Штам соматичних структур макроміцета tyromices revolutus (bres.) bond. et sing. – продуцент молокозсідного ферменту

Штам соматичних структур макроміцета Tyromyces revolutus (Bres.) Bond, et Sing № 1025 [спеціалізована колекція культур Інституту ботаніки їм. М.Г. Холодного НАН України, м. Киів(ІВК)) - продуцент молокозсідного ферменту. Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості, галузі отримання макроміцета (вищого базидіального гриба) Tyromyces revolutus (bres.) bond., що здатний до виділення в навколишнє середовище протеїну молокозсідної дії. Можливе використання нового штаму у сировиробництві, як замінника сичужного ферменту Відомий штам вищого базидіоміцета Мусепа pura (FT), В порядку Agaricales - продуцента молокозсідного ферменту (МЗФ). Середня молокозсідність на активність (МЗА) ферментного препарату, що отримували при різних способах культивування М. pura становить 500000од/г; максимальна 1000000 од./г і більше. Не наводяться дані про токсичність та патогенність штаму і ферментного препарату по відношенню до тварин [1] Наведені дані досягаються за умови застосування коштовних компонентів поживного середовища. У роботі не подано зміни значень МЗА культурального фільтрату при культивуванні продуцента. Умовою розвитку біотехнології є подальший пошук нових, нетрадиційних об'єктів, що мають цінні виробничі властивості. Отже, існує нагальна потреба інтродукції нових організмів [2,5]. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є штам сапрофітного дереворуйнівного гриба Hirschioporas farioinus (Karst.) Ryv.[4]. Отримання МЗФ за прототипом передбачає культивування продуцента протягом 12-15 діб на синтетичному глюково-пептонному живильному середовищу. Посівний матеріал вирощується до 10-15 діб. В основі винаходу поставлена задача отримання нового штаму соматичних структур базидіального гриба Tyronyces revolutus (Bres.) Bond.et Sing, порядку Aphyllophorales, що здатний до підвищеного біосинтезу молокозсідного екзоферменту на поживних середовищах, порівняно зі штамом М-81 Hirsohioporus lariotnus (прототип), що не містять дефіцитних та коштовних компонентів (глюкоза, макро- і мікроелементи та ін). За рахунок цього може бути використаним у біотехнологічних виробництвах дешевих і безпечних промислових ферментних препаратів молокозсідної дії, які застосовуються у молочній промисловості. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам BN-92 (А-025) Tyromyces revolutus виявляє значний рівень МЗА у культурі на живильних середовищах, що складаються з дешевих та доступних компонентів (знехмілене пивне сусло, пептон, вода). Запропонований штам BN-92 (А-025) гриба Tyromyces revolutus зберігається в колекції чистих культур бази діоміцетів кафедри фізіології рослин Донецького держуніверситету (кол. N А-025) та спеціалізованій колекції культур Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, м. Київ (ІВК) за колекційним номером 1025. Отриманий штам БМ-92 (А-025) гриба, Tyromyces revolutus (Bres.) Bond, et Sing, має наступні характеристики. Культурально-морфологічні ознаки. Штам досліджували на глюкозо-картопляному агарі, агарі Чалека-Докса. сусло-агаровому, гпюкозо-лептонному, сусло-пептонному, мінеральному Чапека живильних середовищах. На глюкозо-картопляному агарі у чашках Петрі, 7-денна, міцеліальна колонія має круглу ферму, повстиста. Гіфи гриба розростаються рівномірно, добових змін росту не відмічено. Однаково добре розвинуті як субстрактні так і повітряні гіфи. Колір колонії сніжно-білий, з віком (на 20-25 добу) змінюється на біло-кремовий. Субстрат не забарвлює. Край колонії притулений до поверхні середовища. Зовнішня лінія колонії відторочена. Иа сусло-агарі, гриб має вид як і иа попередньому середовищу. На агарі Чапека-Докса куль ю ю со < 34553 тура складається, головним чином, з занурених субстратних гіф. Середня швидкість росту міцелія на суглоагар» у чашках Петрі при температурі ЗО ± 1°С становить 19,8 ± 0,3, на глюкозо-картопляному агарі 17,8 ± 0,3 і на агаризованому середовищі ЧапекаДоке 7,18 ± 0,4 мм/добу. Температурний оптимум росту міцелію знаходиться в межах 27-ЗОХ. Утворення плодових тіл на застосованих середовищах культивування не спостерігається. