Спосіб детекції chlamydia trachomatis в клінічних зразках

Спосіб детекції Chlamydia trachomatis в клінічних зразках методом полімеразної ланцюгової реакції, який включає проведення ампліфікації з використанням прямого праймеру 5'AACCGTTTTTAATAGTGGCA-3' та зворотного праймеру 5'-TTCTGGCCAAGAATTATCC-3', який відрізняється тим, що після першого раунду ампліфікації виконують додатково напівгніздову ампліфікацію зразка з використанням того ж прямого праймеру та зворотного праймеру 5'CTGCTGTAATCACCCAGTCG-3 з утворенням в позитивних зразках амплікону довжиною 330 нп. (19) (21) u200908274 (22) 05.08.2009 (24) 25.02.2010 (46) 25.02.2010, Бюл.№ 4, 2010 р. (72) МАВРОВ ІВАН ІВАНОВИЧ, БІЛОЗОРОВ ОЛЕКСІЙ ПАВЛОВИЧ, МІЛЮТИНА ОЛЕНА ЙОСИПІВНА, БІЛОЗОРОВА ОЛЬГА ОЛЕКСІЇВНА, ЗУЄВА МАРІЯ ІГОРІВНА, ВАСИЛЬЧЕНКО ВАЛЕРІЙ МИКОЛАЄВИЧ, ЧАСТІЙ ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ДЕРМАТОЛОГІЇ ТА ВЕНЕРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ" 3 47755 інгібіторів ампліфікації, які призводять до хибнонегативних результатів. Результати реакції при цьому мають значно більшу визначеність. Введення в реакцію нового праймеру значно зменшує можливість утворення артефактів ампліфікації і дає можливість точніше визначати результати реакції електрофорезом в гелі агарози. Зворотний праймер другого туру напівгніздової ампліфікації було подібрано за базами даних Національного центру біотехнологічної інформації США і експериментально перевірено на можливість використання для ПЛР з ціллю детекції специфічних ділянок ДНК криптичної плазміди Chlamydia trachomatis. Спосіб виконують наступним чином. Із зразку, що досліджують, виділяють ДНК за допомогою методу з використанням Челексу, фенольним методом, або комерційними наборами для виділення ДНК з клінічних зразків (Літех, Ізогон або інші). Для ампліфікації готують суміш наступного складу: Трис-НСІ, рН 8,5 - 10 тМ, хлористий калій 50 тМ, хлористий магній - 2,5 мМ, дезоксинуклеотидтрифосфати - 0,2 мМ кожний, диметилсульфоксид - 1%, праймери - 0,1 нМ, Taq полімераза 20 од/мл. До 25мкл суміші додають 4мкл виділеної ДНК і 15мкл вазелінової олії. Для першого раунду ампліфікації з 35 циклів використовують праймери: прямий 5'-AACCGTTTTTAATAGTGGCA-3' та зворотний 5’-TTCTGGCCAAGAATTATCC-3’ Для другого раунду ампліфікації використовують той самий прямий праймер 5'AACCGTTTTTAATAGTGGCA-3’ та зворотний праймер 5'-CTGCTGTAATCACCCAGTCG-3. Комп’ютерна верстка Л. Купенко 4 Перший раунд ампліфікації проводять за таким температурним режимом: перший цикл: денатурація 95°С - 2 хвилини, віджиг 54°С - 2 хвилини, елонгація 72°С - 2 хвилини. Після цього проводять ще 34 циклів за такими умовами: 94°С -30 секунд, 54° С -30 секунд, 72°С - 30 секунд. 4мкл суміші після першого раунду ампліфікації вносять в пробірки з сумішшю для другого раунду ампліфікації і проводять 25 циклів при тих же температурних режимах, як в першому раунді. Після закінчення ампліфікація продукти реакції піддають електрофорезу в 1,5% гелі агарози в Трис-ацетат-ЕДТА буфері з рН 8,3 з 0,5нг/мл етидіуму броміду протягом 15 хвилин, після чого аналізують за допомогою трансілюмінатора на довжині хвилі 310 нм. При позитивному результаті реакції виявляють амплікон довжиною 330 нп. Спосіб ілюструє наступний приклад його клінічного використання у хворого N, діагноз - хламідійний уретрит, позитивні результати дослідження на антиген Chlamydia trachomatis за допомогою тест-системи фірми "Рекомбіслайд хламіскан" фірми Лабдіагностика (Москва). ДНК з клінічного зразка, отриманого за допомогою уретрального зонду, була виділена набором реагентів фірми Літех (Москва). Після ампліфікації ДНК згідно з описаним методом і електрофорезу продуктів реакції в гелі агарози було виявлено смужку, забарвлену бромістим етидієм, розташовану поряд із смужкою позитивного контролю на ДНК Chlamydia trachomatis, що відповідає молекулярній масі 330 нп. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601