Живильне середовище для збереження культур лептоспір

Корисна модель належить до медицини, зокрема до бактеріології та може бути застосована для збереження музейних культур лептоспір у бактеріологічних лабораторіях. Відомі різні способи тривалого збереження культур мікроорганізмів [1]: - регулярний пересів їх на свіжі живильні середовища. - збереження під шаром мінеральної олії. - збереження у замороженому стані. - збереження у ліофільному стані. Найбільш розповсюдженим методом збереження культур мікроорганізмів являються регулярні пересіви бактерій у свіжі живильні середовища та збереження їх при кімнатній температурі, або в побутовому холодильнику. Метод широко використовують для збереження нечисленних колекцій мікроорганізмів у більшості бактеріологічних лабораторій. Але при збільшенні колекцій ця робота значно ускладнюється. Метод має ряд недоліків зберігається вільний доступ кисню до культур та середовища, що веде до утворення перекисів, висиханню середовища та до загибелі культур. Визнаним методом є збереження засіяних мікроорганізмів у живильному середовищі під вазеліновою олією, але цей метод потребує регулярних пересівів бактерій на свіжі живильні середовища. Визнано також, що при таких умовах збереження культур відбувається дисоціація бактерій: морфологічні, біохімічні, фізіологічні та антигенні властивості змінюються, що може знецінювати колекційні штами мікроорганізмів та призвести до втрати основних ознак первинної культури. Для збереження культур мікроорганізмів також використовують низькі температури побутового холодильника, в якому зберігають культури мікроорганізмів висіяними на щільні, або на напівтверді живильні середовища, а також зберігають культури у ємностях Дюара з рідким азотом при -196°С. Недоліком цих методів є необхідність утримання та обслуговування в лабораторії великих холодильних камер та великих ємностей Дюара, котрі необхідно регулярно поповнювати рідким азотом для збереження мікроорганізмів. Поряд з цим, для збереження бактерійних культур, використовують як консерванти різні складні синтетичні хімічні сполуки [Патенти РФ №№2008348, 2291193, 2185435 2291193] [3, 4, 5]. Можливо, що методи, наведені в патентах, мають певну перевагу для збереження культур мікроорганізмів з високою стійкістю до зовнішніх впливів середовища та до дії різних хімічних елементів. Лептоспіри відносяться до високочутливих мікроорганізмів до умов зовнішнього середовища та до різних хімічних речовин, вони потребують особливих умов збереження. Методом, що відповідає меті довготривалого збереження лептоспір могла б бути ліофілізація, або висушування із замороженого стану під вакуумом. Але і цей спосіб є проблематичним для лептоспір, тому що вони є вологолюбними мікроорганізмами, які спроможні зберігатися та накопичуватися у прісних відкритих водоймищах, мають у своєму складі 82% води. Обезводнення їх приведе до втрати ними життєдіяльності [2]. До того ж більшість кріопротекторів та їх розчинники, що застосовуються у способі, на лептоспіри діють як дезінфектанти. Таким чином, до цього часу не розроблені методи та умови довгострокового збереження лептоспір. В якості прототипу приготування живильного середовища використали середовище Фервоорт - Вольфа для ізоляції лептоспір в модифікації Тарасова [10]. До складу живильного середовища входять 0,1г пептону і 0,05г агару Дифко у 100мл дистильованої води. До отриманого розчину добавляють 5 - 10мл фосфатної буферної суміші з рН 7,2. Суміш кип'ятять, фільтрують через паперові фільтри, стерилізують у автоклаві, після стерилізації у кожну пробірку вносять 5 - 7 крапель кролячої сироватки. Наведене середовище не може бути використаним для довготривалого збереження лептоспір тому, що введення пептону веде до порушення морфології бактерій, яке виникає, зазвичай, у середовищах з великою концентрацією живильних речовин. Середовище має щільну консистенцію агару з відсутністю рідкої фази, що заважає рухомості лептоспір. Крім того, для підтримання життєздатності лептоспір є важливим використання якісної дистильованої води та встановлення оптимальної концентрації кролячої сироватки [12]. Задача корисної моделі живильного середовища для збереження культур лептоспір є розробка складу живильного середовища для довгострокового зберігання штамів Leptospirae шляхом створення колоїдної системи певної структури задля збільшення строку збереження життєздатності та типових морфологічних ознак мікроорганізмів. Задача вирішується тим, що живильне середовище для збереження лептоспір, містить агар Дифко та кролячу сироватку із наступним співвідношенням компонентів, мас. %: колоїдний розчин агара Дифко 0,005-0,015 кролячу сироватку 3,0-3,5 розчин фосфатного буферу (рН 7,2 - 7,4) решта Задача виконується наступним чином. До фосфатно-буферної основи живильного середовища рН 7,2 - 7,4 вносять дрібнодисперсний високоочищенний агар Дифко у кінцевій концентрації 0,005 - 0,015%, що сприяє утворенню колоїдної системи із 2-х фаз. Після додавання кролячої сироватки 3,0 - 