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з стінками і перегородками, що добре спостерігаються. Є пряжки. Повітряні гіфи тонші за субстрати». Завдяки рясному, потужному розгалуженню субстратних гіф, їх щільності, міцелій має кожисту консистенцію. На мінеральному середовищу Чапека грибниця білого кольору, обрідна, павутиновидна. Повітряні гіфи відсутні, субстратні, - гілчасті, з перегородками. Середня швидкість росту при температурі ЗО ± 1 °С становить 8,40 ± 0,3 мм/добу. Колонія, субстрат не забарвлені. Спороносності не спостерігається. Міцелій здатний до росту в межах температур від 2° до 48°С. Найбільш сприятливі температурні оптимуми росту - 27-ЗОХ, біосинтезу МЗФ - 3032°С. При критичних температурах, ріст гриба різко зменшується і становить 0.2510,1 мм/добу. На рідких глюкозо-пептонному і суслопептонному поживних середовищах штам BN-92 (А025), при поверхневому культивуванні, утворює рівно розвинуті усі типи міцелію. Культуральний фільтрат під впливом гриба дещо знебарвлюється. Фізіолого-біохімічні ознаки. Вивчався вплив різних джерел вуглецевого і азотного живлення на біосинтетичну (МЗА) діяльність штаму. Утилізація моно-, ди- та полісахаридів протікає з різною швидкістю. Найвище накопичення біомаси спостерігається на крохмалі, ксилозі та глюкозі; дуже слабке - на рамнозі, рафінозі і яблучній кислоті. Молокозсідна активність культурального фільтрату не пов'язана з накопиченням біомаси. Високі значення МЗА відмічаються на ксилозі, глицеріні, мальтозі і глюкозі вже на 11-15 добу культивування. При вирощуванні гриба на живильних середовищах, що містили рамнозу, дульцит, сорбіт та інозіт, МЗА не зареєстровано. Вивчення придатності неорганічного (амонійного і нітратного) та органічного азоту (ферментативний пептон, сечовина, амінокислоти) засвідчило, що тільки на середовищах з пептоном йде швидке ферментоутворення і накопичення біомаси. Приклад 1 Штам BN-92 (А-025) гриба Tyromyces revolulus отримано методами, що звичайно застосовуються для одержання чистих культур макроміцетів, а саме вилученням "тканинних" ізолятів з плодових тіл (3J. Плодові тіла зібрані з мертвої гілки кінського каштану Aesculus nipocastanum L у парковій зоні м. Донецька. Чисту міцеліальну культуру штаму підтримують шляхом пересівів через 5-6 місяців на агаризоване знехмілене пивне сусло, чи інші агаризовані поживні середовища Для виявлення МЗА, штам BN-92 (А-025) вирощують на рідкому знехміленому пивному суслі 4 по Валлінгу, що містить 3 г/л ферментативного пептону. Водневий показник середовища після стерілізаціі становить - 4,4-4.6 рН. Культуру вирощують в колбах Ерленмейера місткістю 250 мл з об'ємом середовища - 50 мл, поверхневим способом при температурі 31 ± 1 С Посівним матеріалом є 7-Ю добова культура гриба на агаризованому поживному середовищі. МЗА культурального фільтрату визначають через кожні 3 дні протягом ЗО діб. Виділення ферменту з культурального фільтрату ведуть фракціонуванням (NH«)?S04 при 85% насиченні. Після повного осадження білка протягом 24 годин при температурі 5-10°С, осад відділяють рефрежераторним центрифугуванням при 5000 об/хв. протягом 10-15 хв. МЗФ з осаду діалізують проти дистильованої води при 5 С. Розчин ферменту ліофільно сушать. МЗА культурального фільтрату [КФ] і ферментативного препарату [ФП] визначають за методом, запропонованим Каваї і Мукаї [1, 7]. У 100 мл молока вливають 1 мл 15% розчину СаСІг, перемішують і доводять кислотність 10% НСІ до рН 6,0. У пробірки вливають по 10 мл приготовленого молока і ставлять у термостабілізуючу водяну баню при 35 С. Після нагрівання молока, в дослідні пробірки вносять по 1 мл культурального фільтрату чи 1 мл 0,1% розчину ферментного препарату. Суміш перемішують і ставлять на водяну баню. МЗА реєструють за часом зсідання молока, яку виражають у хвилинах. Розрахунок МЗА ведуть за формулою, запропонованою Д.