, терилітину, лужної протеази і протеази С Дані наведені в таблиці 1. Як видно з даних, наведених в таблиці 1 з п'яти протеаз три ферментних препарата (папаїн, терилітин і лужна протеаза) мають нульовий % збереження активності, трипсин тільки 19,5%, а протеаза С-95,9%. Заздалегідь не можна передбачити, що саме протеаза С здатна до збереження активності на такому високому рівні після іммобілізації в продукт з бурих морських водоростей «Ламідан». Така втрата активності після іммобілізації в інших протеаз може бути пояснена інактивуючою дією продукту з бурих морських водоростей «Ламідан», внаслідок наявності великої іонної сили розчину, що створюється в гелі. При вивченні впливу масових співвідношень протеаза С: продукт з бурих морських водоростей «Ламідан» (табл. 2) встановлено, що висока протеолітична активність ферменту зберігається в усьому розглянутому діапазоні, що дозволяє при необхідності легко варіювати необхідним вмістом ферменту. Реологічні властивості продукту з бурих морських водоростей «Ламідан» з включеною у нього протеазою С досліджували, визначаючи відносну, питому, приведену і кінематичну в'язкості розчинів альгінату натрію. Результати експерименту наведені в табл. 3. Зміна реологічних властивостей розчинів, що спостерігалася, а саме значне зменшення в'язкості полімеру при додаванні до нього ферменту може свідчити про утворення білкового асоціату, компактизації молекул, що призводить до зменшення значень в'язкості. Приклад. Іммобілізацію протеази С проводять наступним чином. Готують суспендований розчин протеази С, для чого 35мг ферменту розчиняють в 5см3 натрій-фосфатного буферного розчину (0,033моль/дм3, рН7,4). Отриману суспензію при температурі 37°С і ретельному перемішуванні повільно вливають в 3см3 гелеподібного продукту з бурих морських водоростей «Ламідан». В результаті включення отримують іммобілізовану протеазу С у вигляді суміші, якій надалі в залежності від потреб можна надати необхідну форму (плівки, гранули та ін.). Зберігають іммобілізований препарат у холодильнику при температурі 0-4°С. Таблиця 1 Визначення протеолітичної активності протеаз, іммобілізованих у продукт з бурих морських водоростей «Ламідан» Фермент Папаїн Трипсин Терилітин Лужна протеаза Протеаза С Протеолітична активність, ПО/г До іммобілізації Після іммобілізації 365,2 — 273,4 53,3 34,5 — 83,7 — 494,9 473,0 % збереження активності 0 19,5 0 0 95,9 Таблиця 2 Масове співвідношення продукт з бурих морських водоростей «Ламідан»:протеаза С Протеолітична активність ПО/г % від макс. 449,72 95,08 444,48 93,97 473,0 100 428,96 90,69 411,56 87,01 Масове співвідношення 1:1 1:0,05 1:0,04 1:0,03 1:0,02 Таблиця 3 Вплив ферменту на реологічні характеристики альгінату натрію* Концентрація полімеру %мас. 3 моль/дм 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2 1,04 2,08 4,17 6,25 8,33 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2 1,04 2,08 4,17 6,25 8,33 Час витікання, с Зразок Вода В'язкість hвідн Альгінат натрію 48,8 35,3 1,382 58,06 35,3 1,645 70,6 35,3 2 82,7 35,3 2,343 94,5 35,3 2,677 Альгінат натрію + Протеаза С 45,3 35,3 1,283 48,7 35,3 1,379 65,7 35,3 1,861 76,3 35,3 2,161 88,9 35,3 2,518 V=15cм3, t = 21°С, DK= 0,73мм; Р>0,001 при n=10 hпит hприв *103 u 0,382 0,645 1 1,343 1,677 367,31 310,09 239,81 214,88 201,32 1,3799 1,6418 1,9964 2,3385 2,6722 0,283 0,379 0,861 1,161 1,518 272,12 182,5 206,47 185,76 182,23 1,2809 1,3771 1,8578 2,1575 2,5138