Спосіб визначення вмісту окису азоту в тканині та біологічних рідинах

Спосіб визначення вмісту окису азоту в тканині та біологічних рідинах, що полягає в реєстрації нітритта нітрат-юнів шляхом діазотування та відновлення, який відрізняється тим, що одночасно визначаються нітрит-, нітратюни та конвертація нітратів до нітритів з використанням відновника - цинкового пилу Винахід відноситься до області клінічної діагностики , а саме - до біохімії В зв'язку з широким спектром дії окису азоту (NO) в нормі та при патолопях виник великий інтерес до методів визначення NO та його метаболітів - нітратів (NO3) та нітритів (NO2) Всі методи визначення окису азоту можна розділити на дві групи методи виділення NO у "режимі реального часу " та методи виділення стійких метаболітів NO (NO2\NOs) Методи 1 групи дозволяють зареєструвати продукти NO в життєздатному біологічному матеріалі експлантантах тканини, біопсіях або ізольованих клітинах (лейкоцитах) [Wennmalm A , Benthin G , Edlund A et al Metabolism and excretion of nitric oxide in humans an experimental and clinical study//Cirs Res -1993 -N73 -P 1 1 1 2 - 1 1 2 7 ] електрохімічних датчиків) Спектрофотометричні методи 11 групи дозволяють визначати метаболіти NO (NO2\NOs) в гомогенаті, плазмі, сечі Для визначення нітритів використовують діазотування на основі реакції Гриса, але нітрати при цьому не реєструються Тому нітрати повинні бути відновлені до нітритів , з подальшим діазотуванням [Green L С .Wagner D A , Glogowski J et al Analysis of nitrate, nitrite and ( 1 5 N ) nitrate in biological fluids / / J Anal Biochem - 1 9 8 2 - N 1 2 6 P 131 - 138] Таким чином, можна держати сумарне значення (NO2\NOs) в пробі Відновлення нітратів до нітритів можна здійснити при обробці проб азотнокислою редуктазою [Bones P N , Bones С Nitrat determination in biolodgical fluids by an enzymatic one-step assay with nitrate reductase // Clm Chem -1995-N41 -P 904 - 907], на кадмії чи гідразином [Navarro-Gonzalvez J A, GarciaBenayas С , Arenas J Semiautomated measurement of nitrat in biological fluids//Clm Chemistry -1998-N 44 - P 679 - 681] Ферментативні методи дорогуваті, а використання гідразину - дуже трудоемка процедура та при підвищенні його долі зменшується процент перебігу NO2 до NO3, тобто низьке відображення А гранули кадмію потребують спеціальної обробки та після аналізу повинні бути регенеровані До таких методів відносяться електрохімічні, хемилюм шесцентні (реакція NO з озоном) [Moshage Н , К о к В , Huizenga J R Nitrite and nitrate determinations in plasma a critical evaluation // Clm Chem - 995 N 41 P 892 - 896], спектрофотометричні (реакція NO з оксигемоглобином) [ Moshage H Nitric oxide determinations much ado about NO -thing'? // Clm Chem - 1 9 9 7 - N 43 - P 553 - 556] Перевага цих методів заключається в тому , що можливо визначення фактичного NO Недоробки цих методів — т е х н і ч н а складність та їх ефективність тільки для життєздатних біологічних препаратів ВІДПОВІДНО, ЦІ методи не підходять для біологічних рідин, позбавлених клітин Крім того, використання цих методів в умовах in vivo достатньо ускладнено (за винятком Метою винаходу є створення способу визначення вмісту NO (NO2\NOs) як в гомогенаті тканини, так і в біологічних рідинах із використанням цинкового пилу в якості відновника Суть запропонованого способу полягає втому, що для визначення нітритів і нітратів в тканині та CO Ю CO Ю 53153 біологічній рідині береться їх діалізат, в якому лимонна кислота - 75г, сульфанилова кислота - 4г, проводиться діазотування за допомогою реактива альфа-нафтиламш -2г) та 5мл оцтової кислоти Гриса для нітратів та одночасне відновлення Реакцію проводили в аналогічних умовах протягом нітратів цинковим пилом і діазотування 10 хвилин Потім проби центрифугували, відбирали супернатант, який фотометрирували Апробація способу була проведена на білих проти "холостої" проби щурах 16-ти тижневого віку Після декапітацм тварин виймалися нирки, з яких готувався Концентрації нітрит - та нітрат ІОНІВ гомогенат Далі проводився діаліз, по закінченні розраховували за формулою якого відбиралися проби діалізату для проведення аналізу на нітрити (Юмл ) та нітрати (5мл) Але наперед у пробах було проведене випадіння білків В - вміст нітрит ІОНІВ (нітрат ІОНІВ), 5 % розчином КОН та 5% розчином сульфату розрахований по калібрувальним кривим, мкг, цинка в об'ємному співвідношенні 2 5 А - маса зразку, г, У проби на нітрити (1 Омл) додавали 1 мл Хі - загальний об'єм фільтрату, мл, реактиву Гриса, пробі рки інтенсивно коливали при Хг - об'єм фільтрату, взятий для аналізу, мл t = 4°С Через 15 хвилин в пробах розвивалося (10 або 5мл ВІДПОВІДНО) рожеве забарвлення Вимірювання оптичної ВМІСТ NO в нирковій тканині визначався як ЩІЛЬНОСТІ проводилося на СФ - 46 при А = 540нм сума (NO2 + NO3) мг\кг У пробі на нітрати (5мл) додавали 0,3г Аналогічно проводиться аналіз для біологічної реактиву "сухий відновник" (сульфат барію - 100г, рідини сульфат марганцю - 10г, цинковий пил - 2г, ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24