Спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів

Спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів, що передбачає включення ферменту в полівініло вий спирт і наступне нанесення його на матрицю, попередньо насичену 2 %-им розчином бури, який відрізняється тим, що як матрицю використовують активований вуглецево-волокнистий матеріал з сумарним об'ємом пор 0,41-1,3 см3/г, а процес ведуть при співвідношенні фермент : полівініловий спирт : матриця, що дорівнює (0,8 -1,2) : (0,110,17):(24-72) відповідно. Корисна модель відноситься до біотехнології, зокрема до способу іммобілізації ліполітичних ферментів і може знайти використання в медицині, ветеринарії при лікуванні хвороб підшлункової залози різної етіології, для замісної терапії недостатнього травлення в масло-жировій промисловості тощо. Відомий спосіб іммобілізації комплексу ферментів, до складу яких входить ліпаза, на харчових волокнах з використанням як середовища насичення 20%-го розчину поліетиленоксиду (ПЕО) і 10%-го полівінілового спирту (ПВС), приготовлених на 5%-му розчині бури (тетраборату натрію) [див. Кравченко И.А. и др. Иммобилизация ферментов заместительной терапии на пищевых волокнах. Доклады НАН Украины, 1997, №3, с.182186]. Даний спосіб обрано найближчим аналогом, який співпадає з корисною моделлю, що заявляється, в наявності спільних ознак: - включення ферменту в полівініловий спирт; - нанесення на матрицю; - попереднє насичення матриці 2%-им розчином бури. Але відомий спосіб має суттєві недоліки. По-перше, при іммобілізації на харчових волокнах втрачається 69-78% вихідної ліполітичної активності. По-друге, 44%-ів ліполітичної активності іммобілізованого ферменту втрачається при зберіганні протягом 1 року при 4°С. По-третє, складність способу, яка пов'язана з подрібненням до порошкоподібного стану іммобі лізованого препарату, отриманого шляхом насичення харчових волокон 20%-им розчином ПЕО. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів, в якому, шляхом заміни матриці і іншого співвідношення ферменту, ПВС і матриці, забезпечити збільшення збереження активності ліполітичних ферментів при іммобілізації і тривалому зберіганні. Поставлена задача вирішена в способі іммобілізації ліполітичних ферментів, що передбачає включення ферменту в полівініловий спирт і наступне нанесення його на матрицю, попередньо насичену 2%-им розчином бури тим, що як матрицю використовують активований вуглецевоволокнистий матеріал з сумарним об'ємом пор 0,41-1,3 (по бензолу), а процес ведуть при співвідношенні фермент: ПВС : матриця рівному (0,81,2):(0,11-0,17):(24-72) відповідно. Заявлений спосіб дозволяє з великим відсотком відтворюваності одержувати іммобілізовані на вуглецево-волокнистому матеріалі ліполітичні ферменти із збереженням 90,8-96,5% -ів ліполітичної активності при іммобілізації (у прототипу 56%) та при зберіганні протягом 1 року при 4°С 93,5% вихідної активності. Новим в заявленій корисній моделі є те, що як матрицю (замість харчових волокон) використовують вуглецево-волокнистий матеріал з сумарним об'ємом пор 0,41-1,3, а також співвідношення ферменту: ПВС і матриці рівному (0,8-1,2):(0,110,17):(24-72). Відомо використання вуглецевого матеріалу в (О 00 о> 7861 якості компонента дренуючої композиції [див а с СССР №1803129] Але невідомо використання вуглецево-волокнистого матеріалу, конкретно марки ДНЕПР-МН, в якості носію (матриці) для іммобілізації ЛІПОЛІТИЧНИХ ферментів Величина пористості (сумарний об'єм пор по бензолу) підібрана експериментально В таблиці 1 наведена порівняльна оцінка ЛІПОЛІТИЧНОІ активності солізіму, (мобілізованого на вуглецевоволокнистому матеріалі з різним об'ємом пор при співвідношенні фермент матриця рівному 1 50 Як видно з таблиці 1 найвищі показники ЛІПОЛІТИЧНОІ активності як після іммобілізації так і через рік зберігання одержані при сумарному об'ємі пор активованого вуглецево-волокнистого матеріалу рівному 0,41-1,3 (по бензолу) Масове співвідношення фермент активований вуглецево-волокнистий матеріал також впливає на ліполітичну активність Як видно з таблиці 2, при співвідношенні фермент матриця 1 (10-20) активність іммобілізованого препарату складає 50,5-79,9%, а при співвідношенні фермент матриця 1 (24-72) ліполітична активність складає 90,8-93,9% при іммобілізації і 90,2-92,9% при зберіганні протягом року При ЗМІНІ цього співвідношення в бік збільшення масової частки матриці відбувається зменшення активності іммобілізованого ферменту, що повязано з неоднорідністю іммобілізованих препаратів Спосіб здійснюється таким чином До активованого вуглецево-волокнистого матеріалу, який має сумарний об'єм пор 0,41-1,3 (по бензолу) і який попередньо насичений бурою і висушений, додають розчин ЛІПОЛІТИЧНОГО фермента в полівініловому спирті Співвідношення фермент ПОЛІВІНІЛОВИЙ спирт матриця складає (0,81,2) (0,11-0,17) (24-72) Отриманий таким чином матеріал з нанесенним ферментом висушували при кімнатній температурі Ліполітичну активність нативних та іммобілізованих препаратів визначали по методиці, яка викладена в книзі Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов Учебное пособие для вузов- Грачева И М и др , М "Легкая и пищевая промышленность", 1982, с 240 Вміст білку визначали по Лоурі в модифікації Хартрі [див Hartree E E Determination of protein modification on the Lowry method that gives a linear photometnc response // Anal Biochem - 1972 V18,№1 -P 422-425] Використовували такі ферментні препарати Солізим, виділений з Penicillium solitum (Ладижинське НВО "Ензім") з активністю 2360од/мг білку Ліпаза виділена з Pseudomonas s p (фірма Sigma), з активністю 2000од/мг білку Ліпаза свиняча з активністю 220од/мг білку Приклад 1 1г активованого вуглецево-волокнистого матеріалу (АВВМ) з об'ємом пор 0,41см3/г насичували розчином 40мг бури в 2см дистильованої води і висушували при 20°С Після цього матеріал насичували розчином 33,4мг солізиму в 3,5% - му ПВС в дистильованій воді Отриманий таким чином препарат висушували при кімнатній температурі Ліполітична активність іммобілізованого препарату - 38ЛО/мг (89% вихідної активності) Після збереження протягом року зберігається 90,1% активності Дані наведені у таблиці №3 Приклади 2-6 ілюструють іммобілізацію солізиму на АВВМ при різних значеннях пористості матриці Дані наведені в таблиці №3 Приклади 7-12 ілюструють іммобілізацію ліпази з Pseudomonas s р на АВВМ при різних значеннях пористості матриці Дані наведені в таблиці №3 Приклади 13-18 ілюструють іммобілізацію ліпази свинячої панкреотичної на АВВМ при різних значеннях пористості матриці Дані наведені в таблиці №3 Як видно з даних, наведених в таблиці №3 використання матриці з сумарним об'ємом пор менше 0,41см3/г (по бензолу) - приклади №№4, 7, 13 призводить до суттєвого зменшення ЛІПОЛІТИЧНОІ активності як після іммобілізації так і після 1 року зберігання Аналогічна закономірність виявляється і при збільшенні пористості матриці (приклади 5, 6, 11, 12, 17, 18) Таким чином, заявлений спосіб має такі переваги в порівнянні з прототипом 1 Збільшення відсотку збереження ЛІПОЛІТИЧНОІ активності іммобілізації до 89,0-96,8% замість 22,0-31,0%, 2 Забезпечення легкості подрібнення іммобілізованого препарату до порошкоподібного стану при використанні його в медицині, 3 Збільшення відсотку збереження ЛІПОЛІТИЧНОІ активності при зберіганні протягом 1 року при 4°С до 89,9-93,7% замість 56% Таблиця 1 Порівняльна оцінка ЛІПОЛІТИЧНОІ активності солізиму, іммобілізованого на матеріал з різним об'ємом пор (масове співвідношення фермент матриця =1 50) % збереження ліпопітичної № Об'єм пор по активності 3 п/п бензолу (см /г) після іммобілі- після І року зберігання зації 1 30,0 50,0 0,253 2 0,4 89,0 90,1 3 96,5 93,5 0,76 4 96,0 92,3 1,3 60,1 1,877 49,0 5 1,936 23,0 40,8 6 5 7861 Таблиця З Таблиця 2 Іммобілізація солізиму на АВВМ Масове співвідношення ферментматриця 1 10 1 20 1 ЗО 1 40 1 50 1 60 1 70 1 80 Ліполітична активність % збереження при іммобілізації після 1 року зберігання 50,5 79,9 90,8 92,8 96,5 93,9 81,5 63,2 64,7 80,1 90,2 91,8 93,5 92,9 77,4 58,2 Комп ютерна верстка М Мацело Іммобілізація різних ЛІПОЛІТИЧНИХ ферментів на АВВМ (співвідношення фермент матриця =1 50) № п/п Ферментний препарат Об'єм пор % збереження по бензолу ЛІПОЛІТИЧНОІ акти(см3/г) вності ПІСЛЯ ІМ мобіліза1 Солізим 2 3 4 5 6 7 Ліпаза з 8 9 10 11 12 13 Ліпаза свиняча 14 15 16 17 18 Підписне 0,41 0,76 1,3 0,253 1,877 1,936 0,253 0,41 0,76 13 1,877 1,936 0,253 0,41 0,76 1,3 1,877 1,936 89 96,5 96,0 ЗО 49 23 28,0 89,3 95,0 96 8 42,9 27,7 28,3 90,1 90,4 96,3 44,5 21,2 Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601 ПІСЛЯ 1 року зберігання 90,1 93,5 92,3 50,0 60,1 40,8 61,0 92,0 92,1 93,5 63,8 45,4 57,7 89,9 93,0 93,7 66,4 43,9