Я. Типограф і Т.А. Петіной І висловлюють в умовних одиницях (6]. МЗАКФ = (40-100 К) / П од/мл, МЗАФП ~ (40 100 К ) / П а од/мл, де К - .коефіцієнт розбавлення КФ чи ФП; П - час (.в хв.), протягом якого з 100 мл молока, після внесення КФ чи ФП, утворюється згусток; 40 - середній час (в хв.) зсідання молока при виготовлені сиру; а - наважка ФП, г. Отримані результати свідчать про те, що штам BN-92 (А-025) афілофорового гриба Tyromyces revolutus (Bres.) Bond, et Sing, продукує в навколишнє середовище фермент молокозсідної дії. МЗА КФ поступово збільшується від 25000 ± 263,5 од/мл у віці 10 діб до 20000 ± 738,1 од/мл у віці культури 12 діб. Наведені максимальні значення МЗА КФ даного штаму спостерігаються в межах часу культивування від 10 до 15 діб. Потім МЗА зменшується і на ЗО день росту штаму BN-92 (А025) після 15 діб культивування, мав МЗА близько 1000000 од/r. Вміст білка в препараті - 36,19%. Приклад 2. Проведено дослідження токсичності штаму BN-92 (А-025) гриба Tyromyces revolutus (Bres.) Bond, et Sing. При одноразовому введенні білим мишам в шлунок у дозі 5000 мг/кг та внутрішньочеревно у дозі 950 мг/кг ФП, загальний стан тварин був задовільний, поведінка активна, апетит не змінювався. Протягом ЗО діб після введення ані загибелі, ані якихось ознак інтоксикації не спостерігалося. Отже, згідно з класифікацією гідролітичних ферментних препаратів мікробіологічного синтезу за ступенем безпеки, штам BN-92 (А-025) гриба 34553 Tyromyces revolutus та отриманий ФП можна віднести до малобезлечних ферментних препаратів (4 клас безпеки). Таким чином, запропонований штам 5N-92 (А025) афілофорового гриба Tyromyces revolutus (Bres.) Bond, et Sing, у порівнянні з прототипом штамом М-81 сапрофітного фиба Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. здатний до синтезу молокозсідного ферменту близької активності при культивуванні на доступних компонентах поживного середовища. Штам цього таксону, в якості продуцента молокозсідного ферменту подається вперше. Штам та ферментний препарат сичужної дії, за проведеними попередніми дослідженнями, не є токсичними щодо тварин. Спороносність у культурі не спостерігається - що гарантує чистоту навколишнього середовища. За рахунок цього може бути використаним у біотехнологічних виробництвах дешевих І безпечних ферментних препаратів молозсідальної дії, які застосовуються у молочній промисловості. Джерела Інформації, які використані при укладанні заявки: 1. А.с. 1374778. СССР. Штамм соматических структур макромицета Мусепа pura (Fr.) Kumm. продуцент молокосвертывающего фермента / Федорова Л. П., Дроздова Т.Н., Низковская О.П., Че ботарев А. И. Заявка N«3906767/31-13 от 22.04.85., М. кл. С12 N 9/54, А23 с 19/02, БИ. № 6,1985. 2. Белки, ферменты и стерины баэидиальных фибов / Под ред. О.П. Ниэковской. Л.: Наука, 1979. - 72 с. 3. Бухало А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - Киев.: Наук, думка, 1988. - 144 с. 4. Патент NB 6229 України. Штам Hkchloporus laricinus (Karst )Ryv. M-81 - продуцент молокозсідального ферменту / Бойко МІ., Нефуцький С.Ф.. Мирошнгченр Т.В., Соболь М.А., Варенко Ю.С. Заявка N» 3787001 от 18. 05.84., М. кл. С 12 N 9/54. (прототип) 5. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности ВНИИСЭНТИ: Обзорная информация, сер. 3.- М., 1985.- 48 с. 6. Типограф Д. Я., Петина Т. А. Условия культивирования фиба Aspergillus candidus, штамм It и его ферментативный комплекс // Прикл биохим. и микробиол. - 1966 - 2, На 4. - с. 417- 424. 7. Kawai M., Mukai N.; Studies of milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. 1. Screening test of Basidiomycetes for production of тіїк clotting enzymes Agric. Biol. Chem. - 1970. - 34. №2. P.159-163. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03