Спосіб виявлення збудника вірусного артеріїту коней з родини arteriviridae у патологічному матеріалі, сироватках крові, культуральній рідині, змивах із носової порожнини та еякуляті (жеребців) за допомогою пол

Спосіб виявлення збудника вірусного артеріїту коней з родини Arteriviridae у патологічному матеріалі, сироватках крові, культуральній рідині, змивах із носової порожнини, еякуляті (жеребців), що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) за 3 33963 Задача: створити новий спосіб виявлення збуднику вірусного артеріїту коней з родини Arteri viridae у сироватках крові, культуральній рідині, змивах носової порожнини та патологічному матеріалі, еякуляті (жеребців). Завдання досягається тим, що в досліджуваних зразках виявляємо специфічні фрагменти нук 4 леїнових кислот (кДНК) за допомогою полімеразної ланцюгової реакцїї-ПДР - ферментативної реакції і двох пар штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційних агентів при температурних і часових параметрах та кількості циклів: Таблиця № пп 1 2 3 4 5 Етап Пепередня денатурація Денатурація Віджиг праймерів Елонгація Фінальна елонгація Температура, °С 95 95 52 72 72 Праймери мають послідовність: Праймери першого етапу реакції: СЕ (5’TGGTAGGTGCTTC ATTGGCT 3’) DЕ (5’GCGGCACAAGAACACTTCTG 3’) Праймери другого етапу реакції: СІ (5’CCTGAGAC ACTGAGTCGCGT 3’) DI (5CCTGATGCCAC ATGGAATGA 3) Приклад Пробу (сироватка крові, носові змиви, біомаса, гомогенат патологічного матеріалу, культура клітин, еякулят) (1гр.) помішують у пластикову пробірку ємкістю 1,5мл і додають 500мкл дистильованої води. Суміш зтрушують і центрифугують, після чого проводимо виділення РНК комерційним набором реагентів «РИБО-золь-А» для виділення РНК. Далі необхідно провести реакцію зворотньої транскрипції, а саме: приготувати реакційну суміш, яка містить ліофілізовану RT-mix (Містить випадкові гексануклеотиди), 125мкл РНК-елюєнта (DEPC-H 20), 6мкл ревертази, 10мкл РНК- проби. В отриману в реакції оберненної транскрипції кДНК для наступної постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20мкл кДНК додати 20мкл ДНКбуфера). Для проведення реакції зворотньої транскрипції використовуємо комерційний комплект "РЕВЕРТА-L-100". Готуємо реакційну суміш для проведення ПЛР: Комп’ютерна в ерстка А. Рябко Експозиція, хвилин 1 0,4 0,4 1 7 Кількість повторень 1 40 1 Для цього в пробірку ємкістю 0,5мкл помішують 1мкл dNTP-mix, по 0,25мкл пари праймерів першого етапу реакції та 3,5мкл Н2О, далі віск 15мкл, 5мкл ПЛР-буферу, 2,5мкл Mg2+, 9мкл Н2О, 0,5мкл Taq-полімерази, 21мкл мінерального масла і 2мкл кДНК вносимо під мінеральне масло. Переносимо в термоцикдер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задаємо вище вказану програму. Аналогічну реакційну суміш го туємо з парою прамерів другого етапу реакції та проводимо ампліфікацію за вище згаданою схемою. Аналіз результата ПЛР проводиться в 1,5% гелі агарози з барвником - бромистим етидієм. В лунки атарозного геля вносять 10-12мкл ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу фрагменти кДНК згруповуються в смужки, які виявляють флуоресцентно при опроміненні ультрафіолетом. Результат ПЛР може бути оцінений візуально за наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для виявлення вірусу вірусного артеріїту коней з родини Arteri viridae у сироватках крові, культуральній рідині, змивах носової порожнини та патологічному матеріалі, еякуляті (жеребців). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601