Штам соматичних структур макроміцету irpex lacteus fr. c-11 – продуцент ферменту тромболітичної дії

MKB С 12 N9/52 ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР МАКРОМІЦЕТУ IRPEXLACTEUSFT. C-ll - ПРОДУЦЕНТТРОМБОЛІТИЧНОГО ФЕРМЕНТУ. Винахід належить до ферментативно] галузі мікробіологічної промисловості та стосується отримання нового штаму соматичних структур макроміцету (вищого базидіального гриба) І грех lade us Fr. - продуцента тромболітнчного ферменту (ТФ), який може бути використаний у медицині як тромболітичний препарат. Відомий штам 5 Aspergillus terricola [1] - продуцент ТФ, який належить до недосконалих грибів та характеризується рясним спороутворенням у культурі, що може викликати різного роду професійні захворювання при його промисловому культивуванні. Склад середовища не наведено, не показана динаміка зміни тромболітичної активності (ТА) при культивуванні продуцента. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, який досягається» є гриб Trichotecium roseum [2], рівень активності культуральної рідини якого складає 2664 питомих одиниць на міліграм. Результати, що їх представлено, досягаються при використанні середовища, склад якого не наведено, не показана динаміка зміни тромболітичної активності (ТА) при культивуванні продуцента та зазначено» що повний лізнс експериментальних тромбів відбувається у 80% випадків. Розвиток біотехнології ферментів пов'язаний з подальшим пошуком нових штамів - продуцентів, які б мали високі виробничі властивості [3], В основу винаходу поставлена задача отримання нового штаму соматичних структур афілофорального макроміцету /. lacteus, який здатний до активного біосинтезу екзоферменту троиболітнчноі дії. 2. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам С-11І. lacteus показує високу ТА в культурі на живильних середовищах, які містять доступні та дешеві компоненти (мінеральні солі, пептон, вода), Штам, що його пропонують, зберігається в колекції чистих культур кафедри фізіології рослин Донецького держуніверситету та депонований у спеціалізовану колекцію культур інституту ботаніки ін. Н.Г. Холодного НАН України, колекційний номер 1631. Отриманий штам С-117. lacteus має наступні характеристики. Культурально-иорфологімні ознаки. Штам досліджували на сусло-агарі, глюкозо-картопляному агарі та агарі Чапека-Докса На сусло-агарі колонія ватоподібна, міцелій повітряний та стелиться по поверхні. Колір колонії білий, субстрат не забарвлює. На глюкозо-картопляному середовищі колонія має вигляд як і на сусло-агарі. На агаризованому середовищі Чапека-Докса колонія представлена головним чином зануреним міцелієм. Швидкість росту міцелію на сусло-агарі при температурі ЗО±1°С складає 13,17±0,75 мм за добу, на глюкозо-картопляному агарі- 13,34±0,56 мм за добу, на агарвзованому середовищі Чапека-Докса - 9,67±1,48 мм за добу. Плодоношення на середовищах культивування, що їх було застосовано, не спостерігали. Мікроскопічні дослідження показують, що міцелій складається з гіллястих гіф, що тісно переплітаються, з перегородками. Пряжки не виявлені. Ріст міцелію можливий в інтервалі температур 2-50°С. Температурний оптимум росту грибу знаходиться у межах 25-37°С, біосинтетичннй - 25-32°С. При 45°С ріст грибу різко знижується до 0,25±0Д мм за добу, а при 50°С ріст припиняється. На рідких глюкозо-пептоновому та сусло-пептоновому середовищах утворює у рівному ступені поверхневий та занурений міцелій. Повітряних гіф мало. Культуральннй фільтрат (КФ) не забарвлює. Фізіолого-біохімічні ознаки. 3. При відборі джерел вуглецевого та азотного живлення критерієм придатності було значення ТА КФ» скорочення терышу росту грибу та отримання ферменту. Утилізація кислот, ноно-, ді-» поліцукрів та спиртів відбувається з різною швидкістю. Найбільше накопичення біомаси спостерігається на крохмалі» дуже слабке - на аспарагіновій кислоті. Штам С-11 /. lacteus, зростаючи на рідкому живильному середовищі з зазначеними джерелами вуглецю, виявляє різну тромболітичну та біосинтетичну активність у культурі. Максимальні значення ТА спостерігаються при вирощуванні гриба у 250 мл колбах на 50 мл живильного середовища з глюкозою при віці культури 10 діб. Вивчення придатності неорганічного (амонійного та нітратного) та органічного азоту (ферментативний пептон, сечовина, амінокислоти) показало, що лише на середовищах з пептоном відбувається активне ферментоутворення тависоке накопичення біомаси. Приклад І. Штам С-11 /. lacteus отриманий методом первинного відбору. Плодові тіла зібрані з засохлої деревини дубу (Quercus robur). Чисту культуру штаму підтримують шляхом пересівів через 3-5 місяців на агаризованоиу пивному суслі» чи інших агаризованих живильних середовищах. Для виявлення ТА штам С-11 1. lacteus культивують на рідкому глюкозопептоновому середовищі, яке містить (г/л): глюкозу - 10; пептон - 3; СаСЬ - 0,05; КН2РО 4 - 0,6; К3 НРО4 - 0,4; MgSO4-7H2O - 0,5; ZnS04 -7H2O - 0,001; дистильовану воду - до 1 літру. Кислотність середовища після стерилізації - 4-5 рН. Культуру вирощують у колбах на 250 мл, об'єм середовища - 50 мл, поверхневим способом при температурі 32°±1°С. Посівним матеріалом служить 7-Ю добова культура грибу з агаризованих середовищ. ТА КФ визначають на 5,10,15, 20, 25 та 30 добу культивування. Тромболітичну активність культурального фільтрату виз начають за методом, запропонованим Імшенецьким таБроцькою [4]. Метод оснований на урахуванні часу лізису штучних тромбів донорської крові. У пробірки Відаля вносять ОД мл розчину тромбіну розведеного , фізіологічним розчином таким чином, щоб у 1 мл містилося 25 одиниць, та 0,1 мл донорської крові. До тромбу, що утворився, додають 2 мл культурального фільтрату . У контрольні пробірки додають 2 мл прокип'яченого КФ . Крім того, для контролю над спонтанним лізисом тромбів готують пробірку , яка містить тільки тромбін і донорську кров. Після внесення розчинів кожну пробірку обережно струшують та поміщають у термостат при 37°С. Розрахунок ТА в у мо в ні о д и ни ці пр о во д ят ь з а пр о п ис о м П с у р це во ї т а Д е н нс о во і [ 5 ] : 24 -t ТА = х 50 , де t - час повного лізису тромбу (годин). t Результати представлені у таблиці 1: Таблиця 1. Вік культури, діб 5 10 15 20 25 30 ТА, умовних одиниць 52 68 54 66 10 0 Отримані результати свідчать про те, що штам С-11 І. lacteus синтезує у середовище фермент тромболітичної дії. Його кількість поступово збільшується і вже на 10-у добу культивування у 250 мл колбах з 50 нл живильного середовища складає 68 у.о. Таким чином , штам С -11 /. lacteus є активним продуцентом протеіназ тромболітичної дії та у порівнянні з прототипами (штамом 5 A. terricola та грибом Т. roseum) не утворює спорової маси, яка може при промисловому культивуванні викликати професійне захворювання. Джерела інформації, що були використані при складанні заявки. 1. А. с. 464617 СССР, М. Кл. С 12 d 13/10. Штамм 5 Aspergillus terricola продуцент протеолитического фермента, обладающего фибринолитическим и тромболнтическиы действием / А.А. Иншенецкий, С.З. Броцкая, В.В. Коршунов. - Опубл. 23.0J.75, Бгол. № 11. 2. А. с. SU 1421348 А 1, М. Кл. 4 А 61 К 37/48, С 12 N 9/58. Способ получения тромболитнческого фермента из гриба Trichotecium roseum штамп D / Н.С. Мурашов, ИВ. Иванова, М.А. Козлова, А.В. Снротенко, Р.А. Максимова, Г.В. Андреенко, Е.В. Макарова, В.И. Данилина. - Опубл. 07.09.1988, Бюл. № 33 (прототип). 3. Белки, ферменты и стернвы базиднальных грибов / Под ред. О.П. Низковской Л; Наука, 1979. 72 с. 4. Имшенецкий А.А., Броцкая С.З. Селекция микроорганизмов, обладающих тромболитнческой активностью //Микробиология. - 1969. - Т. 38. - № 6. - С. 1403-1409. 5. Псурцев а Н.В., Денисова Н.П. Тромболнтическая активность культур Flammulina velutipes (Fr.) Karst. //Микология и фитопатология. - 1982. - Т. 16. - » б . - С . 518-521. ----