Спосіб одержання гіалуронідази

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способу получения ферментов, которые могут быть использованы в медицине для приготовления лекарственных средств и в научноисследовательской работе. Наиболее близким является способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота путем измельчения сырья, экстракции водным раствором уксусной кислоты, двукратного осаждения ацетоном при температуре от 0 до -2°С, перемешивания, инкубации раствора при температуре 6-10°С, обработки ацетоном и эфиром, растворения осадка в воде, отделения целевого продукта путем стерилизующей фильтрации, разлива в ампулы и сублимационного высушивания. Данный способ имеет ряд недостатков: значительная потеря активности фермента за счет тепловых стадий и обработки органическими растворителями, недостаточная очистка от низкомолбкулярного балласта, большие объемы органических растворителей, низкий выход целевого продукта, длительность технологии. Заявляемое изобретение направлено на решение следующих задач: повышение выхода целевого продукта за счет сокращения длительности технологии, удаления балластных белков без обработки агентами, приводящими к денатурации фермента, удаления низкомолекулярных балластных веществ, стандартизации технологии. При использовании указанного изобретения длительность процесса составляет 6-7 сут (по прототипу- 12-14 сут); увеличен выход целевого продукта в 2,5-3.5 раза, что связано с отсутствием обработок ацетоном и сокращением длительности процесса; уменьшено содержание иизкомолекулярных примесей: цветность препарата при 400 нм у препарата, полученного по предлагаемому способу, не более 0,1 (по прототипу - 0,25-0,3} при одинаковом содержании фермента. Это достигается тем. что полученный экстракт фермента подвергают очистке и концентрации до 1/8-1 /10 от исходного объема путем ультрафильтрации через полые волокна, пропускающие белковые молекулы молекулярной массы не более 10000 а.е.м,, и осаждением балластных белков при помощи хлороформа и натрия хлористого. Способ осуществляется следующим образом. Семенники крупного рогатого скота очищают от оболочек и подвергают измельчению. Полученную массу экстрагируют водным раствором уксусной кислоты при рН 4,54,7 в течение б ч при температуре 6-10°С, Затем экстракт подвергают центрифугированию,' и полученный прозрачный раствор концентрируют путем ультрафильтрации на полых волокнах (ВПУ 15) до конечного объема 1 /8-1 /10 от исходного. Раствор охлаждают до 4-8°С и смешивают с охлажденным до температуры от-10 до -15°С хлороформом. Смесь интенсивно перемешивают, прибавляют натрий хлористый и выдерживают в течение 1,5-2 ч, а затем осадок отделяют центрифугированием. Прозрачный фильтрат очищают от хлористого натрия путем ультрафильтрации. Очищенный и концентрированный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофилизации. Πример 1. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10°С в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10°С с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрированию до конечного объема 2,75 л (1/8 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6°С, медленной струей приливают 110 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа - 4 об.%)и перемешивают, Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 159,5 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 48°С в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 вес.%. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,0 г с активностью 128 условных единиц (УЕ) в 30 мг/мл. Пример 2. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-5,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10°С в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10°С с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрируют до конечного объема 2,45 л (1/9 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6°С, медленной струей приливают 123 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа - 5 об.%) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 142,1 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8°С в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 вес.%. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,3 г с активностью 256 УЕ в 30 мг/мл. Пример 3. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10°С в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10°С с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрируют до конечного объема 2,2 л (1/10 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6°С, медленной струей приливают 132 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа - 6 об.%) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 127,6 г до-конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8°С в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 вес.%. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лио-фильному высушиванию. Выход целевого продукта, составляет 5.5 г с активностью 256 УЕ в 30 мг/мл. Выбранные соотношения подтверждаются данными, приведенными в табл. 1 и 2. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, оптимальным является концентрация раствора 1/8-1/10 от первоначального объема. Использование соотношений, отличающихся от указанных, приводит к снижению активности препарата, что β свою очередь снижает выход целевого продукта. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, оптимальным является содержание хлороформа в растворе продукта 4-6 οδ.%. Использование соотношений, отличающихся от указанных, приводит к снижению активности фермента. Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом приведены в табл. 3.