3,5% утворюється гелеподібна сітчата структура завдяки тому, що кроляча сироватка є високомолекулярною сполукою. Сполука, адсорбуючись на поверхні колоїдної частинки агару Дифко, утворює на поверхневому шарі сітчату структуру [11], що перешкоджає об'єднанню колоїдних частинок. Колоїдна частинка має пористу структуру з численними мікроканальцями, а це, по-перше, сприяє умовам входження в них лептоспір, а по-друге, знижує можливість проникнення до пор атмосферного кисню, що є необхідною умовою тривалого збереження життєздатності в них лептоспір. Визначення якості кролячої сироватки проводили відповідно до нашого патенту на корисну модель [№ U200613105 від 11.12.2006 «Спосіб виготовлення живильного середовища для культивування лептоспір»] [12]. Для визначення оптимальної кількості агару, досліджували три варіанти живильного середовища на основі фосфатно-буферного розчину (рН 7,2 - 7,4) з кінцевими концентраціями 0,005%, 0,001%, 0,0015% високодисперсного та високоочищеного агару Дифко з оптимальною кількістю кролячої сироватки (3,0 - 3,5%), вільної від токсичних факторів та неспецифічних аглютининів. Критеріями оцінки оптимальної кількості агару Дифко слугували морфологічні ознаки та кількість життєздатних лептоспір в залежності від терміну спостереження. Досліджувані музейні культури лептоспір вирощували на середовищі із заявленим складом у пробірках впродовж 7-10 діб для накопичування бактерій та переносили в ампули. Ампули запаювали на вогні. Таблиця 1 Порівняльна таблиця терміну збереження культур лептоспір у живильному середовищі з різною кількістю агару Дифко. Живильні середовища Кроляча сироватка, Концентрація агару % Дифко, % вар. 1 вар. 2 0,005 3,0 3,5 0,015 3,0 3,5 0,010 3,0 3,5 Рідке середовище без агару (контроль) 3,0 3,5 Фосфатний буфер, мл Термін збереження лептоспір до 100 до 100 до 100 1-2 роки 3-5 роки 8-10 років до 100 10-15 діб Кількість життєздатних лептоспір в полі зору мікроскопу До 50 100-150 100-150 Поодинокі життєздатні лептоспіри із слабкою рухомістю та порушеною морфологією Таким чином, 0,010% колоїдне середовище дозволяє зберігати лептоспіри в ампулах життєздатними впродовж 8 - 10 років. Збереження лептоспір у напіврідкому живильному середовищі у запаяних ампулах (5,0мл) запобігає висиханню середовища, зберігає сталу концентрацію кисню, сприяє збереженню необхідних умов для росту лептоспір та підтримки життєздатності впродовж тривалого часу при кімнатній температурі. Заявлена рецептура живильного середовища дозволяє довгостроково зберігати лептоспіри без пересівів. Приготування середовища не потребує допоміжної апаратури, являється простим та дешевим при використанні у лабораторіях, що займаються діагностикою лептоспірозів, а також може бути застосованим для одержання діагностичних препаратів на основі свіжоізольованих сероваріантів лептоспір, та при виробництві профілактичних вакцин. Джерела інформації: 1. Методы общей бактериологии в трех томах. Под редакцией Ф. Герхарда и др. Москва. Мир 1984 г. Том 1 С.512-533. 2. Патент RU 2008348 Способ хранения микроорганизмов. Опубликован 1994.02.28. Заявлен Ленинградским научно-исследовательским институтом травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена. 3. Патент RU 95114509 Состав для хранения бактерий. Опубликован 1997.08.10 Заявлен Научноисследовательским институтом химии при Саратовском государственном университете им. Н. Г. Чернышевского; Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 4. Патент RU 2088657 Состав для хранения микроорганизмов 1997.08.27 Заявлен Научноисследовательским институтом химии при Саратовском государственном университете им. Н. Г. Чернышевского; Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». ( 5. Патент RU 2088258. Способ изготовления вакцины против лептоспироза животных. Опубликован 1997.08.27. Заявлен Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом биологической промышленности. 6. Патент RU 2185435 Способ хранения культур микроорганизмов. Опубликован 2002.07.20. Заявлен Пензенской государственной сельскохозяйственной академией. 7. Патент RU 2291193 Консервант для хранения микроорганизмов. Опубликован 2007.01.10. Заявлен ГОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского. 8. Патент RU 2292388 Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенних бледных трепонем Опубликован 2007.01.27. Заявлен Центральным научно-исследовательским кожно-венерологическим институтом Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. 9. Бернасовская Е. П., Угрюмов Б. Л., Вовк А. Д, Могилева Л. А. и др. в кн. Лептоспирозы. Киев "Здоровье" 1978. С.135. 10. Приказ №1152 МЗ СССР от 13.11.1979 г. О профилактике заболеваний людей лептоспирозом. М. 1979. С.58 в разделе Лабораторная диагностика лептоспироза. 11 .Возная Н. Ф. Химия воды и микробиология, 1979 С.344 12. Патент на корисну модель № U200613105 від 11.12.2006 «Спосіб виготовлення живильного середовища для культивування лептоспір». Заявлений Українським науково-дослідним протичумним інститутом ім. І. І. Мечнікова.