Спосіб визначення альфа-токоферолу в печінці курей

Спосіб визначення альфа-токоферолу в печінці курей, що включає екстракцію, омилення, реекстракцію, фільтрування, упарювання, фотометрію, який відрізняється тим, що здійснюють екстракцію етиловим спиртом, реекстракцію гексаном та доочищення в хроматографічній адсорбційній колонці. (19) (21) u200804405 (22) 07.04.2008 (46) 25.07.2008, Бюл.№ 14, 2008 р. (72) КУЦАН ОЛЕКСАНДР ТИХОНОВИЧ, UA, ОРОБЧЕНКО ОЛЕКСАНДР ЛЕОНІДОВИЧ, UA (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ", UA 3 34181 15см3 гексану, упарювання екстракту в потоці повітря, доочищення в хроматографічній адсорбційній колонці, вимивання альфа-токоферолу 15см3 бензолу, упарювання проби досуха та додавання 0,2см3 хлороформу, 2см3 96% етанолу та 0,4см3 кольоро-реагенту і подальше фотометрування. Спосіб виконується таким чином. Наважку печінки 0,3-0,35г поміщають в пробірку, додають 5см3 96% етанолу і ретельно перемішують скляною паличкою. Потім у пробірку додають 10-20мг гідрохінону і ставлять на водяну баню (температура 90-95°С), після того як етанол закипить, у пробірку додають 0,2г гранульованого натрію гідроксиду і омиляють протягом 20-25 хвилин. Після омилення пробірку знімають з бані, додають 3см3 дистильованої води і проводять реекстракцію неомиленої фракції гексаном тричі по 5см3, енергійно струшуючи 3-4 рази. Після розшарування із фракції відбирають верхню гексанову фазу (15см3) і збирають в ємкість на 30-50см3. Отриманий екстракт упарюють досуха, додають до нього 6см3 гексану і фільтрують в адсорбційну колонку, в якій проходить доочищення проби. Завдяки доочищенню вимивається вітамін А і каротиноїди, які можуть заважати визначенню альфа-токоферолу. Потім вимивають альфатокоферол бензолом тричі по 5см3. Екстракт збирають у пробірку та упарюють досуха. До сухого залишку додають 0,2см3 хлороформу, 2см3 96% етанолу та 0,4см3 реактиву Емері-Енгеля (суміш 1:1 спиртових розчинів 0,5% 2-2-дипіріділу та 0,2% хлорного заліза). Перемішують і ставлять на 5-7хв у темне місце. Пробу досліджують за допомогою спектрофотометру за довжиною хвилі 540нм проти контрольної проби, яка готується змішуванням 0,2см3 хлороформу, 2см3 96% етанолу та 0,4см3 реактиву Емері-Енгеля. Контрольну пробу готують шляхом змішування 0,2см3 хлороформу, 2см3 спиртового розчину альфа-токоферолу з концентрацією 50мкг/см3 та 0,4см3 реактиву Емері-Енгеля. Фотометрію проводять не пізніше, ніж за 15-20 хвилин після виймання проби з темного місця. Комп’ютерна верстка C.Литвиненко 4 Розрахунок альфа-токоферолу проводять за формулою: Х= Едосл./Еконтр.´50(´2,32), де Х - кількість альфа-токоферолу мкг/г; мкМоль/г; Едосл. - екстинція дослідної проби; Еконтр. - екстинція контрольної проби; 50 - концентрація стандартного розчину альфа токоферолу мкг/г. 2,32 - коефіцієнт переводу мкг в мкМоль. Якщо вміст альфа-токоферолу в пробі більше 100мкг/г, забарвлену пробу розводять, додаючи по 2,8см3 етанолу і досліджують на спектрофотометрі, вносячи в кювету 3-4см3 дослідної рідини і розрахунок у такому разі проводять за формулою. Х=Едосл./Еконтр.´50´К(´2,32), де X - кількість альфа-токоферолу мкг/г; мкМоль/г; Едосл. - екстинція дослідної проби; Еконтр. - екстинція контрольної проби; 50 - концентрація стандартного розчину альфа токоферолу мкг/г; К - коефіцієнт розбавлення (в скільки разів розбавлена проба); 2,32 - коефіцієнт переводу мкг в мкМоль. Приклад. Для кількісного визначення альфа-токоферолу брали печінку курей 0,35г заливали етанолом, ретельно перемішували, додавали 10мг. гідрохінону і ставили на водяну баню. Потім пробу омиляли 0,2г гранульованого натрію гідроксиду протягом 20 хвилин. Після омилення проводили реекстракцію гексаном тричі по 5см3. Отриманий екстракт упарювали досуха, додавали 6см3 гексану та доочищували в адсорбційній колонці. Потім промивали колонку бензолом. Екстракт збирали, упарювали на водяній бані досуха, додавали 0,2см3 хлороформу, 2см3 етанолу 0,4см3 кольору-реагенту. Потім пробу фотометрували на спектофотометрі за довжиною хвилі 540нм. Спосіб визначення альфа-токоферолу у печінці курей є простим у виконанні, не потребує надмірної витрати реактивів та може використовуватись в лабораторіях